MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie IZOLACE DNA: VÝTĚŽNOST A KVALITA Bakalářská práce Autor práce: Jana Janochová Vedoucí práce: doc. RNDr. Omar Šerý, Ph.D. Odborný konzultant: Mgr. Lukáš Častulík Brno 2009

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe svou bakalářskou práci na téma Izolace DNA: výtěţnost a kvalita jsem vypracovala samostatně pod odborným vedením doc. RNDr. Omara Šerého a s pouţitím uvedené literatury. V Brně dne 2

3 PODĚKOVÁNÍ Děkuji svému vedoucímu doc. RNDr. Omaru Šerému a také Mgr. Lukášovi Častulíkovi za věnovaný čas a cenné připomínky. Děkuji také své rodině a svému příteli za podporu, trpělivost a pochopení. 3

4 OBSAH 1. ÚVOD IZOLACE DNA OBECNÝ POSTUP A PRVNÍ KROKY IZOLACE JEDNODUCHÉ SEPARAČNÍ TECHNIKY VSOLOVÁNÍ A VYSOLOVÁNÍ SRÁŢENÍ ORGANICKÝMI ROZPOUŠTĚDLY MODERNÍ SEPARAČNÍ TECHNIKY FENOL-CHLOROFORMOVÁ EXTRAKCE Lýza pomocí detergentů Izolace plazmidové DNA Štěpení proteinů Chelatační činidla RNáza Extrakce směsí fenol-chloroform Ethanolové sráţení Postup Shrnutí RESIN Iontová výměna Iontoměniče Provedení Postup Shrnutí SILIKA KOLONKY Silikagel Silikové částice Mechanismus vazby a uvolňování Postup Shrnutí MAGNETICKÉ ČÁSTICE Nosiče cílových molekul Příprava magnetit/silikagelových částic Mechanismus vazby a uvolňování Postup Automatizace metody Shrnutí CÍL PRÁCE MATERIÁL A METODY ODBĚR VZORKŮ Sušení vzorků KULTIVACE KVASINEK Příprava ţivné půdy Převedení vzorku do roztoku Kultivace Počítání kolonií IZOLACE DNA KONTROLA ČISTOTY A KONCENTRACE VÝSLEDKY A DISKUSE SOUHRN LITERATURA

5 1. ÚVOD Nejobvyklejším zdrojem lidské DNA je krev. Uskutečnit odběr krve v klinické praxi není problém; existují ale situace, kdy je třeba získat DNA neinvazivním způsobem. K tomu slouţí například tampóny vyráběné speciálně pro tento účel. Pouţívají se pro odběr DNA z bukání sliznice například při určování otcovství - v takovémto případě se vzorek odebírá samotným zájemcem o test v domácím prostředí. Tampóny se mohou pouţívat i pro odběr v oblastech, kde odběr krve vylučují hygienické podmínky. V obou případech pak musí být vzorek uchováván v neprodyšném obalu aţ do okamţiku analýzy. Při samotné analýze se ale vědečtí pracovníci občas setkávají s tím, ţe jsou ve vzorku přítomny inhibitory PCR v takové koncentraci, ţe reakce neprobíhá. Jednou z moţných příčin inhibice PCR reakce by mohly být polysacharidy mikroorganismů, které jsou součástí ústní mikroflóry. 5

6 TEORETICKÁ ČÁST 6

7 2. IZOLACE DNA Separace je prvním nezbytným krokem k získávání informací o DNA. Při izolaci DNA musíme brát v úvahu podobnost DNA s ostatními biopolymery, a proto musíme vybírat metody s vysokou selektivitou (Anzenbacher a Kovář 1986). DNA bývá ve vzorcích obsaţena v poměrně malých mnoţstvích, proto musíme dbát i na citlivost vybrané metody. Musíme uvaţovat i nestabilitu DNA a tedy zachovávat mírné podmínky tak, aby pokud moţno co nejvíce odpovídaly fyziologickým hodnotám a nedocházelo tak k degradaci molekul, hlavně co se týče ph, teploty a pouţitých rozpouštědel. Při izolaci nukleové kyseliny je třeba volit metodu v závislosti na poţadované čistotě a mnoţství finální nukleové kyseliny a na typu buněk, z nichţ má být nukleová kyselina izolována (Raška 2006). V neposlední řadě je třeba zohlednit i časovou náročnost izolačního procesu a celkovou ekonomii. Výběr separační techniky je tedy určitým kompromisem mezi čistotou a výtěţkem, časovou náročností a ekonomikou, a tak při výběru metody musíme vycházet z poţadovaných charakteristik získávané DNA a postupovat pro kaţdý typ vzorku individuálně. Získanou DNA je moţno dále přečisťovat opětovnými aplikacemi separačních procesů nebo jejich kombinací OBECNÝ POSTUP A PRVNÍ KROKY IZOLACE Ve většině případů izolujeme DNA, která je přítomna v nitrobuněčném obsahu. Pokud se ve vzorku nachází více druhů buněk (např. různých rostlinných nebo ţivočišných druhů), je moţno tyto druhy od sebe oddělit, nejčastěji centrifugací. Pak lze izolovat DNA pouze určitého druhu (Anzenbacher a Kovář 1986). Pokud je předmětem zájmu DNA obsaţená v určité buněčné organele, je nutno před samotným izolačním procesem separovat z buněčného obsahu dané organely. K uvolnění buněčného obsahu se pouţívají detergenty, které rozrušují membrány. Detergenty mohou být iontové povahy, nejčastěji SDS (dodecylsulfát sodný) nebo soli ţlučových kyselin, druhou variantou jsou neionogenní (nenabité) detergenty, např. 7

8 Triton X100. Jinou moţností je pouţití různých fyzikálních nebo fyzikálně-chemických postupů, jako je rozrušení membrán ultrazvukem. V následujícím kroku je třeba oddělit izolovanou látku z roztoku buněčného obsahu. Toho lze docílit dočasnou denaturací. Pouţít můţeme teplotní denaturaci, techniku vsolování a vysolování nebo sráţení organickými rozpouštědly. Odstranění RNA Vzhledem k tomu, ţe RNA a DNA mají velice podobné vlastnosti, získává se snadno směs těchto dvou látek. Odstranění RNA lze ovšem provést velmi snadno přidáním enzymu ribonukleázy (RNázy), která specificky štěpí RNA na směs oligonukleotidů, aniţ by degradovala molekulu DNA. 8

9 3. JEDNODUCHÉ SEPARAČNÍ TECHNIKY 3.1. VSOLOVÁNÍ A VYSOLOVÁNÍ Technika vsolování a vysolování je zaloţena na změně rozpustnosti molekul DNA v závislosti na změně koncentrace iontů v roztoku, a to tak, ţe s rostoucí koncentrací iontů rozpustnost nejprve roste (DNA se do roztoku vsoluje) a po dosaţení maxima rozpustnost molekuly klesá a tím se DNA z roztoku vysoluje (Anzenbacher a Kovář 1986). Princip této metody spočívá v nutnosti zachování součinu rozpustnosti. Ionizované skupiny molekuly DNA interagují s ionty v roztoku, a tím se oslabují intramolekulární iontové vazby DNA a molekula se vsoluje do roztoku. Při dosaţení určité koncentrace iontů ale dochází k tomu, ţe ionty svou početností začínají konkurovat molekulám vody, které způsobují samotnou rozpustnost molekul DNA, a tak při vysokých koncentracích iontů dochází k postupnému vysolování v důsledku nedostatečných interakcí s molekulami rozpouštědla. Nejčastěji se pouţívá síran amonný kvůli jeho malým denaturační účinkům. K izolaci nukleových kyselin je vhodná koncentrace asi 30% mnoţství potřebného ke vzniku nasyceného roztoku, vyšší obsah vede k nechtěnému sráţení proteinů SRÁŢENÍ ORGANICKÝMI ROZPOUŠTĚDLY Sráţení organickými rozpouštědly je zaloţeno na jejich schopnosti sníţit dielektrickou konstantu prostředí. Tím se zvyšují intramolekulární elektrostatické interakce nabitých skupin a tedy dochází ke sniţování rozpustnosti. Nejznámější je pouţití ethanolu, tzv. etanolové sráţení. V současné době je ale ethanol nahrazován šetrnějšími organickými rozpouštědly, jako je PEG (polyethylenglykol). 9

