MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2010 NELA DAŇKOVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Způsoby archivace DNA a jejich využití Bakalářská práce Vedoucí práce: prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Vypracovala: Nela Daňková Brno 2010

3

4 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Způsoby archivace DNA a jejich využití vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. Dne. podpis.

5 PODĚKOVÁNÍ Děkuji vedoucímu bakalářské práce prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D., za podnětnou pedagogickou a odbornou pomoc a další cenné rady při zpracování mé bakalářské práce. Chtěla bych také poděkovat PhDr. Aleně Daňkové za pomoc s jazykovými úpravami.

6 Abstrakt V práci na téma Způsoby archivace DNA a jejich využití jsou popsány jednotlivé metody archivace DNA z hlediska teplot (+4,-20,-80, -196 C, pokojová teplota), rovněž formy vzorku, ve kterých lze DNA uchovávat (roztok, vysušený stav). Je vysvětlena kvalita DNA, jednotlivé způsoby, kterými může být negativně ovlivněna, a to během procesu archivace i izolace. Dále metody UV-absorpční spektrometrie, gelové elektroforézy, polymerázové řetězové reakce (PCR) i PCR v reálném čase (Real-Time PCR), kterými lze kvalitu DNA stanovit. Práce zahrnuje i opodstatnění nutnosti archivace v různých odvětvích a problémy spojené s jejím provedením. Na závěr jsou diskutovány výhody a nevýhody jednotlivých metod archivace. Klíčová slova: DNA, archivace, kvalita DNA, degradace, izolace Abstract The thesis entitled The technique of archiving DNA and its utilization describes various methods of archiving DNA in terms of temperature (+4, -20, -80, -196 C, room temperature), as well as sample forms, which can store DNA (solution, anhydrous basis). The quality of DNA is explained, as well as different ways, in which it may be adversely affected, namely during the process of archiving, and isolation. Furthermore, it deals with methods of UV-absorption spectrometry, gel electrophoresis, polymerase chain reaction (PCR) i Real-Time PCR, which can determine the quality of DNA. This work also includes the foundation of necessity of archiving in different sectors, and problems associated with its implementation. In conclusion, the advantages and disadvantages of different methods of archiving are being discussed. Keywords: DNA, archiving, quality of DNA, degradation, isolation

7 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE STRUKTURA DNA POTŘEBY ARCHIVACE DNA KVALITA DNA PARAMETRY KVALITY DNA Nízký stupeň degradace deoxyribonukleové kyseliny Kontaminace FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ KVALITU DNA Teplota ph Iontová síla Ultrafialové záření Ionizující záření Mechanické síly Ultrazvuk Nukleázy SOUVISLOST MEZI IZOLACÍ A KVALITOU DNA Odběr biologického materiálu, ze kterého má být DNA izolována Lyze buněčných obalů a membrán Oddělení kontaminujících látek Zakoncentrování DNA ARCHIVACE DNA ZPŮSOBY UCHOVÁVÁNÍ DNA Rozdělení dle teploty Rozdělení dle formy vzorku Rozpuštěný ve vodném roztoku Rozpuštěný v pufru Ve formě vysušeného peletu Ve formě precipitátu v 70% EtOH Navázaný na pevný nosič... 38

8 10.3 Rozdělení dle časového hlediska Krátkodobá archivace Dlouhodobá archivace Archivace DNA za pokojové teploty Chitosan FTA papír SampleMatrix technologie SOUVISLOST MEZI IZOLACÍ A ARCHIVACÍ DNA METODY URČENÍ KVALITY DNA UV absorpční spektrometrie Elektroforéza Polymerázová řetězová reakce (PCR) a Real-Time PCR ZHODNOCENÍ JEDNOTLIVÝCH ZPŮSOBŮ ARCHIVACE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 60

9 1 ÚVOD Tak jako je třeba uchovávat jakékoli informace, které zjistíme či objevíme v různých odvětvích vědy, proto, abychom se k nim mohli vrátit, opětovně je použít či na jejich základě uskutečnit další výzkum, je nutné, aby se toto dalo provést i v rámci metod molekulární genetiky, a to při výzkumu kyseliny deoxyribonukleové. S nezadržitelným rozvojem oborů jako molekulární biologie, genetika, buněčná biologie, biochemie a ostatních, které se zabývají studiem této životadárné kyseliny, se stejným tempem rozvíjí i techniky a možné manipulace s touto kyselinou. Jednou z nich je právě i archivace neboli uchovávání DNA. Protože jsou v molekulách DNA uchovány prostřednictvím kódu všechny dědičné vlastnosti organismu, detaily metabolických přeměn, struktury bílkovin, enzymů a morfologické zvláštnosti organismu, je DNA předmětem zásadního výzkumu. Pro výzkum DNA je, aniž by se to na první pohled mohlo zdát, velmi důležité i takové uchovávání vzorků kyseliny deoxyribonukleové, které zajistí bezpečné uskladnění vzorků DNA po dlouhou dobu, a tím i možnost tyto vzorky kdykoli znovu pro výzkum použít. Je nutno uvědomit si, že pokud je z biologického materiálu získána sebevíc kvalitní DNA a je archivována takovým způsobem, kdy podmínky skladování nezajistí dostatečné zachování její kvality, je DNA znehodnocena a nemůže být použita pro další analýzy a důsledkem toho dochází ke ztrátě veškeré genetické informace, která je v ní zakódována, což může mít velký dopad, například měl-li být vzorek využit pro lékařský výzkum nebo měl-li být uložen v genetické bance pro potřeby zachování druhu. Důsledek ztráty vzorku znehodnocením je o to fatálnější, jestliže k tomuto dojde u vzácných vzorků nebo v nejhorším případě, nejde-li znehodnocený vzorek DNA nahradit vzorkem novým. Je tedy zřejmé, že je velmi důležité a potřebné zabývat se archivací DNA a hledat co nejvýhodnější způsoby jejího provedení. 9

10 2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce, která je založena na literární rešerši, je jednoznačně popsat a shrnout problematiku archivace DNA, a podat tak v českém jazyce ucelený výklad na toto téma. Vysvětlit důvody, proč se archivace DNA provádí, jak to zasahuje do různých oblastí vědy. Na základě prostudované odborné literatury sjednotit a popsat jednotlivé metody uchovávání, které existují a jsou běžně využívány, jejich principy, odlišnosti. Také objasnit souvislost mezi procesem izolace, archivace a kvalitou kyseliny deoxyribonukleové, kdy jedno s druhým úzce souvisí a dále výrazně ovlivňuje veškeré další studie DNA a na základě toho i závěry a výsledky výzkumem dokázané. V práci budou také diskutovány přínosy a omezení jednotlivých způsobů uchovávání z hlediska zajištění kvality DNA během procesu archivace a rovněž komplexně, tedy z hlediska ostatních aspektů, které s archivací souvisí. 3 STRUKTURA DNA Deoxyribonukleová kyselina, zkráceným názvem DNA, je právě tím činitelem, který umožňuje uchování i přenos genetické informace. Patří spolu s ribonukleovou kyselinou mezi nukleové kyseliny, sám název odvozený od slova nucleus jádro ukazuje, že tvoří důležité složky buněčného jádra. U eukaryotních organismů DNA spolu s proteiny tvoří v jádře buněčné struktury chromozomy, dále ji nalezneme i mimo jádro v buněčných organelách mitochondriích a u rostlin také v chloroplastech. U prokaryotních organismů se DNA vyskytuje ve formě nukleoidu. Obě nukleové kyseliny jsou lineární polymery složené z jednotlivých článků, které obsahují kyselinu fosforečnou, a to jednu molekulu na jeden článek řetězce, deoxyribosu v DNA a ribosu v RNA, obdobně 1 molekulu pentosy na jeden článek řetězce a jako boční části řetězce heterocyklické dusíkaté báze. Tyto báze jsou purinové adenin (A), guanin (G) a pyrimidinové cytosin (C), tymin (T) (Bresler, 1979). 10

