Hořké kyseliny chmele a možnosti jejich stanovení v pivovarské praxi

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Hořké kyseliny chmele a možnosti jejich stanovení v pivovarské praxi Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Tomáš Gregor, Ph. D. Vypracovala: Markéta Pohlová Brno 2013

2 2

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Hořké kyseliny chmele a možnosti jejich stanovení v pivovarské praxi vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne podpis

4 PODĚKOVÁNÍ Tímto bych chtěla poděkovat Ing. Tomáši Gregorovi, Ph.D. za odborné vedení mé bakalářské práce, za pomoc a cenné rady, které mi vždy ochotně poskytnul. 4

5 ABSTRAKT Cílem mé bakalářské práce je zvládnout problematiku hořkých kyselin chmele a jejich stanovení v pivovarské praxi. V úvodu se zabývám charakteristikou, systematickým zařazením, morfologií, pěstováním, odrůdami Chmele otáčivého (Humulus lupulus L.) a jeho chemickým složením. Velká část práce je věnována látkám obsaženým v chmelových hlávkách, především chmelovým pryskyřicím. Dále jsou v práci zmíněny mezinárodní jednotky hořkosti, které jsou důležité při hodnocení intenzity hořkosti piva. V neposlední řadě jsou popsány možnosti stanovení hořkých látek v chmelu, chmelových výrobcích, mladině a pivu. KLÍČOVÁ SLOVA Chmel, hořké kyseliny, α-hořké kyseliny, β-hořké kyseliny, iso-α-hořké kyseliny. ABSTRACT The aim of my bachelor thesis is to manage the issue of hop bitter acids and their determination in brewing practice. The introduction deals with the characteristics, placement in a systematic, morphology, cultivation, varieties of hops (Humulus lupulus L.) and its chemical composition. Large part of this work is devoted to the substances contained in hop cones, especially hop resins. The thesis also mentions international bitterness units, which are important when evaluating the intensity of bitterness of beer. At least, in this thesis there are described options of determination of bitter substances of hops, hop products, wort and beer. KEY WORDS Hops, bitter acids, α-bitter acids, β-bitter acids, iso-α-bitter acids. 5

6 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Chmel otáčivý (Humulus lupulus L.) Systematické zařazení Morfologie chmele Pěstební oblasti a posklizňová úprava Odrůdy chmele Chemické složení chmele Látky v chmelových hlávkách Chmelové pryskyřice Chmelové polyfenoly třísloviny Chmelové silice Doprovodné látky Voda Jednotky hořkosti piva IBU (EBU) Stanovení hořkých látek v chmelu a chmelových výrobcích Stanovení α-hořkých a β-hořkých kyselin spektrofotometricky Pracovní postup Výpočet a vyhodnocení Stanovení hořkých látek modifikovanou Wöllmerovou metodou Příprava základního methanolového roztoku Stanovení veškerých pryskyřic Stanovení měkkých pryskyřic Stanovení konduktometrické hodnoty

7 Stanovení korekčního součinitele octanu olovnatého Výpočet a vyhodnocení Stanovení konduktometrické hodnoty chmele modifikací dle EBC Pracovní postup Výpočet a vyhodnocení konduktometrické hodnoty Stanovení iso-α-hořkých kyselin Woodovou metodou Pracovní postup Výpočet a vyhodnocení Stanovení α-hořkých a β-hořkých kyselin ve chmelu a chmelových extraktech metodou HPLC (EBC) Příprava kalibračního roztoku chmelového extraktu a chmele Chromatografické stanovení Výsledky a vyhodnocení Stanovení hořkých látek v mladině a pivu Stanovení jednotek hořkosti podle EBC Pracovní postup Výpočet a vyhodnocení Spektrofotometrické stanovení iso-α-hořkých a α-hořkých kyselin Pracovní postup Výpočet a vyhodnocení Izolace iso-α-hořkých kyselin z piva metodou SPE Pracovní postup Výsledky a vyhodnocení MATERIÁL A METODIKA Stanovení α-hořkých a β-hořkých kyselin HPLC s UV detekcí VÝSLEDKY A DISKUZE ZÁVĚR

8 7 LITERATURA POUŽITÉ ZKRATKY

9 1 ÚVOD Pivo jest velice zdravý a velmi výživný nápoj, ducha našeho upevňuje, mysl utužuje a rozveseluje. Tadeáš Hájek z Hájku Za národní nápoj Čechů lze považovat pivo, což dokazuje i jeho roční spotřeba, která činí cca 150 l na občana ČR. Základní surovinou pro výrobu piva je chmel, který se pěstuje na našem území od konce 9. století. Tato rostlina našla své uplatnění již ve středověku, kdy lidé věřili v jeho léčebné účinky a pojídali ochucené chmelové výhonky. V dnešní době je chmel pěstován po celém světě především k pivovarským účelům. Oblíbenost zlatavého moku je ovlivňována mnoha faktory a jedním z nich je jeho specifická příjemná hořkost. Tu má na svědomí zejména přítomnost iso-α-hořkých kyselin extrahovaných z lupulinu, který je součástí chmelu. Iso-α-hořké kyseliny během chmelovaru přechází do mladiny a poté do hotového piva. Výchozí látkou pro tyto kyseliny jsou α-hořké kyseliny, jejichž obsah v chmelu je závislý na různých faktorech. Pro stanovení obsahu hořkých kyselin v chmelu a chmelových výrobcích existuje v odborné literatuře mnoho metod. Tyto metody rozlišuje především způsob přípravy vzorku použitého k analýze a také princip stanovení složek. V práci jsou popsány především základní metody pro stanovení hořkých kyselin v chmelu, chmelových výrobcích, v samotném pivu a mladině. Mezi hlavní metody využívané ke stanovení α-hořkých a β-hořkých kyselin se řadí rychlá spektrofotometrická metoda, která se odvíjí od schopnosti chmelových pryskyřic absorbovat světlo v UV oblasti. Pro stanovení konduktometrické hodnoty chmele se využívá metoda modifikace dle EBC a modifikovaná Wöllmerova metoda. Díky této metodě lze velmi rychle stanovit obsah α-hořkých kyselin, které tvoří nerozpustné soli s olovnatými ionty. Nejvíce používanou metodou je stanovení hořkých látek vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií, která slouží ke stanovení α-hořkých kyselin, β- hořkých kyselin a jejich analogů. 9

10 2 CÍL PRÁCE Cílem mé bakalářské práce bylo vypracovat literární rešerži o problematice hořkých kyselin a zaměřit se na jejich stanovení v materiálech pivovarského provozu, jako je mladina, chmelové výrobky a pivo. V závěru práce pak navrhnout vhodné analytické postupy, které by bylo možné použít v laboratoři Ústavu technologie potravin. 10

