in vitro diagnostika

Transkript

1 in vitro diagnostika Prof. Ondřej Topolčan převzal Cenu C. R. Jolliffa pro rok 2011 Optima XE a XPN Zrychlení přípravy vzorků pro sekvenátory nové generace Membránové molekuly na buňkách monocytární řady Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

2 Budoucnost nových výzkumných center Prof. RNDr. Václav Pačes, DrSc. se narodil 2. února 1942 v Praze. Vystudoval Přírodovědeckou fakultu Univerzity Karlovy. V roce 1968 obhájil kandidátskou práci na Ústavu organické chemie a biochemie ČSAV. Rok pak působil na univerzitě v Chicagu a rok na McMasterově univerzitě v kanadském Hamiltonu. Přednášel rovněž na univerzitách v Yale, Seville a v Bristolu, pracoval v Ústavu aplikované biochemie v Japonsku. Byl činný v mnoha dalších zahraničních institucích. Od roku 1976 pracuje na Ústavu molekulární genetiky (dnes AV ČR). Jeho pracovní skupina v roce 1986 dokončila genomový projekt přečtení úplné dědičné informace bakteriálního viru. Stala se tak jednou z prvních na světě, které se to podařilo. Prof. Pačes je objevitelem specifického enzymu zapojeného do katabolismu rostlinného hormonu cytokininu. Je také spoluautorem prvního českého syntetického genu. V roce 1989 získal Václav Pačes Státní cenu za vědu. Zároveň byl vyznamenán cenou ČSAV za popularizaci vědy. V letech byl místopředsedou Akademie, v letech působil jako ředitel Ústavu molekulární genetiky. Předsedá České společnosti pro biochemii a molekulární biologii a je členem prestižní Evropské molekulárně biologické organizace. Podle svých dosavadních prohlášení je zastáncem směru, jenž vidí nejdůležitější roli Akademie věd v základním vyhledávacím výzkumu. Jaký je v současnosti stav financování vědy a výzkumu ze strany státu v porovnaní s ostatními zeměmi OECD? Je stále nižší. Sice se poslední léta financování výzkumu zvyšovalo, ale peníze tekly mj. do několika černých děr. Nyní navíc stagnuje. A vede to k tomu, že se naše projekty jen obtížně prosazují v soutěži o evropské granty, protože nedostatečné financování nutně vede k průměrným výsledkům výzkumu. Myslím, že je třeba veřejné finance soustředit na podporu toho nejlepšího. Mnohé vysoké školy (vysoké jen podle jména) by měly být zrušeny a průmysl by měl být donucen, aby do výzkumu investoval své vlastní peníze. Je předpoklad, že se v budoucnosti změní podíl HDP vynaložený na financování AV? Velmi se obávám, že se změní v neprospěch AV. Přitom vlády neustále opakují, že se výzkumné instituce budou podporovat podle výkonnosti. Všechny objektivní ukazatele, jako je počet a citovanost prací, udělené patenty apod., jasně ukazují, že je Akademie věd naším zdaleka nejvýkonnějším vědeckým zařízením. Například nezávislý mezinárodní žebříček světových vědeckých ústavů řadí naši Akademii věd do první stovky. Univerzita Karlova se umisťuje kolem 200. místa, všechny ostatní české instituce jsou v pořadí až za místem 700. Jaká jsou Vaše očekávání od nově vznikajících center jako Biocev, ELI, Ceitec a dalších? Víte, když jsou peníze, tak to nejsnazší je postavit nové budovy a vycpat je nákladnými přístroji. Daleko obtížnější je stanovit výzkumný program s vizí a vůbec nejtěžší je najít kvalitní lidi, kteří budou tento program formulovat a naplňovat. Když se toto povede, stanou se centra důležitou součástí naší výzkumné infrastruktury. Měly by být navíc silně orientovány na transfer vědeckých výsledků do praxe. To nám hodně chybí. Jsem optimista a věřím, že centra svou úlohu splní. Nejlépe vidím do projektu Biocev. Tam se nám podařilo dobrý program sestavit. Nesmíme však na něm ustrnout a vlastně ho budeme muset neustále aktualizovat podle vývoje světové vědy. Jaké postavení budou mít na základě očekávání tato centra v konkurenci zahraničních renomovaných institucí? Musí být konkurenceschopná. Jenom tak bude zájem o to s nimi spolupracovat. Jde zejména o kooperaci v rámci Evropy, ale ne pouze zde. Velký zájem o součinnost s Biocevem projevili například kolegové z Taiwanu. Kromě akademických institucí chceme spolupracovat i s bio-firmami, a to nejen v České republice. Očekává se, že budou na tyto nově vznikající instituce přicházet zahraniční vědecké kapacity? Jakým způsobem je mohou nová centra nalákat? Chtěli bychom, aby byla tato centra co nejvíce mezinárodní. Všechna vědecká místa budou obsazována otevřenými konkurzy. Nenamlouváme si ale, že se k nám pohrnou kolegové z USA nebo Německa. Tato situace by mohla nastat až později, až se centra prosadí a až budeme moci nabídnout srovnatelné podmínky platové, životní a samozřejmě hlavně pracovní. Zpočátku asi budou přicházet kolegové z východu. Jsou tam velmi schopní vědci, kteří mají podmínky pro práci horší, než je v současnosti u nás. Ti by nám mohli pomoci dostat centra na patřičnou úroveň. Jste velmi úzce zainteresován v projektu Biocev. Jaké bude jeho hlavní poslání a jaké postavení by Biocev mohl reálně mít v roce 2025? Velmi bych si přál, aby byl Biocev v roce 2025 jednou z předních evropských institucí orientovaného výzkumu v oblasti biomedicíny a biotechnologií. Je to reálné, ale musíme se opravdu snažit. Uvidíme, jak se nám to povede. PROF. RNDR. VÁCLAV PAČES, DRSC. ÚSTAV MOLEKULÁRNÍ GENETIKY AV ČR VÍDEŇSKÁ 1043, PRAHA 4 vpaces@img.cas.cz 2 EVA KRÁLOVÁ ekralova@beckman.com

3 OBSAH Úvodník: Rozhovor s Prof. Pačesem E. Králová Prof. Ondřej Topolčan převzal Cenu C. R. Jolliffa pro rok 2011 R. Kučera Optima XE a XPN E. Králová Allegra X-30 E Králová CESI 8000 J. Smolka Zrychlení přípravy vzorků pro sekvenátory nové generace M. Polčík Nová protilátka v soupravě na stanovení estradiolu T. Tietze, I. Mičíková Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometrii P. Kružík Nová reagencie pro stanovení fosfoepitopů P. Kružík Kontrolní materiály pro průtokovou cytometrii P. Kružík Membránové molekuly na buňkách monocytární řady K. Koubek Prediktivní, preventivní a personalizovaná medicína M. Karlíková, O. Topolčan IGF1 a nádorové markery ve stádiích nádoru prsu R. Kučera Kongres ESHRE R. Kučera Uživatelské setkání Hluboká nad Vltavou K. Svobodová X. Celostátní sjezd ČSKB K. Svobodová Analytická cytometrie VI. R. Vlček Labhem a V. BHaTD J. Bernátová LaborExpo 2011 M. Máša MUDr. Tomáš Soukup tak trochu jiný doktor... J. Petera Křížovka Kde se můžeme setkat Časopis vydává a distribuuje Beckman Coulter Česká republika s.r.o., Radiová 1, Praha 10, Časopis připravují Ing. Kateřina Kožaná Ing. Eva Králová Ing. Hana Krátká Mgr. Pavel Kružík Ing. Kateřina Lapišová, Ph.D. Ing. Petr Suchan Mgr. Patrik Šaf RNDr. Jozef Smolka Do časopisu přispěli Ing. Eva Králová Mgr. Radek Kučera RNDr. Jozef Smolka RNDr. Martin Polčík, CSc. Mgr. Ing. Tereza Tietze Ing. Mgr. Ivana Mičíková Mgr. Pavel Kružík RNDr. Kristián Koubek, DrSc. - ÚHKT RNDr. Marie Karlíková, Ph.D. - Lékařská fakulta v Plzni Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc. - FN Plzeň Ing. Klára Svobodová Ing. Roman Vlček Mgr. Jozefína Bernátová RNDr. Martin Máša, Ph.D. Bc. Jakub Petera Ing. Kateřina Kožaná Ivan Šarkan - autor křížovky Ing. Stanislav Čermák - autor tajenky Grafik Jiří Adámek Náklad čísla 2000 výtisků Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