11 4 POTŘEBY ARCHIVACE DNA Abychom mohli DNA uchovávat, nejprve ji vůbec musíme nějak dostat z buněk organismu. Předpokladem archivace je tedy získání DNA z požadovaného materiálu, což se provádí izolací, která bude osvětlena v dalších kapitolách. Nebo DNA nemusí být přímo extrahovaná a lze uchovávat jednotlivé části tkání, pletiva, krev a jiné vzorky, které molekuly DNA obsahují. Kyselina deoxyribonukleová se uchovává pro mnoho různých účelů. V současné době je archivace DNA vysoce potřebná a uložené vzorky jsou využívány v mnoha oblastech, jako jsou molekulární biologie, lékařská diagnostika, populační genetika, forenzní analýzy, biotechnologie a zasahuje v podstatě do veškerého výzkumu, který má co do činění s kyselinou deoxyribonukleovou. Nejčastější důvody požadavku archivace jsou: uchování vzorků DNA v laboratoři pro potřeby dalšího výzkumu Po tom, co je DNA z biologického materiálu získána a nelze ji bezprostředně poté analyzovat, či byla-li analýze podrobena a do budoucna bude ještě tento vzorek pro jiné analýzy potřebný či po analýze čeká například na zaslání do jiného výzkumného ústavu, nelze jej jednoduše nechat bez jakéhokoli zaopatření a je třeba jej vybranou vhodnou metodou archivovat, aby byla zachována jeho kvalita, a byl tak pro všechny analýzy efektivně využitelný. zajištění referenčního vzorku pro identifikaci osob Pomáhá při hledání a identifikaci pohřešovaných osob v případě neštěstí nebo přírodní katastrofy. Důležité je to zejména pro osoby, které vykonávají vysoce nebezpečná zaměstnání - armáda, policie, bezpečnostní agentury, hasiči, váleční zpravodajové, vymahači práva apod. (Genomac, online). Molekulární kriminalistika, která se zabývá vyšetřováním trestných činů na základě využívání molekulárně-biologických metod, provádí identifikaci osob na základě analýzy DNA z odebraných biologických vzorků, jimiž může být vzorek krve, výtěr z bukální sliznice, vlasy a jiné. Vzorek DNA se poté uchovává a může sloužit jako referenční vzorek, tedy jako vzor či předloha pro srovnání s jinými vzorky, to dopomáhá k určení totožnosti pachatelů či obětí trestných činů (Kočárek, 11

12 2007). Analýza nemusí proběhnout bezprostředně po činu, na základě analýzy archivovaného odebraného materiálu byla během posledních několika let uzavřena řada starých případů a pachatel postaven před soud (Brown, 2007). Každý člověk je jedinečný, a to nejen svým fenotypovým projevem, ale hlavně svojí genetickou výbavou (Brdička, 2001). Proto metody zjišťování profilu DNA vycházejí z toho, že s výjimkou jednovaječných dvojčat nejsou kopie genomu dvou různých jedinců identické (Brown, 2007). zajištění referenčních vzorků od jednotlivých členů rodiny Toto je vhodné pro možnou identifikaci dědičných onemocnění v rodině, archivaci rodokmenu (Genomac, online). Jedinec nemusí mít výhradně stejný zdravotní stav jako jeho rodiče nebo jiní biologičtí příbuzní, ale analýza DNA někoho z příbuzných může umožnit nalézt geny zodpovědné za nemoc v rodině. Jestliže je známo, jaké genetické rozdíly se v rodině nacházejí, jedinec a jeho potomci se na základě genetického testování mohou dozvědět o svém vlastním riziku vzniku onemocnění. Poté je získání informace o této skutečnosti výhodné pro různá preventivní opatření a léčbu. Na základě poznatků analýzy DNA se také sestavují rodokmeny. DNA je kromě papírových záznamů a dokumentů důležitým nástrojem pro genealogy, kteří hledají stopy po našich předcích. Archivace DNA tak může přinést důležité informace, které mohou do budoucna doplnit původní poznatky či vytvářet poznatky nové (DNA Direct, online). uchovávání referenčních vzorků v rámci populačně genetických nebo epidemiologických studií (Genomac, online). uchovávání DNA rostlin Je důležité v rámci zachování geneticky cenných materiálů a tím genetické diverzity, aby se zamezilo vyhynutí rostlinných druhů a zachovala se možnost jejich využívání. V tomto případě nejde o uchovávání izolovaných vzorků DNA, ale o uchovávání vegetativních částí rostlin či semen s cílem zachovat jejich genetickou rozmanitost. Pro zachování úplné původní genetické informace, by neměl být objektem 12

13 archivace pyl a buněčné organely, používají se tedy semena, části živých rostlin, z nichž lze původní genotyp regenerovat (hlízy, oddenky, pupeny aj.) a rostlinné explantáty (Dotlačil a kol., 2005). To má vést k zachování genetických zdrojů a také k možnosti efektivně a setrvale je využívat ve šlechtění a v biotechnologiích, což má význam pro zemědělskou výrobu, kdy je tak zachována její stabilita a snížena závislost na agrochemikáliích a energiích (Bednář, Vyhnánek, 2004). archivace DNA chovných zvířat Využívá se pro možnou identifikaci, detekci dědičných chorob, kdy se určují onemocnění, vady nebo náchylnost k nim, a ve šlechtitelské praxi pro potřeby křížení (Genomac, online). V dnešní době se DNA archivuje pro potřeby výzkumných i zdravotnických institucí, ale i pro účely jednotlivců, kdy tyto nadstandardní služby provádí komerční laboratoře za nemalou finanční částku. Také v rámci zachování druhů, jako projekt Zmrazená Archa, kdy je potřeba uložit genetický materiál ohrožených druhů a zabránit tak jejich vyhynutí (Clarke, 2009). S archivací DNA, kdy jde o uchovávání vzorků pro lékařské výzkumy či v rámci zmíněných komerčních laboratoří, je spojená problematika ochrany osobních údajů. Při odběru vzorků, analýze a následné archivaci DNA musí být dodrženy právnické a etické náležitosti. Každá laboratoř by si měla vést svoji interní kartotéku, která poskytuje přehled o jednotlivých zpracovaných a uložených vzorcích DNA. Měla by obsahovat především jména pacientů, jejich rodná čísla, údaje o diagnózách a data odběrů biologického materiálu (Kočárek, 2007). 13