10 4. MODERNÍ SEPARAČNÍ TECHNIKY 4.1. FENOL-CHLOROFORMOVÁ EXTRAKCE Fenol-chloroformová extrakce je poměrně stará, ale přesto stále často pouţívaná metoda, kterou publikovali uţ v roce 1987 Chomczynski a Sacchi. Vychází z oddělení vodné fáze a roztoku obsahujícího fenol a chloroform centrifugací a z rozdělení buněčných sloţek (DNA, RNA a proteinů) mezi tyto fáze na základě jejich hydrofilních, resp. hydrofobních vlastností. Denaturované proteiny tvoří prstenec mezi oběma fázemi. Dalším postupem je odebrání poţadované fáze a sráţení nukleové kyseliny, separace peletu, promývaní a případné rozpuštění poţadované nukleové kyseliny Lýza pomocí detergentů Prvním krokem fenol-chloroformové extrakce je lýza buněk pomocí detergentů nebo fyzikálně-chemickými neenzymatickými postupy. Tím se uvolní genetický materiál do roztoku. Buněčné membrány jsou rozrušeny a přítomné proteiny denaturují přídavkem ionogenních detergentů, kterými jsou nejčastěji SDS (dodecylsulfát sodný), guanidinium hydrochlorid, nebo sarcosyl. Z neionogenních např. NP-40 (Triton X100) umoţní rozpustit buněčnou membránu při zachování jaderné membrány, coţ je jeden ze způsobů, jak separovat jadernou DNA od plazmidové (Raška 2006) Izolace plazmidové DNA Jiným způsobem získání plazmidové DNA je pouţití alkalické lýzy pomocí NaOH v přítomnosti detergentu (SDS). Chromozomální DNA je při lýze fragmentována na lineární molekuly, zatímco plazmidová DNA, která má podstatně menší velikost, si zachová kruţnicovitou formu. V roztoku je ph okolo 12. To vede k uvolňování vodíkových vazeb mezi řetězci DNA a vznikají jednovláknové molekuly. K neutralizaci se pouţívá octan sodný. Dochází k renaturaci, která je ovšem uţ specifickým krokem. Plazmidová DNA renaturuje a vrací se do původní dvouvláknové 10

11 formy, zatímco lineární molekuly chromozomální DNA nejsou schopny tak rychle renaturovat, a proto agregují s jinými sloţkami lyzátu. Tyto sraţeniny se odstraní z roztoku centrifugací (Rumlová a spol. 2003) Štěpení proteinů K rozpadu buňky přispívá nespecifické enzymatické štěpení proteinů. Zároveň je nutné degradovat proteiny kvůli jejich časté enzymatické aktivitě účinky nukleáz, které mohou degradovat izolovanou nukleovou kyselinu, jsou pochopitelně neţádoucí. Pouţívá se proteinkináza A (z Tritirachium album) nebo pronáza E (ze Streptomyces griseus), která je levnější, ale můţe obsahovat stopy nukleáz Chelatační činidla Důleţitá je i přítomnost chelatačních činidel (nejpouţívanější je EDTA - kyselina ethylendiamintetraoctová), které z roztoku vychytávají dvojmocné ionty, jeţ jsou nezbytnými kofaktory pro činnost DNáz, které se běţně vyskytují v buňce kvůli nutným úpravám DNA (Raška 2006) RNáza K odstranění RNA slouţí pankreatická RNáza. Tento enzym je velmi stabilní a navíc nevyţaduje pro svoji činnost přítomnost dvojmocných iontů. Abychom zabránili tomu, ţe bude RNáza rozloţena nespecifickými proteinázami, stačí před přidáním RNázy do roztoku přítomné proteinázy inaktivovat krátkým zahřátím Extrakce směsí fenol-chloroform K samotné separaci DNA, RNA nebo proteinů dochází díky směsi fenolu a chloroformu v poměru 1:1. Chloroform je organické rozpouštědlo a je tedy nemísitelný s vodou, a proto po jejich přídavku dochází k vytvoření dvou fází: horní vodné a dolní 11

12 organické. Protoţe isoamylalkohol zvyšuje rozpustnost fenolu v chloroformu, lze pouţít směs fenol:chloroform:isoamylalkohol v objemovém poměru 25:24:1. Tato směs se pouţívá proto, ţe tak zle po extrakci získat vodnou fázi s malou kontaminací fenolem, který vykazuje nevhodné vlastnosti pro další zpracování DNA, jako jsou jeho inhibiční vlastnosti. Roztok fenolu musí vykazovat vysokou čistotu. Aby se zamezilo výskytu kontaminantů vzniklých jeho oxidací, lze připravit roztok s přídavkem hydroxychinolinu. Velice významnou roli hraje i ph připraveného fenolu. Pokud chceme izolovat pouze DNA, je nutné sytit roztok neutrálním pufrem. Pokud bychom chtěli izolovat RNA, je vhodné ph naopak sníţit buď sycením kyselým pufrem nebo pouze saturací vodou, protoţe fenol sám o sobě je kyselý. Při neutrálním ph zůstávají veškeré nukleové kyseliny rozpuštěné ve vodné fázi, zatímco při kyselém ph (<4) je DNA ve vodě nerozpustná a ve vodné fázi zůstává pouze RNA (Raška 2006). Protřepáváním vodného roztoku lyzátu a směsi fenolu s chloroformem dochází k mísení fází a fenol tak můţe sráţet proteiny přítomné ve vodné fázi. Oddělení fází docílíme centrifugací. Výsledkem je rozdělení na dolní organickou a horní vodní fázi (kde je přítomna DNA), přičemţ na rozhraní se utváří bílý prstenec vysráţených proteinů. Aby bylo zajištěno dokonalé odstranění proteinů z roztoku, je moţné s vodnou fází opakovat postup extrakce tak dlouho, dokud se bílý prstenec proteinů nepřestane vytvářet. Nakonec je třeba ještě zbavit roztok zbytků fenolu, a proto se provádí poslední extrakce se směsí chloroform-isoamylalkohol Ethanolové sráţení DNA je ve vodném roztoku rozpuštěna díky iontovým interakcím mezi polárními molekulami vody a fosfátovými anionty přítomnými v molekule dvoušroubovice. Ethanol ale není tak polární jako voda, a proto dochází k zeslabování iontových interakcí mezi rozpouštědlem a molekulou DNA. Pokud jsou v roztoku přítomny jednovazné kationty, dojde k úplnému přerušení interakcí mezi rozpouštědlem a fosfátovými skupinami, na které se naváţí kationty. Nejčastěji pouţívanými kationty jsou Na +, NH + 4 a Li +, přičemţ koncentrace ethanolu musí být alespoň 64%. 12

13 K vysráţení DNA z přečištěného roztoku se pouţívá koncentrovaný ethanol (popřípadě isopropanol). Sráţení se provádí při nízké teplotě (-20 C) k zamezení degradace molekul DNA. Ke zvýšení výtěţku lze pouţít jako spolusráţedlo neutrální molekulu (např. kvasinkovou trna, polyakrylamid nebo glykogen). Na druhou stranu lze pouţít i sráţení při zvýšené teplotě, coţ nám umoţní sráţet DNA, aniţ by se vysráţela RNA. Optimální doba inkubace závisí na délce a koncentraci DNA. Malé fragmenty a niţší koncentrace vyţadují delší dobu k dosaţení stejných výteţků. Pro velmi krátké fragmenty a nízké koncentrace se doporučuje inkubace přes noc. Po odstředění lze DNA spatřovat jako mléčně zabarvený sediment neboli pelet. Bílé zbarvení je dáno přítomností solí, které se vysráţely spolu s DNA. Soli můţeme odstranit promytím 70% ethanolem. Tím uţ získáme čistou DNA. Supernatant je následně odstraněn a pelet je rozpuštěn ve vodě nebo vodném pufru. Alternativou k tomuto postupu je extrahovat s DNA zároveň i RNA a RNázu přidat aţ v tomto okamţiku. Pak je ale nutné provádět opět přečištění fenol-chloroformovou extrakcí a sráţení DNA ethanolem, a proto se to jeví jako nevýhodné Postup Principiálně byl postup fenol-chloroformové extrakce popsán jiţ výše. Zde bude uveden protokol pro izolaci genomové DNA z grampozitivních a gramnegativních bakterií (Rapley 2000), protokol pro izolaci genomové a mitochondriální DNA z hub (Rapley 2000) a protokol pro získání DNA (vhodné kvality i přiměřeného mnoţství) z tkání, které byly naloţené ve formalínu a uloţeny pod parafínem (Shang-Rong a spol. 2002). Rapleyho protokol uvádí jediný rozdíl mezi izolací DNA z grampozitivních a gramnegativních bakterií, a tím je jeden přidaný lyzační stupeň u grampozitivních bakterií, které ve své buněčné stěně mají vysoký obsah polysacharidů. Proto se do směsi přidává směs lysozymu a lysostafinu. Jinak je proces stejný a zahrnuje tedy rozsuspendování bakterilního peletu v TE pufru, přidání SDS a proteinkinázy K a u G+ bakterií na tomto místě směs lysozymu a lysostafinu. Roztok je inkubován 1 hodinu při 37 C. K roztoku je přidán chlorid sodný, roztok CTAB (hexadecyltrimethyl amonium bromid) /NaCl a následuje inkubace. Poté se přidá směs chloroform-isoamylalkohol a 13

14 roztok se centrifuguje. Viskózní vodná fáze se přemístí do nové zkumavky a provede se extrakce směsí fenol-chloroform-isoamylalkohol. Po centrifugaci je supernatant přemístěn do nové zkumavky a je přidán isopropanol, který vysráţí nukleové kyseliny. Po centrifugaci je supernatant odstraněn a DNA je promývána 70% ethanolem a opět zcentrifugována. Supernatant je odstraněn, pelet vysušen a rozpuštěn v TE pufru. Rapley dále uvádí protokol modifikovaný přídavkem merkaptoethanolu k prášku mycelia. Po inkubaci se přidává směs chloroform-isoamylalkohol a roztok se centrifuguje. Vodná fáze se přemístí do nové zkumavky a po přídavku isopropanolu se opakuje centrifugace s následným odstraněním supernatantu. Pelet je rozpuštěn ve vodě a do roztoku je přidána RNáza. DNA se extrahuje pomocí směsi fenol-chloroformisoamylalkohol, roztok je centrifugován. K vodné fázi je přidána směs chloroformisoamylalkohol, opakuje se centrifugace. K sráţení DNA z roztoku se přidává octan sodný a 100% ethanol. Pelet, který získáme centrifugací a odstraněním supernatantu, je promyt 70% ethanolem. Roztok centrifugujeme a odebráním supernatantu je izolována DNA, která je rozpuštěna v 70% ethanolu. Tento protokol vede k získání DNA z hub, a to jak geonomové DNA, tak i modifikovaný postup pro izolaci mitochondriální DNA. Při extrakci geonomové DNA vychází buď z klasického postupu, který vyuţívá pouze extrakční pufr, RNázu, fenol, chloroform, isopropanol a ethanol, nebo protokol modifikuje přídavkem CTAB pufru a β-merkaptoethanolu v TE pufru. Pro získání mitochondriální DNA vychází Rapley z klasického protokolu (extrakční pufr, fenol, chloroform-isoamylalkohol, centrifugace a rozpuštění v TE pufru). Získaný roztok DNA vstupuje do purifikace v gradientu chloridu cesného. Shan-Rong a spol. se zaměřil na izolaci DNA z archivovaných vzorků tkání, které jsou hojně vyuţívány např. při studiu rakoviny nebo jiných nemocí. Tyto tkáně jsou uchovávány ve formalínu a uloţeny pod parafinem. Mnohé z nedávných studií poukazovaly na moţnost, ţe začlenění kroku, ve kterém bude vzorek zahříván na vysokou teplotu, vede při fenol-chloroformové extrakci ke zvýšeným výtěţkům DNA. Shang-Rong proto provedl ucelenou studii, ve které zkoumal nejen vliv teploty, ale i vliv ph na mnoţství získané DNA, ale i její vlastnosti důleţité pro následnou PCR analýzu a PCR v reálném čase. K prozkoumání byly vybrány teploty 80, 100 a 120 C a rozmezí ph

15 Odstranění parafinu bylo provedeno přidáním xylenu, 100% a 75% ethanolu, vzorek byl promyt PBS a byl přidán extrakční pufr a proteinkináza K. Následovala extrakce směsí fenol-chloroform-isoamylalkohol, centrifugace, odebrání vodného supernatantu, přidání chloroformu, opět centrifugace. K vodnému supernatantu byl přidán octan sodný a isopropanol a směs byla inkubována přes noc. Po centrifugaci byl odstraněn supernatant a vysráţená DNA byla promyta 75% ethanolem. Roztok byl zcentrifugován a získaná DNA byla rozpuštěna v destilované vodě. Bylo zjištěno, ţe výtěţky byly při začlenění zahřátí do procesu izolace niţší. Na druhou stranu pro klasickou PCR byly vhodnější vzorky DNA získané za pouţití vyšší teploty a vyššího ph, pro PCR v reálném čase se nejvhodněji jevila také vyšší teplota a ph optimum bylo stanoveno na hodnotu Shrnutí Extrakce směsí fenol-chloroform je poměrně časově náročná vzhledem ke stále se opakujícím centrifugacím, sráţení, zdlouhavému čištění a postupnému přidávání činidel. Získané výsledky jsou závislé na přesnosti provedení, tedy velkou roli hraje lidský faktor. Přes veškerou snahu a precisní práci není výjimkou, ţe získaná DNA je znečištěna RNA nebo proteiny. Tato DNA se samozřejmě můţe ještě dál přečišťovat, ale časová náročnost je uţ značná. Jedinou moţnou automatizací této metody je zakoupení hotových směsí a pufrů. Tím se částečně odbourá přidávání jednotlivých činidel a pracovní čas se tak zkrátí. Přes to všechno je fenol-chloroformová extrakce stále hodně rozšířená. Její hlavní výhoda leţí v oblasti financí moderní metody a komerční kity jsou pro spoustu pracovišť nepřiměřeně drahé a mnohdy ani není třeba získávat DNA tak vysoké kvality. To se netýká jen čistoty získané DNA, ale i velikosti jejích molekul. Obecně lze říci, ţe tato extrakce poskytuje spíš fragmenty DNA a získat vysokomolekulovou DNA touto metodou je obtíţné. Tato metoda navíc vyţaduje práci s organickými rozpouštědly a s fenolem, který je schopen při styku s kůţí způsobit její poškození. Fenol-chloroformová extrakce je tedy stále vyuţívána hlavně tehdy, kdyţ je třeba zohlednit finanční stránku věci, není zapotřebí vysokomolekulová DNA, nevadí časová náročnost a jsou potřeba vyšší výtěţky DNA, neţ jsou schopny poskytnout komerčně dostupné kity. 15

16 4.2. RESIN Resin (z anglického resin = pryskyřice) je označení pro skupinu metod, které k vázání a následnému uvolňování poţadovaného materiálu vyuţívají iontové výměny. Vyuţívají se různé druhy iontoměničů obecně je lze ale rozdělit na katexy a anexy. Stejně tak i pouţívanými technikami jsou v podstatě dva typy. Jeden pouţívá drobné resinové částice v roztoku, druhý je inkorporuje do membrány. Základem postupu je lyze buněk, interakce a navázání DNA na resinový iontoměnič. Podle druhu techniky následuje filtrace nebo centrifugace. DNA je posléze z resinu uvolněna a uskladněna ve vhodném prostředí. Obr.1: Struktura resinu Qiagen Obr.2: Vazebné principy resinu Qiagen Iontová výměna Dávno před tím, neţ se začala iontová výměna vyuţívat k izolaci biologického materiálu, byla hojně zastoupena mezi anorganickými separačními technikami. Vědeckými pozorovateli, kteří v roce 1906 jako první publikovali svůj výzkum ohledně iontové výměny, byli Thomas a Way (McGarvey). Zprvu byli pouţívány přírodní materiály jako sulfonované uhlí nebo rozsivková zemina, ve čtyřicátých letech minulého století však byly objeveny organické iontoměniče a to vedlo aţ k zavedení moderních iontově výměnných resinů. Iontová výměna můţe být nejlépe popsána jako výměna iontů mezi pevnou fází a kapalinou obklopující pevnou fázi. Zpočátku byla iontová výměna vázána na celistvý 16

17 reakční povrch, ale to bylo postupně nahrazeno strukturami gelového typu, kde se výměna iontů odehrává na jednotlivých částicích. Obr.3: Zobrazení kompetice mezi ionty s různou afinitou Vazebná místa vykazují pro určité ionty různě vysokou afinitu. Toho je vyuţíváno k odstranění navázaného materiálu. Bylo zjištěno, ţe vícevazné ionty vykazují vyšší afinitu neţ ionty s niţším nábojem. U iontů, které mají stejný náboj, se váţe silněji prvek s vyšší atomovou hmotností. Afinitní vztahy mohou být vyjádřeny i pomocí rovnováţných konstant, tedy podle toho, jak je ion stabilní v komplexu s iontoměničem a jak ve volném stavu Iontoměniče Podle povahy přenášeného iontu rozdělujeme iontoměniče na ty, které přenášejí kationty (katexy) a na ty, které přenášejí anionty (anexy). Pro izolaci DNA lze vyuţít oba systémy. Katexy jsou většinou tvořeny vlákny organického polymeru, na které jsou hojně vázány -SO 3 H nebo -COOH skupiny. Při reakci dochází k uvolnění protonu, který je vzápětí nahrazen kationtem kovu. Na takto upravený resin se následně zavádí mobilní fáze a cílová látka utvoří s kovem komplex kov-ligand. Obdobně běţí výměna anionů i na anexech. Jako funkční skupinu lze vyuţít například kvartérní amoniové soli, na kterých probíhá výměna aniontů poměrně snadno. Samotná vlákna jsou zde také tvořeny organickými polymery. Mezi nejčastější patří styren-divinylbenzen, časté jsou i fenol-formaldehydové pryskyřice nebo akrylové amino-formaldehydy (McGarvey). Fenol-formaldehydové pryskyřice jsou ještě často modifikovány hexamethylentetraaminem nebo p-formaldehydem tak, aby byla vytvořena struktura kříţených vláken. V případě epoxidových pryskyřic se pouţívají jako výztuha skelná nebo uhlíková vlákna. 17

18 Styren-divinylbenzenové kopolymery představují silné katexy, pokud jsou sulfonovány nebo karboxylovány. V případě aminace tvoří silné anexy. Slabé kationtoměniče jsou obvykle připravovány z kříţených akrylových kopolymerů. Typické příkady jsou uvedeny níţe. Tab.1: Příklady iontoměničů silný kationtoměnič (matrix ze styrendivinylbenzenu) slabý kationtoměnič (matrix z akrylického divinylbenzenu) silný aniontoměnič (matrix ze styrendivinylbenzenu) slabý aniontoměnič (matrix ze styrendivinylbenzenu) 18

19 Provedení Proces iontové výměny se obvykle provádí ve sloupcích. Původně byly sloupce navrţeny pro samospádovou filtraci. Moderní iontová výměna ale vyuţívá sloupce, které mohou operovat buď souproudovým nebo protiproudovým způsobem. Souproudové provedení vyuţívá toku dolů jak k odsátí, tak k regeneraci sloupce. Nevýhodné je, ţe ionty, které se generují během výměny, brání svojí přítomností efektivnímu pronikání regeneračním iontům, které proudí stejným směrem. Protiproudové pouţití (= sloupce se zpětnou fází), které přivádí regenerační roztok opačným směrem, tento problém odstraňuje. Tato technika je ale obtíţná na provedení, a proto přetrvává souproudové provedení Postup Obecné schéma postupu zahrnuje rozloţení buněk extrakčním pufrem a vazbu DNA k povrchu iontoměniče v prostředí s vysokým obsahem solí. Centrifugací nebo vakuovou filtrací dochází k odstranění zbylého buněčného obsahu. Následuje promývání a posléze i uvolnění DNA z iontoměniče TE pufrem. Sloupec, respektive iontoměnič, je moţné regenerovat pro opětovné pouţití promytím 0,1M HCl a poté třikrát vodou o vysoké čistotě. Ohmori a spol. (2008) provedl srovnání metod k získání DNA z papáji. Ke studiu pouţil i Promega Wizard Resin System. Postupoval takto: Vzorek papáji byl umístěn do polypropylenové centrifugační zkumavky a byl přidán extrakční pufr (Tris-HCl, NaCl, EDTA a SDS) a guanidin hydrochlorid. Po promíchání a inkubaci byla zkumavka centrifugována, k supernatantu byl přidán Clean-Up Resin. Po promíchání proběhlo napojení sloupce na odsávání a supernatant byl odstraněn odfiltrováním. Sloupec byl následně promyt 80% isopropanolem. Sloupec byl vysušen při centrifugaci a poté přenesen na novou mikrozkumavku, promyt TE pufrem, tím se uvolnila DNA, která po další centrifugaci přešla přes membránu a zůstala rozpuštěná v TE pufru. 19

20 Kim a spol. (2008) provedl izolaci DNA ze starověkých kosterních pozůstatků metodou zaloţenou na silika částicích. Část získané DNA dále přečistil na sloupci vyuţívajícím iontovou výměnu (Genomic-tip 20/G, Qiagen) a výsledky porovnal. Došel k následujícímu. Vzorky, u kterých byla provedena pouze izolace pomocí silika částic, vykazovaly po PCR niţší výtěţky neţ vzorky, které byly přečištěny na sloupci. To samé platilo jak pro genomovou, tak i pro mitochondriální DNA. Sloupcová metoda zaloţená na resinu tedy podle Kima mnohem efektivněji odstraňuje inhibitory PCR. Úspěšná PCR je výsledkem soutěţe mezi DNA a inhibitory. To způsobuje, ţe pro úspěšnou PCR je u některých vzorků potřeba menší objem, u některých naopak objem větší. Tento fenomén byl pozorován u obou metod, ale u vzorků, které byly přečištěny na sloupci, byly rozdíly méně nápadné. Co se týče reproducibility, lepší výsledky dosahovaly vzorky, které byly částečně PCR-rezistentní, tedy ty, které nebyly přečištěny na sloupci. Vzhledem k další manipulaci se vzorky během přidané purifikace se poněkud zvyšuje riziko kontaminace, u těchto vzorků starověké DNA například kontaminace moderní lidskou DNA. Proto je třeba dbát zvýšené opatrnosti při manipulaci se vzorky Shrnutí Metoda resinu je zaloţena na iontové interakci mezi molekulou DNA a nabitým iontoměničem, kterým můţe být třeba DEAE (diethylaminoethyl) skupina na nosiči z organického polymeru ve formě membrány nebo částic obsaţených v suspenzi s vhodným pufrem. Resin je poměrně rychlou metodou, která je zaloţena na jednoduché vazbě DNA na iontoměnič, promytí a uvolnění DNA do roztoku. Tato metoda je populární i díky dobrým výsledků, které poskytuje, jako je například vysoký výteţek nebo čistota DNA, která nevyţaduje další purifikaci. Oblíbená je automatizace této metody prostřednictvím moderních kitů. Ty jsou ale zaměřeny spíš na rychlost provedení a je moţné sníţení výtěţnosti. Proto se resin pouţívá mnohdy k přečištění DNA získané jinými metodami. Nespornou výhodou je i efektivní odstranění inhibitorů PCR. 20

21 4.3. SILIKA KOLONKY Tato metoda, která vyuţívá adsorpci na silikátový povrch, je také poměrně stará. V historii byly zprvu vyuţívány přírodní materiály jako křemelina, dnes se pouţívá synteticky připravený silikagel. Metoda vyuţívá poměrně vysoké adsorpce DNA na silikát a je poměrně rychlá a jednoduchá. V přítomnosti chaotropních solí, např. guanidinium thiokyanátu, se DNA naváţe na silikátový povrch. Opakovaným promýváním guanidinium thiokyanátem se odstraní kontaminující sloţky. DNA zůstává adherovaná na silikát aţ do pouţití elučního pufru. Tato metoda je zaloţena na membránovém principu Silikagel Silika neboli silikagel se vţdy bohatě vyuţíval k separaci nejrůznějších látek od jedovatých plynů přes kovové ionty aţ po proteiny a nukleové kyseliny. Ve formě částic tvoří stacionární fázi ve sloupcové chromatografii, ale je vyuţíván i pro tenkovrstvou chromatografii. Silikagel má silně polární charakter a tudíţ adsorbuje také polární sloučeniny. Polární charakter můţe být sníţen připojením nepolárních skupin, jako je například C18. Na silikagel mohou být rovněţ připojeny chelatační skupiny. Taková modifikace je ale vyuţívána hlavně k separaci proteinů. Mezi nesporné výhody silikagelu patří jeho vlastnosti. Není toxický, hořlavý, je nereaktivní a stabilní. Navíc narozdíl od krystalických křemičitanů působení amorfního silikagelu nemůţe vyvolávat silikózu. 21

22 Obr.4: Silikagel Silikové částice Velikost silikových částic se pohybuje v širokém rozmezí velikostí od 2nm (Raman a Brinker 1998). Pokud se tyto částice mají stát součástí membrán, je třeba znát jejich parametry. Určuje se velikost částic a tím i jejich povrch, který je zodpovědný za plochu, na které můţe probíhat adsorpce. Důleţitou charakteristikou je ale i velikost pórů mezi částicemi, která udává míru velikosti molekul, které jsou schopny membránou vůbec projít. Hydrolýzou křemičitých solí nebo alkoxidů můţeme získat stejně velké částice. Objem pórů závisí jednoduše na stěsnání částic. Velikost pórů lineárně klesá s velikostí částic, pokud je ovšem zabráněno shlukování částic. Logická úvaha vede k předpokladu, ţe ideální jsou co nejmenší částice, které poskytují co největší povrch. Nevýhodou příliš malých částic je ale s nimi spojená malá velikost pórů, které jsou zaplněny rozpouštědlem, které ulpívá na částicích. Vzhledem v malé velikosti částic je tato vrstva rozpouštědla relativně velká a musí být odstraněna během sušení, které můţe vést k mechanickému rozrušování částic. Polymerní přístup Polymerní přístup pro přípravu anorganických membrán zahrnuje kalcinaci polymerních solů (Raman a Brinker 1998). Ty se obecně skládají z více nebo méně větvených shluků, které jsou tvořeny jednotkami SiO 2. Anorganické polymery mají několik výhod. Agregace předchůdců polymerů je vyuţito k přípravě membrány bez 22

23 toho, aby vrstva popraskala. Dále velikost polymerů můţe být kontrolována a membrána vytvoří tenkou vrstvu, na které dochází k minimálnímu ucpávání pórů. A konečně, fyzikální a chemické vlastnosti takovéto membrány mohou být měněny buď ve stádiu solu nebo membrány tak, aby došlo ke změně povrchových vlastností, aniţ by byla ovlivňována velikost pórů. Potenciální nevýhodou polymerního přístupu je to, ţe jednotné a zároveň malé velikosti pórů je dosaţeno na úkor objemu pórů. Ve výsledku můţe dojít k postupnému sniţování propustnosti membrány aţ do okamţiku, kdy uţ membrána nebude dále schopná funkce. Vlastnosti silikagelu ovlivňují na něj navázané fáze. Nejčastěji jsou to C8 a C18 řetězce a kyano- a aminoskupiny (Procházková 2003). Amidická skupina NHCO umístěná ve středu uhlíkatého řetězce například vede ke zvýšení polarity. Taková kolona je potom vhodná pro mobilní fáze s nízkým obsahem rozpouštědla. Takovéto podmínky by například u obvyklé C18 kolony vedly ke zborcení C18 řetězce a tím k celkové destrukci. C18 řetězec zvyšuje hydrofobicitu. Polární charakter můţe být naopak zvýšen vloţením polární skupiny, například pentafluoropropyldimetylsilanu nebo polyethylenglykolu, které se navzájem liší hydrofobicitou. Obr. 5: silikátová částice s navázanými uhlíkatými řetězci (nejčastěji C2-C18) Obr.6: Struktura silikagelu Silika kolony mají ale i jisté nevýhody. Silikagel je stabilní jen v rozmezí ph 3-7,5. Po úpravách moderních kolon však lze dosáhnout aţ rozpětí ph Niţší ph způsobuje hydrolytické štěpení organického ligandu, vyšší ph zase vede k rozpouštění samotného silikagelu. Tepelně je stabilita částic omezena 60 C. Toto omezení má význam hlavně 23