4 Prof. Ondřej Topolčan převzal Cenu C. R. Jolliffa pro rok 2011 Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc. převzal dne v americké Atlantě významnou Cenu C. R. Jolliffa pro rok 2011 za svou celoživotní práci v oboru klinické a diagnostické imunologie. Tohoto uznání se mu dostalo na výročním zasedání Americká asociace klinické chemie (AACC). Ocenění je udělováno členům AACC za vynikající výsledky v oboru klinické imunologie a na poli výuky a je spojeno s prémií ve výši USD. Uvedenou významnou cenu, založenou v roce 2006, dosud obdrželo pět amerických a jeden kanadský profesor. Prof. Topolčan je prvním mimoamerickým nositelem tohoto ocenění. Prof. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc. je absolventem plzeňské lékařské fakulty, na níž také v roce 1967 odpromoval. Po ukončení vysokoškolského studia nastoupil na Interní kliniku Lékařské fakulty UK a Fakultní nemocnice v Plzni. V roce 1972 se stal odborným asistentem, v roce 1986 habilitoval a v roce 1993 byl jmenován profesorem vnitřního lékařství. Specializaci 1. stupně z vnitřního lékařství získal v roce 1972, specializaci 2. stupně pak v roce Od roku 1993 pracuje jako vedoucí imunoanalytické laboratoře ve FN v Plzni. V letech byl přednostou II. interní kliniky LF UK a FN v Plzni. Od roku 1994 až do současnosti je členem Vědecké rady LF. 4 Od roku 1997 působil každé dva roky coby předseda Českých imunoanalytických dnů. Je vlastníkem členské karty v European Group on Tumour Markers. Od roku 2001 je též náměstkem ředitelky FN v Plzni pro vědu a výzkum. V roce 2006 se stal viceprezidentem konference ISOBM v Praze. Je členem výboru České společnosti nukleární medicíny a předsedou České společnosti pro imunoanalýzu. Zároveň je držitelem členství ve výboru EPMA (European preventive, predictive and personalized medicine). V souvislosti se získáním Ceny C. R. Jolliffa jsme se Prof. Topolčana zeptali na několik otázek: Pane profesore, můžete říci něco blížšího o Vašich hlavních výzkumných aktivitách? V období let jsme prováděli preventivní prohlídky v průmyslových podnicích (vyšetřili jsme na tamních zaměstnanců) s cílem aktivně vyhledávat pomocí vyšetření imunoreaktivního inzulínu a lipidických parametrů osoby především s patologickou glukózovou tolerancí, eventuálně manifestním diabetem. Jedinci s prokázanými abnormalitami byli dispenzarizováni. Výsledkem výzkumu byl již v 80. letech průkaz vztahu poruch glycidového metabolizmu s výskytem kardiovaskulárních onemocnění. V letech jsem působil jako koordinátor fakultního výzkumného projektu zaměřeného na biologickou aktivitu nádorů. Na tomto úkolu se podílelo více než 150 vědeckých pracovníků. Výsledkem byla celá řada publikací, které poukazovaly na možnost optimálního využívání biomarkerů pro monitorování průběhu nádorového onemocnění a optimalizaci léčby. V rámci tohoto záměru vnikla řada vědeckých spoluprací, z nichž většina trvá dodnes. Kromě své vědecké a výzkumné činnosti se jistě věnujete i výuce. V jakém rozsahu? Na plzeňské lékařské fakultě přes 30 let vyučuji vnitřní lékařství. V současné době jsou to především některé vybrané kapitoly z endokrinologie určené jak českým, tak zahraničním studentům. Kromě toho více než 10 let přednáším o klinickém využití imunoanalýzy. Aktuálně tvoří hlavní náplň mé pedagogické činnosti výukové kurzy v rámci strukturálních fondů EU Endokrinologie a v září tohoto roku zahájený projekt Metody molekulární biologie a personalizovaná medicína. Více než dvacet let jsem působil jako pedagog vnitřního lékařství na Vyšší zdravotnické škole. V zahraničí jsem na univerzitě v Athénách přednášel o uplatnění biomarkerů v onkologii a jednou ročně rovněž vyučuji v kurzech imunoanalýzy v Berlíně.

5 Těžištěm Vaší práce je také po dlouhou dobu postgraduální výuka... Ano, v období let jsem byl školitelem deseti postgraduálních studentů, kteří úspěšně obhájili své disertace. V současné době jsem vedoucím disertačních prací šesti dalších posluchačů. Kromě toho jsem vedl diplomové práce dvou studentů z Fakulty bioinformatiky Západočeské univerzity a ti rovněž ukončili svá vysokoškolská studia s úspěchem. A co Vaše publikační činnost? Doposud jsem publikoval přes 250 prací v lékařských časopisech, z toho 85 s tzv. impact factorem. Na lékařských konferencích a kongresech jsem přednesl přes 400 sdělení. Můj vědecký citační index činí 398 a H index 12. Jsem také spoluautorem tří monografií o imunoanalýze. Ve FN v Plzni vedete laboratoř imunoanalýzy. Čím se Vaše pracoviště především zabývá? V naší laboratoři pracuje 20 zaměstnanců. Ročně zde provádíme zhruba testů. Přibližně 50 procent z nich tvoří vyšetření endokrinologická, 40 procent vyšetření parametrů biologické aktivity nádorů a 10 procent pak nejrůznější speciální metody, především pro potřeby výzkumu. Jejich spektrum se mění výrazně v závislosti na existujících grantových projektech a potřebách spolupracujících pracovišť. V současné době se věnujeme třem aktuálním tématům: 1) změnám hladin vitamínu D u zhoubných nádorů u pacientů s neurologickými chorobami 2) významu stanovení HE 4 pro časnou diagnostiku ovariálního karcinomu 3) významu propsa pro klinickou praxi Na celostátním biochemickém sjezdu byly prezentovány výsledky naší studie o tom, jak propsa (přesněji p2psa) pomáhá v optimalizaci indikací provádění biopsií prostaty. A co Vaše lékařská praxe? Na interní klinice jste se mnoho let věnoval endokrinologii. Zabýváte se v současné době stále i ambulantní léčbou? Jednou týdně mě můžete potkat v ambulanci na II. interní klinice, kde se starám především o nemocné s endokrinními chorobami. Beckman Coulter Vám gratuluje k získání ceny AACC a přeje Vám hodně úspěchů ve Vaší další práci! RADEK KUČERA rkucera@beckman.com POMOZTE NÁM S TVORBOU ČASOPISU IN VITRO DIAGNOSTIKA Pojďte nám, prosím, pomoci s tvorbou časopisu In Vitro Diagnostika a odpovězte nám na několik následujících otázek. Přispějete tak k tomu, že budeme moci co nejvíce přiblížit časopis obsahově i vzhledově vašim představám! Jak jste spokojeni s obsahovou stránkou časopisu In Vitro Diagnostika? Jak jste spokojeni se vzhledem časopisu In Vitro Diagnostika? Co se vám na našem časopise nejvíce líbí? Co se vám naopak nelíbí? Co vám v našem časopise chybí? Jaká témata, informace o produktech, zajímavých osobnostech apod. byste na stránkách IVD rádi uvítali? Své odpovědi na otázky či jakékoliv další připomínky a nápady nám zasílejte na adresu kkozana@beckman.com. Děkujeme! Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

6 Nová generace ultracentrifug Optima Ultracentrifugy patří mezi přístroje, které se již řadu let používají pro základní a aplikovaný výzkum. Společnost Beckman Coulter představila svoji první komerční ultracentrifugu již v roce Od té doby zaujímá čelní pozici v oblasti inovace těchto strojů. I když fyzikální princip zůstává samozřejmě stejný, je stále co vylepšovat a zdokonalovat. Ultracentrifugy jsou často umístěny ve společných prostorách spolu s jinými dalšími zařízeními, jako jsou vysokokapacitní odstředivky, hlubokomrazící boxy nebo inkubátory a třepačky. Dohromady mohou tyto přístroje produkovat značný hluk a spotřebovávat velké množství energie. A právě řešení uvedených problémů se odráží v další generaci ultracentrifug Optima. Základní řada Optima TM XE i prémiová řada Optima TM XPN jsou navrženy a konstruovány tak, aby došlo jak ke snížení hladiny hluku, tak k poklesu spotřeby energie. Hluk je při centrifugaci způsoben rezonancí pohonné jednotky motoru. Rezonance se při provozu obvykle projevuje jako ječivý zvuk. Nový design má za následek výrazný úbytek těchto zvukových ozvěn, čímž je eliminována většina hluku spojeného s provozem ultracentrifugy. Zmíněný průlom v inovaci vyústil dokonce v podání patentové přihlášky. 6 Samotné zdokonalení spočívá ve dvou základních změnách v konstrukci ultracentrifugy. První je její vyztužení, což by ale samo osobě nestačilo. Druhou důležitou změnu představuje nový design motoru. Motor vytváří při provozu teplo, proto jsou jeho součástí chladící žebra. Ta byla dříve všechna naprosto stejná. Nyní má každé z nich jiný tvar a to jim dává unikátní rezonanční kmitočet. V praxi to pak znamená, že buď žádné nebo jen velmi malý počet žeber rezonuje v dané provozní rychlosti., nikoliv tedy jako dříve, kdy všechna rezonovala současně. Dalším důležitým úkolem, který stál před konstruktéry, bylo efektivní využití a snížení spotřeby energie. Inovační pracovníci zkoumali spotřebu energie v každém provozním režimu, to znamená při zrychlování, rovnovážném stavu po dosažení dané rychlosti, brzdění a zej- ména v případě, kdy je sice přístroj zapnutý, avšak není používán. Nejzajímavějšími se ukázaly být dva režimy. První je režim brzdění, kdy rotor z plné rychlosti zpomaluje až na 0 rpm. Druhý pak v klidovém stavu. Nové ultracentrifugy série Optima byly navrženy tak, aby byla část energie vrácena zpět do sítě pomocí tzv. regenerativního brzdění a zároveň aby minimalizovaly spotřebu energie, pokud je přístroj v klidovém stavu. Byla provedena série experimentů, a to jak u našich stávajících ultracentrifug Optima TM L-100K, Optima TM L-100 XP, ale také u kon-

7 kurenční Hitachi WX100. Pokusy ukázaly, že Optima TM XE a XPN mají o 56 % nižší spotřebu energie v klidovém módu než současná Optima TM L-100 XP, o 23 % nižší než Optima TM L-100K a o 33 % nižší než Hitachi WX100. Vzhledem k dlouhé životnosti ultracentrifug to znamená výrazné snížení nákladů na provoz a minimální dopad na životní prostředí. To jsou však pouze technické inovace. Nové ultracentrifugy prošly také výraznou změnou designu a mají řadu důležitých vylepšení pro snadnější obsluhu a ovládání. Nejzásadnější změnou je velká 17-ti palcová dotyková obrazovka, která umožňuje zobrazovat více informací najednou s nejdůležitějšími parametry viditelnými až z druhého konce místnosti. Ovládací software je velmi intuitivní. V případě potřeby lze zobrazit interaktivní nápovědu ke každému tlačítku. Kromě zobrazení aktuálních hodnot otáček, teploty nebo zbývajícího času separace je možné tyto hodnoty vidět v přehledné grafické formě, jež zaznamenává celý průběh chodu centrifugy. Prémiové modely XPN nabízí další doplňky. Jedním z nich je připojení centrifugy k internetu. Díky tomu může být vzdáleně ovládána a monitorována z jakéhokoli počítače nebo i tzv. chytrého telefonu, a to nejen na pracovišti, ale rovněž např. z domova. Můžete se tak více soustředit na jinou práci a nezdržovat se odbíháním a kontrolováním aktuálního stavu přístroje. Přístup k ovládání je zabezpečen vytvořením uživatelských účtů s volitelnými úrovněmi správy přístroje. expert software u modelů XPN dovoluje uživateli offline simulace průběhu a modelování optimálních podmínek separace v gradientech nebo prosté peletace. Obsažena je rovněž databáze všech rotorů a kompatibilních zkumavek, včetně jejich chemické odolnosti. Dále je možné přepočítávat podmínky separace pro různé rotory a zkumavky nebo zjišťovat sedimentační koeficienty biomolekul. Samozřejmostí je zaznamenávání a export historie užívání přístroje, který je aktuálně rozšířen také o správu rotorů podle sériových čísel. Export může probíhat ve formě souboru na USB flash disk, nebo se může rovnou vytisknout na síťové tiskárně. Pokud by některým uživatelům nevyhovovalo ovládání přes dotykovou obrazovku, může si do USB portu centrifugy připojit klasickou počítačovou myš. Centrifugy byly zkrátka navrženy tak, aby splňovaly každodenní potřeby zákazníků, jež jsme zjišťovali v rámci průzkumu, který vývoji předcházel. Jednoduše řečeno: Vy jste povídali a my naslouchali EVA KRÁLOVÁ ekralova@beckman.com Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

8 Nové stolní centrifugy série Allegra X-30 Společnost Beckman Coulter vyrábí centrifugy nejrůznějších typů již více než 60 let. V jejím portfoliu naleznete také malé stolní centrifugy pro běžnou každodenní laboratorní práci. A právě v této produktové řadě uvádí Beckman Coulter na trh novou sérii centrifug s označením Allegra X-30, které byly vyvíjeny s myšlenkou maximálně vyhovět potřebám laboratoří. Allegra X-30 patří k nejuniverzálnějším stolním centrifugám na trhu. Vyniká nejen kapacitou a kompaktním vzhledem, ale také svým výkonem při použití úhlového rotoru nebo rotoru na mikrotitrační destičky nabízí největší otáčky za minutu (rpm) a tíhové zrychlení (g) ve své třídě. K dispozici je celá řada rotorů, proto není problém najít ten nejvhodnější právě pro vaši aplikaci. Další vlastnost, jež může být v laboratoři důležitá, představuje kompaktní design. Chlazená centrifuga se svojí šířkou 46 cm šetří pracovní plochu. V porovnání s konkurenčními centrifugami stejného typu je tak přibližně o 35 % užší. Centrifugy řady Allegra X-30 jsou ideální pro aplikace, jako jsou izolace a frakcionace proteinů, práce s nukleovými kyselinami, izolace buněk, peletování nebo klasická příprava krevních vzorků. Právě pro tyto nejpoužívanější aplikace jsme připravili zvýhodněné aplikační balíčky: příprava krevních a klinických vzorků zpracování buněčných a tkáňových kultur buněčná analýza a stáčení mikrotitračních destiček vysokorychlostní separace v mikrozkumavkách Specifikace: Allegra X-30 Allegra X-30R Maximální rychlost rpm rpm Maximální tíhové zrychlení (g) g g Maximální kapacita 4 x 400 ml Timed pro nastavení času až do 9 hod 59 min Časové módy Hold pro nespecifikovanou délku točení Pulse pro krátké točení Profily zrychlení/brzdění 10/10 Nastavení teploty N/A -20 C +40 C Motor bezúdržbový indukční motor Rozměry v cm (šířka x hloubka x výška) 46 x 55 x 35,5 46 x 70,7 x 37 Váha 48 kg 78 kg Blood Sample Preparation Application Package Balíček je určen pro zpracování krve, moči a dalších tělních tekutin předcházející jejich vlastní analýze. Maximalizuje tak výkonnost a kapacitu je možné stáčet až 64 zkumavek současně. Zároveň lze zvýšit bezpečnost laboratoře dokoupením BioCertified* protiaerosolových víček rotoru. Součástí balíčku jsou: - centrifuga Allegra X-30 nebo Allegra X-30R - výkyvný rotor SX 4400 (4 700 rpm, g) - adaptéry na Vacutainer /Hemolyse/RIA 10ml, 16 mm zkumavky (2 x balení po 2 kusech) - adaptéry na Vacutainer /Hemolyse/RIA 5 ml, 13 mm zkumavky (2 x balení po 2 kusech) 8

9 Cell Culture Application Package Ideální pro práci s buněčnými kulturami ve velkých, středních i malých objemech. Opět je možné zvýšit bezpečnost práce dokoupením BioCertified* protiaerosolových víček rotoru. Součástí balíčku jsou: - centrifuga Allegra X-30 nebo Allegra X-30R - výkyvný rotor SX 4400 (4 700 rpm, g) - adaptéry pro 50 ml konické zkumavky typu Falcon (2 x balení po 2 kusech), kapacita 3 zkumavky na adaptér/12 zkumavek na rotor - adaptéry pro 15 ml konické zkumavky typu Falcon (2 x balení po 2 kusech), kapacita 5 zkumavek na adaptér/20 zkumavek na rotor Microplate Application Package Ideální pro high-throughput aplikace a aplikace vyžadující centrifugaci mikrotitračních destiček při vysokých otáčkách. Součástí balíčku jsou: - centrifuga Allegra X-30 nebo Allegra X-30R - rotor pro mikrotitrační destičky S6096 (4 700 rpm, g), kapacita 6 standardních a 2 deep-well destiček High-speed Application Package Perfektní pro aplikace jako je dělení proteinů, separace nanočástic nebo DNA/RNA izolace. Úhlový BioCertified* rotor, který je součástí balíčku, poskytuje výkon g a umožňuje tak získat výsledky rychleji a ušetřit tak drahocenný čas v laboratoři. Součástí balíčku jsou: - centrifuga Allegra X-30 nebo Allegra X-30R - úhlový rotor F2402H pro 24 x 1,5 ml zkumavek ( rpm, g) *BioCertified je termín používaný pro produkty testované a validované nezávislými laboratořemi pro práci s nebezpečným vzorky. Pro více informací navštivte naše stránky nebo si vyžádejte naši nabídku. EVA KRÁLOVÁ ekralova@beckman.com Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

10 CESI 8000 vysokovýkonný separačný ESI modul s OptiMS technológiou Jedna z primárnych a najrozšírenejších metód na analýzu chemických látok je v súčasnej dobe hmotnostná spektrometria (MS). Medzi jej najväčšie výhody oproti iným vedeckým postupom patrí napríklad NMR, rýchlosť analýzy, citlivosť a schopnosť analyzovať minimálne množstvo látky, čo je v biochemických a forenzných CESI, ktorá plnohodnotne integruje vysokú výkonnosť a nízkoprietokové charakteristiky kapilárnej ekktroforézy (CE) s elektrosprejovou ionizáciou (ESI) do jedného dynamického procesu na jednom a tom istom zariadení. S CESI je možné vygenerovať stabilný prietok elektrolytu nižší ako 10 nl/min, čo výrazne zvyšuje citlivosť celej metodiky. aplikáciách často nevyhnutnou podmienkou. Či už sa teda jedná o charakterizovanie terapeutického proteínu, identifikáciu proteínov, ktoré vytvárajú špecifický proteóm, alebo charakterizáciu posttranslačných modifikácií, vo všetkých týchto prístupoch je zvýšenie citlivosti a zníženie iónovéj supresie vítaným riešením na získanie nových informácií o analyzovaných látkach. CESI 8000 bol vyvinutý v spolupráci s odborníkmi z oblasti hmotnostnej spektrometrie zastrešujúcich množstvo aplikácií v danom odvetví. Hládali sa možnosti ako rozšíriť sféru detekcie a zároveň zvýšiť citlivosť metodiky. Pre dosiahnutie tohto cielá došlo k integrácii nízkoprietokovej pre-ms separačnej technológie s novou ESI technológiou. Tento nový modul je založený na novej predradenej separačno ionizačnej technológii nazývanej CESI-MS ponúka v rámci predradených separačných technológíí tieto hlavné výhody: zvýšená citlivosť stabilná ESI sa vytvára pri ultranízkych prietokoch v nízkej nl/min oblasti vysokoúčinná separácia kapacita > 300 znížená doba cyklu krátke intervaly analýzy a regenerácie presné vzorkovanie od nanolitrových po mikrolitrové objemy vzoriek širšie analytické pokrytie ideálne pre vysokonabité a polárne analyty Kapilárna elektroforéza (CE) je nízkoprietokovou technológiou, ktorá je známa svojou jedinečnou rozlišovacou schopnosťou. CESI 8000 vysokovýkonný separačný EI modul je navrhnutý pre aplikácie hmotnostnej spektrometrie, ktoré analyzujú nabité a polárne molekuly. Vďaka jeho robustnej OptiMS technológii sú výhody kapilárnej elektroforézy priamo poskytnuté do hmotnostného spektrometra bez akéhokoĺvek zoslabenia alebo porušenia. Stabilná elektrosprejová ionizácia je vytváraná pri ultra- 10

11 teplotu kapilári a maximalizuje reproducibilitu. Kapilára je umiestnená v ochranej kazete, ktorá umožňuje ĺahkú manipuláciu a znesie aj robustné zaobchádzanie. Cartridge OptiMS je kompatibilná s viacerými hmotnostnými spektrometrami. Pomocou použitia príslušného adaptéra sa napája priamo do nanosprejových zdrojov zariadení od AB-Sciex, Bruker, Thermo a Waters. nízkom prietoku nl/min, čo má za následok ultravysokú citlivosť. Tieto nízke rýchlosti toku umožňujú zároveň redukovať efekty iónovej supresie. OptiMS Technológia V module CESI 8000 sú jednotlivé komponenty vzorky separované elektrickým pol om, ktoré je aplikované medzi vstupnou skúmavkou a OptiMS sprejom bez použitia nosnej kvapaliny. Kazeta (cartridge) OptiMS pozostáva zo separačnej kapilári, ktorá končí v poróznom spreji, ďalej z dráhy pre vodivú kvapalinu, cirkulujúcej chladiacej kvapaliny a samotného spreja. Vodivý roztok je automaticky dodávaný zo systémovej skúmavky za účelom uzavretia okruhu CE. Cirkulujúci chladiaci roztok udržuje Jednoduchý a modulárny plug-and- -spray dizajn zjednodušuje obsluhu: automatizované spracovanie vzoriek z mikroskúmaviek alebo 96-jamkových platničiek jednoduché prepojenie s automatizovaným spúšťaním zbierania MS dát jednoduché prepínanie medzi kvapalinovou chromatografiou (LC) a CESI-MS znížená iónová supresia nanoprietok vedie k zvýšenej citlivosti SW je priateĺský a jednoduchý JOSEF SMOLKA jsmolka@beckman.com Zrychlení přípravy vzorků pro sekvenátory nové generace Genetická analýza prochází v poslední době bouřlivým rozvojem. Přístroje nové generace používají tzv. sekvenaci syntézou. Zásluhou vysoké míry paralelizace probíhá sekvenace podstatně rychleji než v systémech, jež jsou založeny na modifikacích klasické Sangerovy metody. Zvýšení rychlosti samotné sekvenace je obrovské, u těchto přístrojů o více než dva řády. Obr. 1: SPRIWorks Fragment Library Systems Komplikovaná a časově náročná je příprava vzorků, která představuje široké pole pro inovace. Společnost Beckman Coulter nabízí celou řadu produktů zjednodušujících a zrychlujících přípravu těchto vzrorků. Pro urychlení přípravy vzorků knihoven DNA nabízí Beckman Coulter přístroj SPRIworks Fragment Library Systems. Jedná se o stolní zařízení s jednoduchou obsluhou, jenž automatizuje některé kroky přípravy knihoven. Potřebné chemikálie jsou výrobcem připraveny v destičkách. Systém umožňuje paralelní přípravu až 30 knihoven za pracovní den, manuálně je možné za stejnou dobu vytvořit jen zhruba 8 knihoven. Lze jej použít pro platformy Illumina, Roche a SOLiD. Pro aplikace s vysokým výkonem je určen nejnovější produkt SPRIworks HT, na kterém lze připravit až 96 knihoven denně. Tento výrobek je v současné době nejvýkonnějším systémem pro přípravu vzorků pro sekvenátory nové generace. SPRIworks HT je integrované řešení, jehož nejdůležitější součástí je laboratorní automat Biomek FXp a moduly řídícího software, pomocí kterých se provádějí jednotlivé kroky přípravy vzorků. Uživatel pak může snadno volit vstupní parametry, jako je např. počet vzorků nebo rozsah délek úseků DNA. Před startem metody dostává také přehled objemů potřebných látek. Software může být upravován pro podmínky konkrétní laboratoře. Platformu Biomek lze rozšiřovat a upravovat na principu stavebnice, hardware není v tomto případě nijak omezen. Další výhodou SPRIworks HT je možnost modifikovat metody přípravy vzorků, např. použití vlastních primerů. Chemikálie, jež jsou součástí kitu, umožňují přípravu až 48 vzorků. Automatizace zajišťuje vysokou reprodukovatelnost výsledků. Na obrázku 3 je zobrazena série měření, kde je více než 85 % výsledků uvnitř vybrané oblasti krátkých řetězců, tzn. v intervalu bp. Stejného výsledku bylo dosaženo i pro další dvě možná nastavení délek, tedy bp a bp. Kromě dvou výše uvedených kompaktních řešení nabízí v oblasti přípravy vzorků pro sekvenátory nové generace naše společnost celou řadu dalších produktů. Platforma Biomek obsahuje rovněž menší a cenově výhodnější systémy Biomek 3000 a Biomek NXp. Ty se dají použít ke zrychlení a zefektivnění jednotlivých kroků přípravy knihoven DNA i v menším měřítku, než které dovoluje SPRIworks HT. Sou- Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

12 částí přípravy knihoven DNA je přečisťování nukleových kyselin, jež lze provádět pomocí kitů Agencourt pro Biomek 3000 a NXp. Jednou z funkcí, které automaty Biomek dovolují, je pipetování individuálních objemů předepsaných v externích excelových souborech. Tyto soubory se dají použít při normalizaci knihoven a při vytváření reportů o přenesených objemech. Zároveň jsou užitečné pro pozdější kontroly a verifikace. Beckman Coulter poskytuje místní podporu pro uživatele, kteří tyto metody používají. Automaty Biomek se dají používat i pro další aplikace, a to jak s metodami, jež dodává naše společnost, tak s produkty jiných výrobců nebo specifickými nástroji vyvinutými přímo zákazníky. Možná je také integrace více těchto typů přístrojů do složitějších celků. Velkou předností laboratorních automatů je jejich flexibilita. Uživatel může systémy v čase rozšiřovat a upravovat tak, aby odpovídaly aktuálnímu stavu vývoje, který v genetice postupuje velmi rychle. MARTIN POLČÍK mpolcik@beckman.com Obr. 2: SPRIworks HT chemikálie a pracovní stanice Biomek FX Obr. 3: Reprodukovatelnost výsledků pro krátké řetězce ( bp). Více než 85 % výsledků je v definované oblasti. Posunutá horní hranice je způsobena přidáním adaptéru o délce asi 100 bp. 12

13 Nová protilátka v soupravě na stanovení Estradiolu (33540) Společnost Beckman Coulter se rozhodla v důsledku rozšiřování svých imunoanalytických metod Access nahradit v reagenčních kazetách Access Estradiol (katalogové č ) v současné době používanou polyklonální protilátku. Nové kazety s náhradní protilátkou budou k dispozici podle níže uvedené tabulky. Výsledky validačních testů naší náhradní polyklonální protilátky prokazují, že: Výměna polyklonální protilátky zlepšila analytickou specificitu metody Access Estradiol v důsledku snížení zkřížené reaktivity s estriolem. Pokles reaktivity vedl k posunu u komerčních materiálů pro kontrolu jakosti. Seznam revidovaných hodnot komerčních kontrolních materiálů a porovnání metod u pacientských vzorků vám zašleme na vyžádání. Reagenční kazeta Access Estradiol připravená za využití nové polyklonální protilátky splňuje funkční charakteristiky uvedené v návodu k použití reagencie. Specifické informace o funkčních charakteristikách metody Access Estradiol jsou uvedeny k návodu k této metodě. Ujistěte se, že datum revize návodu k použití je červen 2011 nebo pozdější (vytisknuto na poslední straně). Pokud návod datum revize neuvádí, požádejte nás o nejnovější verzi. Výsledky pacientských vzorků získané za použití stávající protilátky a nové protilátky jsou v celém rozsahu stanovení srovnatelné. Na základě vnitřních testů pacientských vzorků není ověření metody Access Estradiol s novou polyklonální protilátkou pokládáno za nutné. V případě jakýchkoli dotazů nás neváhejte kontaktovat. Číslo šarže Místo výroby Dostupné od nebo vyšší USA srpen nebo vyšší Irsko srpen 2011 TEREZA TIETZE ttietze@beckman.com IVANA MIČÍKOVÁ imicikova@beckman.com Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometrii V návaznosti na průtokové cytometry Gallios a CyAn a sortery MoFlo XDP a MoFlo Astrios, které jsou určeny pro výzkumné účely, se průběžně rozšiřuje nabídka reagencií pro mnohobarevné cytometrické aplikace pro myší a humánní model. Objednávkové číslo Znak Fluorochrom Druh Klon Počet testů B01175 CD14 Krome Orange Anti-human RMO52 50 B01176 CD15 Krome Orange Anti-human 80H5 50 B01177 CD23 Krome Orange Anti-human 2E1 50 B00070 HLA DR Krome Orange Anti-human Immu B01680 CD11c APC Anti-human B B01682 CD49d APC Anti-human HP2/1 50 B08164 CD65 Pacific Blue Anti-human 88H7 50 A88596 CD3 epsilon PC5.5 Anti-mouse C363.29B 0,1 mg A88602 CD4 (L3T4a) PC5.5 Anti-mouse GK1.5 0,1 mg A88586 CD45 (LCA) PC5.5 Anti-mouse I3/2.3 0,1mg A88536 CD45.1 (Ly-5.1) PC5.5 Anti-mouse A20 0,1 mg A88541 CD45.2 (Ly-5.2) PC5.5 Anti-mouse 104 0,1 mg A88607 CD8alpha (CD8alpha/Lyt-2) PC5.5 Anti-mouse ,1 mg Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

14 Služba Custom Design Service Tato služba nabízí zákazníkům možnost označit monoklonální protilátky fluorochromy v kombinacích, jež nejsou přímo obsaženy v našem katalogu. Custom Design Service také poskytuje konjugace dodaných protilátek. Součástí nabídky je široké spektrum fluorochromů, jako jsou Pacific Blue, Krome Orange, Fluorescein, PE, APC, PE tandem dyes: ECD, PC5, PC5.5, PC7, APC tandem dyes: APC-A700, APC-A750 a biotin. Výjimečnou možností je pak optimalizace až desetibarevných koktejlů monoklonálních protilátek. Více informací naleznete na stránkách Nová reagencie pro stanovení fosfoepitopů B08488 PerFix-p Kit, 50 testů Složení : Fixation Buffer: 1 lahvička (3,25 ml) s 10% formaldehydem (methanol free) 65 μl/test Lysis Buffer: 2 lahvičky (25 ml) s 0,05% Proclin ml/test Resuspension Buffer: 1 lahvička (25 ml) s 0,5% formaldehydem 350 μl/test PerFix-p je souprava reagencií určená pro analýzu buněčné signalizace. Umožňuje monoklonálním protilátkám značeným fluorochromy vstup do buněk a specifické označení proteinů zapojených v signálních drahách. Souprava PerFix-p poskytuje jednoduchý protokol pro fixaci a permeabilizaci buněk pro značení a analýzu fosfoepitopů průtokovou cytometrií, včetně kombinace se značením povrchových znaků. Nezapomeňte si přečíst Orozco Aaron F., Lewis Dorothy E.: Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma, Cytometry Part A 77A: 502_514, Tento článek naleznete v plném znění na stránce: Monoklonální protilátky proti antigenu CD14, klon RMO52 (IgG2a) z nabídky Beckman Coulter Objednávkové číslo Fluorochrom IVD počet testů 14 IM0465U FITC 100 A07764 PE CE IVD 100 IM2707U ECD 100 A07765 PC5 CE IVD 100 A70204 PC A22331 PC7 100 IM2580 APC CE IVD 100 A86052 APC-Alexa Fluor B00846 Pacific Blue 50 B01175 Krome Orange 50 PAVEL KRUŽÍK pkruzik@beckman.com

15 Kontrolní materiály pro průtokovou cytometrii Vzrůstající nároky na kvalitu práce v laboratoři průtokové cytometrie vyžadují používání příslušných kontrolních materiálů. pro řízení jakosti. Následující tabulky přináší přehled výrobků, které jsou určeny pro ověření nastavení cytometru, standardizaci fluorescence, nastavení kompenzací a ověření správnosti postupu přípravy vzorků pro analýzu průtokovou cytometrií. Fluorescenční mikropartikule Objednací číslo Název Popis Flow-Check Fluorospheres fluorescenční mikročástice používané pro denní ověřování seřízení optiky a systému kapalin průtokového cytometru EPICS XL/XL-MCL a FC PC7 (770/488) Set-up Kit pro FC500 (parametr FL5) APC (675/633) Set-up Kit pro FC500 s 633 nm laserem (parametr FL4) A63493 Flow-Check Pro Fluorospheres fluorescenční mikročástice používané pro denní ověřování seřízení optiky a systému kapalin průtokového cytometru Navios nebo FC Flow-Set Fluorospheres suspenze fluorescenčních mikročástic používaná pro standardizaci intenzity fluorescence průtokového cytometru pro EPICS XL/XL-MCL a FC500 A63492 Flow-Set Pro Fluorospheres suspenze fluorescenčních mikročástic používaná pro standardizaci intenzity fluorescence průtokového cytometru Navios nebo FC IMMUNO-BRITE Fluorospheres pro stanovení linearity přístroje a standardizaci intenzity fluorescence Flow-Count Fluorospheres pro stanovení absolutních počtů buněk na cytometrech EPICS XL/ XL-MCL, FC500, Gallios/Navios a ekvivalentních analyzátorech Flow-Check Pro Fluorospheres je suspenze fluorescenčních mikročástic používaná pro denní ověřování seřízení optiky a systému kapalin průtokového cytometru Navios. Výrobek obsahuje směs 10 μm fluorescenčních částic s fluorescenční emisí od 515 nm do 800 nm při excitaci na 488 nm, 6 μm fluorescenčních částic od 640 nm do 800 nm při excitaci na 635 nm a 3 μm fluorescenčních částic s fluorescenční emisí od 400 nm do 500 nm při excitaci na 405 nm. Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

16 Nastavení kompenzace Objednací číslo Název Popis CYTO-COMP Cell Kit pro použití s CYTO-COMP Reagent Kit a soupravami QuickCOMP CYTO-COMP Reagent Kit reagencie pro úpravu nastavení kompenzace cytometru EPICS XL/XL-MCL QuickCOMP 2 Kit reagencie pro úpravu nastavení kompenzace na průtokových cytometrech v kombinaci FITC/PE QuickCOMP 4 Kit reagencie pro úpravu nastavení kompenzace na průtokových cytometrech v kombinaci FITC/PE/ECD/PC5 IM3631 Stem-Comp Reagent pro použití v kombinaci se Stem-Trol Control Cells Buněčné kontroly Objednací číslo Název Popis CYTO-COMP Cell Kit pro použití s CYTO-COMP Reagent Kit a soupravami QuickCOMP CYTO-COMP Reagent Kit reagencie pro úpravu nastavení kompenzace cytometru EPICS XL/XL-MCL QuickCOMP 2 Kit reagencie pro úpravu nastavení kompenzace na průtokových cytometrech v kombinaci FITC/PE QuickCOMP 4 Kit reagencie pro úpravu nastavení kompenzace na průtokových cytometrech v kombinaci FITC/PE/ECD/PC5 IM3631 Stem-Comp Reagent pro použití v kombinaci se Stem-Trol Control Cells Buňky IMMUNO-TROL Cells jsou určeny pro kontrolu kvality analýzy buněk plné krve průtokovou cytometrií. Jsou otestované, schopné lýzy a používají se k imunofenotypizační analýze s použitím reagencií obsahujících monoklonální protilátky. Poskytují pozitivní buněčný kontrolní materiál, který se zpracovává stejným způsobem jako vzorky plné krve. To umožňuje ověření kvality reagencií a metod používaných pro barvení cílových buněk, lýzu erytrocytů a analýzu vzorků průtokovou cytometrií. PAVEL KRUŽÍK pkruzik@beckman.com 16

