Univerzita Palackého

Transkript

1 Univerzita Palackého Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie LABRATRNÍ VIČENÍ Z BIEMIE Prof. RNDr. Pavel Peč, Sc. a kolektiv lomouc 2008

2 2

3 BSA Laboratorní řád... 6 Bezpečnost práce v chemické laboratoři... 7 První pomoc při nehodě Aminokyseliny 1.1. Identifikace aminokyselin Dělení směsi aminokyselin chromatografickými metodami Dělení směsi aminokyselin na iontoměniči Dělení směsi aminokyselin chromatografií na tenké vrstvě silikagelu Proteiny 2.1. Stanovení celkových proteinů Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu Stanovení relativní molekulové hmotnosti bílkovin metodou diskontinuální elektroforézy v polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) Diskontinuální elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za nativních 29 podmínek hemické modifikace proteinů Gelová chromatografie barevného derivátu albuminu Enzymy 3.1. Amylasy Aktivita diastasy Substrátová specifita α amylasy a sacharasy ptimální p enzymové reakce α-amylasy Teplotní optimum enzymové reakce sacharasy Aminoxidasa Izolace aminoxidasy ze semenáčků hrachu

4 Stanovení kinetických parametrů aminoxidasy Proteolytické enzymy Lipidy 4.1. hemické vlastnosti lipidů Preparace lipidových frakcí z vaječného žloutku Identifikace lipidů Stanovení lipofilních listových barviv a jejich rozdělení adsorbční chromatografií Sacharidy 5.1. hemické vlastnosti sacharidů - kvalitativní reakce Papírová chromatografie sacharidů Nukleové kyseliny 6.1. Izolace DNA a RNA, identifikace složek nukleových kyselin Příprava činidel a roztoků Použitá literatura

5 PŘEDMLUVA Skripta jsou sepsána pro základní cvičení z biochemie určené studentům oborů biochemie, chemie, biofyziky a biologie. Jsou koncentrátem zkušeností a výsledkem práce autorského kolektivu Katedry biochemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Palackého. Prakticky pokrývají celou oblast biochemie a částečně také molekulární biologie. Úloh je početně daleko víc, než je možné v semestrálním cvičení zvládnout. Řada úloh je alternativních a budou zařazovány podle náročnosti, dostupnosti chemikálií a přístrojů. Autoři skript byli vedeni myšlenkou prakticky představit logickou stavbu biochemie a experimenty vedoucí k jejímu objasnění. Biochemie je intenzivně, ba dokonce dynamicky a exponenciálně se rozvíjejícím oborem. Experimentální metody původně převzaté z jiných oborů chemie jsou překonány a biochemický experiment už tím, že pracuje s biologickým materiálem, se stal samostatnou disciplinou s původními postupy. Jen pro představu: běžná bakterie E. coli obsahuje 70 % vody a 30 % ostatních chemických sloučenin. Z těchto 30 % připadají na ionty a malé organické molekuly 4 %, fosfolipidy 2 %, DNA 1 %, RNA 6 %, polysacharidy 2 % a proteiny 15 %. Úkolem biochemika je např. izolovat a charakterizovat (také sekvenovat = stanovit pořadí bází) bakteriální DNA. Bez nadsázky se takový experiment dá přirovnat k hledání jehly v kupce sena. Mohli bychom popisovat další obtížné experimentální úkoly, před které postavila biochemiky Příroda. Není to účelem úvodu, to vše najdete ve skriptech. Snad jen poznamenáme, že autoři by byli velmi spokojeni, kdyby si uživatelé skript osvojili základní biochemické postupy, pochopili strategii a zvláštní charakter práce s biologickým materiálem a odnesli si do své budoucí praxe poznání, že biochemie je těžký, ale krásný a užitečný obor, který budou dále rozvíjet. lomouc, 2008 Autoři Prof. RNDr. Pavel Peč, Sc. Prof. Mgr. Marek Šebela, Dr. Doc. RNDr. Lenka Luhová, Ph.D. Prof. RNDr. Ivo Frébort, Sc., Ph.D. RNDr. Ludmila Zajoncová, Ph.D. RNDr. Marek Petřivalský, Dr. 5

6 LABRATRNÍ ŘÁD 1. Student je povinen se seznámit před zahájením práce v laboratoři s laboratorním řádem, s bezpečnostními předpisy a s poskytováním první pomoci. 2. Pro získání zápočtu je nutná 100% účast na cvičení. V případě nemoci si lze cvičení nahradit v rámci zápočtového týdne (vyjímečné situace se budou řešit individuálně, př. pobyt v nemocnici). 3. Každá absence musí být omluvena. Má-li student vážné osobní důvody, pro které se nemůže zúčastnit cvičení, sdělí to vedoucímu předem. Každá zameškaná úloha musí být nahrazena. Na termínu náhradního cvičení se dohodne posluchač s vedoucím cvičení. 4. Student je povinen přicházet do laboratoře včas. 5. Student musí být na praktické cvičení teoreticky připravený. Před zahájením cvičení vyučující ověřuje znalosti studentů. Pokud student nemá dostatečné znalosti k řešení dané úlohy, cvičení vykoná v náhradním termínu. Maximální počet náhradních cvičení je Při práci v laboratoři musí mít student pracovní plášť a přezůvky. 7. Studenti pracují ve dvojicích. Před zahájením práce zkontrolují podle přiloženého seznamu pracovní stůl, na případné nesrovnalosti upozorní vyučujícího. 8. Při práci je nutné postupovat přesně podle zadané úlohy a pokynů vyučujícího. Před používáním přístrojů se musí student nejprve seznámit s jejich obsluhou. 9. Průběh práce a dosažené výsledky si každý student zaznamenává do protokolárního sešitu. Po skončení cvičení předloží výsledky k ověření vedoucímu cvičení. 10. Následující cvičení dvojice studentů, řešící spolu danou úlohu, odevzdá jeden společný protokol, který musí obsahovat: jména studentů, studijní kombinaci, datum, název úlohy, stručný princip úlohy, stručný pracovní postup, výsledky, diskusi, závěr (tabulky, grafy) a odpovědi na otázky uvedené u každé úlohy. 11. Po skončení práce je student povinen dát své pracovní místo do pořádku, řádně umýt sklo a opláchnout je destilovanou vodou. 12. Student smí opustit laboratoř až po kontrole dosažených výsledků a stavu pracovního stolu vyučujícím. 13. V laboratoři je zakázáno jíst, pít a kouřit. 14. Studenti jsou povinni dodržovat bezpečnostní předpisy. 15. Práce s jedovatými těkavými a páchnoucími látkami se provádí pouze v digestoři. 16. Zvláštní opatrnosti je třeba dbát při manipulaci s otevřeným ohněm, hořlavinami, žíravinami a jedovatými látkami. 17. Případné závady, nedostatky, nehody nebo poranění je nutné ihned hlásit vyučujícímu a v případě potřeby poskytnout okamžitě první pomoc. 6

7 BEZPEČNST PRÁE V EMIKÉ LABRATŘI Všichni studenti musí být před zahájením cvičení seznámeni a přezkoušeni ze zákona č. 356/2003 Sb. V chemické laboratoři může dojít k poranění při práci se sklem, při neopatrné manipulaci s elektrickými přístroji a zejména při práci s chemikáliemi. Aby nedocházelo k poškození zdraví, je nutné dodržovat základní zásady bezpečnosti práce: 1. Provádíme pouze práce podle pokynů vyučujícího. 2. Seznámíme se s rozmístěním hasících přístrojů a s únikovými východy z laboratoře. 3. V laboratoři nikdy nejíme, nepijeme a nekouříme. K jídlu a pití nikdy nepoužíváme chemické sklo. 4. Po skončení práce si důkladně umyjeme ruce. 5. Tašky a oblečení uložíme na vyhrazené místo mimo laboratoř. 6. Při práci v laboratoři vždy nosíme pracovní plášť a vhodnou obuv. 7. Neprovádíme samovolné opravy nebo úpravy na elektrické instalaci a přístrojích. 8. hemikálie nikdy nezkoušíme ústy a neinhalujeme výpary. 9. Nepipetujeme ústy! 10. Při práci se žíravinami a jinými nebezpečnými látkami si chráníme obličej a oči ochranným štítem, ruce gumovými rukavicemi. 11. Na pracovišti udržujeme pořádek a čistotu. Dbáme, abychom vnější stěny nádob nebo pracovní místo nepotřísnili chemikáliemi. 12. Koncentrované kyseliny a zásady ředíme tak, že kyselinu nebo zásadu lijeme tenkým proudem po tyčince do vody za současného míchání a chlazení. 13. Při provádění pokusů ve zkumavkách držíme ústí zkumavek odvrácené od obličeje (svého i spolupracovníků). 14. Při práci s hořlavinami nesmí být v blízkosti otevřený oheň. 15. Zbytky jedů likvidujeme podle pokynů vyučujícího. 16. Při práci s étherem dbáme úzkostlivě na bezpečnostní opatření (možnost vznícení i od horkých součástí). 17. V případě nehody okamžitě informujeme vyučujícího a poskytneme první pomoc. 18. Po skončení práce uzavřeme vodu a vypneme elektrické spotřebiče. 7

8 PRVNÍ PM PŘI NEDĚ 1. Při poleptání kůže silnou zásadou nebo kyselinou zasažené místo ihned důkladně omyjeme proudem vody. Při poleptání kyselinou provedeme neutralizaci roztokem hydrogenuhličitanu sodného (20 g.l -1 ), při poleptání zásadou zředěnou kyselinou octovou (5 g.l -1 ). 2. Při zasažení oka chemikálií ihned oko vypláchneme slabým proudem vody. V případě zasažení zásadou oko vypláchneme borovou vodou (roztok kyseliny borité 30 g.l -1 ), jedná-li se o kyselinu použijeme k výplachu roztok boraxu (20 g.l -1 ). V každém případě je nutné vyhledat odborné vyšetření u očního lékaře. 3. Při poleptání sliznice v ústech provedeme důkladný výplach úst vodou a následně neutralizaci výplachem kyselinou octovou (poleptání zásadou) nebo hydrogenuhličitanem sodným (poleptání kyselinou). 4. Při požití louhu se doporučuje pít zředěnou kyselinu octovou (0,5-2,0 g.l -1 ), kyseliny pijeme suspenzi oxidu hořečnatého nebo hydroxidu hlinitého ve vodě, jedů je charakter první pomoci specifický podle druhu otravy, doporučuje se vypít aspoň 0,5 L vody a vyvolat zvracení, chemikálií je nutné vyhledat odborné lékařské ošetření. 5. V případě vzplanutí hořlavých látek okamžitě vypneme elektrický proud a odstraníme všechny hořlavé látky z blízkosti požáru. ořící oděv hasíme přikrývkou nebo sprchovou vodou. Při likvidaci větších plamenů použijeme hasící přístroje. Při malých popáleninách ošetříme postižené místo mastí na spáleniny a zakryjeme sterilním obvazem. Větší popáleniny ošetří lékař. 6. Při pořezání sklem odstraníme z povrchové rány sklo, okolí otřeme zředěným peroxidem vodíku (0,9 mol.l -1 ) a ovážeme sterilním obvazem. Větší zranění ošetří lékař. 8

9 1. AMINKYSELINY 1.1. IDENTIFIKAE AMINKYSELIN TERETIKÝ ÚVD Všechny proteiny na Zemi se skládají z dvaceti základních aminokyselin, které se nazývají proteinogenní (br. 1). Jsou to, až na prolin, α aminokyseliny. Prolin obsahuje sekundární aminoskupinu a je tak vlastně α-iminokyselina. Proteinogenní aminokyseliny třídíme podle polarity postranního řetězce do tří skupin. Takovéto dělení není ani tak podstatné pro samotné aminokyseliny, ale pro charakterizaci proteinů, které jsou aminokyselinami tvořeny. ydrofobní postranní řetězce aminokyselin v proteinech odpuzují vodu a naopak hydrofilní jsou vodou solvatovány. br. 1 Vzorce proteinogenních aminokyselin. A. Nepolární N - 3 N - 3 N - Glycin (Gly, G) L-Alanin (Ala, A) L-Valin (Val, V) N N N L-Leucin (Leu, L) L- Isoleucin (Ile, I) L-Prolin (Pro, P) S N - 3 N N - N L- Methionin (Met, M) L-Fenylalanin (Phe, F) L-Tryptofan (Trp, W) 9

10 B. Polární N 2 3 N N - N 3 N L-Threonin (Thr, T) L-Asparagin (Asn, N) L-Glutamin (Gln, Q). S odštěpitelným protonem - pk a 3, 9 4, 1 8, 4-2 S KYSELÉ 3 N - 3 N - 3 N - L-Asparagová kys.(asp, D) L-Glutamová kys.(glu, E) L-ystein (ys, ) 2 10, , 7 3 N - 3 N - L-Tyrosin (Tyr, Y) L-Serin (Ser, S) 2 6, 0 12, 5 10, 5 N N N 2 N 2 2 N N 3 3 N - 3 N - 3 N - L-istidin (is, ) L-Arginin (Arg, R) L-Lysin (Lys, K) 10

11 Aminokyseliny a proteiny mají výrazné acidobazické vlastnosti. Všechny aminokyseliny mají dvě nebo tři (s postranním řetězcem odštěpujícím proton) acidobazické skupiny charakterizované hodnotami pk a. Ve fyziologickém rozmezí p jsou karboxylové i α-aminoskupiny úplně disociovány (amfoterní elektrolyty). α Aminokyselina Zkratky Symboly pk 1 (α ) pk 2 (α N 3 ) Alanin Ala A 2,35 9,87 pk R postranní řetězec Arginin Arg R 1,82 8,99 12,48 (guanidium) Asparagin Asn N 2,10 8,84 Asparagová kyselina Asp D 1,99 9,90 3,90 (β ) ystein ys 1,99 10,78 8,33 (-S) Fenylalanin Phe F 2,16 9,18 Glutamin Gln Q 2,17 9,13 Glutamová kyselina Glu E 2,10 9,17 4,07 (γ-) Glycin Gly G 2,35 9,78 istidin is 1,80 9,33 6,04 (imidazolium) Isoleucin Ile I 2,33 9,76 Leucin Leu L 2,33 9,74 Lysin Lys K 2,16 9,18 10,79 (ε-n 3 ) Methionin Met M 2,13 9,28 Prolin Pro P 2,95 10,65 Serin Ser S 2,19 9,21 Threonin Thr T 2,09 9,10 Tryptofan Trp W 2,43 9,44 Tyrosin Tyr Y 2,20 9,11 10,13 (fenolický -) Valin Val V 2,29 9,74 odnotě p, při které má molekula celkový nulový elektrický náboj, se říká izoelektrický bod, pi. Molekula nemigruje ve stejnosměrném elektrickém poli a je nejméně rozpustná. Z enderson-asselbachovy rovnice pro α-aminokyseliny vyplývá, že pi = pki pkj 2 kde K i a K j jsou disociační konstanty dvou ionizací, jejichž výsledkem je elektroneutrální forma molekuly. Pro monoaminokarboxylové kyseliny, jako alanin (Ala), K i a K j odpovídají K 1 a K 2. Pozor! Pro kyselinu asparagovou (Asp) nebo glutamovou (Glu) jsou však K i a K j rovny K 1 a K R, zatímco pro histidin (is), lysin (Lys) a arginin (Arg) je třeba dosadit hodnoty K 2 a K R. S výjimkou glycinu (Gly) jsou všechny aminokyseliny izolované z proteinů hydrolýzou opticky aktivní, to znamená, že stáčejí rovinu polarizovaného světla. Molekuly se rozdělují na pravotočivé () a levotočivé (-). Směr otáčení se zjistí polarimetrem. Míru optické aktivity molekul kvantitativně vyjadřuje specifická otáčivost: 25 ω [ α ] D = dc Index 25 odpovídá teplotě (25 o ) a index D označuje vlnovou délku monochromatického světla užívaného v polarimetrii, tzv. čáru D sodíkového spektra (589,3 nm) a ω je změřená rotace ve stupních, d je optická dráha v dm a c je koncentrace látky v g.ml -1. odnota specifické otáčivosti se mění s p. Specifická otáčivost nic neříká o skutečné (absolutní) konfiguraci. 11

12 Krokem k určení absolutní konfigurace skupin na chirálním centru bylo zavedení tzv. Fischerova pravidla. Rozmístění skupin kolem chirálního centra se připodobňuje ke konfiguraci glyceraldehydu. E. Fischer zavedl konvenci, že () a (-) stereoizomery glyceraldehydu jsou označeny jako D-glyceraldehyd a L-glyceraldehyd. U α-aminokyselin odpovídá rozmístění amino-, karboxy-, R- a skupin kolem atomu umístění hydroxylu, aldehydu, 2 a vodíku v glyceraldehydu. Tak bylo možné říci, že L-glyceraldehyd a L-aminokyseliny mají shodnou relativní konfiguraci. Všechny α-aminokyseliny obsažené v proteinech mají prostorové uspořádání L. Fischerova volba se ukázala jako správná, neboť v roce 1949 byla pomocí rentgenové strukturní analýzy potvrzena. Relativní konfigurace se tak shoduje s absolutní. Užitečný Fischerův systém nebyl zcela jednoznačný u látek s více asymetrickými centry. V roce 1956 byl zaveden Robertem ahnem, hristopherem Ingoldem a Vladimírem Prelogem nový obecnější způsob označování konfigurace. Podle něho jsou čtyři skupiny obklopující chirální centrum seřazeny podle klesající důležitosti. Substituenty s vyšším atomovým číslem jsou zařazeny před ty s nižším atomovým číslem. Pro stanovení konfigurace orientujeme chirální centrum tak, že nejméně důležitý substituent směřuje v pohledu od nás dozadu. Jestliže jsou ostatní tři skupiny, od nejdůležitější k nejméně důležité, uspořádány ve směru hodinových ručiček, označujeme konfiguraci chirálního centra jako (R ), jestliže je uspořádání proti směru pohybu hodinových ručiček, centrum asymetrie se označí (S). V tomto konceptu odpovídá L-glyceraldehydu (S)-glyceraldehyd a podobně L-alaninu, (S)-alanin. Všechny L-aminokyseliny obsažené v proteinech jsou (S)-aminokyseliny s jedinou výjimkou: L-cystein je (R)-cystein! S použitím systému (S/R) jsou dvě α aminokyseliny obsahující dvě chirální centra označeny takto: L-threonin je (2S/3R)-threonin a L-isoleucin je (2S/3S)-isoleucin. Vedle acidobazických a optických vlastností jsou některé aminokyseliny charakteristické chemickými reakcemi vedlejších řetězců, které mohou být do jisté míry využity k jejich identifikaci, případně stanovení. 1. Sakaguchiho reakce (vyslov sakagučiho). Působením alkalického bromnanu a α-naftolu na guanidinovou složku argininu (Arg) vzniká charakteristické červené zbarvení vzniklého produktu oxidace - substituovaného 1,4-naftochinonu. R N N 2 NaBr N 4 NaBr N 2 R N N 2 2. Xanthoproteinová reakce. Aromatické aminokyseliny (Tyr, Trp, slabě Phe) se lehce nitrují nitrační směsí za vzniku příslušných žlutých produktů, které v alkalickém prostředí přechází na oranžové až červené soli aciformy nitrosloučenin. N 2 2 N N 2 2 N Paulyho reakce. Reakcí tyrosinu (Tyr) a histidinu (is) s diazotovanou kyselinou sulfanilovou v alkalickém prostředí vznikají oranžové až červené kopulační produkty (azobarviva). 12

13 - 2 N S N N 3 S 3 S N N N N - 2 N 3 4. Adamkiewiczova reakce. Kondenzací tryptofanu (Trp) s kyselinou glyoxylovou v silně kyselém prostředí kyseliny sírové vzniká červenofialový produkt. Reakce je citlivá a k její realizaci stačí stopy kyseliny glyoxylové obsažené ve starší kyselině octové, kde vzniká její oxidací. N R R R R 2 N N N R = 2 (N 3 ) 5. Ninhydrinová reakce. xidačněredukční reakcí ninhydrinu (2,2-dihydroxy-1,3-indandion) s volnými amino- a imino- skupinami vznikají barevné produkty. Reakcí s primárními aminoskupinami modrofialový, který se nazývá Ruhemanova violeť (λ max = 570 nm). Reakcí s iminoskupinami, např. u prolinu (Pro) a jeho derivátů, žlutý (λ max = 440 nm). V peptidech a proteinech, kde jsou aminokyseliny vázány peptidovou vazbou, reaguje pouze volná ε aminoskupina lysinu (Lys). Pro zvýšení citlivosti reakce se přidává do reakční směsi částečně redukovaný ninhydrin zvaný hydrindantin, který reaguje s reakcí uvolněným amoniakem za výrazného prohloubení zbarvení. - R(N 3 ) 100 o N(R) - 3 ketimin 2 2 N 2 intermediální amin 2 R ninhydrin N = R aldimin hydrindantin N 3 ninhydrin N Ruhemanova violet λ max = 570 nm 13

14 6. Aminokyselina cystein (ys) a její oxidací vzniklý dimer cystin (ys-s-s-ys) působením alkálií uvolňují za tepla sulfan, který lze dokázat srážením rozpustnou olovnatou solí za vzniku černé sraženiny sulfidu olovnatého PbS. 7. Důkaz peptidové vazby. Biuretová reakce spočívá ve tvorbě fialově zbarvených měďnatých komplexů v alkalickém prostředí. Název reakce je odvozen od sloučeniny biuretu, což je produkt kondenzace dvou molekul močoviny za odštěpení amoniaku (tavení močoviny). Vzniklé seskupení 2 N--N--N 2 je modelem dvou peptidových vazeb. Vlastní fialové zbarvení komplexu (λ max = 540 nm) vzniká interakcí u 2 a čtyř dusíkatých atomů peptidových vazeb. itlivost se pohybuje v rozmezí od 200 do 2000 mg.ml -1 proteinu. Reakci poskytují všechny sloučeniny mající alespoň dvě peptidové vazby. Z aminokyselin reagují pozitivně v koncentrovaných roztocích histidin (is) a asparagin (Asn). MATERIÁL A EMIKÁLIE hemikálie: standardy aminokyselin - 2% roztoky (w/v) ve vodě, 10% hydroxid sodný, kyselina dusičná, 1% síran měďnatý, 0,5% octan olovnatý, 0,2% ninhydrin v Et, 0,2% α-naftol v Et, kyselina octová, koncentrovaná kyselina sírová, bromnan sodný, Paulyho reagens I (5% roztok dusitanu sodného ve vodě), Paulyho reagens II (900 mg kyseliny sulfanilové rozpustíme v 9 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a doplníme destilovanou vodou do 100 ml), 1,5 mol.l -1 uhličitan sodný. Materiál: stojan se zkumavkami, pipety, kahan. PRAVNÍ PSTUP hemické reakce vedlejších řetězců aminokyselin 1. Sakaguchiho reakce. K 0,5 ml roztoku argininu přidáme 3 kapky 10% hydroxidu sodného, 0,25 ml ethanolického roztoku α-naftolu a poté několik kapek bromnanu. Vznikne malinově červené zbarvení. 2. Xanthoproteinová reakce. Zahřátím 0,5 ml roztoku tyrosinu nebo tryptofanu s 0,25 ml koncentrované kyseliny dusičné vzniká žluté zbarvení, případně sraženina. Po ochlazení a zalkalizování 10% Na se barva změní na oranžovou až červenou. 3. Paulyho reakce. Ve zkumavce smícháme 0,25 ml Paulyho činidla I s 1 ml Paulyho činidla II. K 0,5 ml roztoku tyrosinu přidáme 0,25 ml reakční směsi a zalkalizujeme 1,5 mol.l -1 uhličitanem sodným. Vznikají oranžově červené kopulační produkty. 4. Adamkiewiczova reakce. Do zkumavky s 0,5 ml roztoku tryptofanu přidáme 0,25 ml kyseliny octové obsahující kyselinu glyoxylovou. Velmi opatrně v nakloněné zkumavce podvrstvíme 0,5 ml koncentrované kyseliny sírové. Po chvíli se na rozhraní obou kapalin objeví červenofialový prstenec. 5. Ninhydrinová reakce. K roztoku 0,5 ml aminokyseliny přidáme 0,3 ml roztoku ninhydrinu a povaříme. Vzniká tmavě modré zbarvení. Prolin poskytuje žluté zbarvení. 6. Důkaz síry v aminokyselinách. Do zkumavky nalijeme 0,25 ml 0,5% octanu olovnatého a 0,25 ml 10% hydroxidu sodného. Nejdříve se vytvoří jemná bílá sraženina (netřepat), kterou rozpustíme dalším přídavkem hydroxidu. Poté přidáme 0,5 ml cysteinu a směs opatrně povaříme. Přítomnost síry se projeví mírným zašednutím roztoku. 14

15 Důkaz peptidové vazby. Biuretová reakce. Reakci provedeme nejprve pro srovnání s biuretem získaným tavením močoviny. Do suché zkumavky dáme několik krystalků močoviny a zahříváme na slabém plameni, až močovina roztaje a rozkládá se za uvolnění amoniaku. Poté přerušíme zahřívání a necháme močovinu ztuhnout. Ke vzniklému biuretu přidáme asi 0,5 ml 10% Na, zamícháme a přikápneme několik kapek 1% roztoku us 4. Po protřepání se objeví charakteristické fialkové zbarvení vzniklého komplexu. Stejné zbarvení poskytují aminokyseliny histidin a asparagin, ale pouze v pevném stavu. VYDNENÍ VÝSLEDKŮ 1. Do tabulky přehledně uvedeme výsledky provedených chemických reakcí. 2. Identifikujeme složení aminokyselin v neznámém vzorku DĚLENÍ SMĚSI AMINKYSELIN MATGRAFIKÝMI METDAMI TERETIKÝ ÚVD Klasickou úlohou biochemie je dělení směsi látek. Směs aminokyselin můžeme získat např. úplnou hydrolýzou proteinů. ydrolýza se provádí v kyselém prostředí, kde dochází obvykle k destrukci tryptofanu (Trp) a z velké části serinu (Ser) a threoninu (Thr), které nelze stanovit kvantitativně. Amidy asparagin (Asn) a glutamin (Gln) se hydrolyzují na příslušné aminodikarboxylové aminokyseliny (asparagová a glutamová). V tomto případě se uvádí po rozdělení směsi např. Asx, což reprezentuje jak původní kys. asparagovou, tak asparagin. ystein se oxiduje na cystin. ydrolýza v alkalickém prostředí vede k destrukci všech aminokyselin kromě tryptofanu (Trp). Šetrná je enzymová hydrolýza při použití proteas jako např. subtilisinu (E ), papainu (E ). Téměř ve všech případech je nutným dalším krokem dělení směsi aminokyselin. Nejvhodnějšími metodami pro dělení směsi aminokyselin jsou různé typy chromatografie. lavní rozdíly mezi aminokyselinami jsou v náboji a polaritě. Tyto diference lze využít při papírové, tenkovrstvé, iontoměničové, plynové chromatografii a vysokotlaké kapalinové chromatografii (PL). Pro použití ve studentské laboratoři se jako optimální jeví chromatografie na iontoměniči s následnou identifikací aminokyselin adsorbční chromatografií na tenké vrstvě silikagelu. Principem dělení směsi aminokyselin při iontoměničové chromatografii je rozdíl v náboji jednotlivých aminokyselin. Iontoměniče jsou syntetické pryskyřice, které mají bazické (anexy) nebo kyselé (katexy) funkční skupiny. Na dělení aminokyselin se používají katexy obsahující sulfoskupiny -S 3. brázek 2 ilustruje dělení směsi aminokyselin na katexovém iontoměniči. Prezentováno je sedmnáct aminokyselin, v pořadí jak jsou příslušnými pufry eluovány z kolony. Proč ne dvacet? Směs aminokyselin na chromatogramu je výsledkem hydrolýzy typického proteinu. Za těchto podmínek se tryptofan (Trp) rozkládá a amidové vedlejší řetězce asparaginu (Asn) a glutaminu (Gln) jsou hydrolyzovány na volné karboxyly. Dalším produktem je na chromatogramu patrný amoniak. Částečně jsou rozloženy i serin (Ser) a threonin (Thr), a proto nemohou být po kyselé hydrolýze kvantifikovány. Pro rychlé určení interakce iontů s iontoměničem slouží jako pomůcka celkový náboj iontu. Pro jeho výpočet platí: p = pi kde pi je izoelektrický bod (např. aminokyseliny) a p je p použitého pufru. Když je p pozitivní, aminokyselina nese kladný náboj. Aminokyselina s vyšším p je vázána ke katexu silněji než s nižším. Když je p negativní, nese aminokyselina negativní náboj. Čím je p negativnější, tím více je aminokyselina od katexu odpuzována. - p 15

16 Jako příklad si uvedeme oddělení kyselin asparagové a glutamové. bě aminokyseliny mají při p 3,25 přibližně stejný celkový náboj. Izoelektrický bod (pi) kys. asparagové je 2,98 a kyseliny glutamové 3,22. To znamená, že při p 3,25 má kyselina asparagová efektivní náboj -0,27 a kyselina glutamová -0,03. bě aminokyseliny nesou záporný náboj. Kyselina asparagová je však daleko efektivněji odpuzována iontoměničem, než kyselina glutamová. becně se dá říci, že aminokyseliny jsou z kolony eluovány v pořadí od polárnějších k nepolárním a od nesoucích negativní náboj k těm, které mají náboj pozitivní. Jak je patrno z obrázku 3, aminokyseliny jsou eluovány změnou p pufru (od kyselých 3,25 po téměř neutrální p 6). V případě pufru o p 6 je iontová interakce mezi aminokyselinami a katexem přerušená přidáním soli do pufru (v tomto případě 0,8 mol.l -1 Nal). Vysoká koncentrace Na, na rozdíl od nízké koncentrace aminokyselin s pozitivním nábojem, je vytěsní z vazby na iontoměnič. Aminokyseliny v eluátu jsou bezbarvé. K jejich zviditelnění, případně stanovení, se využívá reakce s ninhydrinem. Identifikovat jednotlivé aminokyseliny lze použitím standardů aminokyselin, které se nanesou na kolonu a určí se objem pufru nutný k eluci (eluční objem) každé z nich. Poté porovnáme eluční objemy standardů a směsi. V našem experimentu použijeme ke zjištění přítomnosti aminokyselin v eluátech kapkové reakce s ninhydrinem a k jejich případné identifikaci papírové chromatografie. br. 2 Dělení směsi aminokyselin na katexovém iontoměniči. MATERIÁL A EMIKÁLIE hemikálie: standardy aminokyselin - 2% roztoky (w/v) v 50 mmol.l -1 citrátovém pufru p 3, směs aminokyselin v 50 mmol.l -1 citrátovém pufru p 3 (neznámý vzorek), 50 mmol.l -1 citrátové pufry p 3 a 6, 50 mmol.l -1 Tris/l pufr p 9 (Tris = Tris(hydroxymetyl)aminometan), Dowex 50 v 50 mmol.l -1 citrátovém pufru p 3 (v množství k naplnění kolonky), mobilní fáze ethanol-voda (7 : 3). Materiál: skleněná kolona s uzávěrem (25 cm), rozprašovač aerosolu, Silufol, chromatografický papír Whatman 3MM (3 x 10 cm), malá nálevka (do kolony), chromatografická nádoba se sklem na překrytí (22 x 22 cm), pipety, špičky na nanášení vzorků, zkumavky, elektrický fén, pravítko, tužka. Přístroje: sušárna. 16

17 DĚLENÍ SMĚSI AMINKYSELIN NA INTMĚNIČI PRAVNÍ PSTUP 1. Příprava kolony. Malou kolonku (20-25 cm) upevněnou vertikálně ve stojanu a dole uzavřenou kohoutem naplníme ml katexu DWEX 50 v 50 mmol.l -1 citrátovém pufru p 3. Až se katex usadí, pomalu otevřením kohoutu vypustíme nadbytečný pufr přesně po hladinu katexu. Nikdy nenechávejte sloupec katexu úplně vyschnout! br. 3 Schéma rozdělení směsi aminokyselin na iontoměniči Dowex 50. Schéma rozdělení směsi aminokyselin na iontoměniči Dowex 50 směs neznámých aminokyselin eluce citrátem, p 3,0 Dowex frakce 1-10 kyselé aminokyseliny eluce citrátem p 6,0 identifikace na Silufolu frakce neutrální aminokyseliny eluce Trisem, p 9,0 identifikace na Silufolu frakce bazické aminokyseliny identifikace na Silufolu 2. Nanesení vzorku a sbírání frakcí Připravíme si 30 zkumavek, na jejichž stěně fixem označíme obsah 1 ml (odměřením 1 ml vody). Pomocí dávkovače opatrně aplikujeme na povrch katexu vzorek 0,5 ml směsi aminokyselin. tevřením kohoutu zachytíme první frakci. Jakmile se vzorek vsákne do katexu, zavřeme kohout a přidáme na kolonu 1 ml 50 mmol.l -1 citrátového pufru p 3. Pootevřením kohoutu necháme vsáknout a jímáme další 1 ml frakci. Zavřeme kohout a přidáme 10 ml pufru, otevřeme kohout a jímáme další 1 ml frakce. Abychom zjistili, ve kterých zkumavkách jsou aminokyseliny, odebereme z každé zkumavky dvě kapky vzorku a necháme je vsáknout do filtračního papíru (3 x 10 cm), kde máme čísly označené body jako frakce. Skvrny necháme na vzduchu vyschnout a poté v digestoři postříkáme aerosolem ninhydrinového činidla a dáme do v digestoři umístěné sušárny zahřát 10 minut na 110 o. Frakce obsahující aminokyselinu se zbarví červeně. V této fázi jsou z neznámé směsi odděleny kyselé aminokyseliny. 17

18 Pokud už nejsou ve zkumavkách číslo 11 a dalších aminokyseliny, uzavřeme kohout a přidáme na kolonu 10 ml 50 mmol.l -1 citrátového pufru p 6. Pokračujeme v jímání frakcí. V této fázi by měly být odděleny neutrální aminokyseliny. Poté přidáme 10 ml 50 mmol.l -1 Tris/l pufru p 9 a jímáme další frakce, které obsahují bazické aminokyseliny DĚLENÍ SMĚSI AMINKYSELIN RMATGRAFIÍ NA TENKÉ VRSTVĚ SILIKAGELU PRAVNÍ PSTUP hromatografii na silikagelu uskutečníme v provedení na tenké vrstvě na hliníkové folii zvané Silufol (5 x 15 cm). Jedná se o chromatografii adsorpční. Na Silufolu vyznačíme jemně slabou čáru tužkou 2,5 cm od okraje (start). Výběr aplikovaných vzorků učiníme na základě konzultace s vedoucím cvičení. Vzorky nanášíme jemnou kapilárou (každý 3-4 na stejné místo, skvrnu vždy před dalším nanesením vysušíme pomocí fénu). Skvrny vzorků nesmí být v průměru větší než 3-5 mm. Folii vložíme do chromatografické komůrky s rozdělovací směsí (mobilní fáze) tak, aby mobilní fáze vstupovala na fólii u startu. Čelo mobilní fáze se asi po 45 minutách dostane 2 cm od konce folie. Poté fólii vyjmeme, vysušíme na vzduchu nebo opatrně fénem, postříkáme aerosolem ninhydrinového činidla a zahřejeme v sušárně 10 minut na 110 o (vše v digestoři). VYDNENÍ VÝSLEDKŮ 1. Do tabulky zapíšeme hodnoty R f standardních aminokyselin. U každé z nich změříme délku dráhy skvrny od startu a pro všechny délku dráhy mobilní fáze (start - čelo). odnota R f je bezrozměrný podíl dráhy skvrny k dráze mobilní fáze. 2. Vypočteme hodnoty R f neznámých aminokyselin ze směsi. 3. Porovnáme a zaznamenáme barvu skvrn. 4. U aminokyselin, pro které existují specifické chemické reakce, potvrdíme jejich identitu. KNTRLNÍ TÁZKY 1. Napište iontové formy lysinu, které mohou existovat ve vodném roztoku při p 2, 5, a Jaké bude relativní pořadí hodnot R f aminokyselin směsi: Ser, Lys, Leu, Val, a Ala? Podmínky dělení budou stejné jako u experimentu s dělením směsi aminokyselin na Silufolu. 3. Vypočtěte celkový náboj každé z aminokyselin při daném p: Ala p 3, Asp p 4, Lys p 8, Ser p 6, is p Jaké bude pořadí eluce směsi aminokyselin z kolony katexu za stejných podmínek jako v experimentu: Glu, Ala, Ser, Pro a Arg? LITERATURA Berg J.M., Tymoczko J.L. a Stryer L. (2002) Biochemistry (5. vydání), W.. Freeman (New York). Macholán L., Skurský L. a Zbořil P. (1980) Skripta Laboratorní cvičení z biochemie I, vydavatelství UJEP (Brno). Zbořil P., Macholán L., Dadák V., Skurský L. a Kovář J. (1978) Skripta Pokročilá cvičení z biochemie, vydavatelství UJEP (Brno). Stryer L. (1981) Biochemistry, 2. vydání, W.. Freeman and ompany (New York). 18

19 2. PRTEINY 2.1. STANVENÍ ELKVÝ PRTEINŮ TERETIKÝ ÚVD Pro kvantifikaci celkových proteinů existuje celá řada metod (Tab. 1). Základním problémem je výběr nejvhodnější metody pro daný případ. Vhodnou strategií je kombinovat dvě metody založené na různých chemických principech, jako např. měření absorbance při 280 nm a tvorbu měďnatých komplexů. Metody stanovení celkových proteinů můžeme rozdělit do pěti skupin: 1. Metody založené na interakci proteinů s ionty mědi a) Biuretová metoda, b) artree Lowryho metoda, c) Bicinchoninová metoda. 2. Ninhydrinová metoda po kyselé hydrolýze proteinů. 3. Stanovení z UV spektra. 4. Metoda Bradfordové s vazbou barviva oomassie modř na proteiny. 5. Stanovení celkových proteinů ze sušiny. Biuretová metoda Metoda je založena na chelataci měďnatého iontu imidovými strukturami polypeptidu ionizovanými v silně alkalickém prostředí za vzniku červeno-fialového komplexu. Je pojmenována podle sloučeniny biuretu, vznikajícího tavením močoviny za odštěpení amoniaku, která je modelem dvou peptidových vazeb a vytváří za těchto podmínek barevný komplex s mědí. Se stanovením interferuje glukosa a jiné měď redukující látky jako např. proteiny bohaté na sulfhydrylové skupiny (keratin). Taktéž interferují vysoké koncentrace amonných solí a některé fosfáty užívané při purifikaci proteinů. Biuretová metoda je vhodná pro vzorky obsahující protein v koncentraci 1 až 10 mg.ml -1, které se ředí zhruba 5 x přidáním činidla na konečnou koncentraci proteinu 0,2 až 2 mg.ml -1. Většina proteinů poskytuje tmavě červené zbarvení s maximem absorbance při 550 nm. artree Lowryho metoda Původní Lowryho metoda z roku 1951 patří k nejcitovanějším pracem v biochemii. Stanovení je kolorimetrické, založené na dvousložkovém činidle. První složkou je biuretové činidlo (viz biuretová metoda), druhou složkou je Folin-iocalteau (čti Folin-Čikoltovo činidlo) na fenoly. Jsou to polykyseliny fosfomolybdenové a fosfowolframové, které se redukují tyrosinovými zbytky proteinů a barví se modře. Metoda byla mnohokrát upravena. Prezentované stanovení je modifikace, kterou vypracoval artree v roce Verze využívá tři činidla, z nichž první dvě jsou pro biuretové stanovení, namísto původních pěti. Dochází k tvorbě daleko intenzivnějšího zbarvení (zvýšená citlivost) a stanovení je lineární v širším rozsahu koncentrací. Konečně, činidla jsou stabilnější a metoda méně pracná. Bicinchoninová metoda (BA metoda) Metoda využívá kyseliny bicinchoninové (BA) ke spektrofotometrickému stanovení celkových proteinů založeném na alkalické redukci měďnatého iontu na měďný proteinem a následné chelataci měďného iontu kyselinou bicinchoninovou za vzniku červeného zbarvení. silná báze BA činidlo Protein u 2 u BA u komplex 19

