ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH

Transkript

1 ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH PŘIHLÁŠKA STUDENTSKÉHO PROJEKTU Projekt Název projektu: Vývoj a charakterizace mikrosatelitních markerů pro druhový komplex Crenicichla mandelburgeri [Teleostei: Cichlidae] Uchazeč Hlavní řešitel Příjmení, jméno, tituly: Piálek, Lubomír, Mgr. Ing. lubomir.pialek@prf.jcu.cz Tel.: Studium v doktorském studijním programu zahájeno dne: Pracoviště/místo studia JU v Českých Budějovicích Fakulta (VŠ ústav): Přírodovědecká fakulta Katedra (ústav, pracoviště): Katedra zoologie Školitel: Oldřich Říčan Vedoucí projektu Příjmení, jméno, tituly: Říčan, Oldřich, Mgr. PhD. oldrich.rican@yahoo.com Tel.: Pracoviště JU v Českých Budějovicích Fakulta (VŠ ústav): Přírodovědecká fakulta Katedra (ústav, pracoviště): Katedra zoologie Celkové náklady na řešení projektu Náklady nebo výdaje na pořízení hmotného a nehmotného majetku: 0 Další provozní náklady nebo výdaje: Kč Doplňkové náklady nebo výdaje: 0 Celkem Kč: Kč V Českých Budějovicích dne Podpis uchazeče: Lubomír Piálek

2 Zdůvodnění návrhu projektu Stav řešení problematiky projektu (max. 2 stránky): Rod Crenicichla Heckel je druhově nejpočetnějším rodem neotropických cichlid řazený do skupiny Geophagini. Na rozdíl od všech ostatních linií cichlid jsou příslušníci této skupiny snadno rozpoznatelní díky protáhlému štíhlému tělu (odtud anglický název pike cichlids, "štikovité cichlidy"). Naprostá většina zástupců tohoto rodu jsou predátoři živící se hlavně vodními i suchozemskými bezobratlými a rybami; na svou kořist číhají v úkrytu za kamenem, potopenými věvemi či mezi kořeny. Ve srovnání s ostatními cichlidami jsou nenáročné na hydrologické podmínky a vyskytují se ve většině vodních biotopů od velkých údolních řek, lagun a přehradních nádrží až po malé horské potoky (pers. obs.). V dnešním pojetí zahrnuje tato skupina 85 popsaných druhů (Casciotta et al. 2006; Kullander & Lucena 2006; často úzce endemitních, a počet v současnosti rychle narůstá (Lucena 2007; Casciotta & Almirón 2008; Montaña et al. 2008; Kullander 2009; Piálek et al. 2010, Casciotta et al. 2010). Stawikowski & Werner (2004) uvádějí více než 120 známých druhů včetně těch dosud nepopsaných. Crenicichla má rozsáhlý areál rozšíření sahající od severního okraje jihoamerického kontinentu až po río Negro v argentinské části Patagonie (Casciotta 1987). Zatímco většina skupin neotropických ryb vykazuje nejvyšší počty druhů v povodí Amazonky, podle Kullandera (2009) je druhová diverzita tohoto rodu prokazatelně vyšší v jižní části areálu, v povodí Río de La Plata a přilehlých atlantských povodích. Molekulární fylogenezí této "jižní" druhové skupiny rodu Crenicichla se mj. zabývám v rámci své dizertační práce (Piálek et al., submitted). V rámci této studie jsme popsali nové druhové hejno ze střední části povodí Paraná a nazvali jej C. mandelburgeri sp. complex. Toto uskupení zahrnuje více než 10 morfologicky různých typů odlišujících se navzájem jednak zbarvením a dále stavbou hlavy, čelistí a druhem dentice. Morfotypy sdílející stejné zbarvení a lišící se zmíněnými ekomorfologickými charakteristikami žijí v několika případech (řeka Iguazú) úzce syntopicky a naznačují spolu s výsledky biogeografické analýzy možnost vzniku sympatrickou speciací. Tento způsob diverzifikace byl u ryb čeledi Cichlidae mnohokrát studován, výhradně však v jezerních systémech. Genetická variabilita uvedených ryb byla v rámci čtyř analyzovaných molekulárních lokusů (cytb, ND2, 16S, S7-i1) na rozdíl od variability morfologické velmi nízká (< 1%) a neumožnila navrhnout hodnověrnou hypotézu objasňující jejich evoluční vztahy a mechanismy speciace. Vzhledem k možnosti prokázání prozatím nepopsaného fenoménu sympatrické speciace cichlid v říčních systémech bych proto rád dále studoval uvedené druhové hejno na populačně-genetické úrovni s využitím mikrosatelitních markerů. Přestože jsou neotropické cichlidy bohatě diverzifikovanou skupinou (550 druhů; Kullander 2003) a studium jejich fylogenetických vztahů molekulárními metodami se v posledních letech těší značné oblibě, jen málo prací se zatím této linii ryb věnovalo na populační úrovni (Amado et al. 2008). Vhodné mikrosatelitní lokusy pro analýzu druhového hejna C. mandelburgeri tedy není v současnosti možné (přinejmenším v dostatečném počtu) převzít z literatury a je třeba je vyvinout a otestovat. Na druhou stranu jsou lokusy obsahující mikrosatelitní motivy u ryb často překvapivě konzervativní (Holmen et al. 2005, Amado et al. 2008) a markery identifikované v rámci tohoto projektu by proto mohly mít obecnější použití a posloužit případně i v populačních analýzách dalších skupin cichlid.