14 5 KVALITA DNA Kyselina deoxyribonukleová je poměrně stabilní molekula (Bresler, 1979), i přesto však podléhá různým poškozením, která vznikají v důsledku působení mnoha faktorů. Na stabilitu DNA má vliv mnoho chemických a fyzikálních činitelů (Guschlbauer, 1980). Strukturu DNA v podstatě stabilizují tři druhy sil. A to tyto: vodíkové vazby Vodíkové vazby mají povahu slabých chemických interakcí. Mají význam při určování vzájemného sousedství molekul a také při formování tvaru. Pokud jsou přítomny jednotlivě, nejsou dostatečně silné, aby udržely dva atomy pohromadě (Watson, 1982). Vodíkové vazby se nachází mezi komplementárními bázemi. Jejich prostřednictvím se báze specificky párují, nejsou však hlavními silami, které DNA stabilizují. vrstvící síly Struktura DNA se stabilizuje vrstvícími (hydrofobními) silami, které jsou způsobené vzájemnou interakcí π-elektronů aromatických bází. Interakcí tohoto typu vzniká v polynukleotidovém řetězci dost pevné charakteristické vrstvení bází. iontové vazby Důležitost iontových vazeb mezi negativními fosfátovými skupinami je v tom, že redukují elektrostatické odpuzování mezi negativními náboji cukr-fosfátové kostry polynukleotidů. Pokud chybí ionty s opačnou polaritou, dvoušroubovice DNA přechází do denaturovaného stavu (Guschlbauer, 1980). Počátečním krokem pro molekulárně biologické či genetické analýzy a jakýkoli výzkum v této oblasti je izolace genetického materiálu. A tím je deoxyribonukleová kyselina (DNA) a ribonukleová kyselina (RNA). Po vyizolování tohoto genetického materiálu z buňky žádné ochranné reparační mechanismy, které automaticky působí v organismu a které by alespoň částečně zabránily poškození DNA, nefungují. Získaná extrahovaná DNA tedy může být ještě 14

15 fatálněji znehodnocována přímým vlivem vnějších okolních podmínek. To je však pro následující práci s vyizolovanou deoxyribonukleovou kyselinou vysoce nežádoucí, protože je potřebná kvalitní DNA. Principů izolace a jejich modifikací je velmi mnoho. Použitý způsob záleží na charakteru zdroje, z něhož má být DNA nebo RNA izolována (tkáň, pletivo, semena, krev aj.), a zejména závisí na požadované čistotě a kvalitě nukleové kyseliny pro konkrétní účely (Hruban a kol., 1999). Požaduje se, aby při izolačních metodách byla získána nukleová kyselina v nativním stavu, dostatečném množství a kvalitě. Kvalita izolovaného materiálu často rozhoduje o úspěšnosti navazujících postupů (Šmarda a kol., 2005). Kvalitou purifikovaných nukleových kyselin je myšlena absence kontaminantů a nízký stupeň degradace (nalámání). Pro různé metody molekulární biologie je požadována rozdílná kvalita purifikované nukleové kyseliny (Hanáček, 2009). 6 PARAMETRY KVALITY DNA 6.1 Nízký stupeň degradace deoxyribonukleové kyseliny Degradací se myslí rozpad DNA na menší fragmenty (Kočárek, 2007). Při tomto lámání dochází k přerušení fosfodiesterové vazby mezi sousedními nukleotidy v dlouhých polynukleotidových řetězcích (Rosypal a kol., 1983). DNA se poté láme na menší fragmenty, což zapříčiňuje snížení její kvality. K tomuto nežádoucímu procesu může dojít například působením chemických či fyzikálních vlivů nebo enzymů, ale i mechanickými silami. V důsledku degradace tak dochází k přetváření struktury, kdy molekula DNA podléhá depolymeraci a rozpadá se na různě dlouhé úseky. Změny struktury deoxyribonukleové kyseliny se tedy projeví rozpadem dlouhých molekul DNA na menší fragmenty. Při postupu izolace DNA je nutné přidat chtelatační činidlo, za jeho nepřítomnosti se totiž zvyšuje stupeň fragmentace (Karyagina a kol., 1976). Tímto způsobem může být vzorek DNA natolik znehodnocen, že jeho kvalita už nebude dostačující pro využití v následujících technikách a analýzách. 15

16 Vysoký stupeň degradace DNA snižuje počet molekul DNA, které jsou použitelné pro PCR a schopné úspěšné amplifikace. Tato technika je velmi rozšířená a v dnešní době hojně používaná pro analýzy DNA, a proto je využití fragmentované DNA pro takové aplikace omezeno. Vyšší fragmentace DNA je více pravděpodobná při narušení požadovaného úseku, který má být namnožen, a tím eliminuje jeho dostupnost pro amplifikaci PCR. To má také dopad na cílenou délku amplikonu. Když jsou požadovány dlouhé amplikony, je o to více pravděpodobné, že dojde ke zlomu v řetězci, a tím méně molekul je k dispozici pro amplifikaci. Jsou-li pro amplifikaci požadovány kratší cílové úseky, je výskyt zlomů méně pravděpodobný, a proto mají větší šanci být úspěšně namnoženy. Proto krátké amplikony a nízká fragmentace zvyšují šanci pro úspěšné provedení amplifikace (Ehrich a kol., 2007). Doty a kol. (1959) uvádí, že vlivem ultrazvuku nebo hydrodynamických polí může být molekula DNA rozlámána na kousky, aniž by došlo k porušení Watsonovy a Crickovy dvojité šroubovice Pro makromolekuly DNA o určité délce řetězce existuje takový kritický gradient rychlosti toku, při kterém začíná fragmentace. I při velmi malých rychlostech, např. při vyfukování proudu roztoku DNA z pipety, je DNA o značné molární hmotě podrobena fragmentaci. Aby byla DNA před fragmentací chráněna, je třeba se vyvarovat jakéhokoliv hydrodynamického gradientu (Bresler, 1979). 6.2 Kontaminace Kvalitu DNA a tím i její použitelnost pro navazující postupy, a v důsledku toho i preciznost získaných výsledků, velmi ovlivňuje také výskyt kontaminantů. Kvalitní DNA z hlediska obsahu kontaminantů je taková DNA získaná z buněčného materiálu, která je zbavená všech ostatních složek, které nejsou součástí kyseliny deoxyribonukleové. Vzorek DNA může obsahovat přirozeně se nacházející složky, které jsou jinak součástí molekul DNA v buňce, ostatní buněčné komponenty, proteiny, RNA a jiné nečistoty. Všechny tyto kontaminanty jsou odstraněny postupem izolace. Purifikovaná DNA však může velmi snadno podlehnout kontaminaci způsobené všudypřítomnými nečistotami, které se mohou nacházet na pracovních nástrojích, v okolní atmosféře či na samotném laboratorním personálu. 16