20 Bicinchoninová metoda je variabilní. Její citlivost je závislá na době a teplotě inkubace, na charakteru proteinu použitého k standardizaci atd. Některé skupiny látek jako např. redukující sacharidy a amonné ionty interferují velmi silně. Pokud jsou však odstraněny (např. dialýzou), je metoda srovnatelná s metodou Lowryho. Ninhydrinová metoda po kyselé hydrolýze proteinů Při tomto stanovení jsou proteiny hydrolyzovány na aminokyseliny 6% kyselinou sírovou při 100. ydrolyzáty jsou neutralizovány a aminokyseliny kvantifikovány derivatizací ninhydrinem a měřením absorbance při 570 nm. Při stanovení neinterferují fenoly a podobné sloučeniny jako při stanovení Folinovým činidlem. Jednotlivé aminokyseliny při reakci s ninhydrinem neposkytují stejný barevný výtěžek. Většina proteinů, kromě těch, které mají neobvyklé složení, jako je např. vysoký obsah hydroxyprolinu a prolinu (kolageny), vysoký obsah síry (cystein; např. alkoholdehydrogenasa, thionein), nebo hustě glykosylované proteiny (např. invertasa a glykoforin) poskytuje uspokojivé výsledky při použití leucinu jako kalibračního standardu. Amonné ionty se ninhydrinem silně barví, přibližně stejně jako leucin. Pokud se před hydrolýzou proteiny vysráží kyselinou trichloroctovou, amonné ionty zůstanou v supernatantu. Metoda je časově náročná. svědčuje se při stanovení proteinů v pevném a suchém materiálu, který lze získat z rostlin. Výhodou je také to, že při stanovení neinterferují báze nukleových kyselin. Stanovení z UV spektra Proteiny, obsahující vedlejší řetězce tyrosinu a tryptofanu, absorbují světlo v UV oblasti spektra při 275 až 280 nm. Při vhodném naředění proteinového vzorku je možné takto stanovit celkové proteiny z UV absorbance za použití kyvet z křemenného skla. Fenylalanin absorbuje slabě a jeho absorbanci je možné v řadě případů zanedbat. Absorpční koeficient vztažený na hmotnost proteinu A 1% (koncentrace suchého proteinu v gramech na objem 100 ml nebo hmotnost/objem. procento) se pohybuje mezi 3-30 A 280 jednotek 100 ml.g -1.cm -1 u většiny proteinů. Pokud je známa molekulová hmotnost proteinu, molární absorpční koeficient ε λ L.mol -1.cm -1, potom existuje rovnice, která upravuje vztah k hodnotě A 1% při stejné vlnové délce. 10 x ε λ = A λ 1% x molekulová hmotnost Molární absorpční koeficient může být vypočten z aminokyselinového složení založeném na tyrosinovém a tryptofanovém příspěvku molekuly proteinu. odnoty ε tyrosinu (v neutrálním nebo kyselém roztoku) a tryptofanu jsou 1470 respektive 5700 L.mol -1.cm -1. Například 0,04% až 0,12% roztok proteinu obsahuje 4 až 12 tyrosinů, 2 až 6 tryptofanů a při ε 280 ~ 8, by A 280 = 0,2-1 v 1-cm kyvetě. Metoda je v tomto případě dostatečně citlivá pro stanovení čistých proteinů nebo jejich směsí v koncentračním rozsahu 0,1-1 mg.ml -1. Existuje řada dalších metod spojených s měřením v UV oblasti spektra, jako je absorpce při 205 nm a 224 až 236 nm. Zvláště stanovení spojené s měřením při 205 nm je atraktivní, ale provedeno pouze s čistými proteiny a za vyloučení kyslíku z reakční směsi. Navíc v této oblasti absorbuje velká spousta dalších látek, jako např. některé kofaktory. Proteiny, které vykazují absorpční maximum při 280 nm, se často nacházejí ve směsích s nukleovými kyselinami, které absorbují při stejné vlnové délce. Poměr absorbancí 280/260 nm se používá k eliminaci nukleových kyselin. Proteiny také absorbují při kratších vlnových délkách pod 240 nm, což je způsobeno přítomností Trp, Tyr, Phe, is, Met, ys a peptidových vazeb. Při kratších vlnových délkách je absorbance různých proteinů méně závislá na aminokyselinovém složení a je podstatně vyšší. Absorbance při 205 nm je z větší části způsobena peptidovými vazbami. 20