Mendelova univerzita v Brně. Agronomická fakulta. Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat. Chromozomální aberace u koní.

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Chromozomální aberace u koní Bakalářská práce Vedoucí práce: prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Vypracovala: Zuzana Jakubcová Brno 2010

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Chromozomální aberace u koní vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MZLU v Brně. V Brně dne. Podpis studenta. 2

3 Poděkování Tímto bych chtěla poděkovat prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za vedení a pomoc při zpracování bakalářské práce. Dále také mým rodičům za podporu nejen při studiu. 3

4 Abstrakt Chromozomální aberace u koní Tato bakalářská práce se zabývá výskytem chromozomálních aberací u koní. Cílem práce je zpracování literární rešerše o chromozomálních aberacích, které se vyskytují u koní a jejich dopadu na fenotyp. Jsou zde uvedeny nejčastější chromozomální aberace koní, k nimž patří např. gonádová dysgeneze, pohlavní zvrat nebo mozaicismus. K chromozomálním aberacím je uvedeno a popsáno několik klinických případů. Dále práce uvádí metody detekce chromozomálních aberací, jejich výhody a nevýhody. Klíčová slova: aberace, chromozomy, kůň, karyotyp Abstract Chromosomal aberration in horses This bachelor thesis deals with the incidence of chromosomal aberration in horses. The aim of this work is to conduct a literature search and process information relative to chromosomal aberrations that occur in horses and their effect on phenotype. The most frequent chromosomal aberrations in horses that include gonadal dysgenesis, sex reversal or mosaicism are introduced. Several clinical cases of chromosomal aberration are described and discussed. Further, the work lists the detection methods of chromosomal aberration, and discusses the arguments for and against their use. Key words: aberration, chromosomes, horse, karyotype 4

5 Obsah 1 ÚVOD LITERÁRNÍ PŘEHLED Karyotyp koně Chromozomální aberace Rozdělení chromozomálních aberací Chromozomální aberace zahrnující autosomy Autozomální delece Chromozomální vady u předčasné ztráty embrya a zmetání Autozomální trizomie Chromozomální aberace zahrnující pohlavní chromozomy , X gonádová dysgeneze ,X/64,XX gonádová dysgeneze , XY pohlavní zvrat , XXX , XXY ,XX pohlavní zvrat Mozaicismus/ chimérizmus Metody detekce chromozomálních aberací Cytogenetické barvení Q-pruhování G-pruhování C-pruhování R-pruhování Ag-NOR Genové mapování

6 Mapování syntenií Radiační hybridní mapování Hybridizace in situ Fluorescenční in situ hybridizace (FISH fluorescent in situ hybridization ) Třídění proudu chromozomů Mikrodisekce Chromozomové malování Srovnávací chromozomové malování Zoo-FISH ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK SEZNAM ZKRATEK

7 1 ÚVOD Chromozomální aberace mohou být způsobeny změnami autozomů nebo pohlavních chromozomů. Tyto změny zahrnují buď počet chromozomů, nebo tvar a stavbu chromozomů. Jednotlivé chromozomální aberace mají různé projevy, v závislosti na míře a počtu poškozených chromozomů, a nejsou vždy slučitelné se životem. Na vznik mají vliv různé faktory. Některé aberace jsou dědičné, některé mají vyšší pravděpodobnost výskytu s rostoucím věkem matky, např. Downův syndrom. U lidí jsou chromozomální aberace spojeny s mentální retardací a tělesným postižením. Mezi nejznámější aberace vyskytující se u člověka patří např. Downův syndrom (47,+21), Turnerův syndrom (45,X) nebo Klinefelterův syndrom (47,XXY). Dnes se již provádí prenatální vyšetření k případné diagnostice chromozomální aberace plodu. Mezi tyto metody patří např. amniocentéza (odběr plodových vod). U koní se aberace chromozomů projevují jinak než u člověka a příznaky většinou nejsou běžně známé. Nebo se mohou projevit pouze neplodností jedince. Proto se může zdát, že dosud nebylo popsáno mnoho klinických případů. Studium chromozomálních aberací může vést v některých případech k objasnění neplodnosti koní. To by mohlo mít význam u plemenných zvířat především pro chovatele. 7

8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Karyotyp koně Historie cytogenetiky domácího koně (Equus caballus) pochází z roku 1912, kdy byl hlášen diploidní počet chromozomů, který měl být mezi 20 a 34 u samců koní. Později bylo uvedeno číslo 64. V roce 1959 bylo toto číslo jasně potvrzeno. Kůň má 13 párů metacentrických/submetacentrických a 18 párů akrocentrických autozomů. Chromozom X je druhým největším submetacentrickým, zatímco chromozom Y je jedním z nejmenších akrocentrických (Bowling et al., 1997). Obrázek 1: Schematický nákres G-pruhovaných chromozomů koně, popsaný jako poslední standardní karyotyp koně (Bowling, 1996) 8

9 Tabulka 1: Počet chromozomů a charakteristika karyotypu u různých druhů koní (Chowdhary, Raudsepp in Genetics of the horse, 2000) Rod Druh 2n Charakteristika karyotypu E. f. przewalski Kůň převalského 66 E. caballus Kůň domácí 64 E. asinus Osel domácí 62 E. africanus somaliensis Somálský divoký osel 62/6 3 E. hemionus onager Perský divoký osel 55/5 6 E. hemionus kulan Kulan 54/5 5 E. kiang Tibetský divoký osel E. grevyi Grévyho zebra, Imperial zebra E. burchelli Zebra Grantova, zebra obecná E. zebra Zebra Hartmannové 51/ párů meta a submetacentrických, 18 párů akrocentrických + pohlavních chromozomů. Karyotyp je podobný domestikovanému koni s výjimkou jednoho páru akrocentrických chromozomů navíc Pravděpodobně nejvíce podobný divokému koni s výjimkou metacentrického chromozomu, který odpovídá dvěma akrocentrickým u divokého koně 19 párů meta a submetacentrických autozomů, zatímco zbývající jsou akrocentrické; karyotyp je od koně odlišný až na několik podobností; Robertsonův polymorfizmus zahrnuje chromozom 3 Homologie pruhování s oslem domácím; 19/21 centrické spojení/polymorfické štěpení 22 párů meta a submetacentrických a 5 párů akrocentrických autozomů; centrické spojení/polymorfické štěpení chromozomů 23/24 22 párů meta a submetacentrických a 5 párů akrocentrických autozomů; 13/24 centrické spojení/polymorfické štěpení Polymorfizmy zahrnují prvky, které se účastní Robertsonské translokace u E. hemionus kulan a E. hemionus onager (chromozomy 22/23 u E. kiang) párů meta a submetacentrických a 6 párů akrocentrických autozomů 17 párů meta a submetacentrických a 4 páry 44/4 akrocentrických autozomů; karyotyp je stejný 5 jako u zebry Grévyho 14 párů meta a submetacentrických a 1 pár 32 akrocentrických autozomů; nejnižší počet chromozomů z rodu Equus 9

