zvyšování počtu jednotlivých mikroorganismů roste počet živých buněk exponencio- nálně otevřeném systému

Transkript

1 Definice růstu Růstem myslíme jednak zvyšování počtu jednotlivých mikroorganismů, případně zbytnění jednotlivých organel, a tím i zvětšování jednotlivého mikrobu. Je-li mikroorganismus v uzavřeném prostoru, po několik málo generací roste počet živých buněk exponencionálně, brzy nastává stacionární fáze pro omezení nedostatkem výživy a prostoru. V otevřeném systému s nepřetržitým přísunem živin je exponenciální růst po delší dobu. Pro kvantifikace růstu mikrorganismů je možné použít mnoho technik, kterými se mění nejen životaschopnost, ale i počet buněk včetně buněčné hmoty.

2 Během každého buněčného cyklu se dělí jádro buňky. Buněčný cyklus, nebo cyklus buněčného dělení, je soubor událostí v buňce, které buňku vedou k dělení a zdvojení (replikaci). U bezjaderných buněk (prokaryota), buněčný cyklus je prováděn procesem označovaným jako binary fission binární dělení. U buněk s jádrem (eukaryota), lze buněčný cyklus rozdělit do dvou období: interfáze během které buńky rostou, akumulují živiny potřebné pro mitosu a zdvojení DNA a mitosa (M) fáze, kdy se buňky štěpí na dvě oddělené buňky, často označované jako "dceřinné buňky". Buněčný cyklus je zásadním procesem, kterým se jednobuněčné oplodněné vajíčko rozvíjí ve vyzrálý organismus, právě tak jako jsou některé orgány obnovovány ( kůže, červené krvinky).

3 Schéma buněčného cyklu

4 Dělení cyklu Buněčný cyklus lze rozdělit v zásadě na dvě hlavní části dlouhé období syntetické nazývané interfáze a na mitosu, krátké období ve kterém buňka musí bezchybně distribuovat replikované chromosomy do nové dceřinné buňky. Cyclin-dependentní kinasy (CDK) náleží skupiny protein kinas původně objevených jako účastníků regulace buněčného cyklu.

5 Součásti buněčného cyklu G1 = růst a příprava na replikaci chromosomů; S = syntéza DNA a zdvojení centrosomu; G2 = příprava na mitosu M = mitosa

6 Buněčný cyklus & Mitosa Stadia buněčného cyklu Buněčný cyklus je uspořádaný sled událostí, kterým kulminuje růst buňky a dělení na dvě dceřinné buňky. Nedělící se buňky neprocházejí buněčným cyklem. Hlavní stadia jsou G1- S - G2 - M. G1 stadium znamená "GAP 1". Stadium S znamená "Syntéza". V tomto stadiu nastává replikace DNA. G2 stadium je "GAP 2". M stadium znamená "mitosa", a během této fáze nastává dělení jádra (oddělení chromosomů) a cytoplasmy (cytokinese). Mitosa se dále dělí na 4 fáze. Regulace buněčného cyklu Jak buněčné dělení (a růst tkání) je řízen velice komplexně. Další termíny jsou významné pro regulaci a také znamenají body jejichž chyba může vést k rakovině. Rakovina je onemocnění při kterém se regulace buněčného cyklu hatí a normální růst a chování buněk je ztraceno.

7 Nutné podmínky pro buněčný cyklus Eukaryotická buňka se nemůže dělit na dvě, tyto pak na čtyři, pokud se nestřídají dva procesy : Zdvojení genomu (DNA) v S fázi (syntetická fáze) buněčného cyklu; Rozdělení (halving) genomu během mitosy (M phase). Období mezi M a S se nazývá G1; mezi S a M je G2.

8 S. cerevisiae G1 kontrolní bod: Je-li nalezeno poškození DNA, a je-li přítomen feromon,nebo buňka nedosáhla kritické velikosti, buňka se zastaví (cell arrest) v G1 a není schopna projít Startem, což dovoluje buňce zahájení DNA syntézy a mitosu. Kontrolní bod kompletace vřeténka: Je-li nalezeno poškození DNA, DNA není kompletně replikovaná, nebo nejsou-li chromosomy správně srovnány (metafáze), buňka se zastaví (cell arrest) v metafázi a je neschopná podstoupit závěr mitozy, kdy se sesterské chromatidy oddělují a buňka se dělí.

