Využití spektrofotometrických metod ke kontrole falšování potravin

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Využití spektrofotometrických metod ke kontrole falšování potravin Diplomová práce Vedoucí práce: prof. Ing. Květoslava Šustová, Ph.D. Vypracoval: Bc. Roman Pytel BRNO 2014

2 Mendelova univerzita v Brně Ústav technologie potravin Agronomická fakulta 2013/2014 ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE Autor práce: Studijní program: Obor: Bc. Roman Pytel Chemie a technologie potravin Technologie potravin Název tématu: Využití spektrofotometrických metod ke kontrole falšování potravin Rozsah práce: 50 až 60 stran Zásady pro vypracování: 1. Prostudovat dostupnou odbornou a vědeckou literaturu zaměřenou na využití spektrofotometrických metod ke kontrole kvality potravin a jejich falšování. 2. Zaměřit se při studiu na literaturu objasňující principy spektrometrických metod a na využití těchto metod k zjišťování falšování medů. 3. U vzorků medu laboratorně odzkoušet možnosti stanovení jejich falšování spektrofotometrickými metodami. 4. Výsledky studia odborné a vědecké literatury zpracovat do literární rešerše. Výsledky laboratorních analýz statisticky vyhodnotit a případně graficky zpracovat. 5. Zjištěné výsledky porovnat s jinými autorskými pracemi v diskusi. Na základě nastudované literatury, naměřených výsledků a jejich interpretace vše zpracovat do diplomové práce v rozsahu 50 až 60 strojopisných stran. Seznam odborné literatury: RŮŽIČKOVÁ, J. -- ŠUSTOVÁ, K. Aplikace NIR spektrometrie v kontrole kvality zemědělských 1. materiálů a produktů. Disertační práce. MZLU v Brně, s. LUŽOVÁ, T. -- ŠUSTOVÁ, K. Využití FT NIR spektrometrie ke kontrole kvality potravin. Disertační 2. práce. MENDELU Brno, s. 3. MacDougall: Colour in food: Improving quality. 2002, England. Woodhead publishing, 378 p. 4. Přesná komunikace o barvě. Pro Pragolab přeložil ing. Jan Všianský Vědecké a odborné publikace podle doporučení vedoucího diplomové práce

3 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci: Využití spektrofotometrických metod ke kontrole falšování potravin vypracoval samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:. podpis :..

4 Poděkování Rád bych poděkoval paní prof. Ing. Květoslavě Šustové, Ph.D za vedení mé diplomové práce a za cenné připomínky při její tvorbě. Chtěl bych poděkovat panu Ing. Miroslavu Jůzlovi, Ph.D za pomoc při zpracování výsledků, jejich prezentaci a za rady, které mi poskytl. Poděkování patří panu Ing. Lukáši Dvořákovi a Mgr. Ing. Vladimíru Sýkorovi za cenné rady, poznámky a také za čas, který mi věnovali při psaní této práce. Rád bych poděkoval rodině a kamarádům za podporu při studiu.

5 ABSTRAKT Tématem této diplomové práce je Využití spektrofotometrických metod ke kontrole falšování potravin. V teoretické části jsou uvedeny kapitoly týkající se falšování potravin (obecně), falšování medu, jakostních požadavků na med, spektroskopie a jejich druhů. Diplomová práce je zaměřena na spektrofotometrické měření vzorků medu a cukerných sirupů, kde byla sledována barva a složení medu. Metody použité k analýze jsou NIR spektrofotometrie a UV/VIS spektrofotometrie Získané výsledky byly statisticky a graficky zpracovány. Z výsledků vyplývá, že použití FT-NIR pro detekci falšování medů je vhodnou metodou pro kontrolu medů. Nejméně efektivní metodou k prokázání falšování medů je spektrofotometrické stanovení barvy medů. Při použití této metody nelze prokázat souvislost mezi barvou medu a barvou cukerného sirupu. Klíčová slova: falšování potravin, med, falšování medu, spektrofotometrie, NIR, CIELAB, barva

6 ABSTRACT The theme od this dissertation is Application of Spectrophotometric methods for inspection adulteration of food. In the theoretical part, there are stated chapters regarding adulteration of food (in general), adulteration of honey, quality requirements on honey, spectroscopy and its categories. The dissertaion is focused on spectrophotometric measurements of honey and sugar syrup samples where colour and consistence of honey was monitored. The techniques used for the analysis are NIR spectrophotometry and UV/VIS spectrophotometry. The results gained were statistically and graphically processed. It follows from the outcome that using FT-NIR for adulteration of honey detection is an appropriate method for honey inspection. The least effective method for proving adulteration of honey is the spectrophotometry specification of the colour of honey. Using this method, it is not possible to prove the links between colour of honey and colour of sugar syrup. Key words: adulteration of food, honey, adulteration of honey, spectrophotometry, NIR, CIELAB, colour

7 OBSAH 1 ÚVOD CÍL LITERÁRNÍ PŘEHLED Falšování potravin Specifické předpisy pro oblast falšování potravin Hlavní způsoby falšování Med Složení medu Členění medu Označování potravin Jakost medu Falšování medu Další možnosti falšování Laboratorní parametry medu Spektrofotometrické metody využívané pro detekci falšování potravin Emisní metody Absorpční metody Spektroskopie Infračervená spektroskopie Spektroskopie v blízké infračervené oblasti UV/VIS spektroskopie Barva Barevný prostor L* a* b* Barevný prostor L* C* h... 28

8 4 MATERIÁL A METODIKA Materiál Metody FT-NIR spektrofotometrické metody Spektrofotometrie Konica Minolta Referenční metody VÝSLEDKY A DISKUZE FT-NIR spektrofotometrické metody Spektrofotometrické stanovení barvy ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK PŘÍLOHY... 52

9 1 ÚVOD Česká republika se v posledních letech začala více zajímat o bezpečnost a kvalitu potravin. Spotřebitelé začali více důvěřovat českým potravinám a považují je za kvalitnější. Přestali se dívat jen po cenách, ale začali se dívat po zemi původu a taky po kvalitě. Možná za to můžou i aféry z posledních let. Mezi ty největší by se daly zařadit kauza metanol, nebo kauza falšování hovězího masa masem koňským. U metanolové kauzy došlo k poškození zdraví několika desítek lidí a někteří tuto otravu nepřežili. S novými metodami falšování musí být systém kontroly bezpečnosti pružný, tak aby byl schopný dynamicky reagovat na tyto metody. Falšování potravin je pro spoustu spotřebitelů nepřijatelné, protože považují falšování za úmyslné šizení potraviny. Tato myšlenka vychází z touhy výrobců mít co nejvyšší zisky s nejnižšími náklady. Proto jsou nejčastěji falšovány drahé potraviny jako je káva, víno, med a další, dále se také falšují potraviny, které jsou uváděny do oběhu ve velkém množství. Dozorové orgány, které provádějí kontroly potravin: Státní zemědělská a potravinářská inspekce dozor při výrobě potravin, uvádění do oběhu a při dovozu potravin ze třetích zemí Státní veterinární správa ČR dozor nad potravinami živočišného původu Orgány ochrany veřejného zdraví dozor u stravovacích služeb Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský kontrolní a dozorová činnost nad krmivy, agrochemií a další V posledních letech dochází čím dál častěji k falšování potravin, proto je snaha využívat nových analytických metod, které jsou schopny identifikovat porušení nebo falšování potravin. Pro identifikaci jednotlivých složek v dané potravině se začíná více používat NIR spektrofotometrie, popř. NIR spektrofotometrie s Fourierovou transformací. Tyto metody jsou častěji používané, protože jsou rychlé, nedestruktivní a nedochází k poškození vzorku. 9