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Chmel otáčivý (Humulus lupulus L.) Chmel otáčivý je popínavá, vytrvalá, dvoudomá rostlina, pěstující se na stejném stanovišti 25 i více let. Tato rostlina se pěstuje po celém světě a mezi její největší producenty patří Německo, Spojené státy americké a Česká republika. Chmel je nejen základní surovinou pro výrobu piva, ale také významně ovlivňuje jeho senzorické vlastnosti. Pivu dodává typickou hořkost, charakteristické aroma a plnost chuti. V dřívějších dobách se používal chmel v pivovarství k zajištění vyšší trvanlivosti piva díky svým bakteriostatickým účinkům. Pro dodání hořkosti a úpravě dalších vlastností piva se začal používat až později. Chmel se také využívá v potravinářských odvětvích a farmacii, v lékařství se využívá samičích hlávek a jejich sekrečních žláz tzv. lupulinu proti revmatismu a špatnému trávení. Zcela však převládá využití v pivovarském průmyslu. (GOŁABCZAK J., GENDASZEWSKA-DRMACH E., 2010; PRUGAR J. a kol., 2008; BASAŘOVÁ G. a kol., 2011) Systematické zařazení Chmel patří stejně jako konopí seté do čeledi rostlin konopovitých. Nejznámější je chmel otáčivý, jehož poddruhem je chmel evropský. Mezi další druhy patří chmel planý a chmel japonský. Ty se pěstují pro křížení při šlechtění nových odrůd ke zlepšení technologických vlastností. Chmel japonský se pěstuje v Asii jako okrasná rostlina. K pivovarským účelům se pěstují pouze samičí rostliny chmele evropského v mnoha odrůdách. (KOSAŘ K., PROCHÁZKA S., 2000) Morfologie chmele Chmelová rostlina je tvořena kořenovou soustavou, révou s pazochy a listy s květenstvími, která se v průběhu zrání mění na chmelové hlávky. Chmelové hlávky, které se sklízejí pro pivovarské účely, se skládají ze stopky, vřeténka, pravých a krycích listenů a při oplození obsahují navíc semeno neboli pecku. Na vnitřní straně listenů se při zrání chmele vylučují pryskyřičná zrnka lupulinu. Ty obsahují chmelové prysky- 11

12 řice a silice představující pivovarsky nejcennější složky chmele. Jejich vnitřní skladba a celkové množství závisí na odrůdových vlastnostech, současně jsou však značně ovlivňovány pěstitelskými a klimatickými podmínkami, čímž kvalita chmele v jednotlivých letech silně kolísá. (KOSAŘ K., PROCHÁZKA S., 2000) Pěstební oblasti a posklizňová úprava Na našem území jsou velmi příznivé podmínky pro pěstování chmele a to z hlediska složení půd, klimatu, množství srážek, směru větru a slunečního záření. V České republice se pěstování chmele státně řídí a kontroluje. Jsou zde povoleny tři pěstitelské oblasti Tršicko, Ústecko a Žatecko. Chmel je náročná rostlina, především na vláhu, světlo, teplo a na půdní podmínky. Pro dobrý vývoj květenství a hlávky vyžaduje nejvíce světla v období zrání. Průměrná roční teplota by se měla pohybovat od 8 do 10 C. Kvůli velkému nárůstu zelené hmoty je chmel rostlina vlhkomilná. Půda by měla být dobře zásobená dusíkem, fosforem, draslíkem, vápníkem a hořčíkem. Chmelové hlávky obsahují po sklizni % vody. Nutné je snížení obsahu vody sušením na %. Sušení se provádí v komorových žaluziových sušárnách, kde se chmel vrství a suší 5 až 8 hodin teplým vzduchem, který nesmí přesáhnout 50 C. Pásové sušárny jsou modernější, pracují kontinuálně a dají se zapojit přímo do linky k česacímu stroji. Odsušený chmel se sladuje na půdách, kde zvyšuje svůj obsah vody na 11 %, přejímáním vzdušné vlhkosti. Následuje třídění, lisování do žoků, další zpracování nebo odvoz do pivovarů. Díky předpisům České republiky je chmel certifikován, tím je zajištěna garance původu, odrůdová čistota a dodržení kvalitativních parametrů. (KOSAŘ K. a kol. 2000) Odrůdy chmele Chmelové odrůdy se podle obchodního a pivovarského hlediska dělí na jemné (aromatické), hořké a vysokoobsažné. Aromatické odrůdy poskytují pivu vynikající chmelové aroma i hořkost a jsou zastoupeny především žateckými odrůdami. Hořké a vysokoobsažné odrůdy mají vysoký obsah pryskyřic a méně příznivé aroma. Chmelové odrůdy 12

13 se dále dělí dle zbarvení chmelové révy a to na červeňáky, které jsou díky vyššímu obsahu polyfenolů načervenalé (žatecké odrůdy) a zeleňáky (zahraniční odrůdy). Dle vegetační doby zrání se odrůdy chmele dělí na rané, polorané a pozdní odrůdy. Aromatické odrůdy se většinou řadí mezi rané a polorané, oproti tomu hořké odrůdy se řadí mezi pozdní. V ČR je v současnosti povoleno pěstování odrůd Žateckého poloraného červeňáku. (PRUGAR J. a kol., 2008) Chemické složení chmele Chmel je z chemického hlediska tvořen chmelovými pryskyřicemi, silicemi a polyfenoly. Charakteristikou českého chmele je jemnější charakter hořkosti, což je způsobeno nižším obsahem alfa-hořkých kyselin a nižším poměrem alfa-hořkých kyselin k betahořkým kyselinám. Dále má český chmel ušlechtilé jemné aroma díky příznivé skladbě chmelových silic. Pozornost se také věnuje tzv. problémovým složkám, jež mohou negativně ovlivnit kvalitu chmele či chmelových výrobků. (PRUGAR J. a kol., 2008; BASAŘOVÁ G. a kol., 2011) Tab. 1: Chemické složení chmele. (FEIGERL L., 2008). LÁTKA OBSAH % Voda 8 12 Celkové pryskyřice Polyfenolové látky 2 6 Silice 0,2 2,5 Vosky a lipidy 1 3 Dusíkaté látky Sacharidické látky (celulosa) Minerální látky

14 3.2 Látky v chmelových hlávkách Český chmel patří mezi představitele velmi jemných aromatických chmelů. V chmelových hlávkách jsou zastoupeny jednotlivé charakteristické skupiny látek. Jedná se o: Chmelové pryskyřice Třísloviny Silice Doprovodné látky Voda Tab. 2: Minimální požadavky pro uvádění chmelových hlávek na trh. (KROFTA, K., 2008). Vlastnosti Popis Maximální obsah (hm. %) Upravený chmel Neupravený chmel Vlhkost Obsah vody Listy a stopky Části listů z úponků, stopky 6 6 listů nebo hlávek; za stopku se považují stopky hlávek dlouhé nejméně 2,5 cm Chmelový odpad Malé částečky tmavě zelené 3 4 až černé barvy vzniklé při strojové sklizni, které obvykle nepocházejí z hlávky; částečky jiných odrůd chmele než odrůdy, pro které se vydají ověřovací listiny původu, mohou představovat až 2 % hmotnosti Obsah pecek Zralé plody hlávek