17 Proto, abychom získali kvalitní vzorek DNA, který bude dále analyzován nebo bude archivován, je třeba, aby se při postupu izolace dodržovaly všeobecně platné zásady. Pro zajištění toho, aby byl vzorek co nejméně znehodnocen degradací, je nutné jej velmi šetrně zpracovávat. Také je důležité použít všechny dostupné prostředky, které zajistí očištění od různých příměsí a znečištěnin, a zabrání tak kontaminaci. I přesto, že se pro získání kvalitní DNA z rozdílných druhů biologických vzorků využívají specifické postupy, dodržují se zásady, které jsou pro všechny případy shodné. Mezi základní předpoklady k získávání kvalitní DNA patří (Bednář a kol., 1999): volba správné iontové koncentrace extrakčních a purifikačních roztoků vhodné ph prostředí co největší snížení aktivity enzymů degradujících DNA Předpokladem pro to, aby mohla být DNA efektivně analyzována či archivována, neberou-li se nyní v potaz vlivy, které na vzorek působí následovně, je právě její dostatečná kvalita, která se zajistí vhodným a pečlivým procesem izolace. 7 FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ KVALITU DNA Existuje spousta činitelů, kteří mají vliv na stabilitu DNA (Guschlbauer, 1980). Působením těchto faktorů může docházet k degradaci kyseliny deoxyribonukleové. Je znehodnocována její struktura a tím je negativně ovlivněna její kvalita. Nejčastější faktory, které mohou způsobit znehodnocení nukleových kyselin, jsou teplota, ph, ionizující a neionizující záření, iontová síla roztoku a další. Významnou roli v posuzování kvality DNA hraje i faktor času. Také přítomnost iontů kovů jako Mg 2+ a Ca 2+ ve vzorku DNA je nežádoucí. Ionty aktivují funkci enzymů (nukleáz), které taktéž způsobují znehodnocení kyseliny deoxyribonukleové. 7.1 Teplota Nativní DNA účinkem tepla, ale i louhu nebo kyseliny, mění nejen svoje optické, ale i hydrodynamické vlastnosti (Guschlbauer, 1980). 17

18 Uspořádané seskupení vodíkových vazeb se stává méně stabilní, jestliže se jejich teplota zvyšuje nad fysiologickou teplotu. Je-li roztržen významný počet vazeb, ztrácí molekula svůj původní tvar a zaujímá inaktivní (denaturovanou) konfiguraci (Watson, 1982). Vlivem zvýšené teploty dochází v molekulách DNA k výrazným změnám. Je obecně známo, že jestliže zahříváme DNA na teplotu 80 C, probíhá prudké tání pravidelné dvoušroubovicovité struktury a DNA denaturuje (Bresler, 1979). Během denaturace DNA dochází k přechodu dvoušroubovicových molekul DNA ve volné polynukleotidové řetězce. Tento jev je způsoben uvolněním vodíkových vazeb mezi bázemi komplementárních řetězců (Rosypal a kol., 1983). Nukleotidové složení DNA se podél řetězce značně mění a při zahřívání takových polymerů nebude tání probíhat současně po celé délce řetězce, ale zpočátku budou tát oblasti bohaté na AT páry (Bresler, 1979). Proces denaturace začíná už při teplotě nad 50 C, úplná je ale až při teplotě 95 C nebo vyšší. (Hanáček, 2009). Teplota, při níž zdenaturovalo 50 % dvoušroubovicových molekul DNA, se označuje jako teplota tání a vyjadřuje se zkratkou Tm (Rosypal, 2005) (Obr.1). Obr. 1: Průběh denaturace DNA za standardních podmínek (Kočárek, 2007) 18

19 Tm závisí na : zastoupení GC-párů ph iontové síle složení roztoku Čím více CG-párů DNA obsahuje, tím vyšší teploty je zapotřebí k její denaturaci. Při pomalém vyhřívání roztoku DNA je dvoušroubovicová konformace v určitém rozmezí teplot ještě stabilní. V následujícím teplotním intervalu se na molekulách objevují a postupně zvětšují denaturované úseky. Významné je, že při ph 13 dochází k disociaci řetězců dvojřetězcové molekuly DNA již při pokojové teplotě. Přidáním některých organických látek, např. formamidu, lze teplotu Tm snížit (Rosypal a kol., 1983). Denaturaci lze vyvolat jak dostatečným zvýšením teploty, tak i působením jiných vlivů, např. navozením alkalických podmínek (Rosypal, 2005). Při působení vysokých teplot také dochází k porušení glykozidových vazeb mezi purinovou bází a cukrem, čímž dochází k depurgaci, nebo mezi pyrimidinovou bází a cukrem, kdy se jedná o depyrimidinaci. Fosfoglycidová páteř v obou případech zůstává zachována (Rosypal, 2001). 7.2 ph V kyselém i zásaditém prostředí dochází k porušení dvoušroubovicové struktury DNA (Obr.2). V kyselé oblasti jsou změny struktury způsobeny vazbou protonů na aminoskupiny adeninu, guaninu a cytosinu. Obyčejně při tom dochází k uvolnění vodíkových můstků a k denaturaci šroubovicové struktury DNA. Příčinou nestálosti šroubovicové struktury v zásaditém prostředí je zřejmě kyselá disociace OH skupin, které se vytvářejí u guaninu a thyminu (Bresler, 1979). Působením silných kyselin rovněž dochází k porušení glykozidových vazeb a molekula DNA je měněna depurinací či depyrimidinací (Rosypal, 2001). 19

20 Obr. 2: Tání sekundární struktury DNA při extrémních hodnotách ph (Bresler, 1979, upraveno) 7.3 Iontová síla Čím vyšší je koncentrace anorganických iontů, tedy iontová síla roztoku, tím více je dvojřetězcová DNA stabilizována. Naopak snížení iontové síly prostředí povede k destabilizaci dvojřetězcové molekuly. (Kočárek, 2007) 7.4 Ultrafialové záření Polynukleotidy světlo pohlcují v důsledku konjugovaných dvojných vazeb (elektronových párů) v heterocyklech bází (Bresler, 1979). A díky nim má každá molekula své absorpční spektrum s maximy při určitých vlnových délkách, takže energie fotonů, které mají různé vlnové délky, je různě intenzivně absorbována (Rosypal a kol., 1983). Účinky ultrafialového záření mají na molekulu DNA negativní vliv. UV záření je DNA selektivně absorbováno. Kyselina deoxyribonukelová absorbuje především UV-B a UV-C záření. Excitace DNA vede k vytvoření fotoproduktů, z nichž nejvýznamnější jsou pyrimidinové dimery. Bezprostředně po expozici je výskyt zlomů v řetězci DNA velmi nízký, ale mohou se poté vytvářet nepřímo pozdější inkubací. 20

