Test genotoxicity na cibuli (Allium cepa)

Transkript

1 Test genotoxicity na cibuli (Allium cepa) 1. Účel Test na cibuli (Allium cepa) je účinným pro screening chemických látek a in situ monitoring genotoxicity kontaminantů v životním prostředí. Test se hojně využívá pro studium genotoxicity mnohých pesticidů, k odhalení indukce chromosomálních aberací v kořenových špičkách meristematických 1 buněk cibule. Residua pesticidů mohou být také v ovoci a zelenině a představovat tak riziko pro zdraví člověka. 2. Charakteristika testu Test genotoxicity na cibuli poskytuje snadný screening chemických látek a vzorků s genotoxickým účinkem, zvláště vůči rostlinám. Obvykle nejprve předchází test inhibice elongace kořene, jehož cílem je nalézt hodnotu EC50. Poté se vzorek testuje na přítomnost chromosomálních aberací a mikrojader, kdy je hodnota EC50 zvolena jako nejvyšší testovaná koncentrace. 3. Testovací organismus Testovacím organismem je cibule (Allium cepa), např. Stuttgartská varieta. Mohou však být použity i jiné odrůdy. Cibule by měly mít velikost mm a váhu přibližně 2-4 g. Pokud jsou skladovány v chladu (10-15 ºC) a suchu, mohou být využívány až rok od sklizně. 4. Materiál 3.1 Testovaná látka, aquatický vzorek nebo vodný výluh 3.2 Pozitivní kontrola methylmethansulfonát, c = 10 mg/l 3.3 Negativní kontrola (zřeďovací voda) Rozpusťte následující chemikálie v destilované vodě nebo 2% DMSO, v případě, že testujete látky ve vodě nerozpustné (Tab. 1). 1 Meristém je rostlinné pletivo (= tkáň) tvořené nediferencovanými buňkami, jejichž funkcí je produkovat dceřiné buňky a zajišťovat tak růst rostliny. Meristémy jsou obvykle lokalizovány ve vrcholech rostliny v kořenových špičkách či vrcholech stonků (tzv. apikální meristémy) či místech, kde se zakládají budoucí listy apod. Meristematické buňky jsou analogy kmenových buněk u živočichů. 1

2 Tab. 1: Složení kultivačního média pro cibuli Chemikálie Koncentrace (mg/l) CaSO 4 * 60 MgSO 4 60 NaHCO 3 96 KCl 4 * CaSO 4 rozpouštějte za zahřívání a třepání dřív, než ho smícháte s ostatními solemi! Pozn.: ph kultivačního roztoku i testovaného vzorku by se mělo pohybovat mezi 5,5 a 8. Je-li třeba, upravte ph pomocí 1M HCl nebo NaOH na hodnotu Roztok na fixaci a maceraci Použijte směs 45% kyseliny octové (9 dílů) a 1M HCl (1 díl) 3.5 Barvící látka (orcein) 2% orcein rozpusťte v 45% kyselině octové 5. Pracovní postup 5.1. Předpěstování a expozice testovacích organismů Cibule se nejprve 24 hodin kultivují v kontrolním médiu: Vložte jednotlivé cibule navrch 15ml Falcon zkumavek, naplněných kontrolním médiem. Báze cibule musí dosahovat hladiny média. Stojan se zkumavkami přikryjte alobalem tak, aby byla kořeny během růstu ve tmě. Inkubujte rostliny při 25±1 C v kultivátoru se světelným cyklem. Po 24 hodinách připravte pozitivní kontrolu, koncentrace testovaného vzorku a čerstvé kultivační médium. Na jeden vzorek použijte 6 cibulí. 150ml kádinky naplňte 100 ml vzorku (nebo kontrolního média) a hladinu vody přikryjte alobalem. Do krycího alobalu vyražte 6 otvorů a přemístěte předpěstované rostliny tak, aby cibule byla nad alobalovým povrchem a kořeny uvnitř vzorku v kádince. Exponujte rostliny po dobu 48 hodin při 25±1 C v kultivátoru se světelným cyklem. 2