24 pro separaci silně kyselých nebo naopak silně bazických látek, kde se proto namísto SiO 2 pouţívají kolony na bázi ZrO 2 (Procházková 2003) Mechanismus vazby a uvolňování DNA se na silikátový povrch váţe pomocí adsorpce. Adsorpce obecně je termín pro dipolové interakce dipol-dipol, dipol-indukovaný dipol a vodíkové vazby. Separovaná látka a mobilní fáze kompetitivně soutěţí o adsorpci na stacionární fázi. V našem případě se jedná o silikagel, který obsahuje silanolové skupiny Si-O-Si a Si-OH, které jsou polární a slabě kyselé (Anzenbacher a Kovář 1986). Obecné schéma kompetice spočívá v tom, ţe na silně polární stacionární fáze se váţe polární analyt v prostředí, které je ve srovnání s analytem méně polární. Pokud je přidána látka, která je ještě polárnější neţ adsorbovaná látka, je tento analyt uvolněn v vazby. Analogicky to platí i pro nepolární charakter. DNA obsahuje jak nepolární bázi, tak polární cukr a fosfátovou skupinu. Báze tvoří mezi sebou vodíkové můstky a jsou tudíţ lokalizovány uvnitř dvojšroubovice. Na povrch se tak dostávají polární skupiny a způsobují tak i polární charakter DNA. Navíc jsou směrem do prostoru orientovány i záporné náboje fosfátu (Vodráţka 2002). Také silikagel má silně polární charakter, který umoţní adsorpci DNA. V přítomnosti elučního roztoku, kterým je nejčastěji TE pufr nebo voda, je DNA z vazby vytěsněna a tím uvolněna do roztoku Postup Izolace DNA pomocí silikagelové membrány je zaloţena na jednoduchém procesu vazby, promytí a uvolnění. V prvním kroku je k buňkám, ze kterých má být DNA izolována, přidán extrakční pufr, který uvolní buněčný obsah. Chaotropní soli pak denaturují DNA tím, ţe rozrušují intramolekulární vodíkové vazby. DNA v denaturované globulární formě pak adheruje na povrch membrány. Po centrifugaci roztok, který obsahuje kontaminující sloţky, přejde přes membránu a DNA zůstává navázána na membráně. Následuje promývání, které spočívá v opakovaném přidávání promývacího roztoku a odstřeďování. Poté je 24

25 třeba přenést kolonku na novou zkumavku. Teď uţ můţe být DNA uvolněna z membrány přidáním roztoku, který bude mít nízký nebo ţádný obsah solí. Tím bývá TE, Tris nebo samotná voda. DNA je po centrifugaci přítomna v roztoku, který přešel přes membránu, a připravena k dalšímu pouţití. Tato metoda je v dnešní době součástí mnoţství automatizovaných přístrojů a moderních kitů, které obsahují předem připravené roztoky. Jejich sloţení se ale můţe měnit a proto je třeba postupovat podle pokynů konkrétního výrobce. Srovnání s metodou resinu a metodou zaloţenou na CTAB Qiagen DNeasy Plant Mini Kit a CTAB metoda jsou oficiální metody pouţívané pro detekci geneticky upravené potravy. Plant Mini Kit (PM) je zaloţen na silikagelové membráně. CTAB metoda vyuţívá pufr obsahující cetyltrimethylammonium bromid. Ohmori a spol. (2008) provedl výzkum, ve kterém srovnal tyto dvě oficiálně stanovené metody s dalším systémem, který je zaloţen na resinu (Promega Wizard RESIN System WCR), ve snaze určit nejvhodnější metodu pro stanovení genetické modifikace. Studie byla provedena se vzorky DNA získané z papáji, z geneticky modifikované i bez genetické modifikace a v různém stupni zralosti. Ohmori došel k následujícím výsledkům. Koncentrace DNA získaná CTAB nebo PM metodou byla menší neţ 10 ng μl -1. U WCR to bylo aţ 66 ng μl -1. Poměr A 260 /A 230 byl niţší u WCR neţ u PM. Znečištění DNA získané metodou WCR můţe být způsobeno fenolickými deriváty a sacharidy, jako i sloučeninami obsaţenými v samotném systému WCR. Co se týče inhibitorů PCR, PM i WCR metody dosáhly srovnatelných výsledků Shrnutí Purifikace nukleových kyselin pomocí silika kolon je pohodlná a ekonomicky relativně výhodná. Nespornou výhodou je časová nenáročnost, která vyplývá z jednoduchého základního principu vazby, promytí a uvolnění. Tato metoda nevyţaduje zdlouhavé kroky, jako je extrakce organickými rozpouštědly, ani sráţení ethanolem nebo polyethylenglykolem. Také čistota získané DNA je vysoká. Moţné je znečištění sloučeninami, které jsou obsaţeny v samotném systému, coţ je nevýhoda oproti metodám zaloţeným na iontové výměně. 25

26 4.4. MAGNETICKÉ ČÁSTICE V posledních letech se mezi širší odbornou veřejností ujaly k izolaci nukleových kyselin metody, které vyuţívají magnetické (také paramagnetické) částice (Húska a spol. 2008). Magnetické částice jsou kulovité útvary v rozmezí velikosti 5 nm aţ 100 μm, jejichţ jádro je tvořeno nejčastěji maghemitem (γ-fe 2 O 3 ) nebo magnetitem (Fe 3 O 4 ), ale třeba i zlatem. Povrch částic je dále modifikován tak, aby mohl vázat vlákna nukleových kyselin. Samotná izolace pak probíhá tak, ţe ke vzorku nukleových kyselin přidáme magnetické částice a cílené molekuly se na ně naváţí. Poté zkumavku přiblíţíme působení magnetu, magnetické částice se přitáhnou ke stěně zkumavky a zbylý roztok s nenávaznými částicemi se odstraní. Následuje promývání a uvolnění nukleových kyselin z komplexu do námi přidaného roztoku. Obr.7: Schéma magnetické částice Magnetické částice Jádro magnetických částic tvoří magnetické oxidy ţeleza (maghemit, magnetit, ferrity zlata, kobaltu, manganu a mědi). Částice mají značný rozsah velikostí od nanočástic po mikročástice v závislosti na tom, jakou molekulu chceme izolovat. Pro izolaci 26

27 proteinů pouţijeme částice velké 5-50 nm, pro izolaci nukleových kyselin a virů částice nm, zatímco částice velké μm nám umoţní izolovat celé buňky (Húska a spol. 2008). Magnetické částice tedy neslouţí pouze k izolaci nukleových kyselin, ale jejich vyuţití je značné Nosiče cílových molekul Magnetické částice jsou opouzdřeny látkou, která umoţní navázání cílového objektu. Tímto nosičem můţe být anorganický oxid nebo také organický polymer, například magnetické částice na bázi polystyrenu. Pro izolaci nukleových kyselin jsou ale vhodnější ty organické polymerní nosiče, které mají mnoţství navázaných karboxylových kyselin, které mají hydrofilní charakter a usnadňují tak vazbu nukleové kyseliny. Magnetické částice s anorganickými nosiči se uplatňují v chemickém průmyslu stejně jako v biotechnologii nebo v lékařství. Stále nejvíc se uplatňuje silika (SiO 2 ), která má nad jinými anorganickými oxidy několik výhod pro pouţití při biomedicínckých aplikacích, jako je slučitelnost s biologickými systémy, vysoká stabilita spojení, přizpůsobivost modifikacím povrchu a hydrofilní charakter. K přípravě takovýchto částic vede postup, ve kterém je nejprve třeba smísit siliku s oxidem ţeleza tak, aby se vytvořily sférické částice. Následuje přeměna oxidu ţeleza na magnetickou formu. Tento obecný postup bude dále přiblíţen popisem konkrétní přípravy částic z maghemitu a siliky, které mají příznivé vlastnosti pro vyuţití při bioseparacích Příprava magnetit/silikagelových částic Příprava těchto maghemit/silikagelových částic, kterou popsal Zhang a spol. (2006), sestává z těchto tří stupňů: 1) tvorba mikrosfér z hematitu a siliky za pouţití urea-formaldehydové polymerizace, 2) kalcinace utvořených částic vedoucí k odstranění organických sloţek a 3) in situ transformace oxidu ţeleza redukcí vodíkem. 27