21 Nejdůležitějším přírodním zdrojem UV záření je slunce, které vyzařuje UV záření v celém rozsahu. Ozonová vrstva absorbuje většinu UV-C záření, takže větším problémem se zdá být jen UV-B a UV-A záření (Obe, Vijayalaxmi, 2007). Působením ultrafialového záření na DNA vznikají v prostředí buňky dimery, které mají mutagenní účinek. Buňka má však specifické enzymy, které vyštěpují vzniklé tyminové dimery, a tím poškozenou DNA částečně reparují (Guschlbauer, 1980). Kejnovský, Kypr (1993) dospěli ke zjištění, že pufr Tris chrání strukturu řetězce DNA před zlomy, ke kterým dochází působením ozáření ultrafialovým světlem. Ve své práci dokázali, že molekuly pufru Tris chrání DNA před vytvářením zlomů po ozáření ultrafialovým světlem. Tento ochranný účinek se však týká pouze kostry DNA, a ne bází. Jejich pokus byl prováděn v prostředí vodného roztoku, a ne ve formamidu. Změny ph nebo iontové síly způsobené Tris pufrem nemají na ochranu DNA žádný vliv. 7.5 Ionizující záření Po ozáření složité organické sloučeniny, jako je DNA. může důsledkem ionizace atomů docházet k chemickým reakcím a změnám. Ionizované atomy se uvolňují z chemických vazeb, dochází k disociaci molekul a vznikají vysoce reaktivní radikály, které dále chemicky reagují s molekulami látky (Klemš, 2009). Jak je již dlouho známo, molekulu deoxyribonukleové kyseliny mohou měnit elektrony, které mají dostatek energie k ionizaci nebo elektronové excitaci DNA. Působením ionizujícího záření na DNA dochází v řetězci DNA k vytváření zlomů. Avšak nedávno bylo zjištěno, že poškození DNA mohou způsobit také elektrony o ještě nižší energii (1 ev a méně) (Berdys a kol., 2004). Poškození DNA v prostředí in vivo je způsobeno hlavně oxidací volnými radikály, kvůli přítomnosti reaktivních kyslíkových forem, jako je superoxid a hydroxylové radikály. Působením ionizujícího záření ve vodném prostředí se vytváří hydratované elektrony a další reaktivní elementy, většina poškození DNA ve vodném roztoku je však zapříčiněna působením hydroxylových radikálů. Oxidace volnými radikály způsobuje chemickou degradaci ve vodném roztoku. Poškození vzniklé oxidací je ještě výrazně zvýšeno přítomností stopových kovů (např. Fe 3+, Cu 2+ ) (Middaugh a kol., 1998). 21

22 7.6 Mechanické síly Kyselina deoxyribonukleová se vyskytuje ve formě dlouhého tenkého dvojvlákna, je však velmi křehká, a proto může být snadno poškozena, ať už tlakem, mechanickými silami nebo účinkem enzymů. Aby mohla být izolována nativní DNA v neporušené formě, je třeba vzít na vědomí veškeré vlivy, které by její strukturu mohly porušit či poškodit. Už jen při samotné izolaci DNA z buněčného materiálu hrozí riziko jejího znehodnocení, také pipetování může způsobit poškození DNA (Guschlbauer, 1980). DNA si při dodržování šetrných podmínek zachovává svoji strukturu, ale již po krátkém míchání roztoku DNA dochází k částečné depolymerizaci (Bresler, 1979). 7.7 Ultrazvuk Působení ultrazvuku také dokáže degradovat purifikovanou DNA ve vodném roztoku. V práci Elsnera a Lindblada byla tato skutečnost dokázána působením ultrazvuku o intenzitě, která se běžně používá v klinických aplikacích, na vodný roztok DNA a DNA v biologických vzorcích. K degradaci DNA v roztoku po vystavení ultrazvukovému působení dochází rozbitím vodíkové vazby, což se projeví zlomy v jednom či obou řetězcích DNA šroubovice. Tento proces způsobí dva mechanismy, a to kavitace a účinek tepelný nebo mechanický. Zlomy v šroubovici DNA se vyskytují hlavně mezi atomy kyslíku a uhlíku (Elsner, Lindblad, 1989). Ryabchenko a kol. (1964) prokázali, že kinetika degradace původní dvojřetězcové DNA pomocí ultrazvuku se řídí zákonitostí vlastnotí jednořetězcových polymerů. Jejich výzkum naznačuje, že degradace makromolekuly DNA pomocí ultrazvuku je výsledkem současného prasknutí dvojřetězcové DNA, a nikoliv důsledkem akumulace jednotlivých zlomů v řetězcích DNA. 7.8 Nukleázy Nukleázy rovněž způsobují degradaci DNA, jsou to enzymy, které katalyzují hydrolýzu fosfodiesterových vazeb mezi jednotlivými nukleotidy v polynukleotidových řetězcích (Rosypal, 2001). Za normálních podmínek se nacházejí v cytoplazmě buňky a 22

23 štěpí nukleové kyseliny (Kočárek, 2007). Jejich působením tedy dochází k významnému znehodnocení kyseliny deoxyribonukleové. Proto je důležité se při manipulacích s DNA vyvarovat jakékoli kontaminace nukleázami. Chelatační činidlo má vlastnost vázat dvojmocné ionty kovů, hořčíku a vápníku, které jsou známy tím, že podporují degradaci DNA, protože působí jako kofaktory pro enzymy štěpící DNA. Činidlo s ionty reaguje tak, že vytvoří komplex, čímž je zajištěna inaktivace těchto nežádoucích nukleáz. Pro správnou činnost chelatačního činidla, které váže dvojmocné kovy, je důležité zajištění alkalického ph v rozmezí 8,0-9,5. Takto se zabrání působení nukleáz, které degradují DNA. Jako báze může posloužit Tris, který je slabou organickou bází, anebo lze použít anorganické báze jako uhličitan či hydrogenuhličitan alkalického kovu, a to například sodíku, lithia nebo uhličitan či hydrogenuhličitan draselný (Burgoyne, online). 8 SOUVISLOST MEZI IZOLACÍ A KVALITOU DNA Pro izolaci DNA z požadovaného vzorku se používá celá řada různých protokolů a v poslední době se také často používají komerčně vyráběné soupravy neboli kity. Provedení izolace za použití těchto kitů je sice rychlejší, ale finančně náročnější. Ve většině případů však spolehlivě funguje klasická fenol-chloroformová metoda (Zima a kol., 2004). Nebo adsorpce na silikát, na níž jsou kity založeny. Postup izolace zahrnuje následující kroky: 8.1 Odběr biologického materiálu, ze kterého má být DNA izolována DNA můžeme izolovat z nejrůznějšího biologického materiálu, kterým může být rostlina, živočich nebo lidský organismus. rostlina Jako zdroj DNA u rostlin je možné použít jakékoli pletivo, klíční rostliny, semena či rostliny in vitro kultur. Izolace vysoce polymerní DNA z rostlinného materiálu je daleko obtížnější než izolace z bakteriálních nebo živočišných buněk vzhledem k existenci celulózní buněčné stěny. Při izolaci celkové rostlinné DNA je výsledkem 23