15 3.2.1 Chmelové pryskyřice Chmelové pryskyřice jsou látky syntetizované ze žláz lupulinu nacházejících se v samičích chmelových hlávkách. Tyto transformační produkty jsou zdrojem hořkosti piva, zvyšují biologickou trvanlivost díky antiseptickým účinkům a stabilizují pěnu piva. Pryskyřice jsou složitým komplexem látek, z nichž pouze u některých známe chemické složení i strukturu. Hořké kyseliny jsou v čistém stavu bez chuti a vůně a jsou téměř nerozpustné ve vodě. V první polovině období dozrávání dochází k maximálnímu přírůstku hořkých látek. V ČR je maxima dosaženo koncem srpna a tato hladina hořkých kyselin je udržována asi do začátku září, poté postupně klesá. Podstatou hořkých chmelových látek jsou dvě sloučeniny krystalické povahy, a to α-hořká a β-hořká kyselina. Díky oxidaci a polymeraci těchto kyselin vznikají příslušné měkké a tvrdé pryskyřice, které se liší rozpustností v různých organických rozpouštědlech. Látky nerozpustné při extrakci hexanem jsou označovány jako tvrdé pryskyřice. Ve sladině jsou tvrdé pryskyřice oproti měkkým téměř nerozpustné a dlouhou dobu byly považovány pouze za balast. Rozdělení celkových pryskyřic: měkké o α-hořké kyseliny (humulony) o β-hořké kyseliny (lupulony) o γ-hořké kyseliny (humulinony) o δ-hořké kyseliny (hulupony) o ε-dosud nespecifikované pryskyřice tvrdé o δ-pryskyřice o γ-pryskyřice α-hořké kyseliny (obr. 1) se skládají ze sedmi analogů humulonu, kdy v přirozených směsích převládají kohumulon, humulon, a adhumulon. Obvykle se obsah α-hořkých kyselin v chmelu pohybuje od 3 do 10 hm. %. Hořkost tyto kyseliny získají až při výrobě piva ve fázi chmelovaru, kdy dochází k izomeraci α-hořkých kyselin na iso-alfa hořké kyseliny. Na intenzitu a rychlost isomerace má příznivý vliv vyšší ph a přítomnost 15

16 kovových iontů. Iso-α-hořké kyseliny se během varního procesu formují ve dvou prostorových formách cis- a trans- (2:1) ve prospěch stabilnější cis- formy. Úbytek transformy se projeví snížením hořkosti a tvorbou senzoricky nežádoucích látek, což může být způsobeno stárnutím. Iso-α-hořké kyseliny také prokazují zranitelnost na světlo a snadno podléhají oxidacím, což se projevuje při skladování piva změnou chuti. Kromě dostatečného balení piva se mohou minimalizovat degradace iso-α-hořkých kyselin přídavky fenolických sloučenin s antioxidačními vlastnostmi nebo přídavky čistých stereoizomerů cis-iso-α-hořkých kyselin. Ve směsi analogů se vyskytují také β-hořké kyseliny (obr. 2) např. kolupulon, lupulon a adlupulon. β-hořké kyselin jsou z pivovarského hlediska méně významné. Díky dalšímu hydrofóbnímu postrannímu řetězci klesá rozpustnost ve vodném prostředí. Během chmelovaru se z malé části přeměňují na oxidačně izomerační produkty hulupony, které jsou rozpustné v mladině a pivu. K celkové intenzitě senzorické hořkosti přispívají velmi málo. Až do dnešní doby byl výzkum zaměřen především na studium vlivu měkkých pryskyřic na vlastnosti piva, proto existuje velmi málo informací o funkci tvrdých pryskyřic na kvalitu piva. Na základě výzkumů Almaguera (2012) bylo zjištěno, že tvrdé pryskyřice pozitivně působí na stabilitu pěny. S rostoucí koncentrací tvrdých pryskyřic byla hořkost příjemná a stabilita piva vysoká. (ALMAGUER C. a kol., 2012; CABALLERO I. a kol., 2012; KARABÍN M. a kol., 2009; KOSAŘ K., PROCHÁZKA S., 2000; OL- ŠOVSKÁ J. a kol., 2012; PRUGAR J. a kol. 2008; VENT L., 1963; VESELÝ D., 2006) Obr. 1: Humulon Obr. 2: Lupulon 16

17 3.2.2 Chmelové polyfenoly třísloviny Mezi třísloviny se řadí flavonoidy, jednoduché fenolové kyseliny jako je gallová, hydroxyskořicová, kávová, kumarová a jejich deriváty. Polyfenolům v pivu jsou přisuzovány účinky antioxidační, antimutagenní, antikarcinogenní, antimikrobiální a antitrombotické. Tyto látky jsou velmi reaktivní a snadno podléhají oxidačně redukčním přeměnám. Polyfenoly se dostávají do piva ze surovin tj. ze sladu, chmele a chmelových preparátů. Množství a složení tříslovin je závislé na odrůdě i lokalitě. Obsah celkových polyfenolů ve chmelu se pohybuje od 2 do 6 hm. %. Třísloviny pozitivně ovlivňují trvanlivost výrobku, senzorickou stabilitu piva a přispívají především k výraznosti a říznosti piva. Díky vyššímu obsahu polyfenolů v českých pivech se naše piva odlišují od piv zahraničních. (DOBEŠOVÁ K., 2010; KELLNER V. a kol. 2010) Chmelové silice Chmelové silice jsou nositelem typického chmelového aroma a řadí se mezi sekundární metabolity chmele. Chmelovým aroma se rozumí vjem, vzniklý působením vonných a chuťových látek obsažených v chmelových silicích. V chmelu se nachází 0,4 2,5 % silic, které obsahují více než 200 látek různého chemického složení. Chmelové silice lze rozdělit podle složek na uhlovodíkovou frakci a sirnou frakci. Nejdůležitější a nejvíce zastoupenou je uhlovodíková frakce, především myrcen, karyofylen, humulon a fernesen. Žatecký poloraný červeňák lze dle obsahu a charakteristickému složení silic velmi dobře identifikovat. U ostatních odrůd je složení silic podobné. (KROFTA K., ČEPIČ- KA J., 2000; PLUHÁČKOVÁ H. a kol., 2011) 17

18 3.2.4 Doprovodné látky Mezi doprovodné látky chmele patří cukry, dusíkaté látky, lipidy, vosky, SO 2 a těžké kovy. Tyto látky téměř nemají vliv na technologii a kvalitu piva. Těžké kovy, zejména měď, zinek, mangan a železo, se do chmele dostávají postřikovými látkami. Oxid siřičitý se objevuje u sířených chmelů. Pokud se obsah oxidu siřičitého v mladině zvýší nad 25 mg na 1 l, může dojít ke zhoršení pěnivosti piva. Na činnost kvasinek může mít nepříznivý vliv přítomnost dusičnanů, které se mohou díky některým mikroorganismům redukovat na dusitany, jež jsou pro kvasinky toxické. Pektiny naopak pozitivně ovlivňují stupeň využití hořkých látek. (RYBÁČEK J., 1980) Voda Obsah vody může mít vliv na chmel během jeho skladování. Pokud je chmel příliš suchý, drolí se a dochází ke ztrátám především hořkých látek. Snadněji napadány mikroorganismy jsou oproti tomu chmele s obsahem vody vyšším než 12 %, ty také více podléhají i oxidačním a polymeračním změnám. Z toho důvodu se po usušení udržuje obsah vody v chmelových hlávkách od 10 do 11 %. (BASAŘOVÁ G. a kol., 2010) 18

