informační magazín číslo

Transkript

1 informační magazín číslo INDEX ZDRAVÉ PROSTATY PHI SYSTÉM IGF A NÁDORY HEMATOLOGICKÝ ANALYZÁTOR UNICEL DXH 800 COULTER MIKROPARTIKULY MIKROČASTICE S DÔLEŽITÝMI REGULAČNÝMI FUNKCIAMI

2 Jaký byl rok 2010 a co očekáváme v roce letošním Vážení čtenáři, protože se jedná o první letošní číslo našeho časopisu, rád bych vám úvodem svého článku popřál všechno nejlepší v roce 2011, hodně zdraví, pracovních úspěchů a spokojenosti v osobním životě. Většina z nás na konci roku bilancuje uplynulé období. Zamýšlíme se nad tím, co pro nás uplynulý rok znamenal, co přinesl a co vzal. Věci posuzujeme z pohledu naší fyzické a duševní kondice, úspěchů v pracovní a soukromé sféře, z pohledu rodiny, přátel, známých atd. Jedním z kritérií je také vazba na naše okolí. Na tomto místě jsem se zeptal sám sebe, jaký je vztah naší společnosti k našim zákazníkům, jak jsem se ke svým klientům choval, kam se za uplynulý rok tento vztah posunul a proč, co se na základě toho událo a čím to bylo ovlivněno. Nedávno jsem vedl rozhovor s jedním z našich dlouholetých zákazníků. To, co mi řekl, jsem si rozhodně za klobouk nedal. V uplynulých deseti letech jste byli vzorem společnosti obchodující se zdravotnickými prostředky IVD diagnostiky. Byli jste spolehliví ve vyřizování objednávek i v termínech dodávek zboží, reagovali jste včas na potřeby zákazníka a poskytovali jste technickou podporu nabízených produktů na vysoké úrovni. V minulém roce jste to ale všechno pokazili. Nutno podotknout, že to nebyl jediný odběratel, který si v loňském roce stěžoval na nedostatky v naší práci, především v oblasti vyřizování objednávek a termínů dodávek. Co se vlastně stalo? Abych vám mohl podat uspokojivé vysvětlení, musím to vzít poněkud zeširoka. V roce 2010 prošla naše společnost velkou transformací. Tento proces měl za následek rozsáhlé organizačních změny v oblasti vývoje a výroby našich produktů, ve sféře obchodních a logistických aktivit a přinesl s sebou také přechod na nový informační a plánovací systém. Před rokem 2010 zajišťovala v České republice veškeré komerční aktivity spojené s produkty Beckman Coulter Inc. společnost Immunotech a.s., dceřiná společnost koncernu Beckman Coulter. Ta byla zároveň jeho výrobní a vývojovou jednotkou pro výrobky tzv. Manual Immunoassay Business, jinými slovy pro diagnostické soupravy RIA a ELISA. Na Slovensku pak byly obchodní aktivity zajišťovány společností Immunotech Bratislava s.r.o., dceřinou společností firmy Immuotech a.s. v Praze. Toto uspořádání, především spojení vývojových, výrobních, obchodních a logistických činností, se výrazně odlišovalo od organizační struktury obchodních a výrobních entit společnosti Beckman Coulter jinde ve světě. Navíc v důsledku akvizice diagnostické divize firmy Olympus v roce 2009 společností Beckman Coutler Inc., a tím nutnosti zajistit komerční aktivity i pro tento segment zboží, bylo rozhodnuto vrcholovým managementem koncernu o kompletní restrukturalizaci činností v České republice a na Slovensku a převedení původního informačního systému společnosti Immunotech na systém celosvětově používaný koncernem Beckman Coulter. Co to znamenalo? Ještě na konci roku 2009 byla založena společnost Beckman Coulter Česká republika s.r.o. Do ní byly dnem přesunuty veškeré obchodní činnosti související s diagnostickými systémy společnosti Olympus (do té doby smluvně zajišťované společností Olympus CZ) včetně zaměstnanců. Dne byly obchodní operace (objednávky, dodávky, fakturace) spojené se zbožím pro diagnostické systémy Olympusu převedeny z původního systému Movex (informační systém společnosti Olympus) na systém Oracle. Do společnosti Beckman Coulter Česká republika s.r.o. pak byly dnem plně transferovány obchodní aktivity společnosti Immunotech a.s. zahrnující všechna oddělení a zaměstnance s těmito činnostmi souvisejícími, tedy obchodní a marketingový tým pro domácí trh, exportní oddělení včetně marketingové skupiny pro produktovou podporu manuálních diagnostických souprav, oddělení technické podpory (servis), oddělení administrativní podpory zákazníka (objednávkové oddělení) a oddělení lidských zdrojů. K témuž dni došlo k fyzickému přestěhování těchto útvarů do nových prostor společnosti 2 informační magazín číslo

3 Obsah Stanovení Indexu zdravé prostaty (phi) na systémech Beckman Coulter 6 Stanovování hladin prostatického specifického antigenