CYKLUS TRIKARBOXYLOVÝCH KYSELIN A GLYOXYLÁTOVÝ CYKLUS

Transkript

1 YKLUS TRIKARBXYLVÝ KYSELIN A GLYXYLÁTVÝ YKLUS

2 BSA Základní charakteristika istorie Pyruvátdehydrogenasový komplex itátový cyklus dílčí reakce itátový cyklus výtěžek itátový cyklus regulace Anapleroticé reakce Kataplerotické reakce

3 yklus trikarboxylových kyselin, TAcyklus, citrátový cyklus, Krebsův cyklus itrátový cyklus je sled osmi reakcí ve kterém dochází v cyklu k oxidaci acetylové skupiny acetyloa na dvě molekuly 2 uvolněná volná energie se ukládá do redukovaných koenzymů NAD a FAD 2. produktem jednoho cyklu jsou dvě molekuly 2, tři NAD, jedna FAD 2 a jedna makroergická sloučenina GTP (=ATP). itrátový cyklus působí katalyticky, jako důsledek vlastní regenerace oxalacetátu. brovský počet acetylskupin může být oxidován zásluhou jediné molekuly oxalacetátu.

4 istorie citrátového cyklu Sled těchto reakcím byl intenzivně studován mezi léty 1932 až 1937 řadou badatelů na létacích svalech holubů. V roce 1935 publikoval maďarský vědec A. SzentGyorgyi poznatek, že respirace se urychlí přidáním malého množství sukcinátu, fumarátu, malátu nebo oxaloacetátu. Efekt působení těchto látek byl katalytický. sukcinát fumarát malát oxalacetát 1937 arl Martius a Franz Knoop ukázali, že citrát může být převeden na aoxoglutarát. citrát cisakonitát isocitrát 2oxoglutarát sukcinát fumarát malát oxalacetát

5 istorie citrátového cyklu V roce 1937 publikovali Martius a Knoop klíčový poznatek, který Krebsovi chyběl pro spojení oxidace v citrátovém cyklu s metabolismem glukosy. xaloacetát a pyruvát mohou být převedeny na citrát za působení peroxidu vodíku. Pyruvát jako produkt odbourávání glukosy v glykolýze se tak stal spojovacím článkem mezi metabolismem sacharidů a citrátovým cyklem ans Krebs, publikoval jako první cyklický charakter odbourání acetylové skupiny. 1. Sukcinát se tvoří z fumarátu, malátu nebo oxalacetátu v přítomnosti inhibitoru malonátu, který inhibuje přímou redukci fumarátu na sukcinát, reakce zastavuje celou oxidaci. itrát musí být obnovován. 2. Pyruvát a oxalacetát mohou tvořit citrát enzýmově uzavření cyklu pyruvát + oxalacetát citrát Jednotlivé kroky cyklu jsou dostatečně rychlé odpovídají rychlosti respirace

6 istorie citrátového cyklu 1945 N. Kaplan a F. Lipmann objevili koenzym A 1951 S. choa a F. Lynen zjistili, že acetyloa je látka, která kondenzuje s oxalacetátem za vzniku citrátu Krebsův první pokus o publikaci citrátového cyklu v Nature byl neúspěšný. Práce byla přijata do méně prestižního časopisu Enzymologia. Krebs,.A. and Johnson, W.A.: The role of citric acid in intermediate metabolism in animal tissues. Enzymologia 4, (1937). ans Adolf Krebs ( ) obdržel Nobelovu cenu za lékařství a fyziologii v roce 1953 spolu s Fritzem Albertem Lipmannem.

7 Sir ans Adolf KREBS ( ) 1900 Born in Germany 1918 Began medical school 1923 Graduated from medical school 1925 Graduated with Ph.D. from University of amburg 1932 Identification of Urea ycle 1933 Emigration to the United Kingdom 1937 Identification of itric Acid ycle or "Krebs ycle" 1945 Became a Professor at University of Sheffield 1953 Won the Nobel Prize in Physiology and Medicine 1954 University of xford 1958 Knighted 1981 Died in the United Kingdom, xford

8 Základní charakteristika citrátového cyklu itrátový cyklus je ústřední metabolická dráha vedoucí k zisku energie ze substrátů jako jsou sacharidy, mastné kyseliny a aminokyseliny, které se odbourávají na acetyl oa. itrátový cyklus je lokalizován v matrix mitochondrií.