10 2.2 Chromozomální aberace Chromozomálními aberacemi je podmiňován poměrně velký rozsah fenotypových změn. Jsou to mutační změny, které vedou ke zlomům a přestavbám struktury chromozomů. Většinou při nich dochází ke ztrátám nebo přemístění vetší části genetických informací (Rosypal et al., 2003). Poškození fenotypu závisí zejména na druhu chromozomu, ve kterém došlo k aberaci, na typu a lokalizaci aberace. K chromozomální aberaci dojde způsobením zlomu, případně několika zlomů, v určitém místě chromozomu. Aberantní chromozomy, které vzniknou při gametogenezi, jsou předány jedincům další chromozomální generace. Nejprve způsobují cytologické změny v párování chromozomů při dělení buněk a poruchy reprodukce. Dále se pak mohou projevit ve fenotypu jejich nositelů v různých fázích ontogenetického vývoje a determinovat vznik anomálií, např. neplodnost, sníženou životaschopnost až mortalitu (Řehout et al., 2003). Studie chromozomů může zjistit změny extenzivní DNA ale ne změny jediné základny nebo dokonce malá vypuštění sledu nukleotidů uvnitř jednotlivých genů. Chromozomální abnormality spojené s připojením, ztrátou nebo přeskupením velkého počtu genů jsou obecně neslučitelné se životem a jsou vyloučeny pro neschopnost života pohlavní buňky nebo předčasnou embryonální ztrátu, dříve než mohou být pozorovány nebo studovány (Bowling, 1996). 2.3 Rozdělení chromozomálních aberací Chromozomální aberace jsou klasifikovány do dvou hlavních skupin. Aberace autozomů a pohlavních chromozomů. Obě skupiny jsou dále členěny do dvou podskupin: strukturální a numerické aberace (Chowdhary, Raudsepp in Genetics of the horse, 2000). Numerické abnormality chromozomů jsou obvykle označovány jako ploidie organizmu. Organizmy, které ve svých buňkách obsahují nadbytečnou sadu chromozomů, jsou označovány jako polyploidní. Úroveň ploidie se vztahuje k základnímu chromozomovému číslu, označovanému písmenem n. Diploidní buňky obsahují dvě základní sady chromozomů 2n, triploidní tři sady chromozomů 3n, tetraploidní čtyři sady 4n atd. Pokud dojde ke zmnožení nebo ke ztrátě jednotlivých chromozomů nebo 10

11 jejich segmentů, hovoříme o aneuploidii. Při aneuploidii dochází k početním změnám pouze části genomu. Nejčastěji se jedná o změnu jednoho chromozomu. Aneuploidie způsobuje častěji genetickou nevyváženost. Jedinci, u kterých chybí chromozom nebo jeho část se označují jako hypoploidní. Jestliže je nějaký chromozom nadbytečný, jedná se o hyperploidii. Spojení jednoho chromozomu s jiným chromozomem nebo začlenění určitého segmentu chromozomu v obráceném pořadí jsou označovány jako strukturní změny (Snustad, Simmons, 2009). Tab. 2: Přehled abnormalit pohlavních chromozomů (Chowdhary, Raudsepp in Genetics of the horse, 2000) Abnormality pohlavních chromozomů Strukturální Numerické 64,X,-X+der(X),t(X;15q) 63,X0 64,X, del(xp) 64,XX, del(xp) 63,X/64,X-Y,+t(Yq,Yq) 65,XXX 65,XXY 66,XXXY 64,X,i(Xq) 64,XY/64,XY,del(Xq) 11

12 Tab. 3: Přehled abnormalit autozomů (Chowdhary, Raudsepp in Genetics of the horse, 2000) Abnormality autozomů Strukturální Numerické 64,XX, del(12q) 65,XY, ,XY, del(13qter) 65,XX, +26 centrické spojení 64,XX, del(4p) 65,XX, ,XX, t(1q;3q) 65,XY, ,XY, t(1;30) 65,XX, ,X,-X+der(X),t(X;15q) 65,XY, ,XX/65,XX+fragment 63,XX(-malý metacentrický)/64,xx/64,xy Chromozomální aberace zahrnující autosomy Po čtyřech desetiletích cytogenetické analýzy u koně bylo u toho druhu objeveno šest strukturálních a sedm numerických aberací. Ze šesti strukturálních aberací jsou tři delece a tři translokace (balancované a nebalancované) (Bowling, 1996). Při balancované translokaci je přítomen všechen genetický materiál a jedinec se zdá normální. Při nebalancované translokaci, může být přítomen genetický materiál navíc nebo může chybět, jedinec není normální (Lear, 2009). Všechny numerické aberace u koně jsou trizomie různých autozomů (Chowdhary, Raudsepp in Genetics of the horse, 2000). Chromozomální změny v autozomech mají pravděpodobně mnohem drastičtější účinek na životaschopnost a pár případů bylo nalezeno u koní (Bowling, 1996). Bylo hlášeno jen několik případů autozomálních vad u koně: autozomální delece, autozomální translokace a autozomální trizomie. Předpokládá se, že velké chromozomální delece nebo trizomie zahrnující velké chromozomy jsou příčinou časné embryonální ztráty (Giesecke et al., 2009). 12

13 Autozomální delece Jako delece se označuje ztráta části chromozomu. Velké delece lze rozlišit na chromozomech pruhovacími metodami, u velmi malých delecí jsou však tyto techniky neúčinné (Snustad, Simmons, 2009). Byli ohlášeni 4 koně s autozomální delecí. Jeden z případů byl neplodný hřebec amerického klusáka s abnormálními spermiemi vykazujícím slabou pohyblivost a karyotyp 64,XY,del(13)(qter). Jako další byli představeni arabský hřebec, jeho fraternitní poloviční sestra a fraternitní poloviční bratr s delecí chromozomu 10 v mozaické formě (64,XY/63,XY, 10; 64,XX/63,XX, 10; a 64,XY/63,XY, 10, v tomto pořadí). Anomálie chromozomů u tohoto hřebce byly identifikovány, až když byl pářen s normálními klisnami, které zmetaly mezi 2,5. a 5. měsícem březosti. Jeden ze sedmi živých lidských porodů má viditelné autozomální delece. Vzhledem k tomu, že delece, závislé na velikosti a zasažení chromozomů, mohou mít vážné vlivy na vývoj embrya a přežití, není překvapující, že u koní bylo hlášeno pouze málo případů (všechny mozaiky) (Lear, Bailey, 2008) Chromozomální vady u předčasné ztráty embrya a zmetání Jeden typ chromozomální abnormality, který způsobí ranou embryonální ztrátu, je translokace (Lear, 2009). Jako translokace se označuje přemístění nebo výměnu chromozomového segmentu mezi různými (zpravidla nehomologickými) chromozomy. Tak se geny dostávají do jiných vazbových skupin, než byly původně (Snustad, Simmons, 2009). Fenotypicky normální rodiče heterozygotní pro chromozomální spojení mezi akrocentrickými chromozomy (Robertsonská translokace nebo centrické spojení) mají potenciál pro vytváření geneticky nevyrovnaných gamet během meiózy (nerozdělení chromozomů) (Lear, 2009). Robertsonská translokace je zvláštním typem chromozomální abnormality. Dochází při ní ke spojení nehomologických chromozomů. Při centrickém spojení dochází ke spojení homologických chromozomů, sesterských chromatid nebo homologických chromozomových segmentů (Snustad, Simmons, 2009). 13