10 2 CÍL Med je potravinou živočišného původu, která stejně tak jako další potraviny podléhají falšování. Med patří mezi nejčastěji falšovanou komoditu, a proto se tato diplomová práce zabývá možností využití fyzikálních metod k falšování medu. Cílem této diplomové práce bylo: - Prostudovat dostupnou literaturu, která se zabývá kontrolou kvality potravin - Objasnit principy spektrofotometrických metod, které mohou být použity pro kontrolu falšování medu - Laboratorně odzkoušet u vzorků medu možnosti stanovení jejich falšování spektrofotometrickými metodami - Výsledky laboratorních analýz statisticky příp. graficky zpracovat 10

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Falšování potravin Falšování potravin je problémem už od nepaměti a je staré stejně jako obchodování se zbožím. Společně s vývojem metod falšování se vyvíjí i metody odhalování těchto praktik (Klanica, 2013). Zákon o potravinách a tabákových výrobcích č. 110/1997 Sb. přímo nedefinuje pojem falšování potravin. V tomto zákonu je uvedeno, že do oběhu nemůžou být uváděny potraviny klamavě označené. Falšovaná potravina je ve své podstatě klamavě označená potravina, protože zákon č. 634/1992 Sb. o ochraně spotřebitele říká, že nikdo nesmí klamat spotřebitele. Zejména se nesmějí uvádět nedoložené, nepravdivé, neúplné, nepřesné či přehnané údaje. Každý spotřebitel má právo na všestranné, vyčerpávající, srozumitelné a pravdivé informace. Směrnice č. 89/397 EHS o úředních kontrolách potravin říká, že státy EU provádějí kontroly prostřednictvím inspekčních orgánů pro potraviny, které vedou k ochraně zájmu spotřebitele, podpoře poctivých výrobců a poctivého obchodu. Jednou z povinností, která vyplývá ze směrnice 89/395 EHS je že, označování potravin nesmí klamat spotřebitele, zejména pokud jde o vlastnosti, identitu, vznik, původ a způsob výroby ( 2000). Komoditní předpisy nám stanoví jakostní požadavky na určité druhy potravin (mléčné výrobky, masné výrobky, čokoládu, koření aj.), bez kterých by nebylo možné provádět účinné kontroly potravin. Po kontrole a vyhodnocení výsledků se posuzuje, jestli daná potravina splnila požadavky, zda je nedostatečně označena nebo má méně závažný nedostatek v kvalitě, popřípadě zda se jedná o falšování (Klanica, 2013) Specifické předpisy pro oblast falšování potravin Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 178/2002 Zákon č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích Vyhláška č. 113/2005 Sb., o způsobu označování potravin a tabákových výrobků Zákon č. 634/1992 Sb., o ochraně spotřebitele (Klanica, 2013) 11

12 3.1.2 Hlavní způsoby falšování náhrada dražší suroviny levnější surovinou použití jiné technologie nedodržení receptury nesprávné označení země původu Mezi nejčastější komodity, které se falšují, patří exkluzivní potraviny (lihoviny, koření, víno) nebo potraviny, které se prodávají ve velkém, především masné výrobky, oleje, káva a kakao, ovocné šťávy ( 2013). 3.2 Med Spotřeba medu mírně kolísá a pohybuje se v rozmezí 0,4 0,6 kg/obyvatele/rok. Snahou je zvýšit spotřebu medu tradičně baleného i výrobků, které obsahují přídavek medu, jako jsou paštiky, perníčky nebo medovina (Roubalová, 2004). Produkce medu v České republice dosahuje v průměru tun medu ročně. Protože spotřeba medu v České republice je nízká, přebytek medu je exportován. Hlavní zemí kam se vyváží med medovicový, je Německo, med akátový se vyváží např. do Saudské Arábie (Hrabě et al., 2005). Medem se podle vyhlášky 76/2003 Sb. rozumí potravina přírodní, sacharidového původu, která je složena převážně z glukózy, fruktózy, organických kyselin, enzymů a pevných částic zachycených při sběru sladkých šťáv květů rostlin (nektar), výměšků hmyzu na povrchu rostlin (medovice), nebo na živých částech rostlin včelami (Apismellifera), které sbírají, přetváří, kombinují se svými specifickými látkami, uskladňují, nechávají dehydratovat a zrát v plástech Složení medu Med se ve své podstatě dá považovat za přesycený roztok cukrů, kdy přirozenou vlastností je krystalizace. Obsah vody v medu je od %, sušinu převážně tvoří různé sacharidy (až 95 %). Z tohoto množství tvoří glukóza a fruktóza %. Tyto cukry dávají medu typickou sladkou chuť, hydroskopičnost a určují fyzikální vlastnosti medu. Převládá fruktóza, která zpomaluje krystalizaci medu (Hrabě et al., 2005). 12

13 Složení medu v číslech - fruktóza 38 % - glukóza 31 % - sacharóza 1 % - jiné cukry 9 % - voda 17 % - popel 0,17 % - vitamíny - minerální látky: vápník, fosfor, draslík, sodík, železo a jiné (Koukal, 2010) Členění medu Med můžeme rozdělit podle původu: med květový (nektarový) pochází většinou z květů, někdy z mimokvětních nektárií med medovicový hmyz (Hemiptera) nabodává rostlinná pletiva, kterými vytéká míza, tuto mízu hmyz filtruje a přebytečný sladký roztok rozstřikuje po okolí ( 2014) Další rozdělení podle původu: Med jednodruhový med ze snůšky jednoho rostlinného druhu Med smíšený med z různých druhů rostlin Med z první snůšky (jarní) med, který byl vytočen jako první Med z letní snůšky med, který se vytáčí v létě (druhé vytáčení) Med medovicový (Frank, 2010) Dále med členíme podle způsobu získávání a úpravy: Vytočený med získává se odvíčkováním a odstřeďováním bezplodých plástů (Vyhlášky 76/2003 Sb.) Plástečkový med je to zavíčkovaný a uložený med včelami, do bezplodých plástů, čerstvě postavených na mezistěnách vyrobených ze včelího vosku, prodávaný v plástech (Vyhlášky 76/2003 Sb.) Lisovaný med dochází k lisování plástů bez oplodí za zvýšené teploty do 45 C ( 2014) 13