19 3.3 Jednotky hořkosti piva IBU (EBU) IBU International Bitterness Units je zkratka pro mezinárodní jednotku hořkosti, která je stanovena Americkým sdružením pivovarských chemiků. Používá se také jednotka EBU European Bitterness Units, ta je stanovena Evropskou pivovarskou konvencí a její hodnota by se neměla od IBU příliš lišit. 1 IBU odpovídá 1 mg iso-α-hořkých kyselin na jeden litr piva. Čím vyšší je hodnota IBU, tím větší je hořkost daného piva. Protože se jedná o chemický výpočet, pivo s vyšším IBU se nám někdy může zdát méně hořké, než pivo s nižším IBU. To platí u piv s vyšším obsahem sladové složky, která je na chuť méně hořká, ale má více IBU, než pivo s nižším obsahem sladové složky. Sládci se musí zaměřit na požadovanou hořkost odhadovanou na základě množství a kvality chmele použitého k vaření piva. IBU lze vypočítat pomocí trojčlenky např: Na výrobu ležáku použijeme Žatecký poloranný červeňák obsahující 2,5 5,5 % (pro výpočet použijeme hodnotu 5,5 %) α-hořkých kyselin. Na výrobu 100 l piva navážíme 50 g chmelu ,5 100 = 2,75g α-hořkých kyselin l x g α-hořkých kyselin...1 l x = 0,0275 g = 27,5 mg α-hořkých kyselin na 1 l piva = 27,5 IBU U piva se hodnotí intenzita hořkosti, která charakterizuje intenzitu prvního vjemu při napití, dále charakter hořkosti vyjadřující doznívání hořké chuti v dutině ústní. U českého piva by intenzita hořkosti měla být střední až silná a charakter mírně drsný až drsný ulpívající. Běžné hodnoty u mladiny jsou jednotek hořkosti. U piva je to jednotek hořkosti. 10% piva mívají hořkost asi jednotek IBU a 12% ležáky se pohybují mezi jednotek IBU. Hořkost je měřena pomocí spektrofotometru a extrakce. (ANONYM, 2012; KORBEL M., 2013; SHELLHAMMER T., 2009; KOSAŘ K., PROCHÁZKA S., 2000) 19

20 Tab. 3: Jednotky hořkosti piva. (ANONYM, 2012) 4 6 Berliner Weisse Berlínské bílé 6 12 Biere blanche 6 18 Weissbier 8 16 American lager Trapistická piva Ležák Kölsch Tmavé pivo Porter Bocl Březňák Oktoberfestové pivo Ležák plzeňského typu Sklepní pivo Alt IPA (india pale ale) Stout 20

21 3.4 Stanovení hořkých látek v chmelu a chmelových výrobcích Hořké kyseliny patří mezi nejdůležitější složku chmele. Mezi nejpoužívanější metody stanovení hořkých látek patří konduktometrická, spektrofotometrická a chromatografická metoda. (PRUGAR J. a kol., 2008) Stanovení α-hořkých a β-hořkých kyselin spektrofotometricky Díky své chemické struktuře mohou chmelové pryskyřice absorbovat UV světlo. Množství absorbovaného světla závisí na ph roztoku a použitém rozpouštědle. Stanovení hořkých kyselin chmele a chmelových výrobků pomocí spektrofotometrické metody je velmi rychlé. Vlastní stanovení se provádí proměřováním absorbance toluenového extraktu v UV spektrofotometru při vlnových délkách 325 nm pro alfa kyseliny, 355 nm pro beta kyseliny a 275 nm pro alfa a beta kyseliny. Zjištěné hodnoty dosazujeme do rovnice regrese. Tato metoda se běžně používá v USA pro stanovení hořkých kyselin čerstvých chmelů. U starších chmelů přesnost stanovení klesá, jelikož se mění tvar absorpčních spekter. (KROFTA K., TICHÁ J., 1997) Pracovní postup Pět gramů čerstvého mletého chmele se naváží do 250ml skleněné láhve a přidá se 100 ml toluenu. Po dobu 30 minut se láhev třepe na třepačce a poté se nechá usadit. Do odměrné baňky o objemu 100 ml se převede 5 ml vyčeřeného toluenového extraktu a po rysku se doplní methanolem (roztok A). Roztok B získáme tak, že z A roztoku se odebere 5 ml do odměrné baňky o objemu 50 ml, po rysku se doplní alkalickým methanolem (ke 100 ml methanolu se přidá 0,2 ml roztoku NaOH o koncentraci c = 6 mol/l). Následuje měření absorbance roztoku B při vlnových délkách 275, 325 a 355 nm proti slepému vzorku. Slepý vzorek se připraví stejným ředěním, akorát místo vzorků chmele použijeme 5 ml toluenu. (KROFTA K., 2008) 21

22 Výpočet a vyhodnocení Obsah α-hořkých a β-hořkých kyselin se vypočte z naměřených hodnot absorbancí dle Aldertonových empirických vztahu: AHK = d. 77,79. A ,56. A ,07. A 275 BHK = d. 55,57. A ,59. A ,10. A 275 A 355, A 325, A 275 absorbance při odpovídajících vlnových délkách (nm) AHK obsah α-hořkých kyselin v měřeném roztoku (mg. l -1 ) BHK obsah β- hořkých kyselin v měřeném roztoku (mg. l -1 ) d faktor ředění pokud se pro přípravu roztoku B použije 5 ml roztoku A, pak je ředící faktor d = (100 x 50)/(500x5x5) = 0,40 Přepočtem na procenta v sušině se získá výsledek, který se zaokrouhlí na jedno desetinné místo. Obsah α-hořkých a β-hořkých kyselin se u chmele a chmelových výrobků pohybuje od 2,0 do 10,0 % v sušině a u lupulinu od 10,0 do 35,0 %. (KROFTA K., 2008) Stanovení hořkých látek modifikovanou Wöllmerovou metodou Jedním ze světově nejvíce používaným způsobem stanovení hořkých látek je Wöllmerova metoda. Pomocí této metody lze stanovit jednotlivé frakce hořkých chmelových látek, které slouží k posouzení pivovarské hodnoty a celkové jakosti čerstvého chmele. Pomocí diethyletheru se extrahují chmelové pryskyřice z drtě chmelových hlávek, které se následně frakcionují dle rozpustnosti ve studeném methanolu. Konduktometrickou titrací odměrným roztokem octanu olovnatého se stanoví α-hořké kyseliny. Wöllmerova metoda je velmi zdlouhavá, ale nenáročná na vybavení laboratoře a množství používaných chemikálií. (VENT L., 1963) 22

23 Příprava základního methanolového roztoku Deset gramů rozemletého chmele se nasype do extrakční nádoby o objemu 300 ml, zalije se 200 ml diethyleteru a v laboratorní třepačce se třepe po dobu 2 hodin. Po sejmutí se pipetuje 100 ml čirého roztoku do kuželové baňky se zábrusem. Následuje destilace diethyletheru na rotačním vakuovém odpařováku za přívodu interního plynu. V baňce s 15 ml methanolu se rozpustí odparek, a aby došlo k vyloučení vosků vloží se uzavřená baňka na 2 hodiny do chladničky. Studený roztok se přefiltruje do 50 ml odměrné baňky přes papírový filtr zvlhčený methanolem. Baňka s roztokem se vytemperuje na 20 C a doplní methanolem po rysku. (BASAŘOVÁ G. a kol., 1993) Stanovení veškerých pryskyřic 10 ml základního methanolového roztoku se napipetuje do zvážené baňky o objemu 100 ml. Destilace methanolu se provádí za slabého vakua na rotačním vakuovém odpařováku. Zbytek se za sníženého tlaku dosouší v baňce po dobu šesti minut. Následuje vyrovnání podtlaku, proplach baňky vzduchem a před zvážením se vloží baňka na 30 minut do exsikátoru. (BASAŘOVÁ G. a kol., 1993) Stanovení měkkých pryskyřic Do odstředivkové kyvety se napipetuje 10 ml methanolového roztoku, přidá se 40 ml n-hexanu a třepe se po dobu 30 sekund. Přidá se 20 ml destilované vody a kyveta se vloží do vertikální třepačky na 30 minut. Následuje odstřeďování v odstředivce po dobu 2 minut při 2000 otáček za minutu. Po té se kyveta vyjme a pipetuje se 30 ml z hexanové horní fáze do zábrusové varné baňky. Na rotačním vakuovém odpařováku se oddestiluje hexan na vodní lázni o teplotě 70 C. Po destilaci se baňka propláchne proudem vzduchu, osuší a nechá vychladnout 30 minut v exsikátoru a zváží se. (BASAŘOVÁ G. a kol., 1993) 23