28 Ad 1) Suspenzi hematitu získáme rozpuštěním NaHCO 3 a FeCl 3 ve vodě, suspenzi silikátu připravíme odděleně okyselením koloidního roztoku siliky na ph 2. Obě suspenze se smísí a přidají se urea a formaldehyd. Směs se nechá stát přes noc při laboratorní teplotě. Vytvořené mikrosféry se posbírají centrifugováním a jsou promyty postupně vodou, směsí vody a methanolu (1:1), methanolem a acetonem. Ad 2) K odstranění polymerního templátu a zvýšení mechanické odolnosti se částice kalcinují 2 hodiny při teplotě 200 C, poté 2h při 600 C a nakonec 2h při 800 C. Ad 3) V tomto kroku se hematitové částice umístí do křemenné zkumavky, přítomný kyslík se vyţene dusíkem a ten je následně nahrazen vodíkem. Redukce probíhá za zvýšené teploty (kolem 300 C). Tak dochází k transformaci nemagnetického α-fe 2 O 3 (hematit) na Fe 3 O 4 (magnetit), který je účinně přitahován permanentními magnety. Toto je podstatné zlepšení oproti klasickým protokolům, které popisovaly pouze přeměnu α-fe 2 O 3 na γ- Fe 2 O 3 (maghemit), který vykazoval jen malou odezvu na působení magnetického pole. Metoda podle Zhanga navíc vede k přípravě magnetických částic, které mají vysoce kulovitý tvar, vykazují dobré magnetické vlastnosti, vysoký obsah ţeleza a shodují se i v dalších parametrech jako je povrch, velikost částic a velikost pórů mezi nimi. Obr.8: Magnetické částice pozorované elektronovým mikroskopem 28

29 Obr.9: Schéma syntézy porózních magnetit/silikagelových částic Mechanismus vazby a uvolňování Mechanismus selektivní vazby a vymývání DNA z magnetických částic byl značně studován (Zhang a spol. 2006). Bylo prokázáno, ţe nukleové kyseliny mohou existovat buď v hydratované šroubovicovité formě nebo v kompaktní globulární formě. V přítomnosti polyethylenglykolu (PEG) a solí prochází molekuly DNA přeměnou ze šroubovice do globulární formy a váţí se vodíkovými vazbami na povrch magnetických částic. Tímto způsobem je DNA oddělena od proteinů, buněčných pozůstatků a ostatních buněčných sloţek, které jsou přítomny v roztoku. Jakoţto klíčová sloţka vazebného pufru PEG nejenţe indukuje vazbu DNA na částice, ale také sniţuje adsorpční schopnosti proteinů. Při následném pouţití pufru bez PEG a s nízkým obsahem solí dochází snadno k přechodu DNA zpět do šroubovicovité formy a 29

30 uvolnění do roztoku, který je uţ ovšem bez proteinů a jiných kontaminantů a tudíţ vhodný pro další manipulaci Postup Obecné schéma postupu vychází ze suspenze buněk, ke kterým se přidává lyzační pufr, který naruší buněčnou integritu, vazebný pufr, který obsahuje PEG a NaCl a umoţní vazbu DNA na magnetické částice, a samozřejmě samotné magnetické částice. Následuje imobilizace částic v magnetickém poli a odstranění supernatantu, ve kterém jsou přítomny proteiny a další buněčné pozůstatky. V dalším kroku je komplex magnetických částic a DNA promýván, poté probíhá uvolnění molekul DNA. Dále jsou částice opět imobilizovány a volná DNA můţe být odebrána. Jednotlivé protokoly se liší v podstatě pouze v pouţití různých promývacích nebo elučních činidel nebo se různí v časovém sledu jednotlivých kroků, podstata ale zůstává stejná, jak je dále demonstrováno na příkladech dvou na sobě nezávislých protokolů. Podle prvního Zhang a spol. (2006) izoloval genomovou DNA z buněk Saccharomyces Cerevisiae a z kukuřičných zrn. Sabastianelli a spol. (2008) popsal postup pro izolaci metagenomu z půdního prostředí (metagenomem je míněn veškerý mikrobiotní genom v daném prostředí). Protokol podle Zhanga obsahuje přidání ME-PB pufru k buněčné suspenzi, centrifugování, následné odstranění supernatantu, přidání šnekáza-pbs pufru, centrifugace, odstranění supernatantu, dále přidání lyzačního pufru a dodecylsulfátu sodného. Po inkubaci se do roztoku přidá vazebný pufr a magnetit/silikagelové magnetické částice. Ty jsou následně imobilizovány. Supernatant je odstraněn a magnetické částice jsou promyty 80% isopropanolem a poté 70% ethanolem. Po odstranění supernatantu je DNA uvolněna z magnetických částic přídavkem TE pufru. Magnetické částice jsou opět imobilizovány a pufr obsahující DNA je odebrán a dále analyzován. Sabastianelli k suspenzi přidal lyzační pufr, RNázu A, opět magnetit/silikagelové magnetické částice a vazebný pufr. Magnetické částice byly imobilizovány a supernatant odstraněn. Poté byly částice třikrát promyty vodným roztokem ethanolu, 30

31 opět imobilizovány a vodný roztok ethanolu byl odstraněn. DNA byla uvolněna z magnetických částic přídavkem vody, částice imobilizovány a supernatant obsahující DNA byl přenesen Automatizace metody V posledních letech se stala molekulární diagnostika nedílnou součástí rutinní práce v klinických mikrobiologických laboratořích (Schuurman a spol 2007). Po uvedení molekulární detekce patogenů počet vzorků značně vzrostl. Proto se stává automatizace metod tak atraktivní. Schuurman provedl výzkum, ve kterém porovnal manuální, poloautomatizovanou a plně automatizovanou metodu, která vyuţívá k izolaci DNA magnetické částice. Byl srovnán komerční automatizovaný MagNA Pure DNA Izolation Kit III Bakteria/Fungi (MPLC DNA III), polo-automatizovaný NucliSens minimag a plně manuální metoda. Protoţe téměř všechny automatizované systémy vyuţívají částice zaloţené na silika/guanidinum thyokyanátu, rozhodl se Schuurman a spol. pro pouţití stejných magnetických částic. Jejich výzkum ukázal, ţe manuální metoda poskytuje nejvyšší výtěţky při nejniţších finančních nákladech. Na druhou stranu si tato metoda vyţádala nejvíce času, coţ je pro pouţívání v dnešních molekulárně mikrobiologických laboratořích nepřijatelné. Automatizovaná i polo-automatizovaná metoda poskytovaly pouze poloviční výtěţek, ale jsou časově nenáročné. Všechny tři metody vedly k získání poměrně čisté DNA, přičemţ výsledky byly srovnatelné. Stejně dopadl test na přítomnost inhibitorů PCR reakce. Tady si nejlépe vedl minimag, ale i druhé dvě metody neobsahovaly vyšší procento zastoupení inhibitorů neţ 4%. Co se týče finanční náročnosti, MPLC má nejvyšší pořizovací cenu (~ ) ale niţší provozní náklady přepočtené na jeden vzorek oproti zařízení minimag (pořizovací cena ~ 5.000). Sebastianelli a spol. (2008) provedl izolaci půdního metagenomu pomocí komerčního kitu SoilMaster TM DNA a manuální metody, přičemţ obě procedury vyuţívají magnetické částice. Ke srovnání byla pouţita i klasická fenol-chloroformová extrakční metoda. Nezávisle na Schuurmanově výzkumu došel Sebastianelli k podobným výsledkům. Komerční kit poskytoval oproti zbývajícím dvěma metodám nízký výtěţek. Obě metody, které vyuţívají k izolaci DNA magnetické částice, poskytovaly poměrně čistou 31