24 izolace směs všech typů DNA, a to jaderné (ndna), chloroplastové (cpdna) a mitochondriální (mtdna) kyseliny deoxyribonukleové. Pro molekulární analýzu rostlinného genomu je vždy nutné mít dostatečné množství DNA v potřebné kvalitě. Proto se v izolačních postupech zaměřuje na odstranění kontaminantních sacharidů, proteinů a polyfenolů (Bednář a kol., 1999). živočich U živočichů může být DNA izolována z jakékoliv živočišné tkáně obsahující nativní buňky. U organismů malé velikosti se k izolaci používá i celých jedinců. V tomto případě však samozřejmě hrozí kontaminace parazity, symbionty a zbytky potravy. U jednobuněčných živočichů se někdy používá postup, při kterém se nejprve daný jedinec rozmnoží a DNA je potom izolována ze všech jedinců najednou. U obratlovců, jejichž erytrocyty mají jádro, se dá DNA snadno izolovat z krve, to se používá například i u malých druhů ptáků a ryb. U savců je izolace DNA z krve problematičtější a vyžaduje poměrně velké množství krve. U malých savců nebo obojživelníků lze velmi kvalitní DNA získat z čerstvé tkáně, obvykle však postačí například s odstřihnutý konec ocásku nebo části prstu, takže zvíře nemusí být usmrceno. Při použití speciálních technik je možné izolovat DNA i z takových zdrojů, jako je trus (Zima a kol., 2004). Lze použít i spermie. A pro potřeby mikroanalýzy postačí i pár chlupů s váčkem (Hruban a kol., 1999). Tyto techniky jsou však poměrně obtížné a citlivé na kontaminaci (Zima a kol., 2004). lidský organismus U člověka jsou nejčastějším výchozím materiálem pro izolaci DNA solidní tkáně (normální i nádorové), buněčné kultury, leukocyty periferní krve, chloridové klky, buňky získané stěrem ze sliznic nebo mikroorganismy a viry ( Křemen a kol., 1998). 8.2 Lyze buněčných obalů a membrán Pro izolaci nepoškozené DNA se vyžaduje velmi šetrná dezintegrace tkáně nebo buněk. K uvolnění protoplastu (buněčného obsahu) dojde rozrušením buněčných obalů. K této lyzi buněčných stěn se mohou použít mechanické prostředky či enzymové štěpení v závislosti na tom, o jaký typ buňky jde. 24

25 Jsou-li výchozím materiálem bakteriální buňky, musí se nejprve odstranit pevná bakteriální stěna, která je mechanicky velmi odolná. Pro tyto účely se volí enzym lysozym, který hydrolyticky štěpí proteoglykany bakteriální stěny (Křemen a kol., 1998), nebo etyléndiamin tetraacetátu (EDTA) či jejich kombinace. EDTA odstraňuje ionty hořčíku nutné k ochraně struktury buněčných obalů a také inhibuje buněčné enzymy, které by mohly DNA degradovat (Brown, 2007). Kromě toho se přidávají detergenty (tenzidy), které napomáhají rozpadu buněčných membránových struktur díky tomu, že odstraňují molekuly lipidů. Jako detergenty se používají látky komerčně označené jako Tween 20, Triton X100, nebo lauryl sulfát sodný, který je běžněji označován jako SDS (sodium dodecylsulfát sodný). SDS je negativně nabitý polykationt. Kromě toho, že má detergentní účinky, také působí jako denaturační činidlo a způsobuje disociaci DNA, kdy se oddělí od proteinů (Hruban a kol., 1999). Jestliže chybí chelatační činidlo, stupeň fragmentace DNA se značně zvyšuje. Solubilizace je doprovázena ztrátou některých histonů a nenhistonových chromosomálních proteinů. Odstranění jaderné membrány a velké části proteinů detergentem Triton X 100 napomáhá degradaci chromatinu a vzniku nízkomolekulárních fragmentů (Karyagina a kol., 1976). Stěny buněk rostlin a hub se od stěn buněk bakteriálních liší svým chemickým složením, a proto vyžadují jiné způsoby degradace. Často se využívá mechanické dezintegrace kombinované s působením degradačních enzymů (Šmarda a kol., 2005). U rostlinných pletiv se používají enzymy celulázy nebo hemicelulázy, většinou se však postupuje levněji, kdy se rostlinný vzorek zmrazí v kapalném dusíku a následně se rozmělnění na jemný prášek. Lyze živočišných buněk se docílí jednodušeji, protože buněčná stěna chybí, lze ji tedy indukovat jemnějšími metodami, např. slabými neiontovými detergenty (Šmarda a kol., 2005). U tkání bohatých na pojivo se k usnadnění homogenace používají enzymy typu proteas (kolagenasa, elastasa, proteiasa K.) (Křemen a kol., 1998). Po rozrušení buněčné stěny a plazmatické membrány se v roztoku nachází jejich degradační produkty spolu s nitrobuněčnými složkami. Ze vzniklé komplexní směsi DNA, RNA, proteinů, lipidů, sacharidů nízkomolekulárních látek a uhlovodíků je třeba extrahovat pouze čistou, kvalitní DNA. 25

26 Lyze buňky obvykle vede k fragmentaci chromozomové DNA. Pokud se má izolovaná DNA zachovat intaktní, tedy neporušená, je nutné použít co nejjemnějších podmínek lyze. Je vhodné udržovat lyzační směs v pufrovaném médiu a chladu. Důležité je rovněž vyhnout se fragmentaci DNA, ke které může dojít při pipetování lyzátu (Šmarda a kol., 2005). Mechanické rozdrcení, jeden z nejčastěji používaných postupů homogenizace rostlinného materiálu, však také někdy může způsobit částečnou degradaci DNA (Bednář a kol., 1999). 8.3 Oddělení kontaminujících látek Obě nukleové kyseliny se nacházejí v buňkách ve formě nukleoproteinů. Proto, chceme-li získat čistou deoxyribonukleovou kyselinu, je třeba ji při postupu izolace uvolnit z vazby na proteiny a samozřejmě také odstranit další buněčné komponenty, které jsou v tomto případě potenciálními kontaminanty. Odstranění proteinů je při purifikaci DNA velmi důležité, protože buňky obsahují jednak řadu enzymů, které kyseliny degradují, jednak také proteiny, které se na DNA vážou. Svou přítomností by tak mohly omezovat účinnost následujících experimentů (Šmarda a kol., 2005). Protože vzniklý buněčný extrakt obsahuje tedy kromě DNA také kontaminanty, je třeba DNA od této směsi oddělit. Existuje celá řada postupů, jak toto provést. Jedním ze způsobů, jak získat čistou DNA, je působení látkami, které degradují kontaminanty (Obr.3a), např. metoda organické extrakce. Další metody jako iontoměničová chromatografie jsou založeny na principu rozdělení směsi na složky. Poté je DNA oddělena od nežádoucích příměsí (Obr.3b) (Brown, 2007).. 26

27 Obr. 3: Dva způsoby purifikace DNA: a) Smíchání směsi s reagenciemi, které degradují kontaminující součásti v čistém roztoku DNA; b) Rozdělení směsi na dvě frakce, z níž v jedné se nachází čistá DNA (Brown, 2007, upraveno) Pokud je to technicky možné, je dobré okamžitě po odběru vzorků přidat látky zabraňující činnosti nukleáz. K ochraně DNA před účinkem DNáz se obvykle používá chelatační činidlo EDTA či citrát sodný. EDTA, etylen-diamino-tetraoctová kyselina, je sloučenina s vysokou afinitou k řadě kovů. Používá se jako součást mnoha pufrů k zastavení činnosti enzymů vyžadujících kov jako kofaktor (Hruban a kol., 1999). Svým působením vyváže vápníkové a hořčíkové ionty nezbytné pro funkci enzymů, které by jinak štěpily DNA. Proto, abychom co nejvíce snížili aktivitu těchto enzymů, které degradují DNA, je také třeba práci provádět při snížených teplotách, je vhodné pracovat s chlazenými roztoky (Křemen a kol., 1998). V případě, že by nukleázy zůstaly aktivní, došlo by k rozštěpení DNA a jakákoli další analýza genetického materiálu by byla bezpředmětná (Kočárek, 2007). Dále se EDTA používá k zabránění adheze buněk, jako antikoagulační látka a vůbec ke konzervaci biologických materiálů. Zpravidla jde o dvojsodnou sůl Na 2 EDTA (Hruban a kol., 1999). 27

