Konce TTAA se oznaují jako lepivé konce, mže se na n pipojit jakékoli vlákno DNA, které zaíná AATT

Transkript

1 Molekulární genetika Text pro studenty septim a biologických seminá. Text vznikl v roce 2002 podle pednášek prof. Jaroslava Petra a lánk v asopisu Vesmír, v prbhu dalších let byl mírn aktualizován. Techniky molekulární genetiky (píklady významných technik) 1. Štpení molekul DNA Pomocí enzym restrikních endonukleáz (pocházejí z bakterií, v nich slouží k likvidaci cizorodé DNA virového pvodu). Enzym štpí molekulu na pesném míst pro každou endonukleázu specifický sled bází (typ palindrom te se stejn zleva jako komplementární úsek zprava). Nap. sekvence XXGAATTCXX, rozštpení: XXG AATTCXX proti ní XXCTTAAGXX XXCTTAA GXX Konce TTAA se oznaují jako lepivé konce, mže se na n pipojit jakékoli vlákno DNA, které zaíná AATT 2. Slepování molekul DNA Pomocí enzym ligáz, dv ásti molekuly DNA se mžou pipojit svými vzájemn komplementárními lepivými konci. Štpení a slepování molekul DNA lze mj. využít k vnesení nového genu do DNA bakterie i jiného organismu. Penášený gen se oddlí od pvodní DNA pomocí restrikních endonukleáz, pomocí stejných endonukleáz se rozštpí DNA píjemce (tj. kraje štp jsou komplementární), pomocí ligáz se nový gen pipojí k DNA píjemce. 3. Hybridizace DNA Umožuje testování, do jaké míry je njaká neznámá molekula DNA shodná (resp. komplementární) se známou molekulou (základním principem je využití komplementarity bází DNA). Hybridizaci mžeme nap. využít ke zjišování míry shodnosti gen u rzných organism (z toho lze usuzovat na jejich píbuznost) nebo na porovnání uritého genu u zdravého a nemocného jednice (tím je možné zamítnout i podpoit hypotézu, že zkoumaný gen je odpovdný za danou nemoc pokud je gen zdravého a nemocného úpln shodný, je potvrzeno, že gen není zodpovdný za vznik sledované choroby. 4. Elektroforeze Urování délky zkoumaného etzce DNA. Vychází z toho, že DNA je elektricky nabitá. DNA se umístí na gelovou destiku s mikropóry do silného stejnosmrného elektrického pole. Záporn nabitá molekula DNA se posunuje smrem ke kladnému pólu, ím menší molekula, tím se pohybuje rychleji. Uritý as se nechají molekuly DNA pohybovat v elektrickém poli. Výsledek se (fotografickou cestou) zobrazí jako rovnobžné proužky v rzné vzdálenosti od kraje. Každý proužek odpovídá úseku DNA jisté délky. K zobrazení lze pidat mítko a podle umístní proužku urit poet pár bází zkoumaného úseku DNA. 5. PCR Polymerázová etzcová reakce Postup, který umožuje získat velké množství shodným molekul DNA. 6. Sekvenování DNA Kombinace pedchozích metod, umožuje pesné zjištní poadí bází na zkoumaném úseku DNA. Nároné na as a zrunost laboranta, v souasné dob se sekvenuje na automatech napojených na poíta (tzv. sekvenátorech), na poítai se rovnou zobrazuje poadí bází na zkoumané DNA. tení genomu Zjišování úplného poadí bází na DNA rzných organism. Píklady petených genom: Viry, ada bakterií (více než 20 kmen, nap. pvodci TBC, skvrnitého tyfu, syfilis, boreliózy, Helicobacter pylori, ) Kvasinky Molekulární genetika strana 1/5

2 Prvoci (nap. trypanozomy, plasmodium) Hlístice (Caenorhabditis elegans) Drosofila, komár Anopheles, vela Huseníek (Arabidopsis thaliana) relativn malý genom 2n=10, 120 milión bází Trávy, obilniny, rýže. Obratlovci (ryby tverzubci, myš, potkan, šimpanz, makak, tur, pes, vaice, ptakopysk) lovk ( ohlášeno kompletní petení lidského genomu, ve skutenosti chyblo nkolik %), postupn se dokonuje petení celého geonomu. Projekt HGP (Human Genom Project) vyhlášen v 90. letech, podílí se ada laboratoí v nkolika státech každá laborato osekvenuje úsek, postupn se skládá celý genom. Do projektu