9 S. cerevisiae Tyto kontrolní body jsou posilovány komplexy Cdk/cyklin, což je rodina protein kinas. Katalytické podjednotky těchto komplexů, cyklindependentní kinasy (Cdk), jsou aktivní pouze ve spojení s regulační cyklinovou podjednotkou. U pučících kvasinek, je pouze jedna Cdk (Cdc28); a devět různých cyklinů (Cln1-3, Clb1-6). V závislosti na partnerském cyklinu, Cdc28/cyklin dimery provádějí specifické úkoly. Správný průběh během buněčného cyklu vyžzduje následné aktivace a inaktivace těchto dimerů Cdc28/cyklin. K regulaci Cdc28 aktivity má buňka k dispozici několik mechanismů,jmenovitě:

10 S. cerevisiae K regulaci Cdc28 aktivity má buňka k dispozici několik mechanismů,jmenovitě: - Pomocí syntézy cyklinů různými transkripčními faktory (SBF, MBF a Mcm1). Pomocí degradace cyklinů (podporované Cdc20/APC, Cdh1/APC, a Grr1/SCF). Spojením se stoichiometrickými CDK inhibitory (Sic1 a Cdc6, a Far1). Pomocí fosforylace a defosforylace Cdc28 faktory Swe1 a Mih1. Pomocí regulačních proteinů, které řídí aktivity Cdc28 a zajišťují správný postup událostí buněčného cyklu.

11 Nobelova cena 2001 Lékařství a fyziologie Regulace buněčného cyklu Paul Nurse - Schizosaccharomyces Lee Hartwell Saccharomyces Tim Hunt mořská ježovka CDK (cyklin-dependentní kinasa)

12 Studium buněčného cyklu Tři biologové sdílejí Nobelovu Cenu ve fysiologii a lékařství za objevy vedoucí k odkrytí tajemství buněčného cyklu,které má široké dopady pro biologii a medicinu. Dva britští badatelé, R. Timothy Hunt a Paul M. Nurse, oba z Imperial Research Cancer Foundation, získali cenu spolu s Leland H. Hartwellem z Fred Hutchinson Cancer Research Center v Seattlu (USA).

13 2 typy kvasinek

14 Schéma buněčného cyklu

15

16 Členění buněčného cyklu Mitosa má 5 hlavních pododdílů, z nichž 4 první jsou prophase, metaphase, anaphase, telophase- jejich cílem je oddělit a rozmístit chromosomy, zatímco 5. část označovaná jako cytokinese - dělí buňky a jejich cytoplasmatické součásti do dvou nových buněk. Chemická regulace buněčného cyklu představuje biologické hodiny (biological clock), které řídí stoupání a klesání koncentrací několika proteinů jako jsou cykliny, MPF, cdc2. Přesný mechanismus genové regulace a účinnost vnitřních a vnějších signálů nejsou dosud zcela přesně poznány.

17 I Interfáze Interfáze, představuje cca 90% celkového času buněčného cyklu, lze dělit na tři části G1, S, a G2. V průběhu interfáze G1 a G2 jsou období, kdy buňka roste tím, že syntetizuje proteiny a reprodukuje své cytoplasmatické organely. Během S fáze buňka replikuje svůj genom.

18 Rozdíl mitosy a meiosy

19 Průběh mitosy

20 Schizosaccharomyces pombe CDC 10 th rad 3 mutant- 6 h při nerestriktivní teplotě a zadržen před S fází. Mitosa se vyskytuje nezávislena S fázi. Chyběl checkpoint protein Rad 3. DNA je obarvena DAPI. Nerovnoměrná distribuce DNA do dceřinných buněk.

21 Buněčný cyklus

22 Hlavní složky regulace Cdk (cyclin dependentní kinasa, fosforyluje protein), společně s cyklíny (cyclins), jsou hlavní řídící spínače buněčného cyklu, působí na přechod buňky z G1 do S nebo z G2 do M. MPF (Maturation Promoting Factor) zahrnuje CdK a cykliny a spouští postup buněčného cyklu. p53 je protein, který funguje jako zástava cyklu, v případě, že DNA je poškozená. Je-li poškození závažné tento protein může vyvolat apoptosu (buněčná smrt).

23 regulace Hladina p53 je zvýšená v poškozených buňkách. Takto je získán čas na opravu DNA zablokováním buněčného cyklu. Mutace p53 je nejčastější mutace vedoucí k rakovině. Extrémní případ je Li Fraumeni syndrom, kde genetický defekt v p53 vede k vysoké četnosti rakoviny u postižených jedinců.