28 Odstranění RNA z purifikované DNA lze snadno dosáhnout působením ribonukleázy (Rnázy). Přečištění purifikované nukleové kyseliny působením zmíněných enzymů se používá jen v některých postupech. Pokud určitá kontaminace nukleové kyseliny není v daném postupu na závadu nebo k jejímu odstranění postačují následné purifikační kroky, je možné tento krok vynechat (Šmarda a kol., 2005). U rostlin je také nutno odstranit nežádoucí polysacharidy, které tvoří buněčnou stěnu. Provádí se tak vysrážením DNA cetyltrimetylamóniumbromidem (CTAB) nebo tetraetylamoniumbromidem (TEAB). Pro důkladné odstranění bílkovinných příměsí od DNA se používají různá činidla, která zajistí denaturaci proteinů. DNA zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, aniž by došlo k poškození její struktury (Bednář a kol., 1999). Disociaci DNA od proteinů způsobí přidaný tenzid, například výše zmíněný SDS; umožní oddělení DNA od histonů. Dokonalé degradace disociované bílkoviny se dosahuje pomocí proteolytických enzymů, které jsou aktivní v přítomnosti tenzidů (proteinasa K nebo pronasa) (Křemen a kol., 1998). K oddělení denaturovaných proteinů a lipidů od požadované DNA se obvykle používá fenolová nebo fenol-chloroformová extrakce. Jednotlivé typy nukleových kyselin se extrahují do vodné fáze v závislosti na hodnotě ph použitého pufru, zatímco proteiny se denaturují a vysráží. Alkalický pufr (ph = 8) extrahuje DNA s malou kontaminací ribonukleovými kyselinami, kdežto při kyselém ph (4,5-6) se extrahují převážně rrna a nízkomolekulární RNA. Jednotlivé fáze, tedy fáze vodná s extrahovanou DNA a fáze organická, se oddělí nízkoobrátkovou centrifugací (Křemen a kol., 1998). Po extrakci fenolem máme k dispozici vodný roztok DNA zbavený proteinů, který je však příliš naředěný a navíc obsahuje další kontaminanty, nově přítomné zbytky fenolu a chloroformu. Obzvláště fenol má určitý stupeň rozpustnosti ve vodě a mohl by způsobit nežádoucí denaturaci enzymů při další práci s purifikovanou deoxyribonukleovou kyselinou (Šmarda a kol., 2005). Jak už bylo výše zmíněno, existuje i spousta dalších metod purifikace DNA. K novějším technikám patří například metoda využívající adsorpce nukleových kyselin na silikátový povrch a oproti fenol-chloroformové metodě je rychlejší, bezpečnější a zajišťuje získání vysoce čisté DNA (Kočárek, 2007). 28

29 8.4 Zakoncentrování DNA Purifikovanou DNA je nutno zakoncentrovat neboli zahustit, což se provádí vysolením a precipitací (Hruban a kol., 1999). DNA se z vodné fáze vysráží ethanolem (případně isopropanolem) za přítomnosti solí jako NaCl, octanu sodného či draselného a poté se precipitát oddělí centrifugací od kontaminujících nízkomolekulárních látek (např. nukleotidů) (Křemen a kol., 1998). Protože soli mohou být částečně sráženy spolu s DNA, precipitát se promývá 70% ethanolem a tím se soli odstraní (Šmarda a kol., 2005). Takto získaný precipitát je připraven pro následné úpravy a analýzy. Riziko kontaminace Protože neustále hrozí nebezpečí kontaminace, je třeba dodržovat zásady práce, které zajistí sterilní prostředí. Nejde jen o kontaminaci vzorků DNA mikroorganismy, potem na rukou, který obsahuje nukleázy, a vzorků navzájem, ale i o nebezpečí kontaminace zásobních roztoků a reakčních komponentů, např. enzymů, primerů apod.. Proto, aby se zabránilo znečištění, se při práci s DNA většinou používají gumové (chirurgické) rukavice. Veškeré manipulace jako nabírání, promíchávání či přenášení vzorků DNA a dalších reakčních komponentů se provádí prostřednictvím pístových pipet s pevným či nastavitelným objemem a reagencie se nabírají do nasazených plastikových špiček. Všechny manipulace s DNA se obvykle provádí v plastikových nádobách a zkumavkách. Laboratorní nádobí jako zkumavky, špičky, vícejamové desky a komůrky, kultivační misky apod. se používají výhradně jednorázově (Hruban a kol., 1999). Zabránění kontaminace docílíme tím, že veškerá práce bude prováděna za sterilních podmínek. Roztoky budou autoklávované, rukavice a veškeré laboratorní nádobí a pomůcky budou sterilní (Křemen a kol., 1998). Z popsaného postupu izolace deoxyribonukleové kyseliny je zřejmé, že pokud chceme získat kvalitní DNA, musíme při její purifikaci ze vzorku odstranit ostatní složky. V tomto případě se i látky, které se jinak v buňce nacházejí spolu s DNA přirozeně, stávají potenciálními kontaminanty. Všechny tyto nečistoty negativně ovlivňují kvalitu DNA a v podstatě ji znehodnocují. 29

30 S deoxyribonukleovou kyselinou je také třeba opatrně zacházet, dbát na správné pipetování, vyvarovat se energického třepání a míchání, které by ji mohlo rovněž znehodnotit mechanickým poškozením. Požadavek kvality DNA u různých metod Při některých metodách, v rutinních a rychlých vyšetřeních, například při těch, která jsou založena na amplifikaci DNA pomocí PCR, postačí DNA horší kvality a v nízké koncentraci a je možné použití rychlejší a méně nákladné metody izolace (Zima a kol., 2004). Pro PCR detekci je zcela dostačující zjednodušený postup izolace, znečištění vzorku kontaminanty jako proteiny, jejich fragmenty a jinými látkami není omezující. Pokud potřebujeme DNA pouze k analytickým účelům, zvolíme drastičtější metody, které povedou k částečné degradaci DNA (depolymeraci) (Bednář a kol., 1999). V extrémním případě lze použít pouhé zlyzované buňky (Zima a kol., 2004). Je tedy možné pracovat semisterilně a při jednorázových vyšetřeních (diagnostika) i nesterilně. Pro jiné metody, například pro potřeby klonování a sekvencování či hybridizační techniky je zapotřebí, aby DNA byla ve vysoce čisté formě a měla vyšší koncentraci. Je tedy nezbytné pracovat sterilně, aby se zabránilo nežádoucím kontaminacím jako znečištění DNA bakteriemi a plísněmi (Hruban a kol., 1999). Například DNA určená k hybridizaci musí být zbavena kontaminujících látek, jakými jsou např. glykogen, proteiny nebo ionty kovů, které by mohly bránit reasociaci DNA. Rovněž požadavky na množství a integritu izolované DNA se mohou u různých metod podstatně lišit. Například pro potřeby polymerázové řetězové reakce se nevyžaduje velké množství výchozího materiálu, zatímco pro podrobné genetické analýzy je vhodné připravit požadovaný vzorek DNA v dostatečném zásobním množství. Jiné typy analýz jako pulzní gelová elektroforéza nebo štěpení BAL 31 vyžadují zase vysokou integritu izolované DNA (Šmarda a kol., 2005). 30