14 Translokace heterozygotů jsou uváděny u kaspického pony, ale nejsou přímo zahrnovány do problémů plodnosti u tohoto chovu. Byla popsána jedenáctiletá klisna plnokrevníka, která měla dvě hříbata za osm let chovu s abnormálním karyotypem [64,XX,t(1q;3q)]. A případ osmiletého plodného hřebce plnokrevníka s balancovanou tandemovou translokací mezi chromozomy 1 a 30 [64, XY,t (1:30)]. Klisny oplodněné tímto hřebcem by zabřezly, ale březost by se přerušila předčasnou smrtí embrya. Translokace byla přenesena na jednoho, ze čtyř zjištěných potomků. U toho potenciálně pokračuje problém ztráty embrya v následujících generacích (Bowling, 1996). V poslední době byla popsána vyvážená vzájemná translokace [64,XX,t(1;16)] u málo plodné klisny plnokrevníka s normálním fenotypem. Chromozomální translokace u koní byly vzácně zdokumentovány a všechny způsobily opakovanou ranou embryonální ztrátu (REEL - early embryonic loss). REEL může být dosti nákladná vzhledem k veterinární péči, krmení a dopravě. Častokrát je ztracena celá chovná sezóna (Lear, 2009). V jedné studii Lear et al. (2008) uvádí tři dříve neuváděné autozomální translokace chromozomů způsobující REEL u nepříbuzných klisen plnokrevníka. Aby mohla být určena poloha bodů zvratu chromozomů a zda byly translokace vzájemné, byly mapovány bakteriálními umělými chromozomy (BAC - bacterial artificial chromosomes) obsahujícími geny, které obklopují body zvratu pomocí fluorescence hybridizace in situ (FISH). Výsledky naznačují, že fenotypově normální klisny podstupující REEL mohou být v nebezpečí, že přenášejí translokaci chromozomů a mají být karyotypizovány pro vyloučení anomálií chromozomů. První případ byla fenotypově normální klisna plnokrevníka, narozená v roce 1993, představená pro karyotypizaci po REEL. Tato klisna měla dvě kobylky, jednu v roce 2000 a druhou v roce 2002, ale dále neměla žádná hříbata během následujících čtyř let, přestože měla normální cyklus říje. Po několika připuštěních bylo na ultrazvuku viditelné embryo na 14. a 21. dnu, ale 28. den nebyl zřetelný tlukot srdce. Navíc byl odebrán vzorek pro karyotypizaci od její kobylky narozené v roce 2000, která měla hříbě v roce V dalším případě byly odebrány vzorky fenotypově normální klisny plnokrevníka narozené v roce 2000 kvůli REEL. Tato klisna byla připouštěna po 3 roky, ale nikdy nenosila viditelné 14

15 embryo déle než 28 dní i přes hormonální léčbu. Třetí případ byla klisna plnokrevníka, narozená v roce 1997, s normálním fenotypem, připuštěná poprvé v roce 2002 a bylo zjištěno, že je březí 45. den. Toto embryo se následně vstřebalo. Klisna byla opět březí v roce 2003, ale pod ultrazvukem nemělo embryo na 45 dnech zřetelný tlukot srdce. Klisna nebyla v roce 2003 březí kvůli přetrvávání endometriálních dutin po předchozím vstřebání embrya. Biopsie dělohy odhalila mírnou chronickou endometritidu. Klisna byla znovu připuštěna v roce 2004, ale embryo se vstřebalo po 45 dnech. V roce 2005, po připuštění potratila embryo po 65 dnech. Byla provedena druhá biopsie dělohy a odhalila minimální abnormalitu. Klisna byla léčena konzervativně a připuštěna v roce Ultrazvuková vyšetření 14., 28., 36., a 45. den ukázala normální vývoj embrya. Avšak hříbě se narodilo přibližně o měsíc dříve a následně nepřežilo kvůli infekci krve spojené se zánětem placenty. Z hříběte nebyla dostupná tkáň pro karyotypizaci. V této zprávě byly popsány tři nové translokace způsobující REEL u jinak zdravých a fenotypově normálních klisen. Všechny tři klisny z této zprávy byly karyotypizovány kvůli REEL která měla za následek neplodnost nebo nízkou plodnost. V závislosti na rekombinaci a izolaci chromozomů po meióze mohou translokace vytvářet normální nebo nevyvážené gamety. U lidí mohou mít translokace za následek normálního potomka, předčasné vstřebání embrya, abnormální živé porody a narození mrtvého dítěte. Poslední dvě jmenované kategorie nebyly hlášeny u koní ve spojení s translokacemi chromozomů. To je nejpravděpodobněji kvůli skutečnosti, že abnormální hříbata mohou být uspána krátce po narození a porody mrtvých hříbat nemusí být hlášeny. Tudíž tito potomci nejsou pro analýzu chromozomů k dispozici. 15

16 Obrázek 2: GTG-pruhování karyotypu, 1. Případ klisny s karyotypem 64,XX,t(1;21) (Lear et al., 2008) Obrázek 3: GTG-pruhování karyotypu, 2. případ klisny s karyotypem 64,XX,t(16;22) (Lear et al., 2008) 16

17 Obrázek 4: GTG-pruhování karyotypu, 3. případ klisny s karyotypem 64,XX,t(4;13) (Lear et al., 2008) Časná embryonální ztráta může být způsobena řadou dalších faktorů kromě chromozomální translokace, ale u klisen, které opakovaně potratí embrya před 65 dnem březosti běhěm dvou či více let za sebou, je vhodné poslat vzorky klisny pro karyotypizaci, aby se vyloučila chromozomální translokace (Lear, 2009). Navíc je důležité používat všechny dostupné srovnávací mapovací nástroje pro analýzu těchto klinických případů. Výsledky nejen objasnily příčiny neplodnosti u koní, ale mohou poskytnout vodítka pro rozluštění evoluční historie koňských chromozomů (Lear et al., 2008). Obrázek 5: Chromozomální translokace zahrnující chromozomy 1 a 21, které způsobují opakovanou časnou embryonální ztrátu. Vlevo jsou normální chromozomy (N) a vpravo abnormální chromozomy (AB) (Lear, 2009) 17

