Mendelova univerzita v Brně. Zahradnická fakulta

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta Diplomová práce Eliminace virů u odrůd česneku kuchyňského v podmínkách in vitro Vedoucí práce: Ing. Břetislav Křižan, Ph.D. Vypracoval: Bc. Martina Kudělková Lednice 2010

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Eliminace virů u odrůd česneku kuchyňského v podmínkách in vitro vypracovala samostatně a použila jen prameny, které jsem uvedla v seznamu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Lednici, dne:... Podpis studenta:... 2

3 Poděkování Chtěla bych poděkovat všem, kteří mi pomáhali při zpracování této práce. Zvláštní dík patří vedoucímu práce Ing. Břetislavu Křižanovi, Ph.D., za odborné vedení a ochotu spolupráce a v neposlední řadě děkuji své rodině za podporu po celý čas vysokoškolského studia. 3

4 OBSAH 1 ÚVOD CÍL LITERÁRNÍ PŘEHLED Obecná charakteristika česneku Zařazení dle Konvička (1998); Jelínek, Zicháček (2003) Světové názvy dle Seidemann (2005) Dělení česneku s ohledem na vnitřní rytmus druhu Allium sativum, tvorby lodyhy a stavbu cibule dle Konvička (1998) Klasifikace dle Kuzněcova (Kóňa, Kóňová, 2005) Původ Morfologie česneku Obsahové látky Použití, význam česneku Choroby a škůdci česneku Charakteristika virů Charakteristika rostlinných virů (fytovirů) Významné viry napadající česnek Rod POTYVIRUS Rod CARLAVIRUS Rod ALLEXIVIRUS Rod FIJIVIRUS Ostatní viry, které mohou popřípadě infikovat česnek Metody detekce virů Vizuální metody Sérologické metody Molekulárně genetické metody (PCR) Elektronová mikroskopie Metody eliminace virů na česneku v podmínkách in vitro Meristémové kultury (metoda izolace meristému) Termoterapie Chemoterapie Stem - disc dome culture - metoda stonkových disků

5 3.7 Multiplikace česneku v podmínkách in vitro Meristémové kultury Stem - disc dome culture - metoda stonkových disků Somatická embryogeneze METODIKA Laboratoř Výběr a popis materiálu Příprava rostlinného materiálu Příprava médií Příprava C0 média Příprava C0 média pro chemoterapii Příprava C1 média Založení pokusu Průběh pokusu Úspěšnost kultivace stroužků a meristémů Elisa postup VÝSLEDKY Eliminace GCLV u jednotlivých odrůd Eliminace LYSV u jednotlivých odrůd Eliminace OYDV u jednotlivých odrůd Eliminace SLV u jednotlivých odrůd Eliminace všech virů u jednotlivých odrůd Eliminace GCLV jednotlivými metodami ozdravení Eliminace LYSV jednotlivými metodami ozdravení Eliminace OYDV jednotlivými metodami ozdravení Eliminace SLV jednotlivými metodami ozdravení Eliminace všech virů jednotlivými metodami ozdravení DISKUZE ZÁVĚR ABSTRAKT SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ A GRAFŮ SEZNAM PŘÍLOH

6 1 ÚVOD Česnek kuchyňský (Allium sativum) patří k nejstarším kulturním plodinám, které provází lidstvo již od dávných dob. Je ceněn jako zelenina, koření, ale také jako léčivá rostlina pro své antibiotické účinky. Česnek se řadí do čeledi Alliaceae - česnekovité, ke které řadíme další hospodářsky významné plodiny (především cibuli, pór, nebo pažitku). Pěstování a výnos česneku negativně ovlivňují viry. Viry působí na kvalitu i kvantitu produkce česneku, což může vést i k vysokým ekonomickým ztrátám. Je známo několik patogenních virů, které se vyskytují ve všech oblastech pěstování česneku, z toho ve většině případů je česnek infikován celým komplexem virů. K nejdůležitějším rodům virů napadajících česnek a celý rod Allium patří rody Potyvirus (Onion yellow dwarf virus a Leek yellow stripe virus), Carlavirus (Garlic common latent virus, Shallot latent virus) a Allexivirus, a dále Fijivirus (Garlic dwarf reovirus). Na česneku se mohou vyskytovat i další viry, ty ale nemají ekonomický význam a jsou spíše lokálního charakteru. Vzhledem k tomu, že česnek se množí výhradně vegetativně, jelikož nevytváří semena, jsou virové choroby u této plodiny závažným problémem. Přenos virů pomocí semen je vzácný, hlavní šíření virů se děje právě vegetativní cestou a významnou roli zde má vektor, což jsou především mšice. Komplex těchto hlavních virů se u česneku projevuje převážně mozaikami, proužkovitostí, zakrslostí a celkovým oslabeným vývojem rostlin. Viry mají špatný dopad nejen na jedince, ale i na celý porost a hrají důležitou roli ve výnosu. Jednotlivé viry samy o sobě se ale nemusí projevovat a mohou zůstávat v latentní formě. Je proto vhodné najít účinnou metodu ozdravení česneku od těchto hlavních virů. Jednou z cest je ozdravení česneku v podmínkách in vitro. K těmto metodám patří ozdravení pomocí izolace meristému, z ní vyplvající termoterapie nebo chemoterapie. Někteří autoři se zabývají také metodou stonkových disků ( stem - disc dome culture ) jako možnou variantou ozdravení česneku od virů. Metodou izolace meristému a chemoterapií se zabývá tato práce. 6

7 V podmínkách in vitro lze ozdravený česnek také množit. Multiplikace může probíhat preparací meristémů kultivovaných na různých mediích s odlišnými suplementy, metodou stonkových disků nebo somatickou embryogenezí. 7

8 2 CÍL Cílem práce je získat informace o kultivaci, ozdravování a množení česneku v podmínkách in vitro. Tyto informace a znalosti následně prakticky použít za účelem ozdravení pěti odrůd česneku kuchyňského pro uchování metodou kryokonzervace. Práce bude hodnotit metody chemoterapie a izolace meristému. Přítomnost virů (OYDV Onion yellow dwarf potyvirus, GCLV Garlic common latent carlavirus, LYSV Leek yellow stripe potyvirus a SLV Shallot latent carlavirus) bude stanovována metodou ELISA. Bude zhodnocena účinnost ozdravení jednotlivými metodami. 8

9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Obecná charakteristika česneku Zařazení dle Konvička (1998); Jelínek, Zicháček (2003) Druh: Allium sativum (L.), syn. Allium controversum (Bown, 2002), Porrum sativum (L.) RCHB. (Seidemann, 2005) - česnek setý Rod: Allium - česnek Čeled: Alliaceae - česnekovité Řád: Liliales - česnekotvaré Třída: Liliopsida - jednoděložné Oddělení: Magnoliophyta - krytosemenné Podříše: Cormobionta - vyšší rostliny Říše: Plantae - rostliny Světové názvy dle Seidemann (2005) anglicky - garlic německy - Knoblauch, Knobloch, Knofel francouzsky - aïl, aïl blanc, ail ordinace italsky - aglio holandsky - knoflook rusky - tschesnoik 9