9 Základní charakteristika citrátového cyklu itrátový cyklus je aerobní metabolická dráha. itrátový cyklus je amfibolický. V cyklu dochází ke katabolické reakci (odbourávání acetyl oa na 2 ). Meziprodukty cyklu se využívají k syntézám dalších látek anabolické reakce. Sumární rovnice citrátového cyklu: 3 NAD + + FAD + GDP + P i + acetyloa 3 NAD + FAD 2 + GTP + oa + 2 2

10 itrátový cyklus propojení s glykolýzou a respirací

11 itrátový cyklus propojení s respirací

12 Přehled vstupu substrátů do citrátového cyklu

13 Pyruvátdehydrogenasový komplex Syntéza acetyloa z pyruvátu Pyruvát je za aerobních podmínek transportován do matrix mitochondrie transportním proteinem (pyruvát + symport). Multienzymový komplex pyruvátdehydrogenasy je skupina tří nekovalentně vázaných enzymů, který katalyzuje na sebe navazující reakce. Výhodou multienzymového komplexu je: 1. Sled reakcí je urychlován, protože jsou minimální vzdálenosti mezi enzymy. 2. Přímá návaznost reakcí zamezuje vedlejším reakcím. 3. Reakce na komplexu mohou být koordinovaně kontrolovány.

14 komplex E. coli Složení pyruvátdehydrogenasového komplexu Pyruvátdehydrogenasa (E 1 ) Dihydrolipoyltransacetylasa (E 2 ) Dihydrolipoyldehydrogenasa (E 3 ) Pyruvátdehydrogenasový komplex z Escherichia coli Komplex E. coli je kd proteinový komplex. Průměr 30 nm větší než ribozom. Složení viz obrázek. Mitochondriální komplex je kd protein, obsahuje 20 E 2 trimerů obklopených 30 E 1 heterotetramery a 12 E 3 dimerů.

15 Složení pyruvátdehydrogenasového komplexu Pyruvátdehydrogenasový komplex katalyzuje sekvencí tří reakcí, sumárně: Pyruvát + oa + NAD + acetyloa NAD Komplex využívá pěti různých koenzymů: Kofaktor Lokalizace Funkce Thiaminpyrofosfát (TPP) Lipoová kyselina KoenzymA (oa) Flavinadenindinukleotid (FAD) Nikotinamiddinukleotid (NAD + ) Vázán na E 1 Kovalentně vázán na lysin E 2 (lipoamid) Substrát pro E 3 Vázán na E 3 Dekarboxylace pyruvátu za vzniku karbaniontu hydroxyethyltdp Přijímá karbaniont hydroxyethyl ztdp jako acylskupinu Přijímá acylskupinu z lipoamidu Redukován lipoamidem Substrát pro E 3 Redukován FAD 2

16 Pyruvátdehydrogenasový komplex

17 Pyruvátdehydrogenasa (E1) Dekarboxyluje pyruvát za tvorby hydroxyethyltpp meziproduktu 3 R 2 R 1 N + TPP E 1 + S E 1 3 Pyruvát R 2 R 1 N + S E 1 3 ydroxyethyltpp E 1

18 Lipoamid a dihydrolipoamid Lipoová kyselina je vázána na E2 amidovou vazbou přes eaminoskupinu Lys. Lipoová kyselina Lysin S 2 S 2 N N ( 2 ) 4 Lipoamid e S 2 2 S N N ( 2 ) 4 Dihydrolipoamid

19 Dihydrolipoyltransacetylasa (E2) ydroxyethylová skupina je přenesena na dihydrolipoyltransacetylasu (E2). ydroxyethylový karbanion je současně oxidován na acetyl a lipoamid redukován na disulfid. 3 R 2 3 R 2 R 1 N + S 3 S E 1 3 R 2 + N + S R 1 3 S E 1 + R 1 N + TPP E 1 + S 3 E 1 S S S E 2 E 2 S LipoamidE 2 E 2 AcetyldihydrolipoamidE 2