18 Autozomální trizomie Trizomií je nazývána existence tří kopií téhož chromozomu v karyotypu (Snustad, Simmons, 2009). Autozomální trizomie u koně jsou vzácné s několika málo hlášenými případy a všechny zahrnují mírné vývojové vady (Lear et al., 1999). U lidí a skotu jsou zvláštní autozomy spojeny s těžkými vadami, které novorozenci zřídka přežijí déle než několik hodin nebo dnů. Výjimkou je Downův syndrom u lidí, trizomie chromozomu 21. Koně také vzácně vykazují životaschopnou trizomii. Zvláštní autozomální chromozom byl identifikován u čtyř ročků, kteří nebyli uznáni za neplodné, ale byli popsáni jako malí se strnulým chodem a špatnou konstitucí. Dva byli plnokrevníci, jeden arabský kůň a jeden americký klusák. Jednalo se o dvě samice a dva samce. U každého případu byly postiženy odlišné malé chromozomy (chromozomy 23, 26, 28, a 30). Nejméně dva byli potomci starších klisen, to je pravděpodobně souběžnost spojení Downova syndromu s vyšším věkem matky při zplození (Bowling, 1996). Podle Leara et al. (1999) byla jako první hlášena trizomie chromozomu 28 u hříběte plnokrevníka, kryptorchida, s malou postavou. Později byl popsán případ hřebečka amerického klusáka s poruchami kosterního svalstva a varlat s trizomií 23. Další zpráva popisovala trizomii 26 a trizomii 30 u dvou arabských klisen s úhlovou deformací končetin. Byla uvedena zpráva o nové autozomální trizomii (65, XY, +31) u plnokrevného hřebce s těžkými vrozenými vadami postihujícími pohybový, urogenitální a nervový systém. Brito et al. (2008) uvádí případ devatenáctiměsíčního hříběte amerického klusáka, u kterého bylo podezření na intersexualitu. Při vyšetření bylo hříbě v dobrém celkovém a zdravotním stavu, nebyly pozorovány abnormality svalové a kosterní soustavy, ale bylo poněkud malé v porovnání se skupinou hříbat stejného věku. Mělo neobvykle tuhé zadní končetiny při chůzi a hrubou srst. Reprodukční vyšetření ukázalo přítomnost šourkového váčku, hříbě však bylo dvoustranný kryptorchid. Při ultrasonografickém vyšetření byla obě varlata nalezena v tříselném kanálu. Penis byl normální, ale předkožka byla zvětšená. U hříběte nebyl nalezen žádný důkaz intersexuality. V období březosti matky hříběte a během porodu nebyly hlášeny žádné 18

19 abnormality. Matka přivedla na svět minimálně dvě normální hříbata. Otec hříběte byl úspěšným chovným hřebcem a zplodil řadu normálních hříbat. Hříbě bylo utraceno ve věku 24 měsíců. Histopatologické vyšetření neodhalilo žádnou poruchu mozku, srdce, plic, jater, ledvin, sleziny, brzlíku, hypofýzy, nebo nadledvin. Levé varle a vážilo 25,1 a pravé 36,6 g. Rozměry (délka, šířka, výška), levého a pravého varlete byly 5,8 3,2 3,3 cm a 6,4 4,0 4,1 cm. Levé nadvarle vážilo 13,8 a pravé 14,1 g. Histopatologické hodnocení odhalilo normální vzhled Leydigových buněk varlat v intersticiální tkáni. Tam byla rozsáhlá vakuolizace semenného epitelu a naprostou většinu semenotvorných kanálků lemovaly pouze Sertoliho buňky a spermatogonie. Primární spermatocyty byly pozorovány zřídka u několika málo tubulů, ale nebyly tu žádné spermatidy. Nebyly pozorovány spermie ve vzorcích získaných po vypláchnutí nadvarlat. Obrázek 6: G-pruhování karyotypu ukazuje číslo chromozomu a morfologii u hříběte amerického klusáka s abnormálním samčím karyotypem vykazujícím trizomii chromozomu 27 (65, XY, t 27) (Brito et al., 2008) 19

20 2.3.2 Chromozomální aberace zahrnující pohlavní chromozomy Rozsáhlá většina abnormalit u koně zahrnuje pohlavní chromozom (převážně chromozom X). Z přibližného počtu 300 dodnes hlášených abnormálních karyotypů zahrnuje pohlavní chromozom 94,5% (Chowdhary, Raudsepp in Genetics of the horse, 2000). U samců není karyotypizace tak účinná pro pochopení problémů, jako u samic. Nedostatek příkladů samčích chromozomálních abnormalit může být korelován s vysokým výskytem časných kastrací, takže potenciál plodnosti není u většiny samců hodnocen (Bowling, 1996) , X gonádová dysgeneze Ztráta jednoho chromozomu v karyotypu diploidního jedince se označuje jako monozomie (Snustad, Simmons, 2009). Většina běžných chromozomálních abnormalit je spojena s chybějícím pohlavním chromozomem a vyskytuje se mezi neplodnými klisnami (Bowling, 1996). Gonádová dysgeneze byla poprvé popsána v roce Vznik vady je pravděpodobně porucha ve vývoji, není to dědičný problém (Bowling, Millon, Hughes, 1987). Karyotyp je podobný karyotypu popsaném pro ženskou gonádovou dysgenezi, známou jako Turnerův syndrom. Klisny jsou postiženy chronickou primární neplodností, mají poruchu pravidelnosti cyklu a žádné nebo velmi malé vaječníky (0,5 0,5 1 cm) bez folikulární aktivity. Další charakteristika těchto klisen je malý vzrůst, příliš hranatý postoj zadních nohou, silná plec a široké uši rozložené do šířky. Vyskytuje se zřídka, pravděpodobně z nedostatku páru pohlavních chromozomů pro oddělení během meiózy, vytvářející jednu gametu bez pohlavního chromozomu (a u ostatních s dvěma místo jedné). U lidí je X monozomie hlavní příčinou předčasného ukončení těhotenství a ačkoli se to může stát i u koní, nebyl zatím předpoklad demonstrován u potracených koňských plodů. Nepřesvědčivý důkaz u lidí nebo koní ukazuje dědičný sklon spojení s věkem matky nebo otce při početí vedoucím k potomstvu s monozomií X. Zprávy dokumentují výskyt u desítek chovů od poníků až k tažným koním. Klisny zřejmě nemají potenciál jako plemenné, ale jsou uváděny jako jemní 20

21 jezdečtí koně a nejméně jedna byla uváděna jako šampion mezi cuttingovými koňmi (Bowling, 1996). Obrázek 7: Pohlavní orgány klisny s 63,XO gonádovou dysgenezí ,X/64,XX gonádová dysgeneze Klisny s 63,X/64,XX gonádovou dysgenezí představují přibližně 15-30% všech případů gonádové dysgeneze (McCue, 1998). V několika případech odhalil karyotyping klisen s gonádovou dysgenezí dvě linie buněk, jednu s normálním souborem samičích chromozomů, ostatní s chybějícím pohlavním chromozomem (Bowling, 1996). Tyto klisny nejsou vždy malé postavy (McCue, 1998), mohou mít výjimečně hříbata, ale obvykle jsou neplodné (Bowling, 1996). Pawlak et al., (2000) uvádí studii kde bylo celkem 24 klisen podrobeno cytogenetické analýze, s různými problémy s plodností: sterilita, slabé říje, potraty, a narození malformovaných hříbat. U neplodných klisen se zpomaleným vývojem reprodukčních orgánů byl velmi často nalezen abnormální počet pohlavních chromozomů. Vzorky krve byly odebrány od klisen anglického plnokrevníka, polokrevníka, araba a angloaraba polského chovu. Byla použita standardní technika kultivace lymfocytů, barvení dle Giemsy a také C-pruhování. Z 24 klisen 4 demonstrovaly mozaikový karyotyp 64, XX/63, X. Podíl 63, X buněk se lišil od 10 do 22%. Všechny tyto klisny byly neplodné. Přítomnost dvou linií buněk (64, XX a 63, X), přináší otázku, zda tento stav odpovídá mozaice nebo chimérizmu. XX/X u klisny je obvykle klasifikováno jako mozaika. Výskyt chimérizmu však nemůže být definitivně vyloučen. K potvrzení, že v těchto případech šlo o mozaiky, byla u dvou klisen a jejich rodičů provedena typizace krve a studie polymorfismů krevních 21

22 bílkovin. Byly získány shodné výsledky, a tak bylo konstatováno, že tyto dvě klisny byly mozaiky. Údaje o rodičích dalších dvou klisen nebyly dostupné. Ve většině případů klisen podrobených přezkoumání vzhledem k neplodnosti a gonadální dysgenezi, byly nalezeny abnormality pohlavních chromozomů , XY pohlavní zvrat Druhou obvyklou chromozomální abnormalitou mezi neplodnými klisnami je samčí karyotyp. Dědičná genetická porucha způsobuje, že embrya XY u koní se vyvíjejí jako klisny (Kent et al., 1988). Mezi těmito případy byly zjištěny vítězky závodů a přehlídek v chovech plnokrevníků, quarterů, appaloosy, amerických klusáků, arabských koní, morganů, a shetlandských pony (Bowling, 1996). Zdá se, že k XY pohlavnímu zvratu, dochází u koní poměrně často. Ze 180 neplodných klisen bylo zjištěno 22 případů s karyotypem XY. Většina klisen XY má samičí zevní pohlavní orgány s normální vulvou a pochvou, nerozvinutou dělohu, a malé a neaktivní gonády (Pailhoux et al., 1995). Reproduktivní fenotyp je podobný 63, X gonádové dysgenezi, ale klisny XY neprokazují chudou strukturu monozomu X a mohou být vyšší než je průměr pro klisnu uvedených chovů. V nejméně jedné skupině arabských koní byl problém jasně přenesen plemenným hřebcem na polovinu jeho synů (ti se zdáli být neplodně samičí), ale genetický mechanizmus nebyl určen. Nejméně jedna klisna XY měla hříbata, ale tato situace by neměla být brána jako obecně pravděpodobná (Bowling, 1996). Z hlediska chovu koní je důležitou otázkou, zda je pohlavní zvrat porucha, která prokazuje ojedinělý nebo dědičný výskyt. Rozsáhlé studie prokázaly dědičný výskyt pohlavního zvratu XY u severoamerické populace arabských koní. Předpokládá se, že XY je dědičné onemocnění. Na druhou stranu existují četné případy XY pohlavního zvratu, které byly hlášeny jako ojedinělé (Bugno et al., 2003) , XXX Extra X chromozom u koní samičího pohlaví je spojen s neplodností a je fenotypicky podobný pohlavnímu zvratu XY. Klisny jsou vysoké, 22

23 s omezenou nebo nezřetelnou strukturou vaječníků. Výsledky z případu celosvětové karyotypizace uváděly, že XXX je u koní mnohem méně obvyklý, než monozomie X nebo pohlavní zvrat XY. U lidí je tomu naopak, u lidí se XXX vyskytuje častěji a není spojen s neplodností (Bowling, 1996) , XXY Klinefelterův syndrom (47, XXY) postihuje jednoho z 500 mužů, nicméně u koní bylo hlášeno pouze několik případů. Účinky Klinefelterova syndromu jsou mnohem závažnější u lidí. Muži s Klinefelterovým syndromem jsou neplodní v důsledku poruchy rozvoje zárodečných buněk. Tito pacienti mají malá varlata, nedostatečně rozvinuté druhotné pohlavní znaky a jsou abnormálně vysocí a hubení. U koní ovlivňuje tento syndrom pouze reprodukční trakt. Mezi hlášené případy 65, XXY patří hřebec francouzského klusáka s normálním sexuálním chováním, malými varlaty, malým penisem, a azoospermiemi. A americký klusák s normálními varlaty, který neměl žádné spermie, a měl mozaiku karyotypu 64,XY/65,XXY (Lear, Bailey, 2008). Bowling (1996) uvádí případ koně, pravděpodobně kryptorchida, ne valacha. S nejasnými detaily chorobopisu, protože kůň nebyl prohlédnut klinickými specialisty až do asi osmi let věku (Bowling, 1996) ,XX pohlavní zvrat XX pohlavní zvrat je vrozená anomálie, kdy je normální složení jednotlivých pohlavních chromozomů, ale nesouhlasí s gonadálním pohlavím (Vaughan, Schofield, Ennis, 2000). Pohlavní zvrat může nastat z neobvyklých rekombinačních událostí mezi pseudoautozomálními oblastmi chromozomů X a Y (Bowling, 1996). Spouštěč pro vytváření varlat je oblast určující pohlaví na chromozomu Y (SRY sex determining region Y), nachází se na chromozómu Y. XX pohlavní zvrat může nastat v důsledku přemístění SRY genu na chromozom X nebo autozom. Výsledkem je SRY-pozitivní jedinec XX. Jedinci s XX pohlavním zvratem, kteří nemají SRY gen byli hlášeni u lidí, prasat, koz, psů a koní (Vaughan, Schofield et Ennis, 2000). Zevní pohlavní orgány jsou většinou popisovány jako samičí se strukturou podobnou penisu 23

24 místo klitorisu, slepá vagina, vaječníky jako intra-abdominální varlata, samčí chování a stavba pohlavního chromozomu XX. Takový případ je popsán například u arabského hříběte. Podobné případy byly diagnostikovány u ostatních chovů včetně plnokrevníka, appaloosy a painta. Tříletý poník, který se choval jako agresivní hřebec v průběhu předcházejících šesti měsíců, byl předložen ke gonadektomii. Na klinickém vyšetření, měl samčí vzhled, ale neměl šourek. Byl zde malý rozvoj mléčné žlázy. Ve ventrální perineální oblasti byla přítomna struktura podobná penisu o délce 5 cm. K močení docházelo prostřednictvím uretrální jamky na distálním konci rudimentálního penisu. Nebyly nalezeny žádné skutečné vulvální otvory. Transrektální ultrasonografie k vizualizaci vnitřních pohlavních orgánů neměla význam. Koncentrace testosteronu byla 0,03 ng/ml, což naznačovalo, že neexistuje funkční testikulární tkáň. Koncentrace estradiolu byla 22,62 pg/ml, což naznačovalo, malou velikost varlat. V celkové anestezii byla odstraněna dvě bilaterálně symetrická varlata z tříselných kanálů, a předložena k histopatologickému vyšetření. Krevní vzorky byly odebrány v 10 ml nádobách EDTA, kontrolní krevní vzorky byly odebrány od normálních jedinců koní samčího a samičího pohlaví. Genomická DNA byla extrahována podle výše popsané metody a také z části varlete poníka ke kontrole pro gonadální určení mozaicismu, zda byl přítomen chromozom Y. Po gonadektomii, se poník přestal chovat jako hřebec. Histopatologické vyšetření varlat ukázalo, atrofii semenotvorného epitelu a hyperplazii intersticiálních (Leydigových) buňěk. Několik semenotvorných tubulů obsahovalo malá koncentricky mineralizovaná tělíska (psammoma orgány). Nebyly nalezeny žádné důkazy o spermatogenezi. Byl stanoven samičí karyotyp 64,XX, nebyl doklad o chromozomu Y sekvence v DNA extrahované z pohlavní tkáně. XX pohlavní zvrat nastane, když se u jedinců s karyotypem XX vyvíjejí varlata (XX samci) nebo ovotestes (XX praví hermafroditi). Fenotypový vzhled se liší v závislosti na současné části funkční testikulární tkáně. Tento stav byl hlášen u řady druhů, včetně koní. U ponyho byl diagnostikován XX syndrom pohlavního zvratu na základě jeho normálního samičího karyotypu 24