14 Vykapaný med med získaný odvíčkováním a následným vykapáním bezplodových plástů (Vyhláška 76/2003 Sb.) Med s plástečky obsahuje jeden nebo více kusů plástečkového medu Filtrovaný med med, ze kterého byly odstraněny cizí anorganické nebo organické látky, dochází i k významnému odstranění pylových zrn (Vyhláška 76/2003 Sb.) Pastovaný med upravený med (kdy se při tvorbě jemných krystalů med pomalu několikrát denně míchá, než se vytvoří pastovitá konzistence). V tomto medu nedochází k degradaci enzymů, vitamínů a kyselin. Tento med zůstává hedvábně vláčný s jemným aroma nektaru ( 2014). Pekařský med med určený výhradně pro průmyslové použití nebo jako složka jiných potravin (Vyhláška 76/2003 Sb.) Označování potravin Směrnice Evropského parlamentu 2000/13/ES o sbližování právních předpisů členských států týkající se označování potravin, jejich obchodní úpravy a související reklamy. Povinné údaje: název, pod nímž je výrobek prodáván seznam složek (v sestupném pořadí) množství složek nebo skupin složek vyjádřené v procentech (pokud daná složka figuruje v názvu) množství dané potraviny datum minimální trvanlivosti/datum použitelnosti podmínky skladování název nebo obchodní firma a adresa výrobce, balírny nebo prodejce místo původu ( 2014) Dále se med označí: Způsobem získání a úpravy (neplatí pro med vytáčený) Zemí původu, kde byl med získán, pokud je to směs medů z více zemí EU nebo ze třetích zemí, lze jej označit příslušným názvem: - Směs medů ze zemí ES - Směs medů ze zemí mimo ES 14

15 - Směs medů ze zemí ES a ze zemí mimo ES K označení medu, s výjimkou filtrovaného a pekařského medu mohou být doplněny další informace: Regionální, územní označení původu, pokud je med zcela z uvedeného zdroje původu Jednodruhový nebo smíšený (vzhledem k původu) Druhem rostliny, pokud med pochází zcela nebo převážně z daného druhu a splňuje dané senzorické, fyzikálně-chemické a mikroskopické požadavky U pekařského medu se dále označuje: Slovy pekařský nebo průmyslový med, země původu Údajem, že med je určen k vaření, pečení nebo na jiné zpracování Pokud je tento med použitý jako složka potraviny, může být označen pouze jako med (Vyhláška č. 76/2003 Sb.) Jakost medu Jakost medu je popsána ve Vyhlášce č. 76/2003 Sb. ve znění pozdějších novel Požadavky: Nesmí být přidány žádné jiné látky včetně přídatných látek (výjimkou jsou jiné druhy medu) Nesmí se odstraňovat pyl ani jiné složky medu, výjimkou je odstraňování cizích látek filtrací, kdy tomu nejde zabránit Med nesmí (výjimkou pekařský med): - obsahovat cizí příchutě a pachy - začít kvasit nebo pěnit Být zahřán na teplotu, při které by došlo ke zničení přirozených enzymů nebo k jejich neaktivnosti Nesmí se uměle měnit kyselost Filtrovaný a pekařský med se nesmí přimíchávat do jiných medů 15

16 Smyslové požadavky: Tab. 1: Smyslové požadavky pro med Med Květový Medovicový Konzistence a vzhled Mírně až silně viskózní, tekutý, částečně až plně krystalický Mírně až silně viskózní, tekutý, částečně až plně krystalický Chuť Výrazně sladká až Sladká, popř. kořeněná škrabavá až mírně škrabavá Vodově čistá až Barva s nazelenalým Tmavohnědá s nádechem nádechem, slabě žlutá až do červenohněda zlatavě žlutá Barva medu Barva medu záleží na druhu rostliny, ze které pochází. Nejběžnějšími barvami jsou různé odstíny žluté, hnědé, dále odstíny červenohnědé, oranžové až zelené. Nejsvětlejším medem je med akátový, který je téměř vodojasný. Hodně světlý je i med běžný řepkový. Opakem jsou medy pohankové a medy z jedlého kaštanu. Nejtmavšími medy jsou medy medovicové med bukový, jedlový (Titěra, 2006). Barvu medu ovlivňují barviva převážně rostlinného původu, patřících do skupiny flavonoidních a karotenových barviv. Tmavší barva u medovicového medu je způsobena nižší kyselostí a vyšším obsahem minerálních látek (Hrabě et al., 2005). Titěra (2006) říká, že barva není žádným parametrem pro kvalitu medu, poukazuje pouze na druh. Výjimku tvoří pouze medy přehřáté, kdy se cukr mění v karamel. Ovlivnit barvu může barva plástů, respektive jejich stáří. Nové plásty jsou světlé, po čase vlivem vzdušného kyslíku tmavnou. Na tmavnutí mají vliv i barviva, která přecházejí z pylu uloženého v plástech. Barviva uložená ve velmi tmavých plástech přecházejí zpět do medu. Pro popsání barvy se někdy používá stupnice dle Pfunda. Stupnice dle Pfunda udává barvu v milimetrech a pohybuje se v rozmezí 0 až 114. Nejsvětlejší medy mají do 8 mm Pfundovy stupnice, nejtmavší medy medovicové mají 85 mm a více (Titěra, 2006). 16

17 Fyzikální a chemické požadavky Tab. 2: Fyzikální a chemické požadavky pro med podle Vyhlášky 76/2003 Sb. Med Květový Medovicový Pekařský Součet obsahů fruktózy a glukózy (%) 60,0 45,0 - Obsah sacharózy (% hmot. nejvýše) 5,0 5,0 - Obsah vody (% hmot. nejvýše) 20,0 20,0 23,0 Kyselost (mekv/kg nejvýše) 50,0 50,0 80,0 Hydroxymethylfurfural (mg/kg nejvýše) 40,0 40,0 - Obsah ve vodě nerozpustných látek (% 0,10 0,10 - hmot. nejvýše) Elektrická vodivost ( ms. m -1 ) Nejvýše 80,0 Nejméně 80,0 - Aktivita diastázy (stupňů podle Schadeho nejméně) 8,0 8,0-3.3 Falšování medu Za falšování se pokládá přídavek chemické látky do potravinářského výrobku, který obsahuje podobné látky přírodního charakteru. Rozvoj falšování medu nastal v roce 1970, kdy byl na trh uveden vysokofruktosový kukuřičný sirup. Přídavkem tohoto sirupu nedojde k poškození zdraví, ale poškodíme důvěru spotřebitele (Mehryar, Esmaiili, 2011). Každé cennější zboží se někdy někdo snaží zfalšovat. U medu se to stává, když je cena medu podstatně vyšší než cena řepného cukru popř. některého sirupu. Výjimečně se můžeme setkat i s tzv. pampeliškovým medem (hustý sirup svařený s květy pampelišek), který se někdy nabízí jako med včelí (Titěra, 2006). 17