20 Dihydrolipoyltransacetylasa (E2) E2 poté katalyzuje transesterifikací, při které se acetyl přenese na oa za tvorby acetyloa oa S 3 oa S S 3 AcetyloA S + S S E 2 E 2 AcetyldihydrolipoamidE 2 DihydrolipoamidE 2

21 Dihydrolipoyldehydrogenasa (E3) Regenerace lipoamidu na E2. Reoxidace probíhá přes kovalentně vázaný FAD. FAD S S + E 3 (oxidovaná forma) S S E 2 FAD S S + E 3 (redukovaná forma) S S E 2

22 Dihydrolipoyldehydrogenasa (E3) Reoxidace redukovaného E3. Elektrony z FAD 2 se přenáší na NAD + za tvorby NAD. FAD slouží spíše jako vodič elektronů!!! FAD FAD 2 FAD S S S S S NAD + NAD + + S E 3 (redukovaná forma) E 3 (oxidovaná forma)

23 Aktivní místo dihydrolipoamiddehydrogenasy

24 Lipoyllysylové raménko E2 Raménko přenáší meziprodukty reakce mezi jednotlivými enzymy. 2 S S nm N N Lipoyllysylové raménko (plně roztažené)

26 Toxicita arsenitanu a organických sloučenin arsenu Inhibují pyruvátdehydrogenasu a 2oxoglutarátdehydrogenasu a tím i respiraci As + S S As S S Arsenitan R Dihydrolipoamid R R 1 As rganická sloučenina arsenu S + R 1 As + S R S S R 2

28 Pyruvátdehydrogenasový komplex regulace Inhibice produkty: NAD a acetyloa Kovalentní modifikace fosforylací

29 Pyruvátdehydrogenasový komplex animace * ces/shared_resources/animations/pdc/pdc.html

30 itrátový cyklus

31 itrátsynthasa Kondenzace acetyloa s oxaloacetátem za tvorby citrátu. 2 is is 320 Dvousubstrátová reakce s uspořádaným mechanismem První se váže na enzym oxaloacetát. xaloacetát + N N is xaloacetát + N N is 274 Uplatňuje se enolforma acetyloa! 2 SoA AcetyloA 2 SoA Asp 375 Asp 375

32 Enol forma acetyl oa jako nukleoefil!! is 320 N N is SoA xaloacetát + N 2 itryloa N is 274 Asp SoA 3 oas Asp itrát 2

33 Akonitasa Reverzní izomerizace citrátu na isocitrátu přes cisakonitát. Akonitasa obsahuje komplex [4Fe4S] podílející se na odštěpení skupiny z citrátu itrát cisakonitát Isocitrát

34 NAD + dependentní isocitrátdehydrogenasa Enzym katalyzuje oxidativní dekarboxylaci isocitrátu na aoxoglutarát. xid uhličitý se odštěpuje z původní molekuly oxaloacetátu ne z acetyloa. Produkuje se NAD + +. Koenzymy jsou Mg nebo Mg ionty NAD + NAD + + Mn 2+ 2 Mn 2+ + Isocitrát xalosukcinát 2xoglutarát

35 2xoglutarátdehydrogenasa xidační dekarboxylace podobnost s pyruvátdehydrogenasovým komplexem Multienzymový komplex 2oxoglutarátdehydrogenasa (E 1 ) Dihydrolipoylsukcinyltransferasa (E 2 ) Dihydrolipoyldehydrogenasa (E 3 ) stejná jako v pyruvátdehydrogenasovém komplexu Katalyzuje oxidativní dekarboxylaci aoxoglutarátu za tvorby druhé molekuly 2 a NAD Molekula 2 má také původ v oxaloacetátu Produktem je sukcinyloa

36 2xoglutarátdehydrogenasa 2 2 oas NAD + NAD + + S oa 2xoglutarát SukcinyloA

37 SukcinyloA synthetasa (sukcinátthiokinasa) Katalyzuje štěpení vazby s vysokou energií (sukcinyloa) spojené se syntézou v případě savčího enzymu GTP z GDP a P i u rostlin a bakterií je to ATP z ADP a P i ATP a GTP jsou energeticky ekvivalentní, díky enzymu nukleosiddifosfátkinasa dochází k přechodu: GTP + ADP GDP + ATP D G o =!! Reakce katalyzovaná sukcinyloa synthetasou je další příklad fosforylace na úrovni substrátu (nezávisí na přítomnosti kyslíku).