25 (64,XX), přítomnosti dvou varlat v tříselném kanále a nejednoznačných zevních genitálií (Vaughan, Schofield, Ennis, 2000). Bowling (1996) popisuje karyotyp 64, XX, který byl objeven u dvouletého dvoustraně kryptorchidního hříběte quartera s malým dobře vyvinutým penisem a předkožkou, prsní tkání na stranách předkožky a chováním hřebce. Malá varlata měl umístěna v tříselných kanálech a hladina testosteronu (0,12 ng/ml) byla mírně nad nízkou základní hladinou hřebců (0,1 ng/ml). Bannasch et al. (2007) uvádí případ 18-měsíční klisny amerického jezdeckého koně, která byla představena na veterinární klinice Kalifornské univerzity na chirurgickou úpravu možného pseudohermafroditického stavu. Je to první hlášený případ pohlavního zvratu XX u amerického jezdeckého koně. Majitelé si všimli mimořádných zevních pohlavních orgánů a hřebčího chování. Při fyzikálním vyšetření bylo zjištěno, že proximální strany štěrbiny vulvy byly spojeny a vaginální klenba končila ve slepém váčku. Klitoris byl vyvinutý ve strukturu, podobnou penisu bez spojení s močovou trubicí. Na rektálním vyšetření nebyly hmatné vaječníky a nebyly nalezeny žádné důkazy o sestouplých varlatech. Byla provedena laparoskopická operace a neprokázala se žádná děložní tkáň nebo vaječníky. Byla však identifikována oboustranná nadvarlata, tkáň chámovodů a sledována do tříselného kanálu, kde byla vyjmuta tkáň, která vypadala jako varlata. Na histopatologickém vyšetření této tkáně byly nalezeny semenotvorné tubuly lemované Sertoliho buňkami. Nebyly zjištěny spermatogonie ani primární oocyty nebo ovariální folikuly. Struktura penisu byla odříznuta a předložena k histopatologii. Vypadalo to jako normální tkáň topořivého tělesa. Klisničce byla odebrána krev pro analýzu karyotypu a k izolaci DNA. Zvíře vykázalo karyotyp typický pro klisnu (64,XX). I přesto je možné, že přítomnost malé části chromozomu Y obsahující SRY mohla způsobit tento fenotyp. Další klinický případ uvádí Bodvarsdottir et al. (2009), jedná se o čtyřletého oboupohlavného islandského koně. Majitelé ho považovali za klisnu, ale zpozorovali typické hřebčí chování. Na vyšetření, měl kůň normálně vypadající vulvu s rozšířeným falickým klitorisem. Nebylo zde žádné spojení 25

26 ze struktury penisu do močové trubice. Během sexuální stimulace, se struktura penisu při erekci prodloužila přibližně na 8 až 9 cm v horizontálním směru. Ultrazvukové vyšetření ukázalo asymetrické bilaterální pohlavní žlázy. Normálně velký vaječník pokrytý drobnými četnými folikulárními cystami nebyl aktivní na levé straně, a na pravé straně byla zjištěna malá kompaktní tkáň, podobná tkáni varlete o velikosti přibližně 2 x1,5 cm. Děloha se zdála normální. Nebyla provedena histologická analýza na pohlavní tkáni. Na fenotypové analýze měl kůň částečně maskulinizované pohlavní žlázy a zevní pohlavní orgány. Karyotyp analyzovaný ve všech metafázích byl klisny, 64, XX. Molekulární analýza markerů chromozomu Y byla pro tuto klisnu i pro kontrolní klisny negativní, valach a hřebec byly pozitivní. Kůň může být pravý hermafrodit na základě toho, že má oba vaječníky, struktury varlete, prodloužené falické klitoris a postoj hřebce. Obrázek 8: Rozšířený klitoris čtyřletého islandského koně (Bodvarsdottir et al., 2009) 26

27 Obrázek 9: Karyotyp klisny 64,XX čtyřletého islandského koně, z kultury lymfocytů, identifikovaný technikou G-pruhování (Bodvarsdottir et al., 2009) Mozaicismus/ chimérizmus U koní byly hlášeny numerické kategorie mozaik/chimér zahrnující pohlavní chromozomy (především chromozom X). Druhou nejčastější abnormalitou, která zahrnuje pohlavní chromozom je mozaika buněk, která má normální samičí karyotyp XX s monozomií chromozomu X u stejného jedince se vyjadřuje jako 63,X/64,XX. Reprezentuje okolo 20% ze všech chromozomálních aberací u koně. Ačkoli vypadají tyto klisny genotypicky normálně, jejich klinický stav se úzce podobá klisnám 63,X. Zvířata mají normální vnější pohlavní orgány, spojené s gonadální dysgenezí (Chowdhary et Raudsepp in Genetics of the horse, 2000). Chimérizmus XX/XY celého těla byl objeven u kryptorchidního tříletého hříběte arabského křížence s oběma nesestouplými varlaty a nehmatatelnými v tříselném kanálu. Plodnost nebyla v takovém případě očekávána (Bowling, 1996). Mezi ostatními případy má význam zmínit 63,X/64,XY, protože jako u lidí, mohou být v rozsahu od normálně vypadajících samic s gonadální dysgenezí k mezipohlavní. Za zmínku stojí rozdíl mezi chimérizmem celého těla a krevní chimérou. Konstituce XX/XY u všech buněk může plynout ze splynutí samčích a samičích embryí a u koní byli hlášeni jako praví hermafrodité. Konstituce XX/XY pouze u krevních buněk jsou výsledkem různopohlavních dvojčat. Velmi neobvyklý diploidní/triploidní chimérizmus XX/96,XXY byl hlášen u hříběte plnokrevníka, při narození se přepokládalo, že je to klisna. První typ 27