10 3.1.3 Dělení česneku s ohledem na vnitřní rytmus druhu Allium sativum, tvorby lodyhy a stavbu cibule dle Konvička (1998) 1. var. Sagittatum (Kuzěncov) = typ H paličák 2. var. Bulhare (Kuzněcov) = typ U širokolistý nepaličák 3. var. Variabilis (Konvička) = typ A úzkolistý nepaličák, kontinentální ekotypy Klasifikace dle Kuzněcova (Kóňa, Kóňová, 2005) 1. ssp. Sagitatum česnek paličák s třemi ekotypy Středoasijský, Kavkazskokarpatský a Východo-středomořský 2. ssp. Vulgare česnek nepaličák s třemi ekotypy Kontinentální, Jihomořský a Jihoruský Původ Česnek je znám odpradávna. Jeho původ je ve Střední Asii, kde je kulturní plodinou. Planě roste v Kyrgyzstánu, Tádžikistánu, Uzbekistánu a na severním Kavkaze. Roste zde převážně ve vyšších nadmořských výškách nad 500 metrů nad mořem. (Petříková a kol., 2006). Vznikl pravděpodobně z planého druhu Allium longicuspis. (Rabinowitch, Currah 2002). V Číně se pěstoval už od 2. stol. před Kristem, v Mezopotámii a Egytě odnepaměti. Z Egypta se přes Řecko a Řím dostal česnek do celé Evropy. Zde mají zásluhu na rozšíření česneku hlavně benediktínské kláštěry. Česnek byl v Evropě s výjimkou Anglie všeobecně oblíben. (Konvička, 1998). V současné době je česnek pěstován všude kromě tropických oblastí Morfologie česneku Česnek je trvalka, u nás pěstovaný jako jednoletá nebo dvouletá zelenina. Jako u všech zástupců rodu Allium, se i u česneku tvoří svazčitý kořenový systém. Dělená cibule je 10

11 složena ze stroužků (zdužnatělé pupeny) vyrůstajících z podpučí, které jsou kryty šupinatým obalem (Janča, Zentrich, 1994). U paličáků tvoří cibuli dvě skupiny stroužků, kdežto u nepaličáků je počet skupin 3 7. Stroužky jsou zásobními a rozmnožovacími orgány, které se vyvinuly z kolaterálních pupenů. Dužina je tvořena zásobním pletivem dužnatého listu. Stroužky jsou chráněny dvojvrstvou slupkou, která jim dává barvu. U nepaličáků je často slupka ze tří vrstev a je jemnější než u paličáků. Velikost a počet stroužků jsou odrůdový znak. Listy česneku jsou ploché, žlábkovité, tmavě zelené a ojíněné s listovými pochvami. U paličáků je počet listů obalujících lodyhu vyšší (až 15 listů) než u nepaličáků (průměrně 10 listů). Květní lodyha je u paličáků 0,8 1 m vysoká, také vyrůstající z podpučí, ukončená lichookolíkem řídce rozložených sterilních kvítků, který je obalen v toulci. Jednotlivé květy se skládájí z 6 okvětních lístků zelenavě bílé až růžové barvy. Podle Kuzněcova plané formy ve své domovině ve střední Asii, v nadmořských výškách 3000 metrů, kvetou a tvoří semena. Kulturní formy ale semena netvoří. U sterilních forem bývají prašníky žlutozelené, smrštěné, matné, v normálním stavu červenofialové, lesklé. Mezi jednotlivými květy se nachází dužnaté vegetativní útvary pacibulky, které bývají lidově považovány za semena. Mohou sloužit k vegetativnímu množení (Konvička, 1998; Petříková, 2006) Obsahové látky Glykosidně vázaná silice, sloučeniny síry, fytoncidy, vitaminy A, C, D, skupiny látek podobné pohlavním hormonům, jod a další minerální látky a stopové prvky jsou hlavní obsahové látky v česneku. Důležitý je obsah až 0,4 % alliinu, který se postupně mění na allicín, látku se silným antibakteriálním a antimykotickým účinkem (Konvička, 1998; Kóňa, Kóňová, 2005). K látce antibiotické povahy nalézající se v česneku patří také garlicin. Allin, alicin, allypropyl a disulphide 34, 101 jsou v česneku hlavní obsažené silice (Li, 2000). Dále obsahuje látky insulinových vlastností. Suché cibule obsahují asi % sušiny (Konvička, 1998; Kóňa, Kóňová, 2005). Parametry nejdůležitějších látek (průměrné obsahy ve 100 gramech) dle Kóňa, Kóňová (2005) Voda 61,3 g Bílkoviny 6,21 g 11

12 Lipidy 0,27 g Sacharidy 25,04 mg Vitamin C 18,175 mg Minerální látky 1,39 mg Použití, význam česneku Česnek se u nás používá jako zelenina, koření, ale v hojné míře také jako léčivá rostlina. Celkově má velmi pozitivní vliv na lidský organismus. V dobách, kdy ještě nebyly známy léky antibiotického účinku, byl česnek využíván jako přírodní antibiotikum (Konvička, 1998; Kóňa, Kóňová, 2005). Česnek je antioxidant, snižuje cholesterol, vysoký krevní tlak a tvorbu krevních destiček, má protinádorové účinky a působí proti trombóze (Li, 2000). Působí antiskleroticky tím, že rozšiřuje cévy a brání vzniku tukových usazenin na stěnách cév. Snižuje hladinu cholesterolu a urychluje jeho vyplavování z těla (Kovička, 1998; Kóňa, Kóňová, 2005; Janča, Zentrich 1994). Bown (2002) uvádí česnek jako prevenci proti infekcím a chřipce, bronchitidě a černému kašli, podporuje pocení. Byla zjištěna redukce glukózy u diabetiků. Vně lze použít při problémech s akné. Mimořádně ceněnou vlastností česneku jsou jeho antibakteriální a protiplísňové účinky. Například z asi 560 kmenů zlatého stafylokoka jich česnek přes 500 spolehlivě ničí. Dokáže také hubit rozšířené plísně Candida albicans, které bývají příčinou rakovin a jiných vážných onemocnění (Janča, Zentrich, 1994). Celkově blahodárný vliv má na trávicí ústrojí (proti nadýmání, křečím, podporuje trávení a jiné). Jediným negativem může být jeho typický nezaměnitelný zápach, který se po požití vylučuje všemi póry těla a pro většinu lidí je nepříjemný (Kovička, 1998; Kóňa, Kóňová, 2005; Janča, Zentrich 1994). 12

13 3.1.9 Choroby a škůdci česneku K chorobám abiotického původu patří sluneční úžeh, zasychání špiček listů a genetická porucha česneku (Rod a kol., 2005). Choroby biotického původu vyskytující se na česneku jsou fusariová hniloba (Fusarium oxysporum), modrá hniloba (rod Penicillium), rzivost cibule (Puccinia alli), bílá hniloba cibule (Sclerotium cepivorum), sazovitost česneku (Helmithosporium allii), plísňovitost cibule (Peronospora destruktor - plíseň cibulová), a fytoplasmová žloutenka aster - aster yellows cytoplasma (Rod a kol., 2005, Šafránková, 2007). Mezi škůdce napadající česnek se řadí hádˇátko zhoubné (Dityenchus dipdsaci), houbomilka česneková (Suillia univittata), vrtalka pórová (Phytomyza gymnostoma), třásněnka zahradní (Thrips tabaci), květilka cibulová (Delia antiqua), vlnovník česnekový (Aceria tulipae), molík česnekový (Acrolepia assectella), larvy (drátovci) kovaříkovitých - Elateridae (Rod a kol., 2005, Šafránková, 2007). 3.2 Charakteristika virů Viry jsou nebuněčné živé organismy, které se mohou rozmnožovat pouze v hostitelských (metabolicky aktivních) buňkách, jsou to intrabuněční parazité. Patří do říše nebuněční (podbuněční) - Subcellulata a oddělení viry - Vira. Pojem virus byl dlouho synonymem pro jed, poison. Až s rozvojem výkonnějších optických mikroskopů (elektronový mikroskop, 1939) se upřesnil pojem virus jako infekční agens menší než bakterie, tzv. filtrovatelné (ultramikroskopické) viry. Viry jsou složeny z nukleové kyseliny (DNA nebo RNA, nikdy ne oběma) a bílkovinného obalu (kapsid). Nukleokapsid je také jiné označení pro tento komplex. Většina živočišných virů má kolem nukleokapsidu ještě lipoproteinový obal., tzv. obalené viry. Viry nemají vlastní aparát pro syntézu bílkovin ani metabolický aparát. Jejich velikost se pohybuje v rozmezí 25 nm nm a téměř všechny jsou submikroskopické, pozorovatelné pouze v elektronovém mikroskopu. Viry představují velmi heterogenní skupinu mikroorganismů, jak v šíři hostitelů, tak ve struktuře a reprodukci. Jako virion je označena jednotlivá virová částice viru schopna infikovat a množit se v hostitelské buňce (Navrátil, 2010; Rosypal a kol., 2003; Jelínek, Zicháček, 2003, Rosypal, 2002). 13

14 Viry lze dělit z hlediska jejich hostitelských buněk na bakteriofágy, napadající bakteriální buňky (popř. fágy) a eukaryální viry, které se dále dělí na mykofágy (viry hub), rostlinné a živočišné viry (Rosypal, 2002). Při pozorování v elektronovém mikroskopu byly rozlišeny tyto tvary: izomerický (sférický), baciliformní, tyčkový, vláknitý (flexibilní a fixní), složený, komplexní (Navrátil, 2010) Reprodukce virů má pět fází: 1. adsorpce na buňku 2. penetrace (průnik) do buňky 3. uvolnění a replikace virového geonomu 4. skládání (maturace, zrání) virionů 5. uvolnění nových virionů z buňky (Navrátil, 2010; Jelínek, Zicháček, 2003) 3.3 Charakteristika rostlinných virů (fytovirů) Fytoviry jsou vnitrobuněční obligátní parazité, kteří až na výjimky nemají schopnost překonávat celulózové buněčné stěny. Dnes je známo asi 1000 rostlinných virů řadících se do 36 čeledí, z čehož se většina vyskytuje na kulturních plodinách (Rosypal, 2003; Navrátil, 2010). Rostlinné viry se liší od všech rostlinných patogenů velikostí, tvarem, ale i jednoduchostí svého chemického složení, fyzikální strukturou, množením, translokací v hostiteli a symptomy. Fytoviry se skládají z 5-40% z RNA a z 60-95% proteinu. (Agrios, 2005) Proces napadení buňky virem: Vstup viru do rostliny K průniku viru do buňky rostlin dochází pasivním způsobem (na rozdíl od živočišných a bakteriálních virů), zpravidla při mechanickém poškození, poranění. Pokud je ovšem poškození tak velké, že umírá hostitelská buňka, nepřežívá v ní ani vir. Jen zcela 14

15 ojediněle mohou viry proniknout do rostliny průduchy (Navrátil, 2010; Jelínek, Zicháček, 2003). Přenos a šíření virů mezi hostiteli 1. přenos reprodukčním materiálem a) vegetativní přenos - obvykle bývá spojen s činností člověka. Jedná se o přenos virů reprodukčním materiálem při vegetativním množení. A to jak množitelským materiálem, tak kontaminovanými pracovními nástroji. b) generativní přenos (přenos semeny) - v semenech bývají viry vázány na embrya, endosperm a testu. I když je pravděpodobnost přenosu semeny velmi nízká (kolem 0,1%), rostliny z nich vyrůstající mohou mít až epidemiologický význam. c) přenos pylem - je nevýznamný, pouze vzácně vede k nové infekci. (Navrátil, 2010; Jelínek, Zicháček, 2003) 2. přenos houbami - děje se přes kořeny a přenáší se takto minimálně 30 rostlinných virů. Nejčastěji se jedná o rody Polymyxa, Spongospora, Olpidium (Agrios, 2005). 3. přenos pomocí vektorů - zoochorie Mnohé druhy hmyzu jsou přenašeči jak virů (nejčastěji), tak bakterií a hub. K předání choroby dochází nejčastěji při příjmu potravy. Ale také například pouhým dotykem, nebo kladélkem. Nejčastějšími přenašeči je hmyz, který často střídá hostitele. A dále hmyz s bodavě sacím nebo kousacím ústním ústrojím. Patří k nim nejčastěji mšice, mery a křísi. Mezi vektory dále patří členovci. Epidemiologický význam mají půdní háďátka (třída hlístice, Nematoda). (Navrátil, 2010; Jelínek, Zicháček, 2003) Z tohoto pohledu můžeme přenos rozdělit na perzistentní a neperzistentní Persistentní - Je potřeba dlouhého sání. Vir se dostává potravou do těla přenašeče, do zažívacího traktu, hemolymfy a slinných žláz. Projde celým tělem vektora a odtud kousacím nebo sacím ústrojím infikuje další rostliny. Vektor si ponechává infekčnost po dlouhou dobu, i celý život. Pokud se vir ve vektoru množí, jedná se o propagativní typ, pokud se nemnoží, hovoříme cirkulativním přenosu. Největší koncetrace perzistentních 15

16 virů je v cévních svazcích. Zvláštní případ je transovariální přenos u mšic z matky na potomstvo (Šefrová, 2006; Navrátil, 2010). Nepersistentní - K přenosu viru stačí krátká doba sání (asi do minuty). Vektor si infekčnost uchovává jen krátkou dobu (max. několik hodin). Přenos probíhá mechanicky sacím nebo kousacím ústrojím vektora (Šefrová, 2006; Navrátil, 2010). Semiperzistentní - Nastává tehdy, pokud je doba nutná k projití viru tělem vektory kratší než 3 hodiny (Šefrová, 2006; Navrátil, 2010). 3. přenos zoosporami hub (Šefrová, 2006) 4. mechanický přenos - využívá se u testovacích, experimentálních rostlin (Šefrová, 2006) Jeden vir může být přenesen několika způsoby (Šefrová, 2006). Rozvoj infekce a reakce hostitele Pokud je hostitelská buňka citlivá k infekci (v místě infekce se objevují lokální příznaky), dochází ke změnám v jejím metabolismu a vir se začíná reprodukovat (objevují se systémové příznaky). Výsledkem interakce vir - hostitel je nemoc, choroba. Symptomy virových chorob Choroba se vyznačuje množením viru, poškozením funkcí rostliny a následným projevem symptomů. Jejich přítomnost se projevuje charakteristickými vizuálními příznaky, jako jsou barevné změny, mozaiky, žloutenky, pruhy, kresby, nekrózy na listech, deformace květů, změny tvaru - deformace, zakrslost (což vede až k odumírání), nižší výnos, zhoršené chuťové vlastnosti a skladovatelnost, a snížení imunity vůči dalším napadením. Příznaky můžeme pozorovat na částech rostlin, nebo na celých rostlinách. Objevují se nejen na úrovni makroskopické, ale také histologické a cytologické. Mohou se vyskytovat jen v některé fázi života rostliny. Řada virů je ovšem latentních a neprojevují žádné viditelné příznaky. V přírodě téměř neexistuje bezvirozní rostlina (Navrátil, 2010; Jelínek, Zicháček, 2003; Agrios, 2005). 16