24 Stanovení konduktometrické hodnoty 10 ml základního roztoku a 40 ml směsi dimethylsulfoxidu a ethanolu se převede do kádinky (100 ml). Kádinka se vloží na magnetickou míchačku, umístí se míchadélko a do roztoku se ponoří elektrody. Dále se do roztoku vloží špička byrety s octanem olovnatým, spustí se konduktometr a zaznamenává se titrační křivka. Vyhodnocení se získá tak, že se ramena titrační křivky proloží přímkami a průsečík těchto přímek odpovídá spotřebě titračního činidla v bodě ekvivalence. Provádí-li se titrace ručně, octan olovnatý se dávkuje mikrobyretou po 0,25 ml. Hodnota vodivosti se odečítá po každém ustálení ručičky konduktometru a je zaznamenávána na milimetrový papír proti spotřebě odměrného roztoku. (BASAŘOVÁ G. a kol., 1993) Stanovení korekčního součinitele octanu olovnatého Ke čtyřem mililitrům kyseliny sírové se přidá 40 ml směsi dimethylsulfoxidu a ethanolu. Titrace se provádí konduktometricky odměrným roztokem octanu olovnatého. Korekční součinitel odměrného roztoku octanu olovnatého se vypočítá ze vztahu uvedeného Basařovou G. (1993): = 3,794 f 1 korekční součinitel odměrného roztoku octanu olovnatého f 2 korekční součinitel odměrného roztoku kyseliny sírové a spotřeba odměrného roztoku octanu olovnatého v ml Výpočet a vyhodnocení a) V původním roztoku se obsah celkových pryskyřic (CP) v % určí dle vztahu: = 10 24

25 b hmotnost odparku při stanovení celkových pryskyřic (g) n hmotnost navážky vzorku chmele (g) b) Procentuální zastoupení měkkých pryskyřic (MK) v původním vzorku se vypočte dle vztahu: = 1333 c hmotnost odparku při stanovení měkkých pryskyřic (g) n hmotnost navážky vzorku chmele (g) c) Konduktometrická hodnota (KH) v % se vypočte pomocí vzorce: = 18,85 d spotřeba odměrného roztoku octanu olovnatého v ml n hmotnost navážky vzorku chmele v g d) Obsah β-podílu měkkých pryskyřic (BP) v % se vypočte dle vztahu: = e) Zastoupení tvrdých pryskyřic (TP) v původním vzorku se určí dle vztahu: = U čerstvých chmelů se hodnoty pohybují pro celkové pryskyřice mezi 12 a 20 %, měkké pryskyřice 9 až 18 %, konduktometrická hodnota 3 až 10 % a tvrdé pryskyřice od 2 do 5 %. (BASAŘOVÁ G. a kol., 1993) 25

26 3.4.3 Stanovení konduktometrické hodnoty chmele modifikací dle EBC Konduktometrická metoda slouží k rychlému stanovení obsahu α-hořkých kyselin a dalších složek chmelových pryskyřic, které tvoří s olovnatými ionty nerozpustné soli. Ze chmele jsou hořké látky extrahovány toluenem a následně stanoveny konduktometrickou titrací. (FORSTER A., 1987) Pracovní postup Přesně 10 g mletého chmele se naváží do 200ml skleněné láhve a přidá se 100 ml toluenu. Při 6 až 10 tis ot/min se uzavřená láhev extrahuje po dobu 8 minut v extraktoru. Po ukončení extrakce se nechá obsah usadit. Pipetou se odebere 15 ml čirého extraktu do 100ml kádinky a přidá se 50 ml methanolu. Po promíchání následuje samotná titrace, při které musí být elektrody ponořeny do roztoku a míchadélko správně seřízeno, aby se mezi elektrody nedostaly bublinky vzduchu. Titruje se methanolovým roztokem octanu olovnatého, který se připraví rozpuštěním 20 g octanu olovnatého v methanolu s přídavkem 0,5 ml ledové kyseliny octové v 1000ml odměrné baňce doplněné methanolem po rysku. Titruje se s nadbytkem 1 ml v bodě ekvivalence, k získání rovného raménka křivky vyhodnocení spotřeby titračního činidla. Titrační křivka znázorňuje závislost vodivosti titrovaného roztoku na objemu přidaného titračního činidla. Vyhodnocení se získá proložením obou ramen titrační křivky přímkou, kdy průsečík obou přímek odpovídá bodu ekvivalence tedy objemu spotřebovaného titračního činidla. (KROFTA K., 2008) Výpočet a vyhodnocení konduktometrické hodnoty = 12,60! KH konduktometrická hodnota v původním vzorku v % V objem titračního činidla v bodě ekvivalence (ml) T titr octanu olovnatého W navážka vzorku v g 26

27 12,60 stechiometrická konstanta Konduktometrická hodnota se udává s přesností na jedno desetinné místo a u chmele se pohybuje se v rozmezí 2 až 10%, u lupulinu až 40 %.(KROFTA K., 2008) Stanovení iso-α-hořkých kyselin Woodovou metodou Základní složkou isoextraktů jsou iso-α-hořké kyseliny. Podle jejich obsahu se dá určit způsob dávkování. Po okyselení zředěného roztoku isoextraktu následuje extrakce isooktanem. Okyseleným methanolem se přečistí izooktanový extrakt a spektrofotometricky se stanoví obsah iso-α-hořkých kyselin. (BASAŘOVÁ G. a kol., 1993) Pracovní postup S přesností na jedno desetinné místo se naváží 0,4 g isoextraktu, který se rozpustí ve 100 ml methanolu. Z roztoku se odpipetují 2 ml do 250ml odměrné baňky a doplní se po rysku vodou. 10 ml vodného roztoku se odpipetuje do odstředivkové kyvety (80 ml) nebo kuželové baňky, přidá se 1 ml odměrného roztoku HCl a 20 ml isooktanu. Po dobu 2 minut při teplotě 20 C se obsah nádoby intenzivně protřepává a následně se odstřeďuje. Dále se odpipetuje 10 ml z isooktanové fáze do kuželové baňky (50 ml) a přidá se 10 ml roztoku okyseleného methanolu, následně se roztok promísí stonásobným převracením nádoby. Poté co se oddělí fáze, změří se absorbance izooktanové fáze při vlnové délce 275 nm proti isooktanu promytém roztokem okyseleného methanolu. (BASAŘOVÁ G. a kol., 1993) Výpočet a vyhodnocení Ze vzorku analyzovaného extraktu se obsah iso-α-hořkých kyselin (IAK) v % vypočte pomocí vzorce: "#= # $%