3 Tab.2 Testovací podmínky pro test genotoxicity na cibuli Testovací organismus: Cibule (Allium cepa) Sledované parametry: Mikrojádra v interfázních a chromosomální aberace v anafázníchtelofázních buňkách kořenové špičky Testovací podmínky: Stálá teplota a světelný cyklus 16 h/8 h (světlo/tma) Opakování: 6 rostlin na koncentraci Objem testovaného vzorku: 100 ml Teplota: (25 ± 1) C Délka expozice: 24 h předpěstování v kontrolní vodě, 48 h expozice Osvětlení: lux Chemikálie: vzorek, kultivační médium, methylmethansulfonát, DMSO, orcein, 45% kyselina octová, 1M HCl Pomůcky a zařízení: 150ml kádinky, 10ml zkumavky (skleněné a Falcon), analytické váhy, termostat, ph-metr, pipety, alobal, kultivátor, mikroskop, pinzeta, podložní sklíčka, krycí sklíčka, buničina 5.2. Macerace kořenových špiček a příprava pro mikroskopování Po expozici vylučte rostlinu s nejnižším růstem kořenů. Ostatních 5 rostlin na vzorek použijte pro mikroskopování. Z jedné rostliny odřízněte 5 kořenových špiček v délce asi 10 mm a vložte je do 10ml skleněné zkumavky s 2 ml roztoku kyselina octová/hcl (viz 3.4). Kořenové špičky zahřívejte po dobu 5 minut na 50 ºC. Tímto krokem se buňky fixují a macerují. Poté umístěte kořenové špičky na podložní sklíčko s černým pozadím a pro další přípravu špičky odřízněte v délce 1-2 mm. Zbytky kořenového materiálu a tekutiny odstraňte z podložního skla. Přidejte 2 kapky roztoku orceinu (viz 3.5) a smíchejte důkladně s kořeny pomocí roztírání a poklepávání ocelovou tyčinkou (kopistou). Kořenové buňky přikryjte krycím sklem. Barvicí proces trvá cca 5-10 min. Poté buňky rozmačkejte pomocí vložení preparátu mezi dvě vrstvy filtračního papíru a lehkým stisknutím palce. Mikroskopování proveďte okamžitě anebo krycí sklo zafixujte pomocí průhledného laku na nehty. Takový preparát může být uložen v lednici čerstvý až po dobu 2 měsíců Mikroskopická analýza Mikroskopická analýza zahrnuje mitotický index, přítomnost mikrojader v interfázních buňkách a chromosomálních aberací v buňkách pozdní anafáze či časné telofáze. Pro lepší pochopení sledujte obrázky (Obr. 1). Interfázní jádro je kompaktní, jednotlivé chromosomy nelze odlišit. Buňka není připravena na dělení. Naproti tomu v pozdní anafázi časné telofázi jaderné dělení vrcholí. 3

4 Obr. 1: Interfáze (1) a buňky v anafázi - časné telofázi (2) Mitotický index se stanovuje počítáním všech stádií mitotických buněk (dělících se buněk) v 1000 buňkách celkem. Chromosomální aberace lze hodnotit, pouze pokud je mitotický index nad 10/1000. Pak se aberace vyhodnocují v prvních 100 buňkách v anafázi nebo telofázi, kdy jsou preparáty prohlíženy zprava doleva, nahoru a dolů. Pro potřeby laboratoří aberace nestanovujte, pouze se pokuste nějaké najít (chromosomální fragmenty a můstky Obr. 2). Obr. 2: Dva chromosomální můstky (označené šipkami) V interfázních buňkách se vyhodnocuje přítomnost mikrojader. Mikrojádra jsou fragmenty chromosomů, obalené jadernou membránou (Obr. 3). Sledovat mikrojádra by se mělo v 1000 interfázních buňkách. Spočítejte mutované buňky v 1000 buněk. 4

5 Obr. 3: Mikrojádro v živočišné buňce Porovnejte testované preparáty s negativní kontrolou (žádné aberace a mikrojádra) a pozitivními kontrolními preparáty (přítomnost aberací a mikrojader). 6. Vyhodnocení výsledků Pro statistické zhodnocení výsledků použijte χ 2 test. Posuďte, zda je testovaný vzorek genotoxický či nikoliv. 7. Použitá literatura FERETTI, D., ZERBINI, I., ZANI, C., CERETTI, E., MORETTI, M., MONARCA, S. (2007): Allium cepa chromosome abberation and micronucleus tests applied to study genotoxicity of extracts from pesticide-treated vegetables and grapes. Food Addit. Contam. 24 (6): RANK, J., NIELSEN, M.H. (1997): Allium anaphase-telophase genotoxicity assay. Department of Environment, Technology and Social Studies, Roskilde University, Denmark. 5