32 DNA s nízkým obsahem inhibitorů PCR reakce, zatímco DNA získaná klasickou fenolchloroformovou extrakcí byla znečištena RNA a přítomné inhibitory znemoţňovaly PCR reakci. Koncentrace proteinů byla u všech vzorků srovnatelná a nízká. Při výběru metody se tedy musí zohlednit výhody i nevýhody jednotlivých metod finanční i časovou náročnost a to, v jakém mnoţství a v jaké kvalitě je třeba DNA získat. Obr.10: MagNA Pure DNA Isolation Kit III (vlevo) Obr.11: NucliSens minimag (vpravo) Shrnutí Postup pro izolaci DNA zaloţený na pouţití magnetických částic se zdá být elegantním řešením, jak poměrně snadno získat DNA nekontaminovanou RNA nebo proteiny a s pouze minimálním zastoupením inhibitorů PCR reakce. Tato metoda nevyţaduje ani manipulaci se zdraví škodlivými organickými rozpouštědly a přestoţe není zdlouhavá, pro rutinní pouţívání v moderních laboratořích je třeba vyuţít její snadnou automatizaci, ačkoli automatizované nebo polo-automatizované systémy poskytují niţší výtěţek a pochopitelně jsou finančně náročnější. 32

33 5. CÍL PRÁCE Moderní separační metody a techniky dosáhly obrovského rozvoje. Metody jsou vysoce selektivní a přesné, zvýšily se výtěţky, zkvalitnila se čistota. Nicméně přes veškerý pokrok se u některých vzorků vyskytují problémy s inhibitory PCR analýzy, které běţně pouţívané analytické metody nedovedou odstranit. Tato práce se zaměřuje na vzorky DNA odebrané z bukální sliznice pomocí speciálních tampónů. Je moţné, ţe spolu se vzorkem se na tampón dostanou i mikroorganismy, které tvoří přirozenou mikroflóru ústní dutiny. V buněčné stěně těchto mikroorganismů se nachází značné mnoţství polysacharidů, o nichţ je známo, ţe působí jako inhibitory PCR. Neprodyšně uzavřené obaly se stěrkami představují vhodné prostředí pro růst potenciálně přítomných mikroorganismů během skladování před samotnou analýzou. To vede k úvaze, ţe inaktivace růstu mikroorganismů by mohla výrazně sniţovat koncentraci PCR inhibitorů ve zpracovávaných vzorcích. Cílem práce je tedy dokázat přítomnost mikroorganismů ve vzorcích odebraných pomocí tampónů a pokusit se najít efektivní řešení, jak zamezit růstu těchto mikroorganismů. 33

34 PRAKTICKÁ ČÁST 34

35 6. MATERIÁL A METODY 6.1. ODBĚR VZORKŮ Vzorky DNA byly odebrány pěti dobrovolníkům z řad zaměstnanců Ústavu biochemie dne Odběr proběhl mezi hodinou. Pro odběr DNA byla vybrána neinvazivní metoda stěru z bukání sliznice pomocí speciálních tampónů. Dobrovolníkům bylo doporučeno nejíst a nepít 60 min před odběrem, aby se zamezilo přítomnosti látek z potravy a cukrů ze sladkých nápojů, které by mohli ovlivňovat měřené hodnoty a zkreslovat výsledek experimentu. Povolena byla pouze neslazená neperlivá voda. Samotný odběr byl prováděn sterilními tampóny Flocked swabs od společnosti MicroRheologic. Od kaţdého dobrovolníka byla DNA odebrána čtyřmi tampóny, a to tak, aby nedocházelo k tomu, ţe na tampónech ulpí rozdílné mnoţství bukání sliznice. Proto byl odběr jednotlivými tampóny prováděn v odlišných částech ústní dutiny. Jako lokaci odběru sliznice byla vybrána část mezi lící a vnější stranou dásně. Sliznice byla na stěrku nabírána stejným pohybem, jakým probíhá čistění zubů. Doba odběru pro jeden tampón byla min 2 minuty. Při práci s tampóny jsme se snaţili zamezit tomu, aby se tampón dostal do kontaktu s čímkoli jiným, neţ je povrch bukání tkáně. Tampóny se vzorkem byly umístěny zpět do původního obalu tak, aby se tampón nedotýkal stěn obalu Sušení vzorků Pro dobrovolníky bylo pouţito označení číslicemi 1 5 a pro jejich jednotlivé vzorky písmena A D. Vzorky označené písmenem A byly vybrány k vytvoření nepříznivých podmínek pro kvasinky. K eliminaci růstu kvasinek bylo vybráno jednoduché sušení tampónů volně na vzduchu za pokojové teploty. Sušení probíhalo 3 dny. Tento jednoduchý postup byl vybrán proto, aby byl snadno proveditelný i bez speciálního vybavení v prostorách mimo laboratoře. Ostatní vzorky označené B D zůstaly aţ do kultivace uzavřeny v neprodyšném obalu tampónů, který poskytuje lepší podmínky pro růst kvasinek. 35

36 6.2. KULTIVACE KVASINEK Příprava ţivné půdy Při přípravě ţivné půdy byla zachována sterilita práce. Připraveno bylo celkem 20 misek pro 20 vzorků. Byly vybrány jednorázové plastové sterilní Petriho misky a YPD agar Sigma-Aldrich určený pro kultivaci kvasinek. Sloţení YPD agaru: bakteriologický pepton c = 20 g l -1 kvasničný extrakt c = 10 g l -1 glukóza c = 20 g l -1 agar c = 10 g l -1 Výrobce uvádí, ţe 32 g YPD agaru slouţí k přípravě 1 l roztoku. Pro kaţdou z dvaceti misek je potřeba o něco méně neţ 15 ml agaru, a proto bylo připraveno 250 ml roztoku, který vznikl rozsuspendováním 8 g agaru v 250 ml destilované vody. Roztok byl dále autoklávován podle pokynů výrobce, tedy 15 min při 121 C. S vysokou pravděpodobností je v ústní dutině spolu s kvasinkami přítomno i nemalé mnoţství bakterií, jejichţ kultivace byla neţádoucí, proto byla přidána po autoklávování do připraveného roztoku agaru antibiotika, která zamezila růstu bakterií. Po odborné konzultaci byly vybrány antibiotika tetracyklin a ampicilin. Byly přidány v této výsledné koncentraci: tetracyklin c = 12,5 μg/ml a ampicilin c = 100 μg/ml. Tato antibiotika působí tak, ţe ampicilin inhibuje syntézu buněčných stěn a tetracyklin inhibuje vazby trna na ribosom (Rumlová a spol. 2003). Takto připravený agar byl rovnoměrně rozdělen mezi všech 20 misek. Po zatuhnutí agaru byly misky zavřeny, otočeny dnem vzhůru a takto zůstaly uskladněny aţ do pouţití na kultivaci. 36