18 Jedním z kritérií, které může poukazovat na falšování medu je počet pylových zrn. Toto kritérium je v některých státech rozhodující při tvorbě ceny. Podle obsahu pylových zrn se dá určit i geografický původ medu. Tohoto se využívá při importu a exportu medu. Pokud včelař vytočí nezralý med s vyšším obsahem vody než 19 % a nemá možnost ho nechat dozrát, bývá toto poškození medu označováno jako neúmyslné. Jestliže je přidán např. invertní cukr přímo do medu, nebo zkrmován cukerný roztok v době snůšky, jde o úmyslné falšování. Evropská komise pro med stanovila nové metody, kterými jde odhalit důmyslnější falšování např. přidáním enzymů do invertů (Hrabě et al., 2005) Další možnosti falšování přidávání fruktózy (zpomaluje krystalizaci a zvyšuje výnos) přidávání sacharózy přímo do medu (snadno odhalitelné) přidávání vody (pokud vytočený med má 15 % vody přidávají výrobci vodu, protože norma povoluje 19 % vody), pokud je med s vodou nedokonale promíchán, hrozí místní kvašení barvení karamelem nebo potravinářským barvivem při nedostatku tmavých medů (Titěra, 2006) Laboratorní parametry medu Pro kontrolu kvality medu využíváme několika parametrů chemického složení a fyzikálních vlastností. Analýzami byly stanoveny limitní meze, které jsou v podobě norem kvality. Pokud med vyhovuje normě, je vystaven protokol popř. certifikát kvality, který potvrzuje kvalitu medu (Titěra, 2006). Pro odhalování falšování se využívá moderní metoda, která spojuje hmotnostní spektrometr a kapalinový chromatograf. Touto metodou jde zjistit přídavek C3 i C4 cukrů. C4 cukry jsou vytvářeny nemedonosnými rostlinami jako je kukuřice a cukrová třtina. Zdrojem C3 cukrů je např. řepný cukr (Klanica, 2013). Metody, které jsou dále používány pro detekci falšování potravin (Mehryar, Esmaiili, 2011): Plynová a kapalinová chromatografie Spektrofotometrie v blízké infračervené oblasti (NIR) Fourierova transformace (FTIR) 18

19 Dalšími parametry kvality jsou: obsah hydroxymethylfurfuralu (HMF) množství invertázy množství diastázy kyselost elektrická vodivost (Titěra, 2006). Při koupi medu by měl spotřebitel sledovat: konzistenci medu med by měl být mírně až silně viskózní, tekutý, částečně až plně krystalický barvu medu květový med se vyznačuje vodově čistou barvou až s nazelenalým nádechem, medovicový med má barvu tmavohnědou s nádechem do červenohněda chuť medu sladká až mírně škrabavá, případně kořeněná dle druhu rostliny, ze které byl med získán (Babička, 2012). 3.4 Spektrofotometrické metody využívané pro detekci falšování potravin Spektrofotometrické metody patří do optických metod. Optické metody jsou fyzikální metody, které jsou založeny buď na interakci vzorku s elektromagnetickým zářením, nebo na emisi elektromagnetického záření vzorkem. Tyto metody můžeme rozdělit na: nespektrální, kdy nesledujeme výměnu energie mezi látkou a zářením, ale sledujeme vlastnosti záření (změny rychlosti, otáčení roviny polarizovaného světla, rozptyl). Mezi nespektrální metody řadíme refraktometrii, polarimetrii, interferometrii, nefelometrii, turbidimetrii (Klouda, 2003). spektrální, při kterých dochází k výměně energie mezi hmotou a zářením (Nedoma et al., 1994). Tyto metody ještě dále rozdělujeme na metody emisní a absorpční Emisní metody Měříme záření, které je vysíláno (emitováno) vzorkem. K emisi dochází dodáním tepla, elektrické energie, proudem elementárních částic nebo elektromagnetickým zářením. Po 19

20 přijetí této energie se atomy nebo molekuly dostávají do méně stabilních energeticky bohatých stavů. Přebytek energie je odváděn v podobě elektromagnetického záření. Mezi emisní metody řadíme: atomová emisní spektrofotometrie metoda založená na sledování emise elektromagnetického záření volnými atomy látek v plynném stavu (Klouda, 2003). Vzorek převedeme do excitovaného stavu (např. jiskrovým výbojem) a při návratu vyzáří světlo určité vlnové délky, které je charakteristické pro daný atom. Intenzita je úměrná koncentraci atomů. Emitované záření rozložíme na monochromátoru a pomocí fotočlánků měříme intenzitu jednotlivých světelných čar (Hrdlička, 1998). plamenová fotometrie je modifikace atomové emisní spektrofotometrie, přičemž budícím zdrojem je plamen. Kapalný vzorek je nasáván do proudu okysličovadla, které se smísí s plynným palivem a hoří v hořáku. Teplota plamene bývá v rozmezí 2000 až 3000 C v závislosti na druhu použitého okysličovadla a paliva. Pro měření používáme atomový absorpční spektrometr s plamenovou atomizací bez duté katodové lampy (Klouda, 2003) Absorpční metody Při použití absorpčních metod dochází k pohlcování (absorpci) záření vzorkem. Využíváme přitom vlnové délky různých oblastí spektra elektromagnetického záření. Dále můžeme absorpční metody rozdělit podle charakteru použitého záření (Klouda, 2003). Do absorpčních metod se řadí (Nedoma et al., 1994): absorpční spektrometrie sleduje se absorbance vzorku v závislosti na vlnové délce světla. Vyjádřením závislosti je křivka, která je tvořena charakteristickými maximy a minimy. Tuto křivku nazýváme absorpčním spektrem. Absorpční spektrometrie se používá pro identifikaci a určení struktury organických látek především v infračervené oblasti (Hrdlička, 1998). Atomy v molekule vibrují kolem dané rovnovážné polohy. Molekula je v daném vibračním stavu a má určitou vibrační energii. Pokud molekula absorbuje elektromagnetické záření, dojde ke změně vibračního stavu v rozmezí vlnočtů od 50 do 400 cm -1. Vznikne tak spektrum pásového charakteru (Nedoma et al., 1994). 20

21 fotometrie a kolorimetrie jednoduché a levné varianty spektrofotometrie, při kterých se přísně nepoužívá monochromatické světlo. Výsledky jsou méně přesné (Hrdlička, 1998). 3.5 Spektroskopie Je to obor, který se zabývá studiem interakcí látek a elektromagnetického záření. Množství absorbovaného nebo emitovaného záření nám poskytuje údaje o energetických hladinách, z kterých můžeme vyvodit informace o struktuře molekul nebo krystalů, jimž daná spektra přísluší (Novotná et al., 2011). Obr. 1: Elektromagnetické spektrum ( 2014) Spektroskopii dělíme podle vlnových délek elektromagnetického záření: radio-spektroskopie submilimetrová spektroskopie optická spektroskopie - infračervená spektroskopie - UV/VIS spektroskopie rentgenová spektroskopie spektroskopie gama záření (Novotná et al., 2011) 21