28 A 275 absorbance isooktanového roztoku při 275 nm N navážka vzorku isoextraktu v g Výsledek se zaokrouhlí na jedno desetinné místo. Přesnost metody je ± 2 %. Isoexrakty vyráběné průmyslově obsahují většinou 20 nebo 40 % iso-α-hořkých kyselin (BASA- ŘOVÁ G. a kol., 1993) Stanovení α-hořkých a β-hořkých kyselin ve chmelu a chmelových extraktech metodou HPLC (EBC) Z chmele jsou hořké kyseliny extrahovány směsí diethylether-methanol a zředěným roztokem HCl. Chmelové extrakty se rozpouští v methanolu. Na chromatografické HPLC koloně s reverzní fází dojde k dělení alfa a beta kyselin, které jsou poté spektrofotometricky detekovány při 314 nm. Ke stanovení se používá kapalinový chromatograf vybavený UV detektorem a analytická HPLC kolona nejčastěji Nukleosil 250 x 4 mm, RP C18. (HERMANS- LOKKERBOL J., VERPORTE R., 1994; ONO M. a kol., 1984) Příprava kalibračního roztoku chmelového extraktu a chmele Odváží se vzorek zhomogenizovaného extraktu o obsahu 0,5 g veškerých pryskyřic. K navážce se přidá 30 ml methanolu a vzorek se rozpustí v ultrazvukové lázni. Roztok se převede do 100ml odměrné baňky a po rysku se doplní methanolem. Do 50ml odměrné baňky se odpipetuje 10 ml tohoto roztoku a opět se po rysku doplní methanolem. Hlávkový chmel se rozemele na jemno a odváží se 10 g do 250ml láhve. Přilije se 20 ml methanolu, 100 ml diethyletheru a 40 ml HCl (0,1 M) a obsah se třepe 40 minut na třepačce. Poté se nechá láhev asi 10 minut stát, aby došlo k oddělení fází. Z horní fáze se odpipetuje 5 ml do odměrné baňky o objemu 50 ml a po rysku se doplní methanolem. Po filtraci je roztok připravený k chromatografické analýze. (HERMANS- LOKKERBOL J., VERPORTE R., 1994) 28

29 Chromatografické stanovení Jako mobilní fáze se použije methanol, voda a kyselina fosforečná (900:180:5) a průtok se nastaví na 0,8 ml/minutu. Detektorem se snímá vlnová délka 314 nm. Objem nástřiku vzorku je 10 µl a teplota termostatu je nastavena na 40 C. Analýza hořkých kyselin trvá přibližně 20 minut a výsledkem je chromatografická křivka neboli chromatogram. Hořké kyseliny jsou elučním systémem rozděleny na 4 složky kohumulon, humulon a adlhumulon, kolupulon, lupulon a adlupulon. (HERMANS-LOKKERBOL J., VER- PORTE R., 1994) Výsledky a vyhodnocení Zastoupení jednotlivých složek se vypočte z ploch píků jednotlivých analogů hořkých kyselin ve vzorku. & = ' ( )* &) # & ( * # &) c i koncentrace složky i ve vzorku vyjádřená v % hm. F faktor ředění, F = 1 pro chmelové extrakty, F = 2 pro hlávkový a granulovaný chmel m CS hmotnost kalibračního extraktu (g) c ic koncentrace složky i v kalibračním extraktu vyjádřená v % hm. A i plocha elučního píku i ve vzorku m S hmotnost vzorku (g) A ic plocha elučního píku složky i v kalibračním roztoku Celkový obsah alfa kyselin se vyjádří součtem kohumulonu, humulonu a adhumulonu. Množství beta kyselin odpovídá součtu obsahu kolupulonu, lupulonu a adlupulonu. Obsah kyselin se vyjádří v hmotnostních procentech. (HERMANS-LOKKERBOL J., VERPORTE R., 1994) 29

30 3.5 Stanovení hořkých látek v mladině a pivu Stanovení jednotek hořkosti podle EBC Spektrofotometricky pomocí isooktanu se extrahují hořké látky, zejména iso-α-hořké kyseliny z okyseleného piva (mladiny). (BASAŘOVÁ G. a kol., 1993) Pracovní postup Před samotným stanovením se bez ztráty pěny odstraní oxid uhličitý z piva a následně se odstředěním vyčeří zakalené vzorky piva. K úpravě vzorku se nesmí použít filtrace. Do centrifugační kyvety (30 ml) se odpipetuje 10 ml vzorku, 0,5 ml roztoku HCl (c = 6 mol. l -1 ), 20 ml isooktanu a přidáme pár skleněných kuliček. Po dobu 15 minut a teplotě 20 C se kyvety třepou na třepačce. Poté odstřeďujeme 3 minuty při frekvenci otáček 3000 za minutu. Proti čistému isooktanu se změří absorbance isooktanového extraktu při vlnové délce 275 nm. (BASAŘOVÁ G. a kol., 1993) Výpočet a vyhodnocení Jednotky hořkosti (JH) se vypočítají podle vztahu: + =50 # A absorbance isooktanového extraktu vzorku při 275 nm. Výsledky se uvádí v celých číslech. Pokud budou v pivu přítomny sloučeniny jako n- heptyl-p-hydroxybenzoát, kyselina salicylová, kyselina sorbová a sacharin, výsledky analýzy budou nepoužitelné, protože tyto látky jsou rozpustné v isooktanu a sorbují ultrafialové světlo při vlnové délce 275 nm. Pivo má 10 až 40 jednotek hořkosti v závislosti na typu piva a množství dávky chmele. U mladiny je to 20 až 60 jednotek hořkosti. (BASAŘOVÁ G. a kol., 1993) 30

31 3.5.2 Spektrofotometrické stanovení iso-α-hořkých a α-hořkých kyselin Z okyseleného piva (mladiny) se extrahují hořké látky pomocí isooktanu a kyselým methanolem se vymyjí z extraktu rušící látky. Změřením absorbance v alkalickém prostředí methanolu při 255 a 360 nm se stanoví koncentrace iso-α-hořkých kyselin a α-hořkých kyselin. (CLAUS H. a kol., 1978) Pracovní postup Pivo se před samotným stanovením musí zbavit bez ztráty pěny oxidu uhličitého. Pokud bude vzorek zakalen, je třeba jej odstředit při 3000 otáček za minutu po dobu 15 minut. 50 ml čirého roztoku (20 C) se nepipetuje do centrifugační kyvety a přidají se 3 ml roztoku HCl a 25 ml isooktanu. Následně se centrifugační kyveta třepe 30 minut na třepačce a poté se odstřeďuje 5 minut při 3000 otáčkách za minutu. Pipetou se oddělí spodní vodná fáze a k isooktanové fázi se přidává bezvodý síran sodný, dokud se roztok nevyčeří. Do zkumavky se převede 10 ml čirého roztoku, 10 ml kyselého roztoku methanolu a stonásobným převrácením se obsah promísí. Do odměrné baňky o objemu 25 ml se odpipetuje 5 ml čiré isooktanové fáze a doplní se po rysku alkalickým roztokem methanolu. Při vlnové délce 255 a 360 nm se změří absorbance připraveného roztoku proti slepému vzorku, který se připraví smícháním 5 ml isooktanu a 20 ml alkalického roztoku methanolu. (BASAŘOVÁ G. a kol., 1993; CLAUS H. a kol., 1978) Výpočet a vyhodnocení Obsah iso-α-hořkých kyselin se vypočte podle vztahu: Iso-α-K =2# %% 48,53 2# 45 26,53 Iso-α-K koncentrace iso-α-hořkých kyselin v mg. l -1 A 255 absorbance změřená při vlnové délce 255 nm A 360 absorbance změřená při vlnové délce 360 nm 31