38 SukcinyloA synthetasa (sukcinátthiokinasa) Reakce probíhá ve třech stupních: A) sukcinyloa reaguje s P i za tvorby sukcinylfosfátu a oa B) transfer fosfátu ze sukcinylfosfátu na is enzymu za uvolnění sukcinátu ) fosfát z enzymu je přenesen na GDP za tvorby GTP. V tomto bodě citrátového cyklu je acetyl již kompletně oxidován na dvě 2 dva NAD GTP. Další část cyklu je převod sukcinátu na oxaloacetát.

39 První fáze sukcinyloa synthetasové reakce S oa P P 3 2 S oa SukcinyloA Sukcinylfosfát

40 Druhá fáze sukcinyloa synthetasové reakce Enzym Enzym 2 2 P N N N + P 3 2 N Sukcinylfosfát is Sukcinát 3Fosfois

41 Třetí fáze sukcinyloa synthetasové reakce Enzym Enzym G P P + N 3 N + N + N 2 P 3 + G P P P GDP 3Fosfois is GTP

42 Sukcinátdehydrogenasa Stereospecifická dehydrogenace sukcinátu na fumarát Enzym je jediným z citrátového cyklu lokalizovaný v mitochondriální membráně a obsahuje přes is kovalentně vázaný FAD, který je redukován na FAD 2. FAD se obvykle účastní oxidace alkanů za tvorby alkenů. Pro další katalytický cyklus musí být FAD 2 nejdříve reoxidován. Přenos elektronů je součástí mitochondriálního elektronového transportního řetězce. + EFAD EFAD 2 + Sukcinát Fumarát

43 Kovalentní vazba FAD na is sukcinátdehydrogenasy 2 R Enzym 2 is N N 2 2 N N 3 N N FAD

44 Inhibice sukcinátdehydrogenasy Inhibice sukcinátdehydrogenasy substrátovým analogem malonátem Jeden z Krebsových příspěvků k objasnění citrátového cyklus 2 Malonát 2 2 Sukcinát

45 Fumarasa (fumaráthydratasa) Adice vody na dvojnou vazbu za tvorby malátu. Reakce probíhá přes karbaniontový přechodový stav. Adice předchází adici +. Fumarasa katalyzuje hydrataci dvojné vazby fumarátu za tvorby malátu. Karbaniontový přechodový stav + Fumarát Malát

46 Malátdehydrogenasa regenerace Enzym katalyzuje koncovou reakci regeneraci oxaloacetátu. Mechanismus přenosu hydridového aniontu na NAD + je obdobný jako u laktátdehydrogenasy. Malátdehydrogenasová reakce má D G o = + 29, 7 kj.mol 1 a proto je koncentrace oxaloacetátu v rovnováze velmi nízká. Reakci udržuje odběr oxaloacetátu citrátsynthasou, protože citrátsynthasová reakce má D G o = 31, 5 kj.mol 1. + NAD + + NAD + + Malát xaloacetát

49 itrátový cyklus animated, Voet, Animated fig. hapt. 16 * mated_figures/ch16/f162.html

50 Výtěžek citrátového cyklu xidace jednoho acetylu v jednom cyklu vede ke tvorbě dvou 2 (Pozor: to nejsou atomy uhlíku vstupujícího acetyloa) ve 4 x dvouelektronovém procesu. Dalším ziskem jsou tři molekuly NAD a jedna FAD 2 a jedno GTP. Elektrony z redukovaných koenzymů jsou přeneseny do elektronového transportního řetězce, který vede k redukci 2 na 2 a uvolněná energie se zachytí jako ATP. xidace jednoho NAD vede ke tvorbě tří ATP a oxidace jednoho FAD 2 ke tvorbě dvou ATP. Jeden cyklus vede ke tvorbě 12 ATP!!! Vyjdemeli z molekuly glukosy, získáme za aerobních podmínek cca 38 ATP!!!