17 Membránové molekuly na buňkách monocytární řady Úvod Krvetvorba je velmi složitý komplex dějů probíhající u dospělého člověka převážně v mikroprostředí kostní dřeně, a to v organizovaných ložiscích krvetvorných buněk. Kostní dřeň jako hematopoetický orgán představuje vysoce organizovanou tkáň s difúzní prostorovou strukturou, v níž z nediferencovaných kmenových buněk vznikají jednotlivé progenitorové buňky, které dávají vznik různým buňkám v jednotlivých vývojových řadách. Lokalizace kmenových buněk v mikroprostředí kostní dřeně a jejich fyziologický kontakt s dalšími buňkami produkující jednotlivé růstové faktory je zřejmě zásadní pro vznik i průběh krvetvorby. tokinové sítě. Ta komplexně pokrývá základní fyziologické projevy hematopoetických buněk (proliferaci, diferenciaci, aktivaci, apoptózu a migraci). Jedná se tak o dokonalou spolupráci vzájemných cytokin/chemokin-receptorových interakcí uplatňujících se v kaskádách regulačních a imunoregulačních mechanizmů hematopoézy s hlavním zaměřením na vyvážení buněk do jednotlivých hematopoetických řad. Vývoj buněk v monocytární řadě Vývoj buněk v monocytární řadě probíhá od myeloidního progenitoru (CFU-GEMM) přes progenitorovou hemopoetickou buňku (CFU- -GM) a typické buňky monocytární řady monoblasty, promonocyty až na monocyty. Monocyty se dají prokazovat jak v kostní dřeni, tak v obvodové krvi. Obrázek 1 podává zjednodušenou představu proliferace a diferenciace buněk v monocytární řadě z hlediska výskytu Integrita a homeostáza lidského organizmu je udržována skupinou regulačních molekul rozpustných mediátorů (cytokinů a chemokinů). Regulace krvetvorby je zprostředkována interakcí cytokinů s jejich komplementárními membránovými receptory za tvorby tzv. cymembránových molekul. Je z něj zřejmé, že monocyty nesou na svém povrchu celou řadu molekul, které jim dovolují zprostředkovávat různé funkce. Monocyty se uplatňují při obraně proti vzniku nádorů a v různých imunitních reakcích. Monocyty a makrofágy produkují celou řadu faktorů, jež regulují proliferaci a diferenciaci buněk v jednotlivých řadách hemopoézy, včetně monocytární řady. Buňky monocytární řady jsou kontrolovány jednotlivými růstovými faktory, z nichž některé jsou vyznačeny v obrázku 1. Převážně se jedná o GM-CSF, M-CSF, SCF a některé interleukiny. Aby tyto růstové faktory mohly fungovat, musí mít na odpovídajících buňkách příslušné receptory. Monocyty nejsou koncovými buňkami, protože z nich v různých tkáních proliferují a diferencují makrofágy. Zjednodušeným pohledem hematologa lze monocytární řadu uzavírat monocytem, který se dá velmi dobře Myeloidní progenitor CFU-GEMM Progenitor CFU-GM Prekurzor CFU-GM Monoblast Promocyt Monocyt (nìkteré znaky pro monocyty také ve tkáních) Makrofág (aktivovaný) HLA-DR HLA-DR HLA-DR HLA-DR HLA-DR HLA-DR CD11c CD13 CD14* CD15* CD33 CD34 CD110* CD111* CD112* CD117 CD123 CDw131 CD133* CD173* CD174* CD176 CD227* CD228 GM-CSF M-CSF G-CSF SCF IL3 CD11c CD13 CD14* CD45* CD33 CD34 CD111 CD112 CD115 CD116 CDw123 CDw131 GM-CSF M-CSF SCF IL3 Monocytární řada øada CD13 CD15 CD33 CD111 CD112 CD115 CD116 CDw123 CDw131 Kostní døeò GM-CSF M-CSF IL3 IL4 IL6 CD13 CD14* CD15 CD33 CD111 CD112 CD115 CD116 CDw123 CDw131 CSF-1 GM-CSF M-CSF IL3 IL4 IL6 CD13 CD14 (CD15*) CD33 CD111 CD112 CD115 CD116 CDw123 CDw131 GM-CSF M-CSF IL3 IL4 IL6 (CD4) CD65s CD9 CD68 CD11b (CD74) CD11c CD84 CDw12 CD85 CD13 CD86 CD14 CD87 CD15 CD89 CDw17 CD91 (CD31) CDw92 CD32 CD93 CD33 CD98 CD35 CD101 CD36 CD102 CD38 CD111 (CD40) CD112 CD43 CD115 (CD45RO) CD116 (CD45RA) CD119 (CD45RB) CDw121b CD49b,e,f CDw123 CD63 CD127 CD64 Krev CDw128 CDw131 CD142* CD147 CD155 CD156 CD157 CD162 CD163 CD164 CD168 (CD170) CD171 CD172a CD180 CD184 CD195 CD206 CDw210 CD213a1 CD213a2 CD226 (IL1) IL6 IL8 IL10 IL12 IFN PGF TNF TNF GM-CSF M-CSF PDGF CXCL1 CXCL2 CXCL10 CCL3 CCL5 NGF LIF OSM obr. 17 Obrázek 1 Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