32 Obsah α-hořkých kyselin se podle vzorce: α-k=# α-k koncentrace α-hořkých kyselin v mg. l -1 A360 absorbance změřená při vlnové délce 360 nm Výsledky se uvádí v celých číslech v jednotkách mg. l -1. V pivu se koncentrace iso-α-hořkých kyselin pohybuje okolo 10 až 40 mg. l -1 v závislosti na typu piva a množství použitého chmele. Obsah iso-α-hořkých kyselin bývá obvykle 2 mg. l -1. V mladině se pohybuje obsah iso-α-hořkých kyselin okolo 15 až 60 mg. l -1 a u α-hořkých kyselin 1 až 20 mg. l -1. (BASAŘOVÁ G. a kol., 1993) Izolace iso-α-hořkých kyselin z piva metodou SPE Stanovení iso-α-hořkých kyselin se běžně provádí kapalinovou chromatografií s UV detekcí při 270 nm. Protože se jedná o sloučeniny snadno podléhající oxidaci, je klasická extrakce kapalina-kapalina nahrazena šetrnější extrakcí na tuhé fázi (technika SPE). Nejvíce se uplatňují sorbenty s různými reverzními fázemi vázané na silikagel nebo sorbenty na polymerní bázi, které vynikají vysokou kapacitou a univerzálností použití. K separaci se využívá například chromatografická kolona Nucleosil 100 C18, 250 x 4 mm. Jako mobilní fáze se použije směs voda, methanol a kyselina fosforečná. (JUR- KOVÁ M. a kol., 2003) Pracovní postup K extrakci se použije polymerní sorbent (STRATA X). Nejprve se kolona připraví promytím 1,5 ml methanolu a 1,5 ml deionizované vody. Dále se přes kolonu přeseje 5 ml odpěněného piva. Znovu se kolona promyje 1,5 ml roztoku 5 % methanolu v deionizované vodě. Kolona se vysuší ve vakuu po dobu 30 sekund a je eluována methanolem do výsledného objemu 1,5 ml. Na kolonu se nadávkuje 10 µl eluátu. (JURKOVÁ M. a kol., 2003) 32

33 Výsledky a vyhodnocení Vyhodnocení se provede změřením ploch píků. Iso-α-hořké kyseliny eluují ve třech zónách iso-n-humulon, iso-kohumulon a iso-adhumulon. Iso-α-hořké kyseliny se vyhodnotí společně po sečtení všech píků. (JURKOVÁ M. a kol., 2003) 33

34 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Stanovení α-hořkých a β-hořkých kyselin HPLC s UV detekcí Analýza α-hořkých a β-hořkých kyselin z chmelového výluhu byla provedena metodou kapalinové chromatografie s UV detekcí při vlnové délce 273 nm. Chmelový výluh byl získán povařením chmelových hlávek Žateckého poloraného červeňáku Late ve vodě. Obsah α-hořkých kyselin ve chmelu byl 5,5 %. K analýze byl použit kapalinový chromatograf značky ECOM (Obr. 3) vybavený UV detektorem LCD 2083, dvoupístovou pumpou LCP 4100 a termostatem kolony LCO 101. Separace byla prováděna na chromatografické koloně NUKLEOSIL C18, 250x4mm. Jako mobilní fáze byla použita směs 20 % methanolu a 80 % 1% octové kyseliny ve vodě a jako stacionární fáze silikagel. Objem nástřiku vzorku na kolonu byl 5µl a průtoková rychlost 0,5 ml za minutu. Teplota termostatu byla nastavena na 30 C. Obr. 3: Chromatograf ECOM. 34

35 5 VÝSLEDKY A DISKUZE V grafu 1 je uveden HPLC chromatogram vzorku chmelového výluhu. Koncentrační zastoupení α-hořkých a β-hořkých kyselin ve výluhu chmele bylo stanoveno pomocí ploch píků (Tab. 4). Plocha píku je vypočítána vynásobením hodnoty na ose x (čas v min.) a hodnoty na ose y (napětí v mv). Protože nemohla být provedena kalibrace, píky α-hořkých a β-hořkých kyselin v grafu 1 byly určeny podle výsledků studie Ceslové a kol. (2009) a Haseleua a kol. (2009). Desátý pík tedy odpovídá α-hořkým kyselinám a β-hořkým kyselinám odpovídá jedenáctý pík. Koncentrační zastoupení α-hořkých kyselin ve vzorku je 30,2 % a β-hořké kyseliny jsou zastoupeny 23,4 % ve vzorku výluhu chmele. Graf 1: HPLC chromatogram vzorku chmelového výluhu. 35

36 Tab. 4: Výsledná tabulka naměřených hodnot. 36

37 6 ZÁVĚR Složitá struktura nejdůležitějších složek chmele, tedy hořkých kyselin, je základem mnoha analytických stanovení. Pro stanovení hořkých látek se využívá různých analytických metod a všechny mají své přednosti i nevýhody. V Evropě byla dříve nejvíce využívaná konduktometrická metoda pro stanovení α-hořkých kyselin. Výsledkem konduktometrického stanovení je konduktometrická hodnota KH vyjadřující se v hmotnostních procentech. Přestože princip této metody je velmi jednoduchý, řada konduktometrickcýh metod není zcela přesných. Jednou z nevýhod konduktometrické metody je vedle srážení α-hořkých kyselin octanem olovnatým i nežádoucí srážení některých minoritních složek chmelových pryskyřic a dalších látek rostlinného extraktu. Nejvíce používanou konduktometrickou metodou je stanovení konduktometrické hodnoty chmele modifikací dle EBC a stanovení hořkých látek modifikovanou Wöllmerovou metodou. Velmi rozšířeným stanovením používaným především v USA je spektrofotometrická metoda. Tato metoda je založena na schopnosti hořkých látek absorbovat UV světlo díky dvojným vazbám přítomným v aromatickém kruhu i postranních řetězcích. U této metody je nevýhodou pokles přesnosti při stanovení starších chmelů, což je zapříčiněno změnou absorpčních spekter chmelových pryskyřic. Spektrofotometrická metoda je vhodná ke zjištění orientační hodnoty obsahu hořkých látek. Díky rozdílným absorpčním spektrům α-hořkých a β-hořkých kyselin lze stanovit obě skupiny látek vedle sebe. V současné době nejvíce používanou metodou je stanovení hořkých látek vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Od jiných metod se HPLC odlišuje možností přesného stanovení hořkých kyselin a to i ve starším chmelu. Často se využívá HPLC na kolonách s reverzní fází v kombinaci s UV detekcí. Kvůli zdlouhavosti procesu bývá extrakce kapalina-kapalina nahrazována extrakcí na pevné fázi (SPE), jejíž výhodou je rychlost, šetrnost a redukce počtu chyb. Při analýze lze stanovit α-hořké kyseliny, β-hořké kyseliny a jejich analogy. Na Ústavu technologie potravin je možné prakticky zrealizovat stanovení hořkých látek, jak spektrofotometricky, tak metodou HPLC. V rámci mé bakalářské práce jsem měla možnost vyzkoušet si stanovení hořkých látek metodou HPLC s UV detekcí. V budoucnu bych ráda provedla více analytických stanovení hořkých látek chmele a navázala tak na jejich problematiku při zpracování diplomové práci. 37