22 Klasické chemické metody, které se využívají pro kontrolu falšování potravin, jsou finančně i časově náročné. Za poslední roky se vytvořily nové metody pro detekci falšování, které jsou založeny na optické spektroskopii (Zhen-hua et al., 2010) Infračervená spektroskopie Infračervená spektroskopie je nedestruktivní analytická metoda, kdy vzorek není poškozen, ale informuje nás o složení daného vzorku (Kania, 2014). Dochází k interakci infračervené části elektromagnetického záření s analyzovaným vzorkem, výsledkem je spektrum závislost absorbance (transmitance) na vlnočtu záření. Ve výsledku se potvrzuje přítomnost dané látky ve známém vzorku nebo se určují strukturní rysy, funkční skupiny u látek neznámých. Díky těmto vlastnostem se infračervená spektroskopie využívá v organické chemii, anorganické chemii, při kontrole potravin a v dalších oborech (Novotná et al., 2011). Infračervené záření má oproti ultrafialovému a viditelnému záření větší vlnovou délku a nižší energii. Infračervené spektrum se nachází v intervalu mezi 0, µm, což odpovídá vlnočtu cm -1. Infračervené spektrum se rozděluje na 3 části (Klouda, 2003): Blízká infračervená oblast: cm -1 Střední infračervená oblast: cm -1 Vzdálená infračervená oblast: cm -1 Infračervená spektroskopie se využívá v kvalitativní, ale hlavně v kvantitativní analýze (Praus, Plachá, 2008). Infračervená spektroskopie studuje pohyb jader v molekulách (molekulární vibrace) na základě interakce molekuly se zářením, které vedou k vibračním přechodům. Vibrací označujeme periodickou změnu vzdálenosti mezi jádry (Stuchlík, Müllerová, 2011). Protože na změnu elektronového stavu je zapotřebí velkého množství energie, kterou infračervené záření nemá, dochází pouze ke změnám vibračním a rotačním. Proto jsou tato spektra označována jako vibračně-rotační (Klouda, 2003). 22

23 Typy vibrací Vibrace se dají popsat jako změny vazebných délek a úhlů. Aby byli vibrace pozorovatelné v této oblasti, musí se měnit dipólový moment. Za aktivní vazbu považujeme vazbu polarizovatelnou např. C=N, vazba C=C je nepolární a bude tedy absorbovat záření velmi slabě (Novotná et al., 2011). Vibrace lze rozdělit na (Novotná et al., 2011): valenční (většinou se mění délka vazby): symetrické antisymetrické deformační (většinou se mění vazebné úhly): rovinné nůžkovité, kyvadlové mimorovinné vějířovité, kroutivé Obr. 2: Druhy deformací (Kania, 2014) Spektroskopie v blízké infračervené oblasti Spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR- near infrared spektroscopy) je řazena do molekulové spektroskopie při vlnových délkách nm (vlnočty cm -1 ). NIR oblast navazuje na viditelnou oblast z jedné strany a z druhé strany na střední infračervenou oblast (Matějka, 2008). NIR spektroskopie je rychlá, přesná, s nízkými jednotkovými náklady a je nedestruktivní. Tím, že je tato metoda nedestruktivní, odpadá náročná příprava vzorku. Vzorky musí obsahovat vazby C H, N H, S H nebo O H. Dále musí být koncentrace stanovované látky alespoň 1 g.kg -1. NIR spektroskopie je metoda sekundární, takže přesnost musíme testovat metodou klasickou (Míka et al., 2008). 23

24 NIR spektroskopií můžeme přímo analyzovat téměř všechny typy vzorků bez ohledu na skupenství (roztoky, suspenze, emulze, prášky a jiné). Zároveň můžeme analyzovat i vzorky, které mají nerovný a nepravidelný povrch. Při měření těchto spekter se používají metody založené na: absorpci záření po průchodu vzorkem (transmitance) měření kapalin, emulzí, pevných látek v roztoku nebo v suspenzi metody, které měří absorpci po odrazu záření od povrchu vzorku (difuzní reflektance) měření pevných látek s nerovným a nepravidelným povrchem (použití ve farmacii) metody, které kombinují obě uvedené metody (transreflektance) měření kapalin, emulzí, pevných látek v roztoku nebo v suspenzi (Muselík, 2012) Principem NIR spektroskopie je schopnost molekul absorbovat elektromagnetické záření díky tomu, že mění stav elektronového obalu vibračními pohyby a rotací. Rozeznáváme tři druhy energetických přechodů: elektronový, vibrační a rotační (Míka et al., 2008). NIR spektroskopii využíváme zejména pro stanovení sušiny, bílkovin, tuků a sacharidů. Dále ji můžeme využít pro stanovení senzorických a fyzikálně chemických parametrů hustoty, ph, velikosti částic (Růžičková, Šustová, 2006) Fourierova transformace Spektroskopy s Fourierovou transformací (FTIR) mají místo klasického monochromátoru Michelsonův interferometr, který pracuje na principu interference, kdy zesiluje resp. zeslabuje záření z polychromatického zdroje (Klouda, 2003). Obr. 3: Schéma Michelsonova interferometru (Čermák P., 2001) 24

25 U FTIR spektroskopu prochází světelný paprsek interferometrem, kdy světlo ze zdroje dopadá pod úhlem 45 na polopropustné zrcadlo A. To propustí polovinu záření a polovinu odrazí vznikají 2 paprsky. Každý z nich prochází jedním ramenem interferometru a odráží se od pevného zrcadla a od zrcadla pohyblivého, tak aby se dostaly zpět k polopropustnému zrcadlu A, kde se oba paprsky opět střetnou (Čermák et al., 2001). Fourierova infračervená transformace (FTIR) je jednou ze screeningových metod, které je možno použít pro detekci falšování medů. Nejlepší modely pro zveřejnění výsledků dává PLS (Partial least squares) regresní metoda nejmenších čtverců (Kelly et al., 2004) UV/VIS spektroskopie Ultrafialovo-viditelnou spektroskopii řadíme mezi elektromagnetické spektroskopické metody (Novotná et al., 2011). Podstatou této spektroskopie je absorpce ultrafialového a viditelného záření ( nm). Při absorpci dochází k excitaci valenčních elektronů, které jsou součástí molekulových orbitalů. Tato spektra jsou svou podstatou elektronová spektra (Klouda, 2003). Tato metoda je přesná, rychlá, citlivá a je nenáročná. Tuto spektroskopii využíváme pro identifikaci neznámých látek a stanovení koncentrací známých látek (Novotná et al., 2011) Metody pro měření UV/ VIS spektroskopie: Kolorimetrie metoda, která je založena na vizuálním porovnání intenzity zbarvení neznámého vzorku se vzorky o známé koncentraci. Stanovení se provádí srovnáváním za použití stejných kyvet a porovnáním barevnosti s barevností standardních roztoků. Další metodou je metoda zřeďovací, kdy se ředí standard do koncentrace roztoku vzorku. Hodnocení barvy odpovídá Lambert Beerově zákonu: c 1. l 1 = c 2. l 2 kde: c 1 je koncentrace stanovované složky, l 1 je tloušťka vrstvy stanovované látky, c 2 je známá koncentrace v porovnávaném vzorku, l 2 je tloušťka vrstvy porovnávaného vzorku (Nedoma et al., 1994). 25

26 Fotometrie je metoda objektivní, založená na měření prošlého zářivého toku. Pro měření se využívá jednodušších fotometrů (vymezení intervalu pomocí barevných filtrů) nebo spektrofotometrů, které obsahují monochromátor. Využíváme jedno nebo dvoupaprskové přístroje (Klouda, 2003). 3.6 Barva Barva je velmi mnohoznačný výraz, který má spoustu výkladů. Jedním z nich je, že barva je vlastnost zrakového počitku. Rozlišujeme dvě bezstrukturní části zorného pole stejného tvaru a rozměru. Bezstrukturní část je zbytek vjemu po odečtení prostorového rozložení, rozměrů a času od zrakového počitku. Tato odlišnost je závislá na složení světelného záření, které vstupuje do oka (ČSN ). Pangborn uvádí, že barva potravin slouží jako okamžitý identifikátor dobré nebo špatné kvality. Při nákupu surovin, kde je barva důležitým faktorem kvality, je měření barvy jedním z důležitých kritérií. Příkladem může být barva rajčatového protlaku nebo citrusových šťáv. Barva těchto výrobků nám poukazuje na kvalitu ovoce a taky na kvalitu výrobního procesu (Kress-Rogers, 2001) Barevný prostor L* a* b* Barevný prostor L* a* b* (označován jako CIELAB) je používán v mnoha oblastech pro měření barvy. Je to nejčastěji používaný barevný prostor, který byl definován CIE v roce 1976, který měl nahradit barevný prostor Yxy. (Pragolab, 2006). CIE je zkratkou Commission Internationale de l Eclairage (mezinárodní komise pro osvětlení), která se věnuje celosvětové spolupráci a výměně informací týkajících se světla, osvětlení a barvy ( 2014). Původní systém byl nedokonalý, protože stejné vzdálenosti na osách x, y neodpovídaly vnímanému rozdílu (Pragolab, 2006). Barevný prostor L* a* b* je charakterizován pravoúhlými osami L*, která udává jas a hodnotami a* a b*, které jsou souřadnicemi barevnosti a ukazují nám barevné směry (Zmeškal et al., 2002). 26

27 Obr. 4: Schematické znázornění prostoru L* a* b* (HunterLab, 2012) Střed těchto souřadnic je achromatický. Pokud se hodnoty a* a b* začnou zvyšovat, zvyšuje se i sytost barvy (Pragolab, 2006). Celková barevná diference se vypočte ze vzorce: E*ab = [(L*) 2 +(a*) 2 +(b*) 2 ] 1/2 Tato změna představuje uznávanou metodu hodnocení rozdílu barev. Pro orientaci byla sestavena stupnice, která udává stupně neshody dvou barev. Tab. 3: Rozdíl barev na základě celkové diference (Zmeškal et al., 2002) E* Rozdíl barev E* Rozdíl barev 0,0 0,2 nepostřehnutelný 0,2 0,5 velmi slabý 0,2 1,0 postřehnutelný 0,5 1,5 slabý 1,0 2,0 rozeznatelný 1,5 3,0 jasně postřehnutelný 2,0 4,0 ještě nerušící 3,0 6,0 střední 4,0 8,0 mírně rušící 6,0 12,0 výrazný 12,0 16,0 velmi výrazný více než 16,0 rušící 27

28 Podle tohoto vzorce ovšem nemůžeme indikovat velikost barevného rozdílu mezi předlohou a vzorkem. V případě systému L* a* b* je to relativně jednoduché, protože pracujeme v systému pravoúhlých souřadnic: L* = L* 2 (vzorku) L* 1 (předlohy) a* = a* 2 (vzorku) a* 1 (předlohy) b* = b* 2 (vzorku) b* 1 (předlohy) (Vik, 2014) Odchylky složek můžeme hodnotit i samostatně: L* > 0 světlejší vzorek L* < 0 tmavší vzorek a* > 0 červenější vzorek a* < 0 zelenější vzorek b* > 0 žlutější vzorek b* < 0 modřejší vzorek C*ab > 0 sytější vzorek (Zmeškal et al., 2002) Barevný prostor L* C* h Podle Pragolab (2006) rozdíl mezi barevným prostorem L* a* b* a barevným prostorem L* C* h je v tom, že tento barevný rozdíl používá cylindrické souřadnice. Jas L* je shodná hodnota jasu jako u barevného prostoru L* a* b*. Sytost C* (chroma) se vypočítá ze vztahu: C* = [(a*) 2 + (b*) 2 ] 1/2 Sytost barvy C* se vyskytuje v trojrozměrném prostoru, kde se na svislé ose vyskytují různé stupně šedé, směrem do stran od této osy jsou barvy sytější. Pro šedou barvu má hodnotu 0, pro čisté spektrální barvy má hodnotu 100 (vscht.cz, 2012). Barevný odstín h je dán úhlem, který svírá přímka vedená počátkem souřadnicového systému a vybraným bodem v barevném kruhu s osou souřadnic pro červenou barvu (vscht.cz, 2012). Jednotkou barevného odstínu jsou stupně ( ). Barevný odstín h je dán vztahem: h = tan -1 (b*/a*) Hodnoty a*, b* jsou stejné jako v barevném prostoru L* a* b* (Pragolab, 2006). 28

29 4 MATERIÁL A METODIKA Diplomová práce byla zaměřena na využití spektrofotometrických metod k falšování potravin. Vzhledem k obšírnosti dané problematiky byl v praktické části zvolen jako materiál med, který v současné době bývá velmi často v obchodní síti falšován. 4.1 Materiál Ke stanovení složení a barvy byly použity vzorky medů běžně dostupné v obchodních řetězcích nebo přímo u včelařů. Celkem bylo měřeno 73 vzorků medů, přičemž 33 vzorků pocházelo z tržní sítě, 26 vzorků pocházelo přímo od včelařů a 14 vzorků pocházelo ze sbírky medů. Testovány byly medy luční, medovicové a jeden med pekařský. Seznam všech medů, země původu, balení a cena jsou uvedeny v tabulce, viz Příloha I. 4.2 Metody Pro kontrolu falšování medů bylo použito více metod na ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity v Brně byly využity spektrofotometrické metody FT-NIR a měření barvy medu při UV/VIS na spektrofotometru Konica Minolta CM-3500d. Na ústavu zoologie, rybářství, hydrobiologie a včelařství Mendelovy univerzity v Brně byla stanovena mikroskopická analýza a fyzikálně chemické vlastnosti vzorků medů. Výsledky mikroskopické analýzy a fyzikálně chemických vlastností byly použity jako referenční metody pro srovnání výsledků získaných na FT-NIR Antaris. Cílem této diplomové práce bylo zjistit, zda je možné spektrofotometrickými metodami prokázat, jestli byly medy falšovány nebo nikoliv. Všechny výsledky byly zpracovány pomocí programu Microsoft Excel 2010 a pomocí statistického programu Statistica FT-NIR spektrofotometrické metody Analyzované vzorky byly měřeny na spektrofotometru FT-NIR Antaris. Každý vzorek byl měřen ve dvou paralelních měřeních po pěti opakováních. Parametrem měření bylo 64 scanů při rozlišení 8. Měření probíhalo v režimu reflektance na integrační sféře přes kompresní kyvetu, kdy byla použita transreflektanční kyveta s optickou drahou 0,02 mm. Programové vybavení počítače, který je spojen se spektrofotometrem, je software Omnic verze 7.3 a Resultintegration verze 3.0 (ThermoNicoletCorp., USA). Ke zpracování kalibračních modelů bylo použito programu TQ Analyst verze 7.2, kde byla 29