17 Obr. 1. Snížení výnosu vlivem OYDV u česneku kuchyňského (Elnagar, 2009) Šíření choroby v rostlině Infekce se v rostlině šíří cévními svazky (xylémem a floémem) a z buňky na buňku prostřednictvím plasmodesmat (Navrátil, 2010; Hradilík, 2005). Reakce rostlin na infekci Dle reakce rostlin na infekci je můžeme rozdělit do několika skupin: > imunní - viry zde nevznikají, nemnoží se, nejsou pozorovány virové příznaky, přítomnost viru není možné dokázat - rostlina není hostitelem viru > rezistentní - rostlina je hostitelem viru, ale brání se jeho replikaci a šíření > tolerantní - vir se v hostiteli množí, ale příznaky choroby nejsou silné a nezpůsobují silné ekonomické ztráty > vnímavá - vir se v hostiteli silně množí, objevují se typické příznaky choroby, jsou zde časté silné ekonomické ztráty (Navrátil, 2010) 17

18 3.4 Významné viry napadající česnek Pěstování a výnos česneku je negativně ovlivňováno viry. Viry negativně působí na kvalitu i kvantitu produkce česneku, což vede k vysokým ekonomickým ztrátám. Je známo několik patogenních virů, které se vyskytují ve všech oblastech pěstování česneku, z toho ve většině případů je česnek infikován hned několika viry najednou. K nejdůležitějším rodům virů napadajících česnek a celý rod Allium patří rody Potyvirus (Onion yellow dwarf virus a Leek yellow stripe virus), Carlavirus (Garlic common latent virus, Shallot latent virus) a Allexivirus, a dále rod Fijivirus (Garlic dwarf reovirus) Rod POTYVIRUS Patří do čeledi Potyviridae, která byla objevena a vyhlášena v roce V roce 1995 popsal Murphy a kol. rody lišící se podle vektorů, které je přenášejí (Khan, Dijkstra, 2002). Tato čeleď je nejpočetnější skupinou rostlinných virů, řadíme k ní přes 150 druhů. Název rodu a jeho základní charakteristika jsou odvozeny od typového člena Y viru bramboru (Potato virus Y, PVY). Virové částice mají rozměry 12 nm x nm (Astier a kol., 2007). Genom potyvirů je tvořen jednovláknovou + ssrna (Agrios, 2005). Do rodu Potyvirus řadíme 126 virů, 28 blíže neurčených virů a další 15 je zatím zkoumáno. Tyto viry jsou přenosné mšicemi, nejvýznamnější jsou rody Aphis, Myzus a Macrosiphium, a to způsobem neperzistentním nebo semiperzistentním. K významným virům tohoto rodu napadajícím česnek patří Onion yellow dwarf virus (OYDV) a Leek yellow stripe virus (LYSV). Oba tyto viry mohou redukovat výnos o 17-60% (Caciagli, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Šutić a kol. (1999) uvádí další vir této čeledi napadající česnek - Garlic mosaic (possible) potyvirus (GcMVV). ONION YELLOW DWARF VIRUS (OYDV) - virus žluté zakrslosti cibule Vlastnosti virových částic 18

19 Jedná se o typického zástupce potyvirů, který byl objeven v roce 1960 (Aleksić a kol., 1980 in Šutić a kol., 1999). Virové částice jsou protáhlé, pružné, vláknité a jejich rozměry jsou nm x nm. Bod tepelné inaktivace (dále jen TIP) je ºC, bod, kdy je vir ještě detekovatelný v naředěné rostlinné šťávě se pohybuje v rozmezí (dále jen DEP) 1x10-2 1x10-4 a životnost in vitro (dále jen LIV) je 2-3 dny (Bos, 1976; Tošić and Šutić,1976 in Šutić a kol., 1999). Napadá celý rod Allium (Diekmann, 1997). Spektrum hostitelů Vir se běžně vyskytuje na cibuli, šalotce a česneku.(diekmann, 1997). Šutić a kol. (1999) uvádí, že přirození hostitelé jsou cibule, šalotka, A. moly, A. scorodoprasum, A. vineale. Někteří autoři uvádí také česnek (Bos, 1976 in Šutić a kol., 1999) a pór (Tošic and Šutic, 1976 in Šutić a kol., 1999) jako vnímavé k OYDV. Byl pozorován na okrasných druzích Allium a Narcissus. Pro experimentální a izolační účely se využívá Chenopodium amaranticolor, Ch. quinoa (Šutić a kol., 1999) a Ch. murale (Diekmann, 1997). Izolace z různých hostitelů má různou úroveň infekčnosti. Z česneku a narcisu jsou méně infekční pro cibuli než ty z cibule, a jedná se tedy pravděpodobně o zástupce různých virových kmenů (Šutić a kol., 1999). Geografický výskyt, ekonomický význam OYDV byl popsán všude tam, kde se pěstuje cibule (Šutić a kol., 1999). Vyskytuje se kosmopolitně a největší význam má u semenných porostů (Diekmann, 1997). Podle Klukáčkové a kol. (2007) byl virus žluté zakrslosti cibule přítomen v 75,4% z pěti českých testovaných odrůd česneku ( Anin - 82, Anton - 129, Benátčan - 78, Bjetin - 87, a Vekan - 87 vzorků) a zároveň nebyl vůbec detekován v česneku ze Španělska (14 vzorků). Jejich výsledky dokazují, že je OYDV je u rodu Potyvirus častějším virem než LYSV. U odrůd Anin a Benátčan byl přítomen v 100%. V Řecku a Itálii byl vir detekován 100 % na rostlinách česneku (Dovas a kol., 2001; Dovas and Vovlas, 2003 in Klukáčková a kol., 2007). Na druhou stranu, v Brazílii a Japonsku byla frekvence viru 19

20 pouze do 40% (Daniels (1999), Fajardo a kol. (2001), and Takaichi a kol.(1998, 2001) in Klukáčková a kol., 2007). U citlivých odrůd může být velice škodlivý speciálně tam, kde se neprovádí ochranná, fytoasanační opatření. Úroveň škod závisí na počtu napadených rostlin. (Šutić a kol., 1999; Diekmann, 1997). Ve většině zemí způsobuje až padesáti procentní ztráty (Diekmann, 1997). Výnosy zeleniny u jednoletých rostlin mohou být redukovány až o 25%, kdežto potencionální výnos semen může být zredukován na 50-75%. Některá místa v bývalé Jugoslávii zaznamenávají až 40% výskyt OYDV na poli (Šutić a kol., 1999). Přenos V přírodě je asi 60 druhů mšic přenášejících OYDV nepersistentním způsobem. Největší význam přitom mají Acrythosiphon pisum, Aphis craccivora, A. fabae, Brachycaudus cardui, Hyalopterus pruni, Myzus ascalonicus, M. cerasi, M. persicae, Rhopalosiphum maidis and R. padi. Mnoho mšic jako vektor hraje hlavní roli ve vzniku epidemií (Šutić a kol., 1999). Vir je také přenášen vegetativním způsobem množení. Přežívá v infikovaných cibulích, v cibulích pro produkci semen (procentuálně zde bývá vyšší výskyt, protože tyto rostliny jsou infekci vystaveny 2 roky), stroužcích, pacibulkách, ve vytrvalých zeleninách, v okrasných a volně rostoucích druzích rodu Allium. Vývoj rostlin z těchto cibulí představuje přirozený zdroj infekce během vegetace (Diekmann, 1997; Šutić a kol., 1999). Přenos prostřednictvím osiva nebyl potvrzen (Šutić a kol., 1999). Symptomy Vir má podobné příznaky jako při fyziologických poruchách (popálení herbicidy, nedostatek ve výživě, popřípadě poškození mrazem). Proto můžeme OYDV celkem snadno zaměnit s jiným poškozením (Diekmann, 1997; Rod a kol., 2005). Symptomy se objevují nejprve na listech, rostoucích přímo z infikovaných cibulí jako pozoruhodné, četné, krátké žluté proužkování na bázi. Příznaky primární infekce 20

