Elektromigrační metody

Transkript

1 Elektromigrační metody

2 Princip metoda využívaná k separaci makromolekul na základě náboje, konformace nebo velikosti migrace nabité částice v elektrickém poli je úměrná jejímu celkovému náboji, velikosti a tvaru v = q. E / f frikční koeficient (popisuje tvar a velikost molekuly) rychlost celkový náboj intenzita el. pole + pi > ph kladný náboj + pi < ph záporný náboj malé částice s velkým nábojem velká pohyblivost velké částice s malým nábojem malá pohyblivost - volná elektroforesa zónová elektroforesa rovnovážná elektroforesa isoelektrická fokusace kapilární elektroforesa

3 Volná elektroforesa pufr vložením elektrod do pufru se molekuly proteinů začnou pohybovat k elektrodám s opačnou polaritou a rozdělí se na základě rozdílných nábojů a koeficientů tření vzniknou pohyblivá rozhraní mezi jednotlivými druhy proteinů nevýhody: konvekční míchání zón, mnoho vzorku, složitá aparatura vzorek

4 Zónová elektroforesa elektroforesa na nosiči nosiče: filtrační papír celulosa agarosa polyakrylamid omezení konvenčního míchání lepší rozdělení menší spotřeba vzorku elektroforéza na celulóze pohyb iontu v rozhodující míře závislý na poměru náboje k velikosti částice elektroforéza v gelu porózní gely umožňují separaci na principu molekulového síta a zároveň elektroforetické pohyblivosti provedení v trubičkách plošná vertikální horizontální

5 Aparatury pro trubičkové gely

6 AGAROSA Gely polysacharid z červených mořských řas extrémně jednoduchá příprava pory větší než 10 nm teplota tání 35 C - 95 C low melting agarosa (teplota tání ~ 65 C) velikost pórů: 150 nm 1 % gel 500 nm 0,16 % gel široký separační rozsah, ale relativně nízkou rozpustnost koncentrační rozsah 0,5 % - 4 % fragmenty DNA bp (větší fragmenty pulsní elektroforesa bp) velmi velké proteiny a proteinové agregáty PUFR: Tris-acetát-EDTA (TAE) nebo Tris-borát-EDTA (TBE) NANÁŠECÍ PUFR ( loading buffer -PLB): sacharosa, glycerol,... bromphenolová modř a xylen-cyan

7 analysa a purifikace DNA restrikičních fragmentů Ethidium bromid, SYBR Green citlivost 100 pg 1 ng/proužek Nukleové kyseliny

8 % agarosa rozsah [kb] 0,7 0,8-20 0,9 0,5-7 1,2 0,4-6 1,5 0,2-4 2,0 0,1-3

9 Pulsní gelová elektroforesa (PFG) použití: separace nukleových kyselin ( až bp)

10

11 Uspořádání PFG field inversion gel electrophoresis (FIGE) transverse alternating field electrophoresis (TAFE) rotating gel electrophoresis (RGE) clamped homogeneous electric field (CHEF)

12 FIGE 23 kb 48,5 kb 12 kb 0,5 kb Figure 2. Increased separation of the kb range with field inversion gel electrophoresis (FIGE). Run conditions: 230 V, 7.9 V/cm, 16 hrs., 50 msec. pulse, forward:reverse pulse ratio = 2.5:1, 1% GTG agarose, 0.5X TBE, 10 C.a) 1 kb ladder, kb; b) Lambda/Hind III, kb; and c) High molecular weight markers, kb. HSI Laboratories, Hoefer Scientific Instruments San Francisco, CA

13 RGE Figure 3. Rotating gel electrophoresis (RGE) separation Saccharomyces cercevisiae chromosomes ( kb). Run conditions: 180 V, 5.1 V/cm, 34 hrs., 120 angle, sec. pulse ramp, 0.5X TBE, 1.2% GTG agarose, 10 C. Two combs were used on the same gel to load 32 samples, a maximum of 72 are possible HSI Laboratories, Hoefer Scientific Instruments San Francisco, CA

14 Imunoelektroforesa ZÓNOVÁ ELEKTROFORESA/IMUNODIFUSE směs antigenù je nejprve elektroforeticky rozdělena, po té je do podélného žlábku nanesena směs protilátek a provedena imunodifuse tvorba precipitačních linií dojde-li k tvorbě komplexu Ag-Pl

15 ELEKTROIMUNODIFUSE - RAKETKOVÁ TECHNIKA gel obsahuje definovanou koncentraci protilátky

16 POLYAKRYLAMID chemicky inertní a mechanicky stabilní obtížnější příprava oproti agarosovému gelu T celková koncentrace akrylamidu C stupeň prokřížení podíl dimeru k monomeru T C = = a + b.100[%] V b.100[%] a + b a...hmotnost akryamidu [g] b hmotnost methylenbisakrylamidu [g] V objem [ml]