18 Chemokinové a cytokinové receptory na makrofágách a monocytech Chemokinové a cytokinové receptory na makrofágách a monocytech IL16 IFN- IL3R IL3 IL1 IFNR IL16R CCR6 CCL17 CCL3 CCL5 CCL7 CSFR-1R M-CSF IL2 IL9 IL1R IL9R CCL1 CCR8 makrofágy CD11b, CD14+, CD16+, CD40, CD54, CD64, CD71+, CD84, CD80, CD163+, HLA-DR++, (TLR2, TLR4, 25F9, 27E10) CCR5 CCL3 CCL8 CCL5GM-CSFR GM-CSF prokazovat morfologickým stanovením. Tato buňka tak byla zahrnuta do diferenciálu buněk obvodové krve (do 10 %) a kostní dřeně. U normálního zdravého dospělého jedince kolísají počty monocytů v periferní krvi mezi 1,7 9,3 %, což v referenčním rozmezí představuje 0,11 0,59 x 109 l. Na obrázku 1 je uvedena většina membránových molekul vyskytujících se na buňkách monocytární řady. Tyto molekuly byly postupně odkrývány a poté zahrnuty do CD nomenklatury. Výskyt některých molekul značně kolísá, proto lze říci, že málokterá molekula je vhodný reprezentant pro celkové stanovení monocytárních buněk. Funkční projevy monocyto-makrofágového systému Obrázek 2 dokumentuje výskyt některých cytokinových a chemokinových receptorů na monocytech a makrofázích. Z obrázku je zřejmé, že monocytární-makrofágový systém je zastoupen celou řadou receptorů, které dávají tomuto systému specifické funkce. Proto jsou na obrázku vyznačeny také ligandy, s nimiž příslušné receptory reagují. Membránové receptory pro cytokiny mohou být monomery, dimery, popř. trimery, zatímco membránové receptory pro chemokiny procházejí 7 x buněčnou membránou. U membránových receptorů byly ponechány jejich původní názvy, aby bylo patrné, s kterými ligandy reagují. Reakce jednotlivých chemokinů se svými receptory byla vyznačena červeným kolečkem. Je třeba si uvědomit, že jak kvalitativní, tak kvantitativní zastoupení těchto receptorů může být velmi odlišné v závislosti na profilu makrofágů. Monocyty přecházejí vaskulární endoteliální buněčnou stěnou do různých tkání, kde je nacházíme v rrozličných formách např. jako dendritické buňky monocytárního původu, mikrogliální buňky v mozku, alveolární buňky plic, Kupferovy buňky v játrech, peritoneální a pleurální makrofágy a pravděpodobně i osteoklasty. Monocyty se mění také v aktivnější fagocyty histiocyty, takže jsou předchůdci 18 CCR2 CCL2 CCL7 CCL8 IL10 IL10R IFN- IL1 IFN- IFN R IL16 IL17 IFN- IL17 IFN-R TNF- IL3 TNF- CD120 IL3R IL5R ERB-1 IL5 EGF TNF- CCL3 CCL5 CCL7 M-CSF CSFR-1R IL2 IL9 IL1R CCL3 CCL8 CCL5 obr. 18 plicních, alveolárních či slezinných makrofágů monocyto-makrofágového systému lymfatických uzlin, kostní dřeně, pleury, peritonea a jater. Tyto makrofágy mají na svém povrchu vyjádřeny různé molekuly zprostředkovávající rozdílné funkce. Kupfferovy buňky v játrech se mohou uplatňovat při absenci odezvy imunitního systému na mikrobiální podněty. Naproti tomu plicní makrofágy jsou schopné likvidovat určité patogenní bakterie. Některé další buňky makrofágového systému se uplatňují v efektorových funkcí a rovněž v regulacích specifické T-lymfocytární imunity. Makrofágy jsou užitečné při nejrůznějších funkčních projevech, což se promítá do poměrně širokého zastoupení jednotlivých CD znaků, kterých je v současné době popsáno až 135. Z těchto znaků, jež jsou schopné vstoupit do reakcí s jednotlivými skupinami patogenů, lze uvést receptory pro komplement, scavenger receptory, toll-like receptory (označené čísly 3, 7, 8, 9), popř. jiné. Těmito receptory jsou některé tkáňové makrofágy schopné rozpoznat celou řadu vysoce konzervovaných specifických molekul, které jsou přítomny na virech, bakteriích a plících. Tyto mikroorganismy mohou vyjadřovat např. virové proteiny a jejich RNA, bakteriální flagelin, lipoarabinomanan (LAM), lipopolysacharid (LPS), lipoteichoiovou kyselinu (LTA), peptidoglykan (PGN) a zamosan. Tkáňové makrofágy rozeznávají tyto komponenty pomocí širokého spektra rozpustných cytoplazmatických i membránově vázaných receptorů a po setkání s příslušným patogenem zahajují sérii kroků. Ty lze označit jako detekci, fagocytózu, degradaci, aktivaci, prezentaci antigenů a sekreci cytokinů. Např. bakterie jsou fagocytární kapsou vtaženy do mikrofágů, kde jsou ve vesikulech (fagolysozomech) fagocytovány. Zde se uplatňuje celá řada jevů, při nichž nukleasy štěpí nukleové kyseliny, fosfolipázy, lipidy, cukry (lyzozomální enzymy) a proteiny (proteinázy). Větší komponenty jsou popř. vyvrhovány ven z buňky a některé jiné jsou podrobovány antigenní prezentaci. Makrofágy dávají vznik různým buňkám, kde se v diferenciačních IL9R CCL1 CCR8 monocyty CD11b, CD14++, CD16++, CD40, CD54, CD64, CD71+/-, CD84, CD80, CD163++, HLA-DR++, (TLR2, TLR4, 25F9, 27E10) CCR5 GM-CSFR GM-CSF IL10 IL10R ERB-1 CCR2 CCL2 CCL7 CCL8 IFN R IL5R IL17 IFN- IFN- CD120 IL17 EGF TNF- TF TN- IL5 Obrázek 2 a proliferačních stádiích uplatňují rozličné faktory vázající se na příslušné receptory (např. na vzniku osteoklastu z osteoblastu se podílí faktory TNF rodiny a RANK, které aktivují příslušné receptory). Naproti tomu fyziologická role TRAIL molekuly je v blokaci fosforylace p38 mitogen aktivované protein kinázy. U aktivovaných makrofágů dochází ke změně jejich morfologie (pseudopodie). Rovněž dochází k sekreci cytokinů, chemokinů a různých difusibilních faktorů. Těmito zásadními funkčními projevy se tak makrofágy odlišují od monocytů. Stanovení membránových molekul na buňkách monocytární řady Membránové molekuly na buňkách monocytární řady se běžně prokazují imunoflurescenční metodou, která se vyhodnocuje průtokovou cytometrií. Jednou z prvních molekul nalezenou na monocytech byl vedle HLA-Dr membránový znak označený jako CD14. Postupně byly odkryty i další antigeny jako CD13, CD33, CD15, CD34, CD41, CD61. Monocyty se uplatňují v nejrůznějších funkčních projevech, proto se jejich průkaz vztahuje k etiopatogenezi a etiopatofysiologii různých chorob. Zvýšené hodnoty monocytů se nacházejí při EB infekci a také při akutních leukémiích. V současné době je k dispozici celá řada údajů týkajících se výskytu membránových molekul (zařazených do CD nomenklatury) na buňkách monocytátního/makrofágového systému. Tabulka 1 popisuje zastoupení membránových znaků na monocytech, makrofázích a na monocytech/makrofázích. I když se jedná o hrubé údaje, přesto může tato tabulka posloužit k představě antigenního vybavení retikulárních buněk, které plní svoji funkci v imunitních fagocytárních reakcích a podílí se na následné inaktivaci cizích antigenních materiálů. Z těchto údajů a z údajů na obrázku 2 lze poukázat na velké antigenní vybavení těchto buněk sloužící k plnění dané funkce. Buňky nejenže vykazují obrovskou antigenní hete-

19 rogenitu, ale mají rovněž určitou plastičnost. Navíc několik dalších molekul přistupuje na aktivovaných buňkách celého systému, jež nejsou uvedeny. Monocyty u zhoubných onemocnění krvetvorby Akutní leukémie (AL) představují velmi heterogenní skupinu zhoubných onemocnění krvetvorby vznikající maligní transformací hemopoetických buněk. Leukemická transformace postihuje jak buňky řady myeloidní, tak řady lymfoidní, proto je možné z tohoto hlediska vymezit jak leukémie akutní myeloblastické (myeloidní), tak akutní lymfoblastické (lymfoidní). Akutní myeloblastická leukémie (AML) tvoří velmi různorodou skupinu onemocnění postihující buňky myeloidní a monocytární řady provázené abnormální proliferací a diferenciací. Klasifikace AML prodělala určitý vývoj, přičemž jeden z přínosů bylo vytvoření tzv. francouzsko-americko-britské klasifikace (FAB) AL..V této klasifikaci lze podle morfologických a cytochemických kritérií vymezit zhruba 8 typů označovaných jako: M0 neklasifikovaná (nediferencovaná) M1 myeloblastická bez vyzrávání (21 %) M2 myeloblastická s vyzráváním (35 %) M3 promyelocytární (s mikrogranulární variantou, M3v) (9 %) M4 myelomonoblastická (myelomonocytární) (23 %) M5A monoblastická M5A, monoblastická málo diferencovaná (6 %) M5B promonocytární dobře diferencovaná M6 akutní erytroleukémie (2 %) M7 megakaryoblastická Tabulka 2 podává základní charakteristiky pro vymezení myeloblastických leukémií (označují se též jako nelymfoblastické leukémie) dle FAB klasifikace. Buňky AML jsou z hlediska membránových fenotypů velmi intenzivně studovány. Byly publikovány různé kombinace jejich výskytu. Na buňkách AML (u M1 M6) lze nalézt antigeny charakteristické pro myelomonocytární řadu (CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, CD37, CD39, CD74, CD78). Je zřejmé, že fenotypy AML v rámci jednotlivých FAB M1 M5 typů jsou velmi heterogenní, takže je u nich možné vymezit jednotlivé varianty. AML M0 je označována jako časná myeloidní leukémie, AML M1 je akutní myeloidní leukémie bez vyzrávání myelopoézy, AML M2 je akutní myeloidní leukémie s vyzráváním myelopoézy (zde je i varianta M2Baso s bazofilními prekurzory, kde se vyskytují chromozomální aberace t (6; 9) nebo 12p), AML M3 se rozlišuje na klasickou hypergranulární variantu a mikrogranulární variantu, u AML M4Eo se vyskytují atypické eosinofily, AML M5 má dvě varianty označované M5A a M5B, AML M6 můžeme rozdělit na dva typy M6A (Di Guglielmův syndrom) a M6B (Di Guglielmova choroba) a AML M7 je akutní megakaryoblastická leukémie. Z tohoto důvodu existují nepřesnosti v jejich třídění, proto je snaha tuto klasifikaci stále zdokonalovat. Vhodné kombinace znaků je možné dosáhnout při dodržování určitých kritérií, charakteristických fenotypů umožňujících zařazení patologických buněk. Při tomto stanovení lze vzít vedle morfologického rozlišování v potaz také intracelulární průkazy CD znaků, jako jsou cytochemické reakce (myeloperoxidáza, terminální dezoxyiribotransferáza, PAS reakce). Určité rozpaky mohou nastat v rozlišení blastů (myelo versus lymfo).v těchto případech je tak nutné provádět pro stanovení definitivní diagnózy vyšetření z kostní dřeně, kde je pro dg. ALL zapotřebí nejméně 30 % lymfoblastů, které jsou negativní v reakci s myeloperoxidázou, ale většinou pozitivní na Tdt. V dalším sledu je možné zvolit vybrané panely směřující k cílené informaci. Obecně platí, že čím více se testuje, tím více informací můžeme o patologických buňkách získat, a to z hlediska adhezívních, aktivačních, diferenciačních cytokinových a chemokinových profilů. Přesto jsou ale převážně z ekonomického hlediska doporučovány cílené panely MoAbs, jež prokazují vybrané znaky stanovující základní charakter onemocnění. Je nutné si uvědomit, že klasifikace leukémií není zdaleka ukončena, proto se objevují a doporučují jednotlivá schémata, která nesou různá označení REAL, WHO. Mimoto jsou popisovány i vzácné typy leukémií s rozdílnými genotypovými a fenotypovými charakteristikami, jež pouze v detailech dokumentující velkou heterogenitu leukemického procesu. Do těchto vzácných typů leukémií lze zahrnout juvenilní myelomonocytární leukémii, která se projevuje v dětském věku. Můžeme ji vymezit jako promyelocytární leukémii s pravidelnými jádry, která se však od AML M3 odlišuje tím, že má na povrchu patologických buněk CD13, CD15, CD33 a rovněž CD56 antigeny a nemá translokaci t (15; 17), avšak t (11; 17). Závěrem lze říci, že buňky monocytární řady obsahují na svém povrchu jednotlivé membránové molekuly, jež vtiskují těmto buňkám různé funkce. Buňky tak mohou pomocí svých receptorů zareagovat na celou řadu signálů, které přicházejí z vnějšího prostředí. Z těchto receptorů jsou důležité molekuly pro růstové faktory (chemokiny a cytokiny). Ty pomocí zpětnovazebných mechanizmů udržují podmínky homeostázy. V současné době je možné jednotlivé molekuly v přímé imunoflurescenční metodě označovat a průtokovou cytometrií vyhodnocovat. To nalezlo velké uplatnění nejen v klinické medicíně, kde je možné tyto populace na základě výběru vhodných molekul spolehlivě prokazovat a interpretovat v jejich patogenezi a patofyziologii, ale i v experimentální sféře. K dané problematice existuje velké množství literárních zdrojů, proto se autor omezil pouze na základní informace týkající se CD systému, který je knižně zpracován (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9). Zkratky AML = akutní myeloblastická leukémie CFU-GEMM = kolonie granulocytů, erytrocytů, megakaryocytů, monocytů CFU-GM = granulo-monocytární progenitorová buňka CFU-M = progenitorová buňka monocytů (makrofágů) CFUMeg = megakaryocytární progenitorová buňka FAB = francouzsko-americko-britské klasifikace FAB M4 = myelomonocytární leukémie (AMML) FAB M5 = monocytární leukémie (AmoL) LAM = lipoarabinomanan LPS = lipopolysacharid Tabulka 1: Výskyt membránových znaků na monocytech, makrofázích a monocytech/makrofázích Zastoupení na monocytech Výskyt na makrofázích Výskyt na monocytech/makrofázích CD11b, CD13, CD17, CD23, CD30, CD35, CD44, CD49a-f, CD53, CD62L, CD65, CD85j, CD85k, CD86, CD87, CD88, CD92, CD93, CD101, CD102, CD137, CD142, CD155, CD162, CD168, CD178, CD180, CD185,CD192, CD226, CD232, CD244, CD245, CD253, CD255, CD270, CD276, CD277, CD281, CD282,CD285*, CD286, CD300a, CD301, CD306 CD16a, CD72, CD80, CD84, CD105*, CD106*, CD111, CD116,CD129, CD154, CD169, CD170, CD195, CD204, CD206*, CD209, CD224, CD272, CD280*, CD288 CD11a, CD11c, CD4*, CD14, CD15, CD26, CD33, CD36, CD51/61, CD52, CD63, CD64, CD68, CD85a, CD85d, CD89, CD97, CD112, CD114, CD119, CD121b, CD126,CD136, CD140a, CD157, CD163, CD172a, CD195, CDw210a, CDw210b, CD256, CD257, CD263, CD264, CD275, CD284, CD300c, CD300e, CD313,CD302 Poznámka: CD znaky označené hvězdičkou (*) se vyskytují na populacích, tučně zvýrazněny jsou hlavní znaky uvedených buněk. Informační magazín IN VITRO DIAGNOSTIKA

20 Tabulka 2: FAB klasifikace akutních nelymfoblastických leukémií FAB Akutní leukémie Některé charakteristiky Imunofenotyp* M0 nediferencovaná AML velké blasty s hojnou cytoplazmou a nápadnými jadérky, cytochemicky negativní MPO±, CD7+, CD13±, CD14±, CD15±, CD33±, CD34±, CD65±, CD117±, HLA-DR±, TdT M1 nezralá AML blasty s kulatým jádrem a menším množstvím cytoplasmy s ojedinělými azurofilními granuly a Auerovými tyčemi, MPO a sudanová čerň pozitivní MPO+, CD11b+, CD13+, CD15+, CD33±, CD34+, HLA-DR+ M2 AML s vyzráváním bílé řady blasty obsahují četná azurofilní granula a Auerovy tyče, MPO a sudanová čerň pozitivní, věk kolem 30 let, častá t (11; 17) MPO+, CD11b±, CD13+, CD14±, CD15+, CD33+, CD34+, CD64+, CD65+, HLA-DR+ M3 akutní promyelocytární leukémie blasty s kulatým jádrem s jadérky, hojné Auerovy tyče a granula, MPO a sudanová čerň silně pozitivní, věk let, často provázeno DIC, časté t (15; 17) a t (11; 17) MPO+, CD1a+, CD13+, CD15+, CD33+, CD56+, HLA-DR- M4 akutní myelomonocytární leukémie blasty se světle šedou granulovanou cytoplasmou a zprohýbanými jádry, pozitivní nespecifické esterázy MPO+, CD11b+, CD11c, CD13+, CD14+, CD15+, CD33+, CD34±, CD36+, CD41±, CD58, CD61±, HLA-DR+ MEo akutní myelomonocytární leukémie s eosinofilií blasty vzhledu myelomonocytární leukémie, eozinofily tvoří 5 10 buněk dřeně, časté cytogenetické abnormality, v oblasti 16. chromozómu pruh q22 MPO+, CD2±, CD13±, CD14±, CD15±, CD33+, CD34±, CD117±, HLA-DR+ M5 akutní monocytární leukémie blasty se zprohýbanými jádry s hojnou lehce granulovanou cytoplazmou s Auerovými tyčemi, častěji 50 let, často extramedulární postižení, abnormity v oblasti 11. chromozómu pruh q23 MPO+, CD11b±, CD13+, CD14+, CD15+, CD33+, CD34±, CD41±, CD61±, HLA-DR+ M6 akutní erytroleukémie bizarní erytroblasty často mnohojaderné, s karyorhexí, PAS pozitivní CD13+*, CD33±, CD36+, CD71+**, CD235+**, HLA-DR+ M7 akutní megakaryoblastická leukémie mikromegakaryocyty jedno- či dvoujaderné, PAS a kyselá fosfatáza pozitivní, častá inv. 3. chromozómu CD3±, CD13±*, CD34±, CD36±, CD41a+, CD42b+, CD61+, HLA-DR± * = exprimován na myeloblastech, ** = exprimován na erytroblastech, + = přítomen u většiny pacientů, ± = přítomen u více než 50 % pacientů LTA MPO PGN SCF Tdt. 20 = lipoteichoiovou kyselinu = myeloperoxidáza = peptidoglykan = růstový faktor kmenových buněk ( stem cell factor ) = terminální dezoxyribonukleotidyltransferáza Základní literární odkazy z hlediska exprese CD molekul 1. Bernard A., Boumsell L., Dausset J., Milstein C. and Schlossmann S.F. (eds.). Leucocyte typing 1. Human leucocyte differentiation antigens detected by monoclonal antibodies. Berlin, Springer-Verlag, Reinherz E.L., Hayne E.F., Nadler L.M., Bernstein I.D. Leucocyte Tyliny. Springer-Verlag, McMichael A.J., Beverly P., Cotbolt S. et al. Leucocyte typing III. White cell differentiation antigens. Oxford University Press, Knapp W., Doken B., Riber E.et al.: Leucocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Oxford University Press, , Schlossman S., Boumsell L., Gilks W., et al.: Leucocyte typing V. White cell differentiation antigens. Oxford University Press, , Kishimoto T., Kikutani H., von dem Borne A. et al.: Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens, Garland Publishing, Inc., New York, , Mason D.Y., Bensussan A., André P. et al.: Leucocyte typing VII. Oxford University Press, 1-945, Zola H., Swart B., Nicholson I.: CD molecules 2005: human cell differentiation molecules. Blood. 106: , Zola H., Swart B., Nicholson I. and Voss. E.: Leukocyte and Stromal cell molecules. The CD markers. John Wiley and sons, Inc., Hoboken, New Jersey, 1-581, Poděkování Autor vyslovuje poděkování Ing. J. Buriánkové za zpracování obrázků a tabulky. Článek byl podpořen vědeckým záměrem pro ÚHKT. RNDR. KRISTIÁN KOUBEK, DRSC. KLINICKÝ ÚSEK, ÚSTAV HEMATOLOGIE A KREVNÍ TRANSFÚZE, U NEMOCNICE 2, PRAHA 2 kristian.koubek@uhkt.cz