30 použita metoda diskriminační analýzy. Byly vytvořeny diskriminační kříže odlišnosti na hladině pravděpodobnosti na základě zvolených parametrů. Pomocí funkce PLS (Partial least squares tj. metodou nejmenších čtverců) byli získány predikované hodnoty měřených ukazatelů (vodivost, počet pylových zrn, obsah vody, rotace před a po inverzi). Po provedení cross-validace byla využita diagnostika funkce PRESS. Pro správnost kalibračního modelu je důležité, aby tato funkce měla klesající charakter a bylo využito optimální množství faktorů (2-15). Obr. 5: FT-NIR Antaris (USA) Obr. 6: Měření medu na integrační sféře Spektrofotometrie Konica Minolta K měření byl použit přístroj Konica Minolta CM 3500d (Japonsko), který je vybaven softwarem SpectraMagic verze 2.0, jímž byla získaná data analyzována. Transmitance celého spektra ( nm) byla měřena při intervalu vlnové délky 5 nm. Měření probíhalo při osvětlení D65 (tato hodnota představuje průměrné denní světlo s korelací barvy 6500 K) a pod úhlem 10. Vzorky byly měřeny transmitancí ve skleněné kyvetě při velikosti štěrbiny 30 mm a parametru SCI (měření s leskem). Vzorky medů byly před měření ztekuceny při teplotě 40 C v termostatu Incucell 55 (BMT, Česká republika), zhomogenizovány a měřeny v optické skleněné kyvetě proti slepému vzorku vodě. 30

31 Obr. 7: Spektrofotometr Konica Minolta (Japonsko) Referenční metody Abychom mohli porovnat výsledky získané na spektrofotometrech, byly na ústavu zoologie, rybářství, hydrobiologie a včelařství provedeny u vzorků medu analýzy pomocí referenčních metod: mikroskopická analýza, stanovení obsahu vody a stanovení měrné vodivosti u vzorků medů. Tyto analýzy byly provedeny na celkem 33 vzorcích medu, z toho 24 medů pocházelo z tržní sítě a zbylých 9 bylo koupeno přímo u včelařů Mikroskopická analýza pylová analýza Mikroskopické prvky obsažené v medu (pylová zrna či medovice) jsou odstřeďovány ve zkumavce s vodou. Vzniklý sediment se podrobí mikroskopické analýze (Louveaux et al., 1978). Vzorek medu o hmotnosti 10 gramů se rozpustí s 20 ml destilované vody, vzniklý roztok se rozdělí do 3 kyvet. Tyto kyvety jsou 3x odstřeďovány při 3000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut. Před třetím odstředěním se vzorky z kyvet smíchají do jedné kyvety a naposledy se vzorek odstředí. Sediment se nanese na podložní sklíčko a nechá se zaschnout. Poté se kápne roztok glycerin-želatiny na sediment a přikryje se krycím sklem. Sledujeme pod mikroskopem při 450 násobném zvětšení. Provedeme identifikaci nejméně 200 pylových zrn (u medů s velkým počtem pylových zrn se počítá až 500 zrn), poté stanovíme procentuální zastoupení (Přidal, 2005) Stanovení obsahu vody Obsah vody v medu je jedním z kritérií jeho kvality. Čím vyšší je obsah vody, tím vyšší je pravděpodobnost, že daný med bude kvasit v průběhu skladování. Stanovení vody ve vzorku se provádí refraktometricky. Touto metodou získáme nižší hodnoty než metodou 31

32 Carl Fischer, nicméně refraktometrické stanovení vody je velmi levná a dobře reprodukovatelná metoda. Metoda je založena na principu, kdy index lomu se zvyšuje se zvyšujícím se obsahem pevných látek (Bogdanov, 2002). Vzorek medu se nanese na hranol refraktometru, tak aby vrstva medu pokryla celou plochu hranolu. Index lomu se odečte po minutě, v tabulkách dohledáme odpovídající procentuální obsah vody. Tento obsah vody musíme ještě upravit na danou teplotu (Přidal, 2005) Stanovení měrné vodivosti Měrná vodivost vzorku medu je závislá na obsahu popela a množství kyselin, které jsou ve vzorku obsaženy. Čím vyšší je obsah popela a kyselin, tím vyšší je celková vodivost. Měrná vodivost je velmi jednoduchá a rychlá metoda. Stanovení měrné vodivosti je založeno na měření elektrického odporu, jehož elektrická vodivost je střídavá. Výsledek je vyjádřen v ms. m -1 (Bogdanov, 2002). Vlastní stanovení je založeno na přípravě 20% roztoku (40 ml medu ml destilované vody). Upravíme hustotu vzniklého roztoku na 17,6. Tímto roztokem naplníme sondu a na přístroji odečteme hodnotu v ms. cm -1. Provedeme korekci v závislosti na teplotě měřeného vzorku a převedeme na ms. m -1 (Přidal, 2005) Výsledky získané pomocí referenčních metod Provedené analýzy všech 33 vzorků medů ukázaly, že 18 medů odpovídalo deklaraci a splňovaly požadavky na med. 8 vzorků bylo nedostatečně či špatně označeno a tudíž neodpovídaly tyto vzorky deklaraci. Na základě analýz byly 3 vzorky podezřelé z falšování, ale odpovídaly deklaraci. Vzorek medu 19-T-009 byl falšovaný mikroskopický obraz prokazoval porušení medu. Další vzorek porušoval vyhlášku, na etiketě nebyl označen typ medu. Vzorek 23-T-009 obsahoval kriticky nízký počet pylových zrn (159 pylových zrn na g -1 ), podle závěru Ústavu zoologie, rybářství, hydrobiologie a včelařství se nejedná o med, ale o látku, do které byl med pouze přidán. Poslední med, vzorek 33-M-011 byl deklarován jako květový, lipový med, ale nejedná se o lipový (počet pylových zrn na med lipový byl moc vysoký). Celkové výsledky mikroskopické analýzy a fyzikálně chemické vlastnosti jsou uvedeny v Příloze IV a V. 32

33 5 VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 FT-NIR spektrofotometrické metody Pro měření medů se jako vyhovující projevila FT-NIR metoda měření na integrační sféře, kdy spektra vykazovala malé odchylky. V optimálním případě by spektra měli mít minimální odchylky (viz Obr. 8). Obr. 8: Spektra medů získaná pomocí integrační sféry Získané výsledky byly za pomoci TQ Analyst rozděleny do klastrů pomocí metody diskriminační analýzy na základě porušenosti medů a místa získání medů. První diskriminační kříž byl vytvořen porovnáním výsledků na základě jejich pravosti. Nejdříve byly porovnávány medy falšované s medy, které falšované nebyly. Podle tohoto kritéria nám vznikly oddělené následující klastry: Obr. 9: Diskriminační kříž čistých medů ( ) a falšovaných ( )medů 33

34 Na obr. 10 byly porovnávány vzorky cukerných sirupů s medy, které byly ověřeně falšované opět došlo k diferenciaci jednotlivých tříd od sebe: Obr. 10: Diskriminační kříž medů ověřeně falšovaných ( ) a cukerných sirupů ( ) Stejně tak se diferenciovaly i medy čisté od cukerných sirupů. Tím se potvrdilo, že FT-NIR je vhodná metoda pro rozlišení medů čistých, medů falšovaných i cukerných sirupů. Obr. 11: Diskriminační kříž medů čistých ( ) a cukerných sirupů ( ) 34

35 Spektra medů a cukerných sirupů jsou si velmi podobná, rozdíl je pouze v absorpčních maximech, proto dochází k diferenciaci spekter při použití diskriminační analýzy. Obr. 12: Rozdíl spekter mezi medem, falšovaným medem a cukerným sirupem Při vytvoření diskriminačního kříže, byly srovnány medy zakoupené v tržní síti a medy zakoupené přímo u včelařů, došlo také k diferenciaci, i když jsme předpokládali, že tyto dvě skupiny si budou velmi podobné. Obr. 13: Diskriminační kříž medů zakoupených v tržní síti ( ) a přímo u včelařů ( ) Podle Chen et al.(2008) je použití metody FT-NIR společně s metodou nejmenších čtverců rychlou screeningovou metodou pro kontrolu kvality čínských medů. 35

36 Vedle diskriminační analýzy, která byla použita pro odlišení vzorků navzájem od sebe, byla použita metoda tvorby modelu PLS (Partial Least Squares Metoda nejmenších čtverců). Kvalita vibračního modelu se posuzuje podle směrodatné odchylky kalibrace SEC (Standard Error of Calibration), pro validaci se používá odchylka predikce SEP (Standard Error of Prediction). Odchylka SEP by měla být co nejmenší, protože se projeví v budoucích předpovědích. SEP by měla být o něco málo větší než SEC. Pro úspěšnou NIR kalibraci by měla být odchylka SEP asi 2x větší než směrodatná odchylka laboratorního stanovení. Abychom mohli porovnat spolehlivost kalibrace pro různé složky, lze vypočítat kalibrační variační koeficient CCV (Calibration Coefficient of Variation), který nám vyjadřuje SEC v procentech průměrné laboratorní hodnoty. Analogem pro SEP je predikční variační koeficient PCV (Prediction Coefficient of Variation). Výhodou CCV a PCV je nezávislost na použitých jednotkách. Dobrá kalibrace má CCV do 5 % (PCV do 10 %), do 10 % CCV je model ještě použitelný (Čurda et al., 2002). Tab. 4: Celková získaná data pro tvorbu kalibračních modelů pro med KALIBRACE SEC CCV (%) R Obsah vody 13,3 77,515 0,919 R korelační koeficient kalibrace Rotace před inverzí 0,911 21,73 0,992 SEC směrodatná odchylka kalibrace Rotace po inverzi 5,72 91,315 0,506 CCV kalibrační variační koeficient Vodivost 11,4 22,59 0,169 Tab. 5: Validované hodnoty kalibračních modelů pro med VALIDACE SEP PCV (%) R Obsah vody 1,01 5,88 0,496 R korelační koeficient predikce Rotace před inverzí 2,25 53,66 0,949 SEP směrodatná odchylka predikce Rotace po inverzi 6,53 104,246 0,237 PCV predikční variační koeficient Vodivost 32,2 63,82 0,359 Kalibrační modely pro stanovení obsahu vody a rotace před inverzí měly nejvyšší hodnoty korelačních koeficientů 0,919 a 0,992. Směrodatná odchylka kalibračního modelu pro obsah vody dosahovala hodnoty 13,3, což je příliš vysoká hodnota. Model pro rotaci před inverzí dosahoval hodnoty směrodatné odchylky 0,911. Ani jeden 36

37 z modelů není popsán spolehlivostí - CCV VODA 77,515 %, CCV ROTACE 21,73 %. Korelační koeficienty pro ostatní kalibrační modely vykazovaly nízké korelační koeficienty, ale ani zde se hodnoty CCV nedostaly pod 10 %. Všechny navržené kalibrační modely vykazují hodnoty CCV vyšší než 10 %. Tyto modely jsou tedy nespolehlivé a tudíž nepoužitelné. Toto tvrzení dokazují i funkce PRESS, která nemá optimální klesající charakter. Obr. 14: Průběh funkce PRESS pro rotaci po inverzi Získané výsledky ukazují, že použití přístroje FT-NIR Antaris je vhodné pro zjištění složení daného vzorku medu, při tvorbě diskriminačních křížů dochází k diferenciaci. Využitím FT-NIR spektrofotometrie v oblasti falšování medu se zatím nikdo nezabýval, proto není možné získané výsledky porovnat s jinými výsledky. Králová et al.(2014) použily tento přístroj, aby zjistily, zda je schopen rozpoznat rozdíly ve skladování medu. Při tvorbě diskriminačního kříže došlo k rozdělení vzorků medů. FT-NIR rozdělil vzorky podle toho, zda byly vzorky skladovány na světle, ve tmě nebo v chladničce. 37

38 5.2 Spektrofotometrické stanovení barvy Pro lepší orientaci ve výsledcích byly vzorky medu rozděleny na základě parametru jasu L* a to do čtyř skupin: 1. L* > 90 medy velmi světlé 2. L* medy světlé 3. L* medy tmavé 4. L* < 30 medy velmi tmavé Pátou skupinou jsou cukerné sirupy, které mají průměrnou hodnotu L* 97,44. Výsledky získané na spektrofotometru Konica Minolta jsou rozděleny do skupin podle jasu L* (D65) a uvedeny v Příloze III. Obr. 15: Porovnání barev medu a cukerného sirupu (zleva: med velmi světlý, med světlý, med tmavý, med velmi tmavý, cukerný sirup) Tab. 6: Průměrné hodnoty parametrů pro skupiny medů a cukerných sirupů Skupina Počet vzorků L*(D65) a*(d65) b*(d65) ,32±1,49-2,70±0,30 22,73±5, ,13±7,24 11,14±7,66 72,91±18, ,45±8,25 25,48±10,52 80,25±17, ,20±5,32 36,28±4,10 32,81±9, ,44±5,74 0,00±1,62 13,35±26,76 38