se zapojily i soukromé firmy (Celera Genomics). Význam hledání vztahu gen vlastnost. Známe-li pesné sekvence gen, mžeme zjišovat, jak se projeví jejich odchylky na fenotypu porovnání gen zdravých a nemocných jedinc (lidí i zvíat) porovnání sekvencí u rzných druh nové poznatky pro výzkum vývoje druh, evoluní píbuznost. (Nap. genom lovka a šimpanze se podle pedbžných výsledk liší v 1,5 % sekvencí zamení výzkumu bude na to, co tchto 1,5% odlišné informace zapisuje). Jeden z pedbžných výsledk je, že ada druh se geneticky odlišuje mén než fenotypov. genetické otisky prst z drobného vzorku na míst inu (nap. vlas, kapka krve, odloupnutý kus kže, ) lze izolovat DNA a porovnat s DNA podezelých (staí porovnat jen krátký úsek, který se liší u rzných jedinc). Neexistuje geneticky identická dvojice lidí (s výjimkou jednovajených dvojat). pesnjší diagnostika bakteriálních a virových chorob z tla nemocného se izoluje vzorek patogenního organismu, jeho DNA se porovná s databází a tím se urí pesná diagnóza. (k porovnání staí krátký specifický úsek DNA). genová diagnostika a poradenství (rozpoznání genetických poruch u vyvíjejícího se zárodku, zjišování pítomnosti recesivních alel u rodi) genová terapie (viz dále) Genové manipulace (genové inženýrství) Používané termíny: GMO geneticky manipulované organismy organismy, kterým byl upraven genom Transgenní organismy organismy, které mají do svého genomu zabudovaný nový gen Knokautované organismy organismy, kterým odebrán nebo vyazen z innosti njaký gen Bakterie Od 70. let, v souasnosti ada bžných biotechnologických postup. Využívá se schopnosti bakterií vymovat si genetickou informaci. Do plazmidu se vloží potebný gen, nkteré bakterie jsou schopné tento plazmid vlenit do své buky. za vhodných podmínek tím mohou získat schopnost syntézy potebné látky (bílkoviny). V souasnosti se takto získává nap. lidský inzulín, rstový hormon, apod. (je to levnjší a mén rizikové, než získávání téhož produktu od zvíat množství zvíat, imunitní odpov, riziko BSE, ) Rostliny Rzné techniky, základní princip: izolace potebného genu, jeho pípadná úprava (nap. spojení dvou gen z rzných rostlin), vpravení do genomu rostliny (pomocí mikroinjekce, virového nosie apod.), namnožení rostlin, kde byla genová úprava úspšná. Nkteré manipulace ve stádiu výzkumu, jiné už v praxi (nap. sója a kukuice v USA) Využití Získání odolnosti proti hmyzím škdcm Bt kukuice obsahuje gen z Bacillus thuringiensis, který zajišuje odolnost proti hmyzím škdcm (u kukuice jde hlavn o motýla zavíjee kukuiného), podobn nap. Bt brambory odolné proti mandelince bramborové Odolnost proti herbicidm umožuje ošetit kulturu herbicidem plevele znieny, rostlina vydrží Odolnost proti plísním, bakteriím, virm Zvýšení odolnosti proti mrazu, suchu, zasolení pdy Schopnost syntézy nových látek, nap. Zlatá rýže vnesen gen pro zvýšení obsahu provitamínu A, podobn jiné transgenní odrdy mají geny pro zvýšení množství železa a fosforu v obilkách (vtší výživná hodnota rýže) Molekulární genetika strana 2/5

3 epka chimérický gen (složený z gen dvou rzných organism) pro oleosin+hirudin produkce hirudinu (protisrážlivý faktor využití nap. pi operacích, levnjší než získávat z pijavek) Bavlna obsahující gen pro modré barvivo na poli se sklízí rovnou modrá bavlna, nemusí se barvit Vnesení genu, který umlí jiné geny nap. u rajete je inhibován gen produkující enzym, který psobí mknutí plod. ištní kontaminovaných pd nkteré rostliny lze geneticky upravit tak, že do nadzemních ástí akumulují nap. tžké kovy v mnohonásobné koncentraci oproti koncentraci v pd. Rizika Penos genu na jiné kulturní odrdy nebo plan rostoucí rostliny kíženec nesoucí modifikovaný gen mže v populaci pevážit a postupn vytlait ostatní varianty snížení genetické variability druhu Invazní rostliny GM rostlina sama nebo její kíženci. Masov se šíí, protože je odolnjší než konkurenti. Nepíznivé psobení na živoichy, kteí požírají GM rostlinu (žádoucí likvidace škdc, nežádoucí likvidace ostatních druh, možné negativní úinky technických GM rostlin na živoichy). nap. z Bt kukuice se vtrem penesl pyl na další rostliny (jiné druhy), na nich motýl Monarcha sthovavý, pro nj pyl toxický). Nepíznivé psobení na predátory škdc snížení množství potravy, látky z GM rostlin v tlech škdc Vznik rezistence škdc (nap. rezistence vi Bt kukuici je recesivní; opatení: kolem polí s Bt kukuicí se vyseje ochranný pás normální kukuice vtšina pylu z GM rostliny se zachytí v ochranném pásu, v normální kukuici se mohou vyvíjet a množit jedinci nesoucí dominantní alely, ti se kíží s recesivními, tj. v populaci nepeváží recesivní homozygoti) Možnost vzniku nových virových chorob rostlin jako penašee gen se používají viry, za uritých podmínek by se mohly rekombinovat virové geny a vytvoit se nový vir Díve obsahovaly GM rostliny geny rezistence k antibiotikm (tyto geny byly ve vazb s vnášeným genem a sloužily k selekci tch rostlin, kde se správn zalenil nový gen) riziko penosu na patogenní bakterie, dnes se ze všech GM rostlin tyto geny odstraují. Psobení na lovka potenciální alergeny (lovk mže mít alergii nap. na oechy pokud se gen z oech penese na jinou plodinu, mže tato GM plodina vyvolat alergickou reakci). Obecn: 1) Polní pstování GM rostlin je uritým zásahem do ekosystému a pináší jistá rizika 2) GM rostliny mžou obsahovat nové alergeny nebo jejich kombinace (úinek pvodní rostliny se zkombinuje s úinkem vneseného genu), které mžou být rizikové pro nkteré lidi (pípadn zvíata) Testy GM rostlin Test produktu genu bílkoviny: obsah a distribuce v rostlin, vliv na rostlinu Bezpenost bílkoviny: toxikologické zkoušky na myších a dalších pokusných zvíatech, izolace bílkoviny, zjišování sekvence aminokyselin (skandál: Bt brambory, zkoušky na potkanech potkani krmení výhradn Bt brambory, špatná kondice a hynutí potkan dv interpretace: 1) dkaz toxicity Bt brambor pro potkany/ 2) špatn uspoádaný pokus bez srovnávacího vzorku (= potkani krmení normálními brambory), na potkany nepízniv psobily jiné látky, než produkt vneseného genu Srovnání s geneticky nemodifikovanou odrdou (obsah látek, toxicita) Písné zákony pokud njaká ze zkoušek dopadne nepízniv, není povolena distribuce GM rostliny. V ad zemích Evropy vtšina genov manipulovaných rostlin zakázána (veejné mínní, ekonomika), v USA podmínky liberálnjší (nap. velké plochy GM sóji a kukuice). GM rostliny nadjné zejména pro tetí svt zvýšení výnosu a nutriní hodnoty, odolnost vi škdcm (asto až 90% úrody znií škdci, plísn apod.) Živoichové Genové manipulace složitjší a he proveditelné než u rostlin nebo bakterií (rozsáhlejší genom, složitjší regulace, nemožnost vegetativního rozmnožování, ) Využití zvýšení rstu hospodáských zvíat odolnost vi chorobám zmna vlastností produkt (nap. snížení množství laktózy v kravském mléce) produkce farmakologicky využitelných bílkovin, nap. v mléce (vakcína proti viru hepatitidy B, faktor srážlivosti krve, ) produkce nových materiál (umlá pavuina, ) Molekulární genetika strana 3/5

4 Techniky vpravení genu do zárodku i tkán mikrokapilárou málo úinné pomocí virových nosi penést lze jen nkteré geny, u nkterých vir riziko (nap. imunitní reakce) vpravení genu do kultury bunk in vitro, výbr vhodných jader, kde byl penos genu úspšný, klonování (vnesených takto upravených jader do oocyt vývoj nového jedince) Nap: Z embrya se odeberou fibroblasty (zárodené pojivové buky), do nich se penese vybraný gen. Jádra s novým genem se penesou do oocytu zbaveného vlastního jádra, vajíka jsou pak implantována do dlohy. Narodí se transgenní potomek, který produkuje potebnou látku. (Ovce Polly v mléce produkuje faktor IX pro srážení krve léba hemofilie. Získávání faktoru IX touto cestou je mnohonásobn levnjší, než jinými zpsoby). Klonování Obecn jde o získání geneticky shodných jedinc. Klon je každá skupina geneticky shodných bunk i organism (nap. vegetativn namnožené rostliny, prvoci vzniklí dlením jedné buky apod.) Klonování savc ti dležité metody: 1) Dlení zárodk Na úrovni moruly se zárodek rozdlí na nkolik ástí, za píznivých okolností se z každé ásti vyvine samostatné embryo schopné dalšího vývoje. Nap. opice Tetra vyvinula se z embrya vzniklého rozdlením pvodního embrya na 4 ásti (ti ostatní zárodky zahynuly bhem vývoje). Využití: Rozdlení embrya hodnotného hospodáského zvíete získání vtšího potu jedinc (nap. pi oplodnní in vitro získá se vtší množství embryí, ty se testují, nejlepší se vyberou a naklonují dlením). (Pirozen takto vznikají jednovajená dvojata) 2) Penos jader Do oocytu (samií pohlavní buka) zbaveného vlastního jádra se penese 2n jádro z vybrané buky genetického rodie. Pak se buka stimuluje k dalšímu vývoji, vnese se do dlohy biologické matky a nechá se vyvinout pirozenou cestou. P.: Ovce Dolly jádro buky mléné žlázy dosplé ovce. Úspšné jen u nkterých druh (zatím nejvtší úspchy u ovcí a skotu), zatím spíš ojedinlé úspchy (Dolly z 277 pokus jeden úspšný). Základním problémem je interakce cytoplasmy vajíka píjemce a jádra dárce. V první fázi je vývoj oplozeného vajíka ízen enzymy a RNA, které jsou pítomny v cytoplasm a pocházejí od biologické matky. Po uritém ase (nap. myš 2 dny, prase a lovk 4 6 dní, ovce 8 dní, králík 16 dní) ízení vyvíjející se buky pevezme její jádro. Po implantaci nového jádra do oocytu njaký as trvá, než se nové jádro nastaví na situaci v nové buce a pevezme její ízení. Pokud je po tuto dobu buka ízena RNA a enzymy v cytoplasm (tj. pokud toto ízení trvá delší dobu nap. 8 dní u ovce), je vyšší pravdpodobnost úspchu. Pi penosu jader jsou v cytoplasm buky píjemce mitochondrie (které mají vlastní DNA), tj. geny nesené mitochondriemi pocházejí od biologického rodie, ostatní od genetického rodie. U ovce Dolly se objevil další problém: na koncích chromozom každé buky jsou úseky telomery, které se pi každém dlení buky zkracují. Pokud se telomery zkrátí na minimum, bunný cyklus se zastaví a buka se dál nedlí (délka telomer tedy odpovídá potu dlení buky ím astjší dlení buky, tím kratší telomery). (U pohlavních bunk se telomery obnoví na pvodní délku.). Ovce Dolly má telomery odpovídající stáí své genetické matky, tj. mnohem kratší, než ovce stejného vku, a projevují se u ní choroby typické pro pokroilý vk (nap. artróza). 3) Využití embryonálních kmenových bunk (ESC) Za uritých podmínek se ESC množí bez diferenciace, vznikne hodn bunk se stejnou genetickou informací. Existují postupy, jak z tchto bunk získat adu životaschopných geneticky shodných zárodk (zatím úspšné pokusy u myší, u dalších zvíat se nedaí). Z ESC lze ovlivnním diferenciace získat (u myší) adu rzných tkání. Genové manipulace a klonování lovka Klonování lovka 1) Reprodukní cílem klonování je vytvoit geneticky (tém) shodného jedince s dárcem jádra ve vtšin zemí zakázáno, velké biologické riziko (vrozené vývojové vady), eticky nevyjasnno Molekulární genetika strana 4/5

5 2) Terapeutické cílem klonování je získání bunk pro lébu Genové manipulace u lovka Genové manipulace jsou omezeny (prozatím) na tlní buky tj. jde o zmny v bukách, ze kterých se nevyvíjejí potomci, zmna se týká jen jednoho jedince Genové manipulace se zárodenými bukami (tj. bukami, ze kterých budou vznikat mj. pohlavní buky) zmna se týká všech potomk zatím složité a riskantní, ve vtšin zemí zakázáno. Ve stadiu experiment je vytvoení umlého chromozomu, na který se penesou potebné nové geny. Takový chromozom bez problém prochází mitózou i meiózou a mže být možností, jak ešit obtíže a technická rizika manipulace se zárodenými bukami. Výsledek je riskantní z etického a sociálního hlediska. Genové manipulace mžou nap. prodloužit lidský vk (u zvíat úspšné pokusy) tak, že jednotlivá stádia vývoje budou trvat déle. Pro reprodukci budou pak dlouhovcí lidé vyhledávat odpovídající partnery. Lidé geneticky manipulovaní (tj. ti, kteí investovali peníze do genetické výbavy svých potomk) budou pednostn vyhledávat geneticky manipulované partnery, pítomnost nového chromozomu mže být pekážkou plodnosti potomk geneticky pozmnných lidí s nepozmnnými. Všechny tyto ti píklady mohou vést k rozdlení lidské populace na skupinu geneticky pozmnných a geneticky nepozmnných, mezi nimiž bude postupn vznikat reprodukní bariéra. Genová terapie lovka Pevážn ve stadiu pokus (zkoušky na zvíatech, klinické pokusy na dobrovolnících) Léba nkterých chorob zpsobených vadným genem Do organismu se vpraví (rznými technikami nap. mechanickým vnesením, pomocí viru, transplantací geneticky pozmnných bunk, ) genový konstrukt, který nahradí nefunkní nebo vyadí z provozu vadný gen. Nap.: - defekt enzymu adenosin deaminázy léba transfekcí kostní den (3 vyléené pípady) - hemofilie do bunk se vpraví gen pro produkci chybjícího faktoru srážlivosti - Alzheimerova choroba do mozku injikovány vlastní buky se zvýšenou produkcí GNF (= nervový rstový faktor) - srdce buky obsahující gen pro faktor rstu nových cév, gen pro zvýšení produkce NO Pokusy s lidskými ESC (embryonálními kmenovými bukami) cílem je navodit diferenciaci tak, aby vznikly konkrétní tkáové buky, které lze transplantovat do nemocného orgánu (nap. buky produkující inzulín, buky srdeního svalu, buky stny srdeních cév, mozkové buky léba Parkinsonovy choroby, ) Jedna z možných technik: Pacient dá své buky, jejich jádra se penesou do oocytu zbaveného jádra (ped tím mže dojít k jejich genetické modifikaci nap. se vnese gen pro schopnost produkovat inzulín), embryo se vyvine, vytvoí se ESC, z nich se diferencuje potebná tká, ta se transplantuje na potebné místo. Naznaený postup zaruuje, že transplantované buky nebudou odmítnuty imunitním systémem. Dva problémy: 1) etický usmrcení embrya 2) technický z ESC vzniknou jiné buky než chceme Snaha o ešení problému 1) pokusy s využitím zvíecích bunk, do kterých bude peneseno jádro lidské buky (nepíliš úspšné), druhou možností je použití vlastních bunk pacienta, které se uritými zásahy vrátí do nediferencovaného stavu a budou se chovat jako ESC (zatím ve stadiu prvních pokus). DNA vakcíny DNA okování místo oslabeného nebo mrtvého patogenu se do bunk vnáší jen ást jeho DNA produkce nap. virové bílkoviny vyvolání imunitní reakce (nap. HIV, TBC, salmonella, malárie, ) Léba nádor (asi 70% klinických zkoušek) (Nádor množící se tká, chová se jinak než normální tká v tle) Základní princip: 1. Do nádoru se vpraví gen. 2. Podá se látka, která psobí na geneticky pozmnné buky. Tím se nap. rovnou usmrtí nádorové buky, aktivizuje se imunitní systém, který nádor znií, zastaví se rst cév, které nádor vyživují, obnoví se innost genu, který spouští apoptózu (apoptóza = naprogramovaná sebevražda buky, u nádorových bunk je gen pro spuštní apoptózy deaktivovaný). Molekulární genetika strana 5/5