21 objevující se na listech se později v sezoně ztrácí a listy se jeví jako zdravé. S vývojem nemoci infikovaných listů přichází brzy kompletní chloróza, částečné zploštění a zkroucení a listy nabývají neobvyklého vzhledu. Úzké proužky se objevují také na květních stoncích, které se kroutí. To vedlo k pojmenování choroby onion yellow dwarf. Rostliny infikované OYDV vytváří deformovaná květenství nebo květenství se sterilními květy a netvoří semena (Šutić a kol., 1999). U česneku se symptomy neprojevují tak silně jako u cibule. Prvotní příznaky se objevují na listech. Na česneku se vytvářejí velice slabé chlorotické, světle žluté až žlutozelené podélné pruhy. Mohou přecházet ve žlutou mozaiku. Redukuje se velikost cibulí a růst nadzemní části (Diekmann, 1999). Rozsah napadení závisí na odrůdě a na množství viru. Například ve Francii (Lot a kol., 1998) způsobil OYDV ztráty 39-60%. Pokud se vyskytuje v kombinaci s jinými viry, způsobuje větší poškození a ztráty. Příznaky jsou četnější a výraznější v chladném počasí (Diekmann, 1999). V prvním roce nemusí být pozorovány žádné příznaky. Od dalších let mohou být ale napadány i květní stvoly, které sice neztrácejí turgor jako listy, ale objevují se na nich vizuální projevy (stejné jako u listů). (Diekmann, 1999). Na cibuli a šalotce je hlavním příznakem zpomalený růst a zakrnělost. Listy jsou zploštělé, zkroucené, od báze se na nich objevují nezvyklé žluté proužky, které při silné infekci splývají a celé listy mohou být chloroticky žluté. Působí povadlým dojmem. (Šutić a kol., 1999; Diekmann, 1999). Infikované rostliny mají slabá květenství nebo sterilní květy (Šutić a kol., 1999). Zhoršuje se skladovatelnost, během níž dochází k předčasnému rašení (Diekmann, 1997). U póru nedochází k barevným ani tvarovým změnám, choroba se projevuje poškozením kořenů háďátky (Diekmann, 1997). Kontrola Produkce zdravého materiálu je hlavní pro produkci nebo snížení výskytu infekce. Během kontroly by měly být zničeny všechny infikované rostliny. Měla by být dodržena prostorová izolace od cibulových rostlin. Šalotka, která představuje pravidelný zdroj přirozené infekce, by neměla být pěstována v blízkosti cibule. Proti mšicím lze 21

22 použít chemickou kontrolu. Všechny infikované rostliny nebo zbytky rostlin by měly být zlikvidovány, protože slouží jako zdroj infekce po sklizni (Šutić a kol., 1999). LEEK YELOW STRIPE VIRUS (LYSV) - virus žluté proužkovitosti póru Vlastnosti virových částic Virové částice jsou přizpůsobivé a dlouhé nm, TIP je C, DEP je 1x10-2 až 1x10-3, LIV je 3-4 dny (Bos, 1981). Morfologicky a hostitelsky je podobný OYDV, ale sérologicky vzdálený (Bos, 1981 in Šutić a kol., 1999). Geografické rozlišení a ekonomický význam Jedná se o dalšího významného potyvira, napadajícího výhradně celý rod Allium. Nejvíce je napadán pór a česnek (Diekman, 1997). Vyskytuje se všude, kde je pór pěstován. Je považován za jeden z nejvíce škodlivých virů na póru v několika zemích Evropy (Šutić a kol., 1999). Virus byl poprvé popsán Walkeyem a kol. (1987) v Anglii. Stejně jako OYDV může způsobovat redukci výnosu až o 50% (Diekmann, 1997). Například ve Francii se snížil výnos až o 54 %. Směsná infekce LYSV a OYDV dále redukuje výnos (Lot a kol., 1998). Lunello a kol. (2007) uvádí, že v Argentině snížil LYSV způsobil redukci hmotnosti a obvodu u česneku až o 74 %. Hostitelé Podle Diekmana (1997) patří k nejvíce napadaným rostlinám pór a česnek. Přirození hostitelé jsou pór, cibule, šalotka. Vůbec neinfikuje A. fistulosum (Šutić a kol., 1999). Symptomy Jednoduše rozpoznatelné chlorotické skvrny se nejprve objevují na bázi listů a postupně se šíří až k vrcholu. Kratší nebo delší pruhy v mosaikovém intervalu se střídají se 22

23 zelenými. Během vývoje choroby se tyto žluté pruhy šíří a pokryjí celý list a přichází kompletní chloróza. Čepele listů jsou vrásčité a zkroucené, listy jsou hrubé a více křehké. Rostliny mají pomalý růst, jsou více stresovány a umírají během zimy nebo jara. Stonky infikovaných rostlin jsou tenké, zakrslé a světlejší a podstatně redukované kvality, jsou citlivé na mráz a umírají buď v zimě, nebo v předjaří (Šutić a kol., 1999). Příznaky na česneku se projevují nerovnoměrným, světle zeleným proužkováním na mladých listech, které ve spodních a středních částech přechází do žluté barvy. Vir redukuje průměr stonku, ale významně neovlivňuje výšku rostlin (Diekman, 1997). Na póru se infekce projevuje zřetelným proužkováním listové čepele, které se objevuje od báze postupující nahoru, ojediněle i zcela chlorotické. Napadené rostliny špatně snáší ranní mrazy a tím pádem dochází k předčasnému úhynu (Diekman, 1997). I když k infekci dochází během vegetace, symptomy se objevují jen v říjnu a ozimé plodiny mohou být infikovány 100%. Vir zůstává v infikovaných rostlinách během zimy a na jaře je mšicemi přenášen na zdravé rostliny (Šutić a kol., 1999). Podle Diekmana (1997) a Šutić a kol. (1999) jsou rostliny infikovány LYSV mšice neperzistentním způsobem (především Aphis fabae a Myzus persicae) a vegetativním množením (ne generativně). Mšice, jako aktivní skupina vektorů, mohou způsobit vývoj této choroby až do epidemických rozměrů (Šutić a kol., 1999). K izolaci a biologickým testům (například při mechanické inokulaci) se používají Chenopodium quinoa, Ch. amaranticolor, Ch. album (Bos, 1981), Ch. murale (Mohamed, Zouny, 1980). Kontrola Hlavní preventivní opatření spočívá ve zdravém množitelském materiálu a adekvátní prostorové izolaci od jarní cibule, likvidace infikovaného materiálu během vegetace a likvidace posklizňových zbytků. Chemická kontrola mšic u sazenic je vhodná jako ochrana po přesazení rostlin na pole. Pro pór k produkci v čerstvém stavu není chemická ochrana doporučena z důvodu chemických reziduí (Šutić a kol., 1999). 23

24 GARLIC MOSAIC (POSSIBLE) POTYVIRUS (GcMV) Vlastnosti virových částic Virové částice jsou protáhlé o rozměrech 640 x 14 nm (Br cak, 1975 in Šutić a kol., 1999). TIP je 70 C a DEP 1 x Geografické rozlišení a ekonomický význam V bývalé Jugoslávii se vyskytoval všude, kde byl pěstován česnek. Redukuje růst a vitalitu a snižuje výnos o 30-40%. Tyto škody jsou považovány za hlavní příčinu nižších výnosů (Šutić a kol., 1999). Hostitelé Allium sativum je primární přirozeným hostitelem GcMV, zřídka napadá cibuli a pór může být infikován experimentálně (Šutić a kol., 1999). Symptomy Příznaky se projevují na prvních listech vyrůstajících z infikovaných stroužků. Objevují se bledé, chlorotické, úzké pruhy nebo pruhované mosaiky. S vývojem nemoci se tyto příznaky postupně rozšiřují z listových bází až na vrcholy a způsobují chlorózy celých listů. Jednotlivé stroužky zůstávají nevyvinuté a zakrslé. Celkově snižuje růst a vitalitu rostliny. Virus se uchovává v infikovaných stroužcích sloužících k propagaci česneku. Přirození vektoři nejsou známí, ale mohlo by se jednat o pavouky a roztoče. Jako ochrana a prevence je nutné použití zdravého, bezvirového množitelského materiálu (Šutić a kol., 1999). 24

25 3.4.2 Rod CARLAVIRUS Rod Carlavirus patří do čeledi Flexiviridae (Astier a kol., 2007), podle jiných autorů (Khan, Dijkstra, 2002) do čeledi Tobusviridae. Obsahuje 68 členů, z toho 39 definovaných a 29 zkoumaných (Ryu, Lee, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Název rodu je odvozen od typového člena Carnation latent virus (Khan, Dijkstra, 2002). Virové částice mají rozměry 12 nm x nm (Astier a kol., 2007). Genom carlavirů je tvořený jednovláknovou + ssrna (Agrios, 2005). V některých částech světa (Jižní a Střední Amerika, Indie, Čína, Evropa) byli zástupci r. Carlavirus objeveni i na česneku (Bos, 1999). Symptomy na přirozených hostitelích jsou velmi slabé nebo žádné, pokud se objevují mosaiky, tak pouze v raných stádiích růstu. Tato tendence k mírné nebo latentní infekci přitahuje pozornost virologů a fytopatologů. Mnoho členů rodu bylo objeveno až v posledních desetiletích a většina z nich je spojena s dalšími závažnými virovými onemocněními. Většina je přenášena mšicemi neperzsistentním nebo semiprezistentním způsobem a mechanickým kontaktem (Ryu, Lee, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010, Diekman, 1997). K významným zástupcům napadající rod Allium patří Garlic common latent virus (GarCLV) a Shallot latent virus (SLV), také znám jako Garlic latent virus (Caciagli, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Garlic latent virus (GLV) byl z česneku poprvé izolován v Japonsku (Lee a kol., 1979). Řadí se k SLV, protože sérologicky je od něj nerozeznatelný (Tsuneyoshi a kol., 1998). Další carlavirus, podobný Carnation latent virus, byl ohlášen z Argentiny a podle Mavriče, Ravnikar (2005) označen zkratkou CG (Conci a kol., 1992 in Mavrič, Ravnikar, 2005). GARLIC COMMON LATENT VIRUS (GarCLV, GCLV) Popis virových částic Virové částice GarCLV jsou vláknité, přibližně 650 nm dlouhé a nepatrně ohebné (Diekman, 1997). Geografické rozlišení a ekonomický význam GCLV byl detekován ve všech oblastech, kde se pěstuje česnek. Poprvé byl GCLV zjištěn v roce 1981 ve Francii jako Garlic latent virus - GCL (Delecolle, Lot, 1981). 25

26 Později je v Japonsku GLV přejmenován na GarCLV (van Dijk, 1993). Záznamy o jeho výskytu jsou z Asie, Evropy, Jižní Ameriky (Bellardi a kol., 1995; Fajardo a kol., 2001; Mavrič a kol., 1999;) a ze Severní Ameriky (Pappu a kol., 2005). Hostitelé Vnímavé hostitelské rostliny se vyskytují v čeledích Alliaceae, Amaranthaceae, Chenopodiaceae, Solanaceae (ICTVdB Virus Description, 2002). Běžně se vyskytuje ve zdánlivě zdravých rostlinách (Šutić a kol., 1999). Hlavní způsob přenosu viru je vegetativně množeným materiálem, zejména u česneku. GarCLV je přenášen mechanickou inokulací. Přenos mšicemi je pochybný (van Dijk, 1993; Barg a kol., 1994, 1997). Doposud nebyl zaznamenán přenos tohoto carlaviru semeny. K experimentálním účelům slouží Chenopodium quinoa, Ch. amaranticolor, a jiné druhy merlíků, dále Nicotiana occidentalis a především druhy čeledi Alliaceae (van Dijk, 1993). Symptomy Tento virus je v česneku a póru latentní, to znamená, že většinou v hostitelské rostlině nevyvolává žádné symptomy. V přítomnosti jiných virů (kromě potyvirů) může vyvolat slabé příznaky na česneku a póru. Pokud je ale snížen výnos cibulí, mají na to vliv hlavně ostatní viry přítomny v rostlině Diekmann, 1997). Graichen (1991) zjistil, že přítomnost carlaviru zesiluje symptomy potyvirů. Symptomy na experimentálních rostlinách se projevují jako lokální chlorózy a nekrózy, slabé zelené kroužky nebo chlorotické vyryté poškození (ICTVdB Virus Description, 2002). SHALLOT LATENT VIRUS - SLV Vlastnosti virových částic Virové částice jsou mírně zakřivené, dlouhé 650 nm, TIP v syrovém pórku je 80 C, DEP je 1x10-4 až 1x10-5, LIV při 24 C je 8-11 dní (Bos, 1982 in Šutić a kol., 1999). Žádné kmeny nebyly pojmenovány. 26

27 Geografické rozlišení a ekonomický význam SLV je rozšířen v zemích Asie a Evropy (van Dijk, 1993b; Barg a kol., 1994) a záznamy o výskytu jsou i z Mexika (Barg a kol., 1997). Lze ho považovat za celosvětově se vyskytující (Bos, 1982 in Šutić a kol., 1999). Hostitelé a symptomy Přirození hostitelé viru jsou šalotka, cibule a pór (Šutić a kol., 1999). SLV systematicky infikuje Nicotiana occidentalis a N. hesperis, a dále široký okruh zástupců čeledi Alliaceae. SLV systematicky infikuje Nicotiana occidentalis a N. hesperis, a široký okruh zástupců čeledi Alliaceae, uváděno je až 80 druhů. Symptomy se na hostiteli se projevuje stejným způsobem jako u GarCLV. Pokud se vyskytují slabé symptomy na česneku, cibuli, šalotce a póru, vytváří se světle zelené proužkování na listech (Diekmann, 1997). Šutić a kol. (1999) uvádí, že na šalotce zůstává vir bez příznaků. Jeho výskyt je však spojován se současnou přítomností potyvirů, která intenzitu příznaků potlačuje (Paludan, 1980; Graichen, 1991). V kombinaci s LYSV způsobuje těžkou chlorózu nebo bílé pruhování listů, někdy může dojít až k úhynu. (Paludan, 1980 in Šutić a kol., 1999). U Chenopodium amaranticolor a Ch. quinoa se objevují nekrózy na starších listech a chlorózy na mladších listech. Jsou dobrými testovacími rostlinami (Šutić a kol., 1999). Virus se šíří mechanickým způsobem nebo mšicemi, a to neperzistentní způsobem. K nejčastějším vektorům patří Myzus ascalonicus a Aphis fabae (Bos, 1982 in Šutić a kol., 1999). Přenos SLV mšicemi je méně efektivní než u potyvirů. Vegetativní šíření SLV převažuje u česneku a šalotky (Diekmann, 1997). Virus může být přenášen mechanicky v cibuli, která je bez příznaků. Infikované cibule a mšice jsou hlavní cestou k epidemii. Těmto faktorům by měla být věnována speciální pozornost v ochraně rostlin. Doporučeným opatřením pro kontrolu jiných virů infikujících tuto skupinu rostlin je také efektivní kontrola SLV (Šutić a kol., 1999). Přenos viru semeny nebyl prokázán. Pro experimentální účely se využívají Chenopodium spp., Vicia faba (van Dijk, 1993b). SLV systematicky infikuje Nicotiana occidentalis a N. hesperis, a široký okruh zástupců čeledi Alliaceae. 27

28 3.4.3 Rod ALLEXIVIRUS Tento rod se řadí do čeledi Flexiviridae. Do tohoto poměrně nového rodu Allexivirus je řazena skupina blíže nespecifikovaných virů označována souhrnným názvem Miteborne viruses. Druhy jsou svou délkou příbuzné Potyviridae, vývojově jsou mezi potyviry a carlaviry (Béss, 1999). Název rodu je odvozen od typového člena Shallot virus X. Virové částice jsou obvykle flexibilní, vláknité, o délce přiblížen 800 nm a průměru 12 nm (Agrios, 2005). Genom allerxivirů je tvořený jednovláknovou + ssrna (Agrios, 2005; Boss, 1999). První publikace, ve které se allexivirus objevuje jako člen skupiny rostlinných virů, vyšla v roce 1992 v Moskvě (Zavriev, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Mezi tyto viry se řadí viry česneku (garlic virus) A, B, C, D, E, X (GarVA-E,X), Garlic mite-borne latent virus (GarMbLV), Garlic mite-borne filamentous virus (GarMbFV), Shallot virus X (ShVX), Onion and Shallot mite-borne latent virus (Zavriev, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Geografické rozlišení a ekonomický význam Jmenované viry jsou rozšířeny kosmopolitně (Diekmann, 1997) - záznamy o výskytu jsou z Brazílie (Filho a kol., 2004), Argentiny (Conci a kol., 2003), Japonska (Takaichi a kol., 1998), Slovinska (Barg a kol., 1997), Ruska, Holandska, Německa (Navrátil, 2008), Korei, Taiwanu, Thailandu, Francie a Velké Británie (Zavriev, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Allexivirus nezpůsobuje závažná onemocnění rostlin a proto nepřitahuje zvláštní pozornost fytopatologů, ale je zajímavý z hlediska studií taxonomie, struktury genomu a vztahů mezi rody, druhy a poddruhy různých virů (Zavriev, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Hostitelé Hostitelský rozsah se vztahuje na rod Allium (Astier a kol., 2007; Diekmann, 1997). Infikuje především česnek, cibuli, šalotku, pór a divoce rostoucí druhy jako A. ampeloprasum komplex (Diekmann, 1997). 28

29 Symptomy Příznaky jsou obecně velmi slabé, nebo žádné (od toho název - doslovný překlad zní jako mírně nesený, skrytý vir) (Diekmann, 1997). Symptomy se na hostiteli projevují slabým proužkování, slabou mosaikou nebo mohou také zůstávat latentní, bez příznaků (Yamashita a kol., 1996). Jsou přenášeny pomocí vektora - roztoče Aceria tulipae perzistentním způsobem nebo mechanickým přenosem. Žádný z těchto virů není přenášen mšicemi (van Dijk, 1991, Zavriev, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Nejsou žádné záznamy o přenosu semeny. Díky snadnému přenosu u vegetativně množených cibulovin a přítomnosti roztočů, je výskyt těchto virů v Evropě a Asii vysoký (hlavně u česneku a šalotky). K experimentálním účelům jsou používány hlavně rostliny rodu Allium, dále Chenopodium murale, C. amaranticolor, C. quinoa a Atriplex hortensis, na kterých se lépe objevují příznaky (Diekmann, 1997) Rod FIJIVIRUS Rod Fijivirus patří do čeledi Reoviridae. Dle Astier a kol. (2007) má 8 popsaných druhů. Typový člen je Fiji disease virus (Khan, Dijkstra, 2002, Caciagli, 2008 in Mahy, Regenmortel, 2010). Genom fijivirů je tvořený dsrna (Agrios, 2005). GARLIC DWARF REOVIRUS (GDV) Virové části jsou ikosahedrické, dvouvrstevné, o průměru nm. RNA je dvouřetězcová, segmentovaná. Virus není přenášen mechanicky, ale vektor přenášející tento vir, není znám. Pravděpodobně se jedná o skákající hmyz. Vir je šířen také infikovaným materiálem. Hostitelem viru je česnek. Doposud je na česneku omezená distribuce a nízký výskyt tohoto viru, ale má vysoký potenciál pro zničení úrody česneku. Prvotní příznaky se projevují červenáním konečků bazálních listů. Většina z napadených rostlin neprodělává normální vývoj. Příležitostně může vývoj probíhat normálně, ale později se buď internodia netvoří, nebo jsou velice zkrácená. Rostliny mohou mít vějířovitý vzhled. V některých případech se může zdát, že napadané zakrslé rostliny se znovuobnoví, uzdraví. Ale nové listy se opět objeví se zkrácenými internodii. 29

30 Většina silně zakrslých listů se zbarvuje do tmavě zelené barvy. Na žilnatině se mohou objevovat zduřeniny, nádorky. Cibule napadených rostlin mají hruškovitý tvar, jsou svraštělé, scvrklé s houbovitou, porézní strukturou. I když některé stroužky mají normální velikost, většina jich je malých. Přítomnost viru byla zatím omezena jen na areál jižní Francie. Virové částice mohou být pozorovány elektronovým mikroskopem. Vir se detekuje pomocí DAS - ELISA testu (Diekmann, 1997) Ostatní viry, které mohou popřípadě infikovat česnek Podle Diekmanna (1997) se na česneku mohou vyskytnout ještě další viry, mají však pouze velice malý nebo jen lokální význam. Je to Cucumber mosaic cucumovirus, který byl detekován v Jugoslávii, Lettuce necrotic yellow rhabdovirus v Austrálii, Tobacco mosaic tobamovirus, který se vyskytl v Rusku, Tobacco rattle tobravirus, detekován v Holandsku, Dánsku a Německu (van Dijk, 1993) a nakonec Turnip mosaic potyvirus ve Slovinsku a Izraeli (Ucman a kol., 1997). 3.5 Metody detekce virů Vizuální metody Tradičně používané kontroly porostů česneku jsou založeny na vizuálním hodnocení rostlin. Tato metoda je však často nepřesná a nespolehlivá, protože některé rody virů (například carlaviry) nemusí v hostiteli vyvolat žádné symptomy. Naopak některé viry mohou vyvolávat podobné příznaky, a proto může dojít k jejich záměně. Podobné nebo někdy i stejné viry z různých geografických oblastí byly díky tomuto chybně označeny jako podobné druhy (například potyviry). (Rabinowitch, Currah, 2002) Sérologické metody Dnes patří k nejpoužívanějším diagnostickým metodám pro detekci rostlinných virů. Jsou velmi citlivé, specifické a přesné. Principem je reakce protilátky s antigenem, 30

31 jehož výsledkem je barevná reakce (Rabinowitch, Currah, 2002, Eichmeier, 2006). Touto metodou se zjišťuje přítomnost virů, háďátek, houbových patogenů, patogenních bakterií (Eichmeier, 2006) K nejspolehlivějším a nejčastěji používaným technikám patří diagnostická imunochemická metoda Enzyme - linked immunosorbent assay = ELISA. Vyznačuje se vysokou specifičností a citlivostí, je zde možnost detekce více virů najednou (směsná antiséra). Pomocí testu ELISA lze získat i údaje o sérologické příbuznosti izolátů virů (Rabinowitch, Currah, 2002). Na mikrotitrační destičku se naváže specifická protilátka, na ni se naváže antigen v podobě extraktu zkoumaného vzorku. Přidá se konjugát protilátek s enzymem a substrát a dochází k barevné reakci, která se vyhodnocuje spektrofotometricky. Testování trvá od několika hodin až po dva dny (Žemla, 1995). Při provedení ELISA testu může ovšem docházet k chybám, způsobeným kontaminací vzorků, materiálu, nebo slabou reakcí pozitivních vzorků (Rabinowitch, Currah, 2002, UPOL, 2006 in Eichmeier, 2006). Snížení tohoto rizika umožňuje použití specifických monoklonálních a rekombinačních protilátek (Eichmeier, 2006). V rostlinné virologii se používá varianta DAS ELISA test (Double antipody sandwich ELISA), která je založena na dvojité reakci protilátka antigen (Dovas a kol., 2001; Conci a kol., 1999). One - site - testing: tkáňový otisk ELISA je komerční rychlá metoda pro velké množství vzorků. Testovací sady jsou vhodné zatím jen pro určité viry a bakterie. Citlivost metody je vyšší pro detekci virů než bakterií a je vhodnější pro rostliny, které už vykazují příznaky. Testování trvá několik minut (Eichmeier, 2006) Molekulárně genetické metody (PCR) Jsou určeny pro nejškodlivější rostlinné viry a bakterie (Eichmeier, 2006). Polymerázová řetězová reakce = PCR (Polymerace Chain Reaction) patří k nejperspektivnějším metodám spolehlivější a snadnější identifikace. Byla vyvinuta v Cetus Corporation v Emeryville v Kalifornii koncem roku 1983 (Rabinowitch, Currah, 2002). 31

32 Technika je založena na identifikaci specifických úseků nukleové kyseliny pro daný organismus (Saiki a kol., 1988). Je to jednoduchá metoda, kde stačí velmi malé množství původního vzorku (teoreticky jediná molekula DNA). K detekci RNA virů se používá specifická, vysoce účinná molekulární metoda Reverse Transcription PCR = RT PCR (Takaichi a kol., 1998, 2001; Dovas a kol., 2001 in Rabinowitch, Currah, 2002) Elektronová mikroskopie Jedná se o identifikace virů vizualizací izolovaných virionů obarvených protilátkami (Dovas a kol., 2001; Rabinowitch, Currah, 2002). Je to velice citlivá a přesná metoda. Ale velice náročná na vybavení, kvalifikované specialisty a finance (Rabinowitch, Currah, 2002). Používá se jako jeden z hlavních způsobů zkoumání ve virologii (Wikipedie, 2010). Elektronový mikroskop je podobný optickému, kde jsou fotony nahrazeny elektrony a optické čočky elektromagnetickými. Vynálezcem je německý fyzik Ernst August Friedrich Ruska, který za svůj objev v roce 1986 získal Nobelovu cenu za fyziku (Wikipedie, 2010). Ve virologii se používá transmisní typ el. mikroskopu, nebo imunoelektronová mirkorskopie. Potřeba je měděná nebo niklová mřížka potažená vrstvou umělé hmoty. Pro zvýraznění struktur se používají negativní barviva (kyselina fosfowolframová, molybdenan amonný, uranyl acetát). (Wikipedie, 2010) 3.6 Metody eliminace virů na česneku v podmínkách in vitro Meristémové kultury (metoda izolace meristému) Po mnoho let byly meristémové kultury využívány celosvětově pro produkci viruprostého materiálu. Tato metoda se poprvé objevuje v pracích Morela - Morel a Martin, 1952, 1955 (Novák, 1990). Meristémové buňky tvoří prostředí, které není vhodné pro množení virů, tudíž jejich koncentrace zde bývá nejnižší (Šebánek, Sladký, 32

33 1988). Embryonální buňky nejsou v meristémovém pletivu česneku napadeny nebo skoro vůbec napadeny virovými infekcemi, na rozdíl od virem infikovaných stroužků a jiných rostlinných tkání. Z toho důvodu mohou být rostliny pěstované z meristémové kultury viruprosté (Novák, 1990; Ohkoshi, 1991, Wang a kol., 1994, in Rabinowitch, Currah, 2002). I když někteří autoři uvádějí přítomnost virových částic ve vrcholových částech meristémů, v explantátových kulturách je tato metoda nejvíce používaná a nejlépe propracovaná (Novák, 1990). Úspěšnost podílu získávání zdravých rostlin je odrůdově závislá (Rabinowitch, Currah, 2002). Nejlepší období k odebírání meristémů je podle Havránkové, Havránka (1987) prosinec až leden. Meristémových buněk je však málo a jsou těžko oddělitelné od infikovaných buněk (Ma a kol., 1994, in Rabinowitch, Currah, 2002). Pro praxi platí, že čím je primární explantát menší, tím je pravděpodobnější zisk viruprostého jedince. Na druhou stranu čím je izolovaný vrchol menší, tím je nižší jeho životaschopnost (Novák, 1990). Většinou pokusů byl dokázán vysoký počet embryonálních buněk bez virů pomocí kultivace malých vyříznutých špiček. Další snižování velikosti vzorkovaných tkání není proto žádoucí (nemá praktické využití), ačkoli teoreticky je to technicky možné (Rabinowitch, Currah, 2002). Meristématické buňky jsou malé a všechny mají přibližně stejné rozměry (tzv. izodiametrikcé), buněčná stěna je tenká, jádro velké, místo centrální vakuoly mají několik malých, místo chloroplastů mají drobné, nezelené plastidy. Mezi jednotlivými meristematickými buňkami se nenacházejí interceluláry (Procházka a kol., 2003). Některé, ještě nevyvinuté embryonální buňky mohou získat vir od sousedních, mírně vyspělejších, napadených buněk a to prostřednictvím nově vytvořených plasmodesmat (Rabinowitch, Currah, 2002). Odstraněné meristémy jsou složeny z embryonálních kmenových buněk a ze sousedních buněk, které jsou v procesu diferenciace a proplétání mezibuněčně, cytoplasmaticky spojeny pomocí plasmodesmat. V praxi nicméně existují tkáně složené z kmenových i sousedních buněk a mohou obsahovat více či méně virových částic (následně se objevující rostliny mohou být buď viruprosté, nebo infikované). Jsou proto potřebné velice citlivé metody k detekci virů již v brzkých stádiích vegetativní reprodukce (Rabinowitch, Currah, 2002). 33