51 Aerobní zisk ATP z glukosy

52 Pyruvátdehydrogenasa je jediný savčí systém tvorby acetyl oa z pyruvátu. Dva regulační systémy: Regulace pyruvátdehydrogenasy A) Inhibice produkty NAD a acetyloa. B) Kovalentní modifikace systémem fosforylace/defosforylace E 1. Vysoké poměry NAD/NAD + a acetyloa/oa udružují enzym E 2 v acetylovaném stavu, který nepřijímá hydroxyethylovou skupinu zpomalení pyruvátdehydrogenasy.

53 Aktivace a deaktivace pyruvátdehydrogenasy defosforylací a fosforylací P i Pyruvátdehydrogenasa fosfatasa 2 E 1 (aktivní) E 1 P 3 2 (inaktivní) ATP Pyruvátdehydrogenasa kinasa ADP U eukaryot produkty jako NAD a acetyl oa, aktivují pyruvátdehydrogenasakinasu. Výsledná fosforylace specifického Ser vede k inaktivaci pyruvátdehydrogenasy. Insulin, signál dostatku glukosy, aktivuje pyruvátdehydrogenasafosfatasu a tím enzym aktivuje.

54 Enzymy kontroly rychlosti citrátového cyklu Změna standardní volné energie (D G o ) a fyziologická změna volné energie (D G) reakcí citrátového cyklu. Reakce Enzym kofaktor D G o D G 1 itrátsynthasa 31, 5 Negativní 2 Akonitasa FeS ~ 5 3 Isocitátdehydrogenasa FeS 21 Negativní 4 2xoglutarátdehydrogenasa multienzymový komplex Kyselina lipoová, FAD 5 Sukcinyl oasynthetasa 2, 1 33 Negativní 6 Sukcinátdehydrogenasa FAD, FeS + 6, 0 7 Fumarasa 3, 4 8 Malátdehydrogenasa + 29, 7

55 Regulace citrátového cyklu Identifikace rychlost limitujících pochodů je obtížná, protože neznáme přesné koncentrace substrátů a produktů, které se pohybují mezi matrix a cytosolem. Tři enzymy jsou za fyziologických podmínek mimo rovnováhu: 1) citrátsynthasa 2) NAD + dependentní isocitrátdehydrogenasa 3) 2oxoglutarátdehydrogenasa.

56 Regulace citrátového cyklu V srdečním svalu je průtok metabolitů závislý na spotřebě kyslíku. itrátový cyklus je kontrolován: A) Dostupností substrátů B) Inhibicí produkty ) Kompetitivní zpětnovazebnou inhibicí meziprodukty cyklu

57 pyruvátdehydrogenasa NAD + dependentní isocitrátdehydrogenasa 2oxoglutarátdehydrogenasa

58 Regulace citrátového cyklu Acetyl oa a oxaloacetát jako hlavní substráty jsou přítomny v matrix v nízkých koncentracích, které nesaturují citrátsynthasu. Metabolický tok přes citrátsynthasu závisí na dostupnosti substrátů. Koncentrace oxaloacetátu, který je v rovnováze s malátem se pohybuje v závislosti na [NAD] / [NAD + ] dle rovnice: K = [oxaloacetát].[nad] / [malát].[ NAD + ] Znamená to, že v pracujícím svalu při zvyšující se respiraci klesá současně [NAD] v mitochondrii. To doprovází vzrůst [oxaloacetátu], který stimuluje citrátsynthasu.