28 2n/3n buněk hlášený u koně vykazoval normální obrázek karyotypu z lymfocytů. Kultura fibroblastů však ukázala chimérickou populaci přibližně 85% buněk typu 96,XXY. Klinické vyšetření klasifikovalo hříbě jako mezipohlavní. Jako roček byl popsaný jako atraktivní, zdravý a agresivní jedinec. Ojedinělý chimérizmus byl hlášen u osmileté arabské klisny, která měla problémy s plodností, a u které byla později diagnostikována gonadální dysgeneze. Kultura fibroblastů od této fyzicky normální klisny vykazovala linie buněk XX a XXX v poměru 1:3. Obrázek leukocytů zahrnoval šest různých typů buněk 63,X0/64,XX/65,XXX/65,XXY/66,XXXY/66,XXYY s převážně typy XX a XXX (Chowdhary, Raudsepp in Genetics of the horse, 2000). Bugno et al. (2008) uvádí klinický případ dvouletého samce pony, který byl podroben cytogenetické a molekulárně genetické analýze. Zvíře mělo celkově stavbu samčího těla a chovalo se jako hřebec. Mělo typický hřebčí krk, malou nefunkční předkožku a vulvu s penisem místo klitorisu ve spodní části. Byla možná erekce a kůň močil z penisu. Byla zde štěrbina zevní části samičích genitálií, ale nebyly průchodné. Malá varlata byla nalezena laparotomicky na břišní středové ose. Cytogenetické vyšetření bylo provedeno z kultury lymfocytů, za použití standardní metody. Detekce pohlavních chromozomů byla provedena pomocí fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Mikroskopické vyšetření ukázalo přítomnost tří buněčných linií 63,X/64, XX/65, XX, del (Y) (q). Obrázek 10: Vulva zahrnující malý penis (Bugno et al., 2008) 28

29 Obrázek 11: Vnější pohlavní orgány v tříselné poloze (Bugno et al., 2008) Tabulka 4: Přehled mozaicismu/chimérizmu (Chowdhary, Raudsepp in Genetics of the horse, 2000) Mozaicismus/chimérizmus 63,X0/64,XX 63,X0/65,XXX 64,XX/65,XXX 63,X0/64,XX/65,XXX 64,XX/64,XY 63,X0/64,XY 64,XX/65,XXY 63,X0/65,XYY 64,XX/65,XXX/65,XXY 63,X0/64,XX/64,XY 63,XX/64,XX/64,XY 63,X0/64,XY/65,XXY 63,X0/64,XX/65,XXY 64,XX/64,XY/65,XXY 64,XX/96,XXY 63,X0/64,XX/64,XY/65,XXY 63,X0/64,XX/65,XXX/65,XXY 63,X0/64,XX/65,XXX/65,XXY/66,XXYY/66XX XY 29

30 2.4 Metody detekce chromozomálních aberací Chromozomální aberace se zjišťují cytogenetickými metodami, především analýzou karyotypu a identifikují se je jako konkrétní tvarové nebo strukturální odchylky od normálního karyotypu (Řehout et al., 2003). Počet a strukturu chromozomů lze sledovat v dělících se buňkách na základě různých barvicích postupů a mikroskopických analýz. Cytogenetické analýzy chromozomů se provádějí nejčastěji v průběhu mitotického dělení buněk. Dříve byl proto používán materiál, který obsahoval velké množství dělících se buněk, například embrya živočichů. Rozvoj technik tkáňových kultur postupně umožnil použít i jiné typy buněk. Z periferní krve mohou být izolovány bílé krvinky, které se po oddělení od červených převedou do kultivačního média, kde je stimulováno jejich dělení. Po několika dnech kultivace je dělení buněk zastaveno v metafázi chemickými látkami, které rozrušují mitotické dělící vřeténko. Cílem je shromáždění chromozomů v mitóze, kde jsou nejlépe viditelné. Mitotické buňky se potom převedou do hypotonického roztoku, který způsobí zvětšení jeho objemu v důsledku osmózy a tím rozvolnění chromozomů. Potom se chromozomy fixují, vzorek se kápne na podložní sklíčko a chromozomy se barví jednou z cytogenetických technik. Tento postup velmi usnadňuje cytogenetické analýzy. I v případě velkého počtu chromozomů v mitózách je možná přesná identifikace jednotlivých chromozomů (Snustad, Simmons, 2009) Cytogenetické barvení V současné době se používají barvící metody, které obarví každý chromozomový pár charakteristickým způsobem (Snustad, Simmons, 2009). Ke studii chromozomů koní byla použita široká řada pruhovacích technik. Dřívější studie se soustředily v první řadě na morfologii, velikost a počet chromozomů (Chowdhary, Raudsepp in Genetics of the horse, 2000). Hlavní nevýhodou pruhovacích technik je omezené rozlišení (Langer et al., 2004) 30

31 Q-pruhování První sloučenina použitá k diferenciaci chromozomů byl chinakrin (fluorescenční barvivo). Chromozomy, které se obarví chinakrinem vykazují charakteristické uspořádání světlých příčných pruhů na tmavém pozadí. Tato metoda vyžaduje hodnocení preparátů pomocí fluorescenčního mikroskopu, který slouží jako zdroj UV záření. Takové pruhování je specifické pro každý chromozomový pár (Snustad, Simmons, 2009) G-pruhování Barvení chromozomů Giemsovým barvivem způsobuje charakteristický sled různě širokých světlých a tmavých pruhů (Snustad, Simmons, 2009). Zpracování trypsinem, a následné použití Giemsova barviva definuje oblasti s vysokou koncentrací adeninu a tyminu obsahující základní sekvence (Bowling, 1996) C-pruhování Zpracováním hydroxidem barya a barvivem giemsa se identifikuje heterochromatin, který je charakteristický pro většinu centromerických oblastí. C-pruhování je zvláště užitečné pro rozlišování pohlavních chromozomů, protože chromozom Y je pouze heterochromatin, ve srovnání s ostatními malými autozomy, od kterých může být obtížné jej odlišit podle velikosti. Chromozom X má intersticiální C-pruh na dlouhých ramenech, což jej odlišuje od podobně dimenzovaného druhého největšího autozomu R-pruhování Inkubace BrdU (5-bromo-2 -deoxyuridin) následovaná barvivem giemsa vytváří obrácené vzory pruhů ve srovnání s přehledem procesu trypsinu. Jak G- tak R-pruhování jsou užitečná pro přesnou identifikaci ztráty, získání nebo přeskupení chromozomálních segmentů (Bowling, 1996). 31

32 Ag-NOR Stříbrné zbarvení identifikuje oblasti jadérkového oganizátoru (NOR - nucleolar artificial organiser), které vytvářejí ribozomální RNA používanou v přenosu genetického kódu do proteinů (Bowling, 1996). Ag-NOR barvení ukazuje rozdíly ve velikosti a četnosti stříbrných nánosů na NOR u mnoha organismů včetně koní (Slota et al., 2007) Genové mapování Mapování syntenií Základní metodou pro vytvoření map syntenií, je pomocí konstrukce somatického hybridního panelu buňky (SCH somatic cell hybrid) slučováním linií buněk dvou druhů, z nichž jeden je druh, ve kterém je nutno vytvořit mapu. Hlavní metody pro analyzování SCH panelu je elektroforéza enzymů, Southernův přenos a amplifikace polymerázové řetězové reakce (PCR - polymerase chain reaction) se základy specifickými pro druhy. Přesnost mapování syntenií závisí na tom, jak dobře jsou cytogeneticky charakterizovány hybridní klony, jakož i pomocí mapování dostatečného počtu znaků. Jakmile jsou segmenty chromozomů charakterizovány přesně, je možno určit znaky dokonce u segmentů (pruhů) jednotlivých chromozomů. Hlavní nevýhodou této metody je však, že ukazuje syntenii, ale ne pořadí genů nebo vzdálenosti mezi lokusy. Přes výrazný pokrok neumožňuje dostupná mapa syntenie u koní adekvátní srovnávací analýzu s genomy/chromozomy ostatních druhů, protože počet mapovaných znaků typu I je velmi nízký (Chowdhary, Raudsepp in Genetics of the horse, 2000). První skupina syntenií koně může být sledována zpět do nepřímé analýzy uskutečněné v SCH panelu muly-myši. Tři geny byly přiděleny na chromozóm X. Potom byly postaveny další čtyři SCH panely. Bylo zajímavé, že ve všech panelech, byly přednostně ztraceny velké submetacentrické chromozómy. Z volných RH panelů koní, byl dosud charakterizován jen jeden metodou FISH s koňskou genomikou DNA. Do roku 1995 bylo stanoveno jen devět skupin syntenií koně pomocí enzymatické analýzy lyzáty nebo PCR. V 32