17 logu 200 = logu K T U T...relativní pohyblivost T 0 R. Fergusonova analýza U 0...volná relativní pohyblivost K R...tzv. retardační koeficient K. 2 7 R = 2, ,53.10 M r log UT koncentrace gelu [% T] Ferguson, K.A. (1964) Starch-gel electrophoresis-application to the classification of pituitary proteins and polypeptides. Metabolism 13,

18 PAGE Uspořádání: kontinuální diskontinuální ZAOSTŘOVACÍ GEL: nižší hodnota ph, nižší koncentrace polyakrylamidu DĚLÍCÍ GEL: má vyšší hodnotu ph než rozdělovací ELEKTRODOVÝ PUFR: Tris/Glycin/SDS zaostřovcí gel velké póry dělící gel malé póry princip zaostřování

19 SDS-PAGE Tris/Gly/SDS anionický detergent po zahřátí na 100 C rozbaluje protein a váže se na něj (1 molekula SDS na 2 AK, 1,4 g SDS na 1 g proteinu) velký náboj velká pohyblivost vysoké rozlišení dobrá fixace proužků lze odstranit z gelu, aniž by se uvolnily proteiny 10x vyšší detekční limit než nativní elfo Nevýhody: za nízkých teplot krystalizuje mnoho proteinů se chová anomálně -v důsledku neuniformní vazby SDS -proteiny s velkým záporným, velkým kladným nábojem a na prolin bohaté proteiny NANÁŠECÍ PUFR ( loading buffer -PLB): SDS, glycerol, DTT, pufr, bromfenolová modř, H 2 O

20

21

22 SDS-PAGE Tris/Tricin/SDS separace proteinů < 14 kda lineární rozlišení kda Tricin = N-Tris(hydroxymethyl) methyl glycine

23 SDS-PAGE Tris/Borát/EDTA elektroforesa glykoproteinů SDS se neváže na sacharidy CTAB-PAGE CTAB kationický detergent pro záporně nabité proteiny, silně bazické nukleoproteiny nedenaturuje protein, tj. řada proteinů má i po CTAB PAGE enzymatickou aktivitu kyselé prostředí ph 3-5 Nativní-PAGE i jiné pufry HEPES, MOPS, MES zymogramy

24 Gradientová gelová elektroforesa

25 Gradientová gelová elektroforesa

26 Preparativní PAGE

27 2D-PAGE

28

29

30 Gradientová gelová elektroforesa

31 Gradientová gelová elektroforesa

32 Preparativní PAGE

33 2D-PAGE

34

35

36 PAGE Nukleových kyselin sekvenování poslední krok sekvenace TBE pufr teplota > 50 C, přítomnost močoviny manuální sekvenování radioaktivní značení 32 P - chromogenní nebo chemiluminiscenční detekce na membráně pomocí značené proby - barvení gelu stříbrem

37 08_dideoxy_sequencing.swf

38 automatizované sekvenování 4 rozdílné fluorescenční značky 1 fluorescenční značka - fluorescein

39

40 PAGE nukleových kyselin fragmentů DNA % akrylamid rozsah [bp] 3, , , , , ARDRA restrikční analysa amplifikované rdna rozdělení po restrikčním štěpení specifický obraz

41 Figure 1. Restriction patterns obtained after restriction digestion with CfoI, AluI, MboI, RsaI and MspI for amplified 16S rdna of different Acinetobacter species

42 DNA fingerprinting RFLP restriction fragment lenth polymorphism

43 DNA fingerprinting Analýza VNTR pomocí PCR (highly variable repeat sequences) Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) loci regiony na chromosomalní DNA, na kterých se různěkrát opakuje krátký motif jako je GC nebo AGCT

44

45

46

47 RAPD náhodně amplifikovaná polymorfní DNA rychlá detekce polymorfismu širokého spektra organismů 2 krátké primery, nízká teplota amplifikace sady různých DNA fragmentů o různé velikosti RAPD různých variet kvasinek

48 Silver-stained polyacrylamide gel showing three distinct RAPD profiles generated by primer OPE15 for Haemophilus ducreyi isolates from Tanzania, Senegal, Thailand, Europe, and North America.