59 Regulace citrátového cyklu Pyruvát a 2+ pyruvátdehydrogenasa AcetyloA citrátsyntasa xaloacetát Malát itrát Fumarát NAD Isocitrát a 2+ NAD + dependentní isocitrátdehydrogenasa Sukcinát ADP GTP SukcinyloA 2xoglutarát a 2+ ATP 2oxoglutarátdehydrogenasa

60 Amfibolické funkce citrátového cyklu

61 Amfibolické funkce citrátového cyklu

62 Kataplerotické reakce 1. Glukoneogeneze oxaloacetát k syntéze glukosy. xaloacetát musí být transportován do cytosolu, kde glukoneogeneze probíhá. Vstupuje tam ve formě malátu nebo aspartátu. Vzhledem k cyklickému charakteru, může být takto využit k syntéze glukosy každý meziprodukt. 2. Biosyntéza mastných kyselin probíhá v cytosolu. Acetyl oa je do cytosolu transportován ve formě citrátu. V cytosolu je ATPcitrátlyasa která katalyzuje reakci: ATP + citrát + oa ADP + P i + oxaloacetát + acetyl oa. 3. Biosyntéza aminokyselin 2oxoglutarát přechází na Glu a oxaloacetát na Asp.

63 Kataplerotické reakce

64 Glutamátdehydrogenasová reakce tvorby glutamátu NAD N + NAD N 3 + 2xoglutarát Glutamát

65 Transaminace oxaloacetátu na aspartát N + N xaloacetát Alanin Aspartát Pyruvát

66 Anaplerotické reakce Doplňují meziprodukty citrátového cyklu Nejdůležitější anaplerotickou reakcí je pyruvátkarboxylasová: Pyruvát ATP + 2 oxaloacetát + ADP + P i Reakce je také prvním stupněm glukoneogeneze. Pyruvátkarboxylasu aktivuje acetyl oa.

67 Anaplerotické reakce Doplňují meziprodukty citrátového cyklu Další anaplerotickou látkou je sukcinyloa, který se tvoří při odbourávání mastných kyselin s lichým počtem uhlíků a některých aminokyselin. Dále 2oxoglutarát a oxaloacetát vznikající reverzibilní transaminací Glu a Asp.

68 Anaplerotické reakce citrátového cyklu

69 Reverzní citrátový cyklus Některé bakterie produkující uhlíkaté stavební jednotky z vody a 2. Jedna z forem fixace 2.

70 Glyoxylátový cyklus Rostliny, bakterie a plísně obsahují enzymy, které katalyzují konverzi acetyloa na oxaloacetát a tím do glukoneogeneze. Glyoxylátový cyklus probíhá v glyoxysomech a mitochondriích. Glyoxysomy jsou na membránu vázané organely, specializované peroxisomy. Řada enzymů je společných s citrátovým cyklem. Navíc: glyoxysomální isocitrátlyasa a malátsynthasa.

71 Glyoxylátový cyklus Výsledkem glyoxylátového cyklu je převod dvou molekul acetyloa na sukcinát, kdežto v citrátovém cyklu se uhlíky acetyloa uvolňují jako 2. Vytvořený sukcinát je transportován do mitochondrie do a převeden na malát anaplerotická reakce!! Malát může být převeden na oxaloacetát, nebo transportován do cytosolu a tam převeden na oxaloacetát jako prekurzor glukosy v glukoneogenezi.

72 Reakce glyoxylátového cyklu

73 Reakce glyoxylátového cyklu v glyoxysomech

74 Reakce glyoxylátového cyklu v mitochondriích

75 Dráha malátu v cytosolu YTSL 2 Malát NAD + NAD xaloacetát GLUKNEGENEZE

76 Význam glyoxylátového cyklu elková reakce glyoxylátového cyklu: 2 AcetyloA + 2 NAD + + FAD oxaloacetát + 2 oa + 2 NAD + FAD Isocitrátlyasa a malátsynthasa existují jen u rostlin a některých mikroorganismů. Umožňují klíčícím rostlinám využívat skladované triacylglyceroly. Jedná se o anaplerotickou reakci!! Vnáší oxaloacetát do citrátového cyklu. Patogen, jako Mycobacterium tuberculosis přežívá v plících aniž by bylo odhaleno imunitním systémem. Využívá glyoxylátový cyklus. Možnost zásahu inhibice isocitrátlyasy. bdobně kvasinka andida albicans.