31 9 ARCHIVACE DNA V poslední době je velmi diskutovanou problematikou uchovávání kyseliny deoxyribonukleové. Pro některé potřeby je požadováno vzorek DNA skladovat krátkou dobu, avšak jestliže je pro navazující genetické analýzy potřebná její archivace po dobu delší, zvyšuje se tím riziko možné degradace, což je samozřejmě nežádoucí, a proto je tím více vynakládáno úsilí o zachování její kvality. Ať už je třeba uchovat vzorky kyseliny deoxyribonukleové na krátkou dobu pro běžná laboratorní použití nebo na čas mnohonásobně delší, například pro archivaci v DNA bankách, společným rysem obou těchto případů by mělo být vytvoření takových podmínek skladování, které zajistí vhodné prostředí pro uchovávání DNA, během kterého bude zachována její chemická i fyzikální integrita. Před uložením vzorku je třeba pečlivě zvážit dobu, po kterou má být uchováván, a zvolit vhodnou metodu archivace, která zajistí optimální ochranu DNA, kdy během skladování DNA nebude znehodnocena vůbec nebo jen minimálně. Kyselina deoxyribonukleová je považována za poměrně stabilní makromolekulu. Například oproti RNA je daleko méně reaktivní, což vyplývá z její molekulové struktury. Tento chemický rozdíl mezi DNA a RNA je usuzován z různého chování cukerných složek. Ukázalo se, že sloučeniny ribosy jsou mnohem labilnější než sloučeniny deoxyribosy, protože hydroxylová skupina na 2 uhlíkovém atomu umožňuje např. alkalickou hydrolýzu řetězce. Kromě toho je ribosa, obsahující hydroxylové skupiny na 2 a 3 uhlíkových atomech, na tomto místě lehko atakovatelná různými oxidačními činidly. Deoxyribosa tyto vlastnosti nemá (Bresler, 1979). I přesto však molekula DNA podléhá různým změnám. Z hlediska archivace se bere v potaz působení různých činitelů, kteří mohou zapříčinit znehodnocení DNA v průběhu skladování. Na vzorek izolované DNA působí mnoho činitelů, kteří mohou způsobit takováto znehodnocení. Jsou to již zmíněné DNázy, ionizující a ultrafialové záření, volné radikály a mnoho dalších vnějších podmínek, které molekuly DNA destabilizují (Baust, 2008). Problém stability DNA spočívá v tom, že jestliže DNA, kterou separujeme z buňky a purifikujeme od zbylých buněčných komponentů, necháme stát při pokojové teplotě, je rychle degradována nebo fragmentována deoxyribonukleázami. 31

32 Ve skutečnosti je pozvolná degradace DNA přirozenou vlastností vzorku a působí v každém vzorku bez ohledu na podmínky skladování. Cílem efektivní archivace je však minimalizovat tuto rychlost rozkladu DNA (Anchordoquy, Molina, 2007) a vytvořit takové podmínky, při kterých nebude DNA ohrožena působením nepříznivých vlivů okolního prostředí. Je tedy snaha snížit rychlost degradace na co nejnižší stupeň a pro tyto účely se používají různá opatření, která zajistí stabilitu molekul DNA. 10 ZPŮSOBY UCHOVÁVÁNÍ DNA Přesto, že jsou využívány pro uchovávání DNA různé metody, které jsou založeny na úplně odlišných principech, společným znakem jich všech je nutnost zachování kvality uložené DNA po celou dobu, po kterou je potřeba vzorek archivovat. DNA by měla být po procesu archivace použitelná pro různé genetické analýzy, jako PCR, hybridizace, sekvenování a celou škálu různých potřebných technik. Způsob skladování nukleové kyseliny závisí na její velikosti, konformaci a dalším využití (Šmarda a kol., 2005). V praxi se pro uchování DNA běžně využívají různé strategie, které se odlišují teplotou, při níž se DNA skladuje, a také tím, v jaké formě se uchovávaný vzorek nachází (Baust, 2008). V současné době se pro skladování nebo přepravu DNA běžně využívají různé metody, při kterých je purifikovaná kyselina deoxyribonukleová izolovaná z genetického materiálu stabilizována převedením do vysušeného stavu nebo je převedena na kapalné skupenství a následně je uchovávána za různých teplotních podmínek. Kyselina deoxyribonukleová se může uchovávat zamražená v precipitovaném stavu v ethylalkoholu nebo vysušená v lyofilizovaném stavu či ve vodném roztoku, případně v pufru, což se využívá nejčastěji (Knoll, Vykoukalová, 2002). 32

33 10.1 Rozdělení dle teploty Archivace se provádí za různých teplotních podmínek, při kterých se významně liší způsob ochrany molekul DNA, a to (Baust, 2008): při teplotě +4 C při teplotě -20 C při teplotě -80 C při teplotě -196 C při pokojové teplotě Při teplotách +4,-20,-80 a -196 C v principu jde o uchovávání vzorků DNA za snížených teplot. Obecně je totiž známo, že působením snížených teplot, tedy chlazením, resp. zmrazením, se omezí molekulární pohyblivost, a proto je při uchovávání za takovýchto podmínek zajištěno zachování integrity molekul DNA po dlouhou dobu (Anchordoquy, Molina, 2007). Nevýhodou těchto způsobů uchovávání je však to, že chceme-li vzorek DNA opětovně použít, je nutno jej rozmrazit a opakovaným rozmrazováním a zamrazováním dochází ke znehodnocování DNA. Bylo prokázáno, že proces zmrazování roztoku DNA má za následek zjevný úbytek DNA templátu pro PCR. To může souviset s vodnou fází, která se stále více koncentruje jako kapalná voda a přeměňuje se na ledové krystalky před tím, než celkový objem nakonec zamrzne za předpokladu, že konečná teplota je dostatečně nízká. Tento efekt může také vysvětlit poněkud větší stabilitu vodných vzorků skladovaných při +4 C a podstatně nižší stabilitu vzorků uchovávaných při teplotě -20 C (Podivinsky a kol., 2009). Výjimkou je archivace při pokojové teplotě, která je založená na jiném principu, kdy je DNA navázána na pevné matrici a uchovávána za běžných laboratorních teplot. Během manipulací a samotné archivace je vhodné, aby DNA nebyla vystavována přímému slunečnímu záření, které způsobuje její degradaci; z toho důvodu je žádoucí DNA skladovat v takových podmínkách, kde bude před působením světla chráněna. Je dostačující, je-li vzorek, který není bezprostředně používán v laboratoři, uložen v uzavřeném chladicím či mrazicím zařízení, nebo je-li při skladování za pokojových teplot skladován v laboratorních skříních. 33