49 DGGE ELEKTROFORESA S GRADIENTEM DENATURUJÍCÍHO ČINIDLA detekce jednobodové mutace rozdílná elektroforetické pohyblivost částečně denaturovaných molekul (6 M močovina % formamid) TGGE ELEKTROFORESA S TEPLOTNÍM GRADIENTEM teplotní gradient (katoda 15 C, anoda 70 C)

50 PCR Amplification Mixed Population of DNA 16S rrna Gene + PCR Primers G+C-Rich Clamp G+C-Tailed Product Separate on Denaturing Gradient Gel Denaturing Gradient Gel Electrophoresis A B C D Increasing Denaturant

51 Negative image of an ethidium bromide stained DGGE gel loaded with 16S rrna coding gene

52 ETHIDIUM BROMID fluorescenční barva interkalační činidlo do gelu do pufru barvení po elfu Vizualizace DNA SYBR GREEN

53 Barvení proteinů Coommassie Brilliant Blue

54 Coomassie Blue x barvení stříbrem Porovnání identických gelů po barvení Coomassie Blue (dráhy 1 3) a po barvení stříbrem (dráhy 4 6). [B. S. Dunbar, Two-Dimensional Electrophoresis and Immunological Techniques, Plenum Press, New York,1987.]

55 DIGE DIFERENČNÍ GELOVÁ ELEKTROFORESA Cy2 Cy3 Cy5 excitace 488 nm emise 520 nm excitace 532 nm emise 580 nm excitace 633 nm emise 670 nm

56

57 Barva A max (nm) Použití Amidočerň10B 620 barvení proteinů Coomassie Brilliant Blue R barvení proteinů, 10 x citlivější než amidočerň Coomassie Brilliant Blue G barvení proteinů Alcian Blue 630 Glykoproteiny Methylene Blue 665 RNA, RNase Methyl Green 635 Nativní DNA, neutrální nebo kyselá dělící barva Fast Green FCF 610 barvení proteinů Basic Fuschin 550 Pyronin Y 510 RNA, kyselá dělící barva Bromocresol Green Glykoproteiny, nukleové kys., glykoproteiny bohaté na sialovou kys. dělící barva pro DNA agarosovou elfo Bromophenol Blue 595 neutrání nebo alkalická dělící barva Crocein Scarlet 505 Immunoelektroforesa Ethidium Bromide Fluorometrická detekce DNA Toluidine Blue O 620 RNA, RNase, mukopolysacharidy

58 Isotachoforesa migrace všech iontů stejnou rychlostí separace složek jako iontového vlaku zonový zaostřovací efekt diskontinuální systém vedoucí a terminační elektrolyt

59 migrace všech iontů stejnou rychlostí

60 separace složek jako iontového vlaku

61 zonový zaostřovací efekt

62 Isoelektrická fokusace agarosa nebo polyakrylamid konstantní teplota - pk a je závislé na teplotě 10 C volné nosiče gradientu ph pomocí ampholytů imobilisovaný gradient ph lineární gradient dvou různých polymerizačních směsí deriváty akrylamidu

63

64 difusní přenos kapilární přenos přenos vakuem elektropřenos Blotování - přenos

65 Membrány nitrocelulosa - nejběžnější polyviniliden difluorid vysoká vazebná kapacita nylon nukleové kyseliny diazobenzyloxymethyl chemická aktivace ionexové membrány - preparativní aktivovaná skleněná vlákna pro přímou sekvenaci

66 Detekce HYBRIDIZACE REAKCE SE SUBSTRÁTEM radioaktivní proba vysoká senzitivita, Southern blot neradioaktivní proba biotin streptavidin, dioxigenin nativní enzym, nedifundující substrát IMUNOBLOTTING 125 I-protein A enzymem značená sekundární protilátka konjugace s peroxidasou (tetrazoliová sůl), alkalickou fosfatasou zlatem značená sekundární protilátka (100 pg) chemiluminiscence nejcitlivější

67 Kapilární elektroforesa Probrané elektromigrační metody mají tři hlavní nedostatky: značná produkce Jouleova tepla během elektroforesy, hodnota vloženého napětí je tím limitována, použití nižšího napětí - odtud časová náročnost detekce - nutné barvení po elektroforese je obtížné automatizovat kapilární elektroforesa (CE) metoda byla vyvíjena od počátku 80. let (Jorgensen a Lukacs), první komerční přístroj se objevil v roce 1988

68 Způsoby provedení kapilární elektroforesy kapilární zonální elektroforesa micelární elektrokinetická chromatografie kapilární gelová elektroforesa kapilární izoelektrická fokusace kapilární izotachoforesa

69 stacionární vrstva (Sternova) mobilní vrstva (Guy-Chapmanova)

70 princip: pohyb podle velikosti náboje + elektroosmotický tok Lineární elektroforetická rychlost U ve = µ e. E = µ e. L t = L / v e = 2 L µ. U e N µ e. U = 2D ν e... rychlost toku µ e elektroforetická pohyblivost E... intenzita elektrického pole U... napětí L... délka kapiláry D difusní koeficient analytu

71 Elektroosmotický tok ζ = 4. π. η. µ ε EOF veof = µ EOF. E = ε. ζ. E 4. π. η µ EOF... elektroosmotická pohyblivost ζ... zeta potenciál ε... dielektrická konstanta η... viskosita elektrolytu r... poloměr kapiláry Celková rychlost pohybu analytu µ= µ e + µ EOF v = U ( µ + µ ). E = ( µ + µ ) L e EOF e EOF. t = L / v = 2 L ( µ + µ )U e EOF. N = ( µ + µ ) e 2D EOF. U

72

73 Kapilární zonální elektroforesa

74

75

76 CE Czech.swf

77 Kapilára polyimidový povlak tavený křemen ochranný polyimidový povlak délka cm vnitřní průměr µm vnitřní povrch lze modifikovat tavený křemen Detekce UV/Vis absorpce fluorescence radiometrie MS

78

79

80 Kapilární gelová elektroforesa na základě velikosti polymerní síta (agarosa, bis-polyakrylamid, methylcelulosa) kapilára je naplněna gelem - zvyšuje rozdíly mezi elektroforetickými rychlostmi velkých iontů různých tvarů, které jsou nuceny migrovat póry gelu nevzniká elektroosmotický tok - lze dělit pouze jeden druh iontů používá se pro velké ionty jako peptidy, bílkoviny, sacharidy, štěpy DNA a RNA

81 Dodnes však nenahradila klasickou gelovou vertikální a horizontální elfo. Výhody: - vysoká rychlost průchodu vzorku - přímá kvantifikace -možnost automatizace Nevýhody: -drahé přístrojové vybavení Pro sekvencování DNA se na přístroji Applied Biosystems 3730 DNA analyzer paralelně používá 96 kapilár, to umožňuje až 1000 analýz za 24 hodin. PAA gely pro proteiny, PAA a agarosové gely pro nukleové kyseliny. Modifikace při přípravě gelů (lineárně polymerovaný PAA), možnost použití řidších gelů oproti konvenčním.

82

83 Micelární elektrokinetická chromatografie dělení elektroneutrálních látek (hydrofobní a hydrofilní) na základě rozdílných rozdělovacích koeficientů mezi vodní a micelární fází povrchově aktivní látka přidána do pufru (detergent, např. SDS, deoxycholát sodný, CTAB) koncentrace detergentu musí být větší než je kritická micelární koncentrace (CMC). povrchově nabité micely migrují uvnitř pufru vlastní elektroforetickou rychlostí a unáší molekuly a ionty separovaných sloučenin, které jsou více či méně přítomny uvnitř hydrofobních dutin micel stupeň solvatace molekul micelami udává rychlost unášení těchto molekul micelami + -

84

85

86 Kapilární isoelektrická fokusace dělí molekuly mající amfolytickou povahu na základě jejich rozdílných isoelektrických bodů pi dělící kapilára se naplní roztokem dělených amfolytických látek a pomocného amfolytu, který je schopen pufrovat celý rozsah ph z opačných konců migrují do kapiláry OH - a H + ionty, které v ní vytvářejí spojitý lineární ph gradient dělené molekuly (ionty) putují roztokem dokud nedosáhnou ph, které se rovná jejich pi vytvoří úzkou zónu (fokusují) po fokusaci se zóny mobilizují (uvedou do pohybu), aby prošly detektorem a byly detekovány kapilární izoelektrické fokusování je použitelné pouze pro amfolytické molekuly

87 Kapilární izotachoforesa dělí ionty na základě jejich rozdílných elektroforetických mobilit roztok dělených iontů je dávkován jako rozhraní dvou rozdílných pufrů vedoucí, terminační iont každý separovaný iont vytváří během analýzy svoji vlastní zónu zóny všech dělených iontů jsou uzavřeny mezi vedoucí a terminační pufr a jsou seřazeny bezprostředně za sebou podle klesající elektroforetické pohyblivosti dělených iontů kapilární izotachoforéza je použitelná pouze pro molekuly s nábojem během jednoho experimentu lze dělit a detekovat pouze jeden druh iontů

88

89 Aplikace Analysa cukrů Analysa anorganických iontů DNA profil Identifikace proteinů výhody rychlost málo vzorku relativně levný automatizované nevýhody nelze identifikovat neutrální látky nelze rozlišit tvar

90

91 Při CE lze měnit několik parametrů pro lepší separaci. Optimální hodnoty jsou ale vždy důsledkem kompromisu. Př. Zmenšení průměru kapiláry umožňuje použití vyššího napětí (lepší odvod tepla). Zvýší se rozlišení a sníží doba analýzy. Snížením průměru se ale sníží tloušťka optické dráhy detektoru, tím poklesne citlivost detekce. Prodloužení kapiláry umožňuje opět použití vyššího napětí, avšak prodlouží se doba analýzy, vyšší difuze. Důležitá je volba vhodného pufru. S rostoucí iontovou silou roste vodivost, ale i produkce tepla.