38 7 LITERATURA ANONYM, 2012: Jednotky hořkosti piva (IBU). Databáze online [cit ]. Dostupné na: BASAŘOVÁ G. a kol., 1993: Pivovarsko-sladařská analytika 2. Merkanta s.r.o., Praha, 248 s. BASAŘOVÁ G. a kol., 1993: Pivovarsko-sladařská analytika 3. Merkanta s.r.o., Praha, 332 s BASAŘOVÁ G., HLAVÁČEK I., BASAŘ P., HLAVÁČEK J., 2011: České pivo. Havlíček Brain Team, Praha, s BASAŘOVÁ G., ŠAVEL J., BASAŘ P., LEJSEK T., 2010: Pivovarství. Vysoká škola chemicko-technologická, Praha, 904 s. ALMAGUER C., GASTL M., ARENDT E. K., BECKER T., 2012: Contributions of hop hard resins to beer quality. BrewingScience, 65 (7-8): s Databáze online [cit ]. Dostupné na: 224D087E57FF1544B0B974.iqs8TDG0Wy6BURhzD3nFA%3a20&sot=b&sdt=b&sl= 63&s=TITLE-ABS- KEY%28Contributions+of+hop+hard+resins+to+beer+quality%29&relpos=0&relpos= 0&searchTerm=TITLE-ABS- KEY%28Contributions+of+hop+hard+resins+to+beer+quality%29 CABALLERO I., BLANCO A., PORRAS M., 2012: Iso-α-acids, bitterness and loss of beer quality during storage. Trends in Food Science and Technology, 26 (1): s Databáze online [cit ]. Dostupné na: 38

39 f&src=s&st1=caballero&nlo=&nlr=&nls=&sid=6a8f6c233c224d087e57ff1544b0b 974.iqs8TDG0Wy6BURhzD3nFA%3a450&sot=q&sdt=sisr&cluster=scopubyr%2c% %22%2ct&sl=29&s=TITLE-ABS-KEY- AUTH%28caballero%29&ref=%28iso+alpha+acids%2c+bitterness+and+loss+of+beer +quality+during+storage%29&relpos=0&relpos=0&searchterm=%28title-abs- KEY- AUTH%28caballero%29%29+AND+%28iso+alpha+acids%2C+bitterness+and+loss+o f+beer+quality+during+storage%29+and+%28+limit- TO%28PUBYEAR%2C2012%29+%29+ CLAUS H. VANDYCK J., VERZELE H., 1978: Photometric constant of hop bitter acids. Journal of the Institute of Brewing, 84 (4): s [cit ]. Dostupné na : Search&qid=29&SID=T1Hc9@hGfbg2AjdoIkN&page=1&doc=1 CESLOVA L., HOLCAPEK M., FIDLER M., DRSTICKOVA J., LISA M., 2009: Characterization of prenylflavonoids and hop bitteracids in various classes of Czech beers and hop extracts using high-performance liquid chromatography-mass Spectrometry. Journal of chromatography A, 1216 (43): s [cit ]. Dostupné na: &qid=27&sid=w1obfhagbda7eai3kko&page=2&doc=12 DOBEŠOVÁ K., 2010: Technologicky významné chemické látky chmele. Bakalářská práce (in MS), Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, Zlín, 53 s. FEIGERL L., 2008: Problematika technologie výroby speciálních piv. Bakalářská práce (in MS, dep. Knihovna MENDELU v Brně), MZLU v Brně, Brno, 68 s. FORSTER A., 1987: Conductometric methods for hops and hop products. EBC Monograph XIII, Symposium on Hop. Freising-Weihenstephean, s

40 GOŁABCZAK J., GENDASZEWSKA-DARMACH E., 2010: Xanthohumol and other prenylated flavonoids of hop cones - Biological and technological aspects. South Africa Journal of Economic and Management Sciences. Databáze online [cit ]. Dostupné na: B0B974.iqs8TDG0Wy6BURhzD3nFA%3a60&sot=q&sdt=b&sl=31&s=TITLE-ABS- KEY-AUTH%28xanthohumol%29&relpos=140&relpos=0&searchTerm=TITLE-ABS- KEY-AUTH%28xanthohumol%29 HASELEU G., INTELMANN D., HOFMANN T., 2009: Identification and RP-HPLC- ESI-MS/MS Quantitation of Bitter-Tasting beta-acid Transformation Products in Beer. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57 (16): s Databáze online [cit ]. Dostupné na: Search&qid=17&SID=W1OBFHagBdA7eai3KKo&page=1&doc=10&UT=WOS: HERMANS-LOKKERBOL J., VERPORTE R., 1994: Development and validation of high-performance liquid chromatography system for the analysis of hop bitter acids. Journal of Chromatography, 669 (1-2): s Databáze online [cit ]. Dostupné na: JURKOVÁ M., KELLNER V., ČULÍK J., HORÁK T., ČEJKA P., 2003: Rychlá a účinná izolace iso-α-hořkých kyselin z piva metodou SPE. Kvasný průmysl, 49 (9): s KARABÍN M., BRÁNYIK T., KRULIŠ R., DVOŘÁKOVÁ M., DOSTÁLEK P., 2009: Využití chemicky modifikovaných hořkých látek v pivovarství. Chemické Listy, 103. s

41 KELLNER V., ČEJKA P., MARINOVA G., BAČVAROV V., JURKOVÁ M., ČULÍK J., HORÁK T., DVOŘÁK J., HAŠKOVÁ D., 2010: Studium jednoduchých polyfenolových látek v pivech různé provenience. Kvasný průmysl, 56 (5): s KORBEL M., 2013: IBU: International Bitterness Units. Databáze online [cit ]. Dostupné na: KOSAŘ K., PROCHÁZKA S., 2000: Technologie výroby sladu a piva. Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, Praha, 398 s. KROFTA K., 2008: Hodnocení kvality chmele. Chmelařský institut s.r.o., Žatec, 50 s. KROFTA K., ČEPIČKA J., 2000: Stanovení chmelových silic metodou mikroextrakce na tuhou fázi (SPME). Kvasný průmysl, 46 (9): s KROFTA K., TICHÁ J., 1997: K problematice analytického stanovení obsahu α- hořkých kyselin ve chmelu. Kvasný průmysl, 43 (7-8): s OLŠOVSKÁ J., JURKOVÁ M., ČEJKA P., 2012: Nové trendy v kapalinové chromatografii a jejich využití v analýze piva a pivovarských surovin. Část 2. Stanovení cis/trans izomerů iso-α-hořkých kyselin v pivu metodou ultraúčinné kapalinové chromatografie. Kvasný průmysl, 58 (4): s PLUHÁČKOVÁ H., EHRENBERGEROVÁ J., KRETEK P., KOCOURKOVÁ B., 2011: Chmelové silice ve vybraných odrůdách z různě starých chmelnic. Kvasný průmysl, 57 (7-8): s PRUGAR J. a kol., 2008: Kvalita rostlinných produktů na prahu 3. tisíciletí. Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, Praha, 327 s. RYBÁČEK J., 1980: Chmelařství. Státní zemědělské nakladatelství, Praha, 426 s. 41

42 SHELLHAMMER T., 2009: International Bitterness Units. Databáze online [cit ]. Dostupné na VENT L., 1963: Chmelařství. Státní zemědělské nakladatelství, Praha, 413 s. VESELÝ D., 2006: Obsah alfa hořkých látek u chmele v závislosti na klimatických charakteristikách ročníku. Diplomová práce (in MS, dep. Knihovna MENDELU v Brně), MZLU v Brně, Brno, 41 s. 42