3 Literatura: Amado M.V., Hrbek T., Gravena W., Fantin C., Nogueira de Assunção E., Astolfi-Filho S. & Farias I.P. (2008) Isolation and characterization of microsatellite markers for the ornamental discus fish Symphysodon discus and cross-species amplification in other Heroini cichlid species. Molecular Ecology Resources 8: Casciotta J.R. (1987) Crenicichla celidochilus n. sp. from Uruguay and a multivariate analysis of the lacustris group (Perciformes, Cichlidae). Copeia 1987: Casciotta J. & Almirón A. (2008) Crenicichla tesay, a new species of cichlid (Perciformes: Labroidei) from the río Iguazú basin in Argentina. Revue suisse de Zoologie 115: Casciotta J.R., Almirón A.E. & Gómez S.E. (2006) Crenicichla yaha sp. n. (Perciformes: Labroidei: Cichlidae), a new species from the río Iguazú and arroyo Urugua-í basins, northeastern Argentina. Zoologische Abhandlungen, Staatliche Naturhistorische Sammlungen Dresden, Museum für Tierkunde 56: Casciotta J., Almirón A., Piálek L., Gómez S. & Říčan O. (2010) Crenicichla ypo (Teleostei: Cichlidae), a new species from the middle Paraná basin in Misiones, Argentina. Neotropical Ichthyology 8(3): Holmen J., Vøllestad L.A., Jakobsen K.S. & Primmer C.R. (2005) Cross-species amplification of zebrafish and central stoneroller microsatellite loci in six other cyprinids. Journal of Fish Biology 66: Kullander S.O. (2003) Cichlidae (Cichlids). In: Reis, R.E., Kullander, S.O., Ferraris Jr., C.J. (Eds.), Checklist of the Freshwater Fishes of South and Central America. EDIPUCRS, Porto Alegre, pp Kullander S.O. (2009) Crenicichla mandelburgeri, a new species of cichlid fish (Teleostei: Cichlidae) from the Paraná River drainage in Paraguay. Zootaxa 2006: Kullander S.O. & Lucena C.A.S. (2006) A review of the species of Crenicichla (Teleostei: Cichlidae) from the Atlantic coastal rivers of southeastern Brasil from Bahia to Rio Grande do Sul State, with description of three new species. Neotropical Ichthyology 4: Lucena C.A.S. (2007) Two new species of the genus Crenicichla Heckel, 1840 from the upper rio Uruguay drainage (Perciformes: Cichlidae). Neotropical Ichthyology 5: Montaña C.G., López-Fernández H. & Taphorn D.C. (2008) A new species of Crenicichla (Perciformes: Cichlidae) from the Ventuari River, Upper Orinoco River basin, Amazonas State, Venezuela. Zootaxa 1856: Piálek L., Říčan O., Almirón A. & Casciotta J. (2010) Crenicichla hu, a new species of cichlid fish (Teleostei : Cichlidae) from the Paraná basin in Misiones, Argentina. Zootaxa 2537: Piálek L., Říčan O., Casciotta J., Almirón A. & Zrzavý J. (submitted) Multilocus phylogeny of Crenicichla (Teleostei: Cichlidae), with biogeography of the C. lacustris group: species flocks as a model for sympatric speciation in rivers. Molecular Phylogenetics and Evolution. Stawikowski R. & Werner U. (2004) Die Buntbarsche Amerikas. Band 3: Erdfresser, Hecht- und Kammbuntbarsche. Eugen Ulmer, Stuttgart, 478 pp.

4 Stanovení badatelských cílů, metody a způsob řešení (max. 2 stránky): Cílem tohoto projektu je: A. Vyvinout a charakterizovat dostatečný počet mikrosatelitních markerů, které by byly informativní pro druhový komplex Crenicichla mandelburgeri. B. Testovat amplifikovatelnost vybraných mikrosatelitních lokusů u dalších skupin v rámci čeledi Cichlidae. A.1. Příprava mikrosatelitní knihovny Tkáňové vzorky ryb z druhového hejna C. mandelburgeri již byly získány během terénních prací v Argentině v letech Genomová DNA bude izolována komerčním kitem Qiagen dle standardního protokolu. Kontrola kvality izolátů bude provedena pokusnou PCR amplifikací již optimalizovaných markerů (cytb, ND2) a její koncentrace bude proměřena absorpční metodou na UV/Vis spektrofotometru (Nanodrop). Pro zajištění polymorfismu navržených lokusů bude pro tvorbu mikrosatelitní knihovny použita směs izolátů genomové DNA z ca vybraných exemplářů v ekvivalentním poměru. Zhotovení mikrosatelitní knihovny (restrikce, ligace adaptérů, amplifikace, hybridizace se sondami s mikrosatelitními motivy) bude zajištěno komerčně u firmy GenoScreen, Francie včetně následného NGS sekvenování získaných fragmentů. Knihovna bude firmou dodána ve formě počítačových souborů obsahující jak zjištěné sekvence, tak navržené páry primerů. GenoScreen garantuje identifikaci min různých sekvencí s mikrosatelitními motivy a min. 100 bioinformatickými metodami ověřených párů primerů včetně délky jimi amplifikovaných lokusů. A.2 Výběr primerů a jejich praktické ověření Z navržených primerů bude vybráno min. 30 párů (pro různé lokusy) na základě termodynamických kritérií (změna Gibbsovy energie vazeb při tvorbě dimerů, heterodimerů a vlásenek). V úvahu bude brána rovněž délka amplifikovaných lokusů tak, aby bylo ve výsledné fázi možné detekovat co největší počet nezávislých lokusů v rámci jedné fragmentační analýzy. Zvolené primery budou v neznačené formě pořízeny u firmy Integrated DNA Technologies a jejich funkčnost bude ověřena PCR amplifikací (optimalizace na teplotním gradientu) a detekcí příslušných fragmentů na agarózovém gelu. Analýzy budou prováděny na 20 až 30 vzorcích ryb zahrnujících všechny známé morfotypy z uvedeného druhového komplexu. A.3. Ověření informativnosti vybraných lokusů Na základě výsledků PCR amplifikace bude vybráno ca mikrosatelitních lokusů, pro které budou objednány značené F primery (Applied Biosystems, G5 set). Zvolené lokusy budou testovány na jedincích prostřednictvím fragmentační analýzy provedené komerčně u firmy Macrogen Europe, Holandsko. Délka fragmentů bude analyzována prostřednictvím software GeneMapper; populačně-genetické parametry jednotlivých lokusů (genetická variabilita, pozorovaná a očekávaná heterozygosita, F-statistika) pak v programu GENETIX. B.1. Test amplifikovatelnosti mikrosatelitních lokusů u dalších skupin čeledi Cichlidae Neznačené primery (min. 30 párů) vybrané postupem A.2 budou použity rovněž k testování amplifikovatelnosti příslušných lokusů u dalších linií neotropických a afrických cichlid (ca. 50 jedinců min. 35 různých rodů). Tkáňové vzorky jsou k dispozici z našich terénních sběrů,

5 postup izolace bude shodný s předešlým. Amplifikované fragmenty budou detekovány na agarózovém gelu a jejich délka odhadnuta porovnáním s velikostním standardem. Harmonogram prací: týden Výběr a izolace tkáňových vzorků, kontrola kvality (PCR), objednání mikrosatelitní knihovny u firmy GenoScreen (dodací lhůta ca. 3 měsíce) týden Během přípravy knihovny bude proveden výběr vzorků dalších linií cichlid (ca. 50), izolace genomové DNA a kontrola kvality (PCR). 17. týden Výběr potenciálně vhodných primerů a jejich pořízení v neznačené formě týden Optimalizace a PCR amplifikace vybraných lokusů s neznačenými primery: 1. Crenicichla mandelburgeri sp. komplex, 2. ostatní rody. Výběr a pořízení značených primerů týden Amplifikace vybraných lokusů se značenými primery, fragmentační analýzy týden Analýza jednotlivých lokusů, sepisování závěrečné zprávy, zahájení přípravy publikace Předpokládaný typ vědeckých výsledků projektu Publikace mikrosatelitních markerů a charakteristik příslušných lokusů v časopisu Molecular Ecology Resources. Hlavní řešitel (maximálně 30 řádek) Piálek Lubomír, Mgr. Ing. V rámci doktorského studia se na katedře zoologie PřF JU zabývám fylogenezí a historickou biogeografií živočichů, především neotropických cichlid s využitím molekulárních metod (sekvenování DNA, AFLP). Granty: 2010: GAJU - Evoluce druhové diverzity rodu Crenicichla [Teleostei: Cichlidae] v provincii Misiones jako důsledek historického vývoje oblasti Publikace: Říčan O., Piálek L., Almirón A. & Casciotta J. (in press) Two new species of Australoheros (Teleostei: Cichlidae), with notes on diversity of the genus and biogeography of the Río de la Plata basin. Zootaxa.

6 Casciotta J., Almirón A., Piálek L., Gómez S. & Říčan O. (2010) Crenicichla ypo (Teleostei: Cichlidae), a new species from the middle Paraná basin in Misiones, Argentina. Neotropical Ichthyology 8(3): Piálek L., Říčan O., Almirón A. & Casciotta J. (2010) Crenicichla hu, a new species of cichlid fish (Teleostei : Cichlidae) from the Paraná basin in Misiones, Argentina. Zootaxa 2537: Zrzavý J., Říha P., Piálek L. & Janouškovec J. (2009) Phylogeny of Annelida (Lophotrochozoa): total-evidence analysis of morphology and six genes. BMC Evolutionary Biology 9: 189. Vedoucí projektu (maximálně 30 řádek) Říčan Oldřich, Mgr., PhD. Odborná charakteristika: Výzkum evoluce a diverzity Neotropické oblasti, historická biogeografie (Guyanská a Brazilská vysočina, Andy, Stř. Amerika) založená na studiu fylogenetických vztahů a areálů rozšíření. Modelovou skupinou jsou sladkovodní ryby, převážně čeleď Cichlidae. Výzkum zahrnuje kompletní spektrum aktivit začínají výzkumem v terénu a končící analýzou ekologických, morfologických a molekulárních dat. Granty - výběr: : GAČR 206/08/P003 - Phylogeny and biogeography of cichlid fishes in Mesoamerica. 2005: Grant Agency of the University of South Bohemia - Phylogenetic analysis and biogeographic history of Middle American cichlid fishes. 2004: Helge Axon s Johnsons Stiftelse (Sweden) - Phylogeny and biogeography of Central American cichlid fishes. Publikace - výběr: Musilová Z., Říčan O. & Novák J Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research 47 (3): IF Musilová Z., Říčan O., Janko K. & Novák J Molecular Phylogenetics and Evolution 46: IF Říčan O. & Kullander S. O Zootaxa 1724: IF Říčan O., Zardoya R. & Doadrio I Molecular Phylogenetics and Evolution 49: IF Concheiro Peréz G. A., Říčan O., Ortí G., Bermingham E., Doadrio I. & Zardoya R Molecular Phylogenetics and Evolution 43: IF Higham T. E., Hulsey C. D., Říčan O. & Carroll A. M Journal of Evolutionary Biology 20: IF Říčan O. & Kullander S. O Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research 44 (2): IF 1.826

7 Říčan O. & Kullander S.O Copeia 2003 (4): IF 0.748

8 Požadované finanční prostředky Výdaje a náklady na pořízení hmotného a nehmotného majetku (max Kč) Drobný hmotný a nehmotný majetek: 0 Kč Spotřební materiál: Kč Náklady na publikace (max. 2000Kč): 2000 Kč Požadované finanční prostředky celkem: Kč Slovní zdůvodnění a rozpis finančních prostředků izolace DNA QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit - budou využity přebytky z jiných projektů 0 zhotovení mikrosatelitní knihovny bude hrazeno z jiných zdrojů 0 PCR amplifikace: neznačené primery IDT, 60 ks 15 značené primery Applied Biosystems, 15 ks 35 polymeráza budou využity přebytky z jiných projektů fragmentační analýzy: budou hrazeny z jiných zdrojů 0 spotřební materiál: eppendorfky, plata 96, rukavice, špičky, ethanol, PCR voda, TAE, agarosa, SYBR Green I atd. budou využity přebytky z jiných projektů 0 odborná literatura 2 Hedrick: Genetics of populations Wakeley: Coalescent Theory - An Introduction Celkem 52