24 p53 p53 je protein potlačující tumory, také označovaný jako "Guardian of the Genome - strážce genomu. Hraje významnou roli v kontrole buněčného cyklu a apoptosy. Defektní p53 může dovolit proliferaci abnormálních buněk, s následkem rakoviny. Až 50% všech lidských tumorů obsahuje mutantní p53. V normálních buňkách je hladina proteinu p53 nízká. Poškození DNA a ostatní stresové signály mohou spustit zvýšení syntézy proteinu p53, který má tři hlavní funkce: Zástavu růstu (growth arrest), opravu DNA a apoptosu (buněčnou smrt). Zástava růstu zastaví postup buněčného cyklu, a tak zabrání replikaci poškozené DNA. Během zástavy růstu, p53 může aktivovat transkripci proteinů provádějících opravu DNA. Apoptosa je poslední prostředek, jak se vyhnout proliferaci buněk obsahujících abnormální DNA. Koncentrace p53 v buňce musí podléhat přísné regulaci. Zatímco vysoká hladina p53 může potlačit tumory, múže zároveň zrychlit proces stárnutí nadbytečnými apoptosami. Hlavní regulátor p53 je Mdm2, který může spustit degradaci p53 pomocí ubiquitinového systému.

25 Enzymy cyklu Třídy enzymů, které se účastní spouštění jednotlivých událostí v buněčném cyklu: A. proteasy B. transferasy C. kinasy D. nukleasy

26

27 Regulační proteiny Cykliny, proteiny (známá A i B forma) Jejich obsah v buňce se mění v závislosti na fázi buněčného cyklu Prudce stoupají až k mitose, pak klesají k nule Po dosažení prahové hodnoty, dovedou buňku do G2 fáze Spolu s p34 kinasou (cdc2) tvoří maturaci podporující faktor (MPF) cdk aktivující kinasa CAK aktivuje cdk fosforylaci CAK fosforyluje thr/tyr zbytky několika cdk na cdc2 reakci ruší fosfatasa cdc25

28 Typy cdk G1 fáze cdkc S fáze cdkc M fáze cdkc Cdk jsou aktivované activation loop phosphorylation. Tato modifikace může být strukturně posílena vazbou cyklinu tak, že navodí plně aktivní konformaci. Cdc28p (hlavní kvasinková cyklin-dependentní kinasa účastnící se řízení buněčného cyklu) je vysoce homologní s Cdk2 a jejich struktura je velmi podobná. Předpokládá se, že všechny cykliny aktivují všechnyl cyklin-dependentní kinasy stejným způsobem. Biologická role většiny cyklin-dependentních kinas je spouštění jednotlivých fází buněčného cyklu.

29 Regulace aktivity Cdc2 kinasy

30 Klíčové body cyklu

31 3 složky kontroly Poškození nebo zpoždění vznik signálu Chemické nebo radiační poškození DNA Defekt vřeténka nebo špatné upevnění na kinetochor Signál má specifický přenašeč V případě poškození DNA kaskáda kinas Signál je monitorován příjemcem a reguluje schopnost pokračovat v buněčném cyklu, CDK nebo APC aktivita

32 Jak buňka pozná poškození

33 Regulace cyklu Průchod buněčným cyklem vyžaduje aktivitu dvou ubiquitinylovaných komplexů, jednak Skp1-cullin-Fbox-protein komplex (SCF) a anafáze-promoting komplex/cyclosome (APC). Pozorování posledních let odhalila nečekané podobnost mezi SCF a APC a umožnila podrobnou analýzu regulace jejich aktivit. U obou komplexů je známé, že existují v různých formách, které atakují různé substráty podléhající ubiquitin-závislé proteolysi.

34 Kontrola časné a pozdní S fáze

35 regulace p27 je protein, který se váže na cyklin a cdk. Tak blokuje vstup do S fáze. Současné výzkumy ukazují, že prognóza rakovina prsu je určovaná hladinou p27. Snížená hladina p27 predikuje špatný výsledek pacientů s rakovinou prsu.

36 Fúze jader

37 Mitose promoting factor - MPF

38 Epistase označuje akci mezi jedním genem, který ovlivňuje jeden nebo více genů. Modifikující geny

39 Situace u pučících kvasinek

40 Závislost S fáze na M fázi je regulovaná Cdc2

41 Sekundární signální transdukce Zahrnuje GTPasy, kinasy, fosfoinosit-kinasy, a Ca 2+ α-podjednotka G proteinu se váže na adenylcyklasu a tak reguluje obsah camp GTPasy jsou typu ras (typ onkogenu identifikovaného Harvey a Kirstenem u krys- rat sarcoma virus) mají několik podskupin, liší se velikostí molekuly Regulace buněčného cyklu Ser/Thr kinasy označované jako cyklin- dependentní kinasy (Cdks, cdc28, cdc2, p34

42 kvasinkový feromon α faktor

43

44

45

46 Dělení bakteriální buňky Segregace chromozómů Syntéza bílkovin G1-fáze Syntéza DNA a bílkovin G2-fáze S-fáze Dělení buňky 2 buňky v G1 fázi

47 Buněčný cyklus prokaryontních mikrooorganismů Jak je replikace a segregace genomu propojena s buněčným růstem a dělením? Během logaritmické fáze růstu je buněčný růst plynulý (kontinuální) až na 3 periodicky se opakující události: - iniciace replikace chromosomu - oddělení sesterských chromatid - rozdělení buňky

48

49

50

51

52

53

54

55 Pro tyto 3 cyklické jevy specifické proteiny Konečnou příčinou aktivace těchto cyklických proteinů je to, že buňka dosáhne kritické velikosti (objemu nebo délky). Iniciace replikace chromosomu je oddělena od vlastní replikace DNA a vyžaduje specifický soubor enzymů proteinů. Oddělení komplementárních řetězců DNA v míste oric je prvním krokem.

56 Dělící se buňka

57 Buněčný cyklus E.coli I Růst vedoucí ke kritické hmotnosti (objemu) vede k iniciaci replikace chromosomu Iniciace vyžaduje DnaA protein + ATP + replikační proteiny Replikace je následována odpojením a monomerizací molekul sesterských chromatid. Sesterské chromatidy se rychle oddělují do opačných polovin buňky, pomocí kinesinu podobnému proteinu MukB. Cytokinesiny zahajují tvorbu kruhu GTP/vazebných proteinů FtsZ, obvykle kolem centra buňky. Specifický enzym (PBP3) spolu s dalšími proteiny(ftsq, FtsA, FtsL, FtsW) odpovídají za koordinované vrůstání peptidoglykanů do buněčné stěny v tomto místě.

58 Buněčný cyklus E.coli II Protein EnvA je nutný k rozštěpení vznikající přepážky a tvorbě nových pólů. Tvorba kruhu FtsZ je inhibovaná aktivovaným MinC proteinem. Minimální délka buňky je nutná pro rozdělení a zároveň minimální velikost volné zóny bez DNA je nutná pro tvorbu septa. Geny kódující regulační proteiny: dnaa iniciace replikace chromosomu mukb oddělení chromosomu ftsi PBP3, ftsw, ftsq, ftsa, ftsz, ftsy, ftse, ftsx, enva, minc, mine, sula dělení buňky pbpa (PBP2), roda tvar buňky

59 FtsZ protein FtsZ protein je klíčovým prvkem řízení buněčného dělení u Escherichia coli. Náročné transkripční titrace byly použity ke kvantifikaci ftsz mrna přítomné v synchronně se dělících buňkách. Hladina ftsz mrna osciluje během buněčného cyklu, maxima dosahuje v čase odpovídajícím začátku replikace DNA. Tato závislost buněčného cyklu je vyvolaná dvěma blízkými ftsz promotory. Byl vytvořen kmen, kde exprese ftsz mohla být modulovaná vnějším induktorem. V tomto kmenu velikost buňky a četnost buněčného dělení byly citlivé k obsahu buněčného FtsZ, což ukázalo na úlohu tohoto proteinu na rychlost buněčného dělení.

60 FtsZ protein Transkripční aktivita promotorů ftsz je nezávislá na DnaA, a to ukazuje fakt, že DNA replikace a buněčné dělení mohou být nezávisle řízeny v čase kdy je iniciován nový cyklus replikace DNA. To naznačuje možnou paralelu mezi signály prokaryotického buněčného cyklu a bodem START v eukaryotickém buněčném cyklu.

61 Vizualizace FtsZ proteinu

62 Regulace buněčného cyklu

63 S fáze může být nezávislá na cytokinesi. Escherichia coli rostla v bohatém mediu (vlevo) nebo byl přidám ampicilin na 90 min (vpravo). Barveno DAPI modří pro vizualizaci nukleoidu. Fluorescenční mikroskopie.

64 Vibrio cholerae 2 chromosomy

65 Průběh buněčného cyklu u Caulobacter crescentus Pohyblivé bičíkaté buňky Stopkaté buňky

66 Životní cyklus Caulobacter crescentus Životní cyklus Caulobacter crescentus: bičíkaté buňky jsou pohyblivé a neschopné iniciace replikace DNA. Po určité závazné době se tyto buňky diferencují na stopkaté buňky. Nastává S fáze, DNA replikace a iniciace dělení buněk. Bičíky a pili jsou nahrazeny stopkou a adhezivním přichycujím se orgánem. Stopkaté buňky se prodlužují, dělí a tvoří nový bičík na pólu opačném ke stopce. Vzniklá asymetrická buňka dává vznik 2 rozdílným typům buněk.

67 Buněčný cyklus stopkatých bakterií

68

69