33 průběhu dalších let se stal hlavním přispívajícím syntenií map koní panel, vytvořený na UC Davis. S okolo 450 markery analyzovanými na tomto panelu, byl centrálním zdrojem při zařazování syntenií skupin (včetně genů a mikrosatelitů jednotlivých autosomů a pohlavních chromozomů koní). Zdroj také významně přispěl k rozvoji srovnávací mapy člověka a koně. Stejně jako u ostatních druhů, je zřejmě možné využití tohoto zdroje v budoucnu omezené. Částečně je to přičítáno dostupnosti jiných, rychlejších přístupů mapování, ale na druhou stranu je přičítána vyčerpávání DNA rezervy z původního panelu (Chowdhary, Raudsepp in Mammalian Genomics, 2005) Radiační hybridní mapování Radiační hybridní mapování je v podstatě technika SCH s rozdílem, že před spojením linií buněk je celý nebo částečný genom druhů, které nás zajímají, vystaven vysoké dávce rentgenového záření, která způsobuje rozdělení chromozomů. Radiační hybridní mapování ukazuje nejen syntenii mezi místy, ale také pomáhá analyzovat fyzickou vzdálenost mezi nimi. Čím dále od sebe jsou na chromozomu dva znaky, tím větší jsou šance, že budou odděleny působením rentgenového záření a naopak (Chowdhary, Raudsepp in Genetics of the horse, 2000). Dva RH (radiation hybrid radiační hybridní) panely (kůň-křeček) byly provedeny u koně: 3000 rad a 5000 rad panel rad panel zahrnující 92 hybridních buněčných linií, byl použitý jako první k získání komplexní RH a srovnávací mapy pro ECA11 a ECAX a poslední dobou se rozvíjí první generace RH a srovnávacích map genomu koní. Tato mapa obsahuje celkem 730 znaků (258 typ I a 472 typ II). Na této mapě u koně, který zahrnuje typ I a typ II markerů, integruje syntenii, cytogenetické a meiotické mapy do shody a poskytuje nejdetailnější šíři informatiky genomu do dnes na srovnávací organizaci genomu koní ke vztahu k lidem. Tato mapa poskytuje jedno z nejlepších pokrytí markerů pro některý z autozomů koní. Větší zájem je o nedávný vývoj genových map pro pohlavní chromozomy u koně. RH mapování hraje klíčovou roli při rychlém rozvoji genových map koně (Chowdhary, Raudsepp in Mammalian Genomics, 2005). 33

34 Hybridizace in situ Hybridizace in situ je technika, která se využívá v několika odvětvích biologie. Tato technika dovoluje přímou vizualizaci lokalizace určitých genů nebo neznámých DNA segmentů chromozomů. Existují dvě hlavní součástí hybridizace in situ, tj. chromozomy, které jsou cíli a sondami, které jsou segmenty DNA různé délky. Obvykle je cílem metafáze nebo prometafáze chromozomů, ale v případech, kde je vedeno fyzikální mapování s velkým rozlišením, vlákno chromatinu může být buď z buněk v interfázi nebo z mechanicky natažené buněčné DNA. Sondy značně mění velikost, stejně jako původ. Velikost může být v rozsahu od několika párů bazí (bp) do několika set kilobazí (kb). V závislosti na typu in situ hybridizace může být sonda DNA označena radioaktivně nebo neradioaktivně (Chowdhary, Raudsepp in Genetics of the horse, 2000) Fluorescenční in situ hybridizace (FISH fluorescent in situ hybridization ) V současné době roste diagnostický význam této molekulárně cytogenetické metody. Jde o hybridizaci DNA přímo v preparovaných buňkách. Sonda DNA je značena fluorescenčním barvivem a její vazbu tak lze prokázat fluorescenčním mikroskopem. Umožňuje diagnostikovat i velmi drobné chromozomální aberace (Rosypal et al., 2003). Během posledních deseti let se FISH stala důležitým doplňujícím prostředkem genetické diagnostiky. Použitím proměnné FISH techniky zvyšující důkladnou interpretaci numerických a komplexních chromozomálních aberací, se překonává propast mezi konvenční pruhovací analýzou chromozomů a molekulárně genetickými studiemi DNA (Tönnies, 2002) Třídění proudu chromozomů Tato technika odděluje samostatné chromozomy daných druhů s použitím fluorescenčně aktivovaného třídícího systému buněk (FACS fluorescence-activated cell sorting system). Protože předvedená fluorescence chromozomu je proporcionální k obsahu DNA a oblastem bohatým na AT/GC, 34

35 je možno oddělovat samostatné chromozomy. Postup má za následek generaci proudu karyotypu rozlišující každý chromozom. Jednou oddělená a shromážděná DNA ze samostatných chromozomů může být buď přímo zvětšená, nebo použitá pro vytvoření knihovny. V obou případech je celá chromozomálně specifická DNA přístupná jako kombinovaná sonda pro aplikace FISH u klinické cytogenetiky, srovnávacího malování, klonování a mapování genů. U koní je tato technika zřídka používána. Jediná dostupná zpráva se týká izolace chromozomu X pomocí třídění bivariatního chromozomu pro generování x-specifické sondy pruhování (Chowdhary, Raudsepp in Genetics of the horse, 2000) Mikrodisekce Malovací sondy specifické pro chromozomy mohou být také úspěšně generovány s použitím procesu označovaného jako mikrodisekce. Mikrodisekce se vyvinula v jeden z nejpřímějších prostředků pro izolování DNA z některé chromozomální oblasti organizmu. V současné době mohou být rychle mikrodesekovány celé chromozomy, větve, oblasti nebo dokonce jednotlivý pruh dosahující od 5 do 100 Mb a DNA může být zesílena pro různé účely. U lidí našla chromozomální mikrodisekce široký rozsah použití. Jako srovnání s tímto, našla chromozomální mikrodisekce dosud velmi omezené využití v koňské genomové analýze. V poslední době byla pomocí mikrodisekce generována chromozomově specifická malování pro všechny metacentrické a submetacentrické autozomy a pohlavní chromozomy. Tyto složené sondy byly potom použity pro malování chromozomu napříč druhy. Přestože je aplikace mikrodisekce pro genomovou analýzu koní ve velmi rané fázi, očekává se, že tato iniciativa je velmi užitečným nástrojem pro systematický vývoj koňské genomové mapy. To je zejména správné pro tyto chromozomy, ke kterým nebyly přiřazeny žádné znaky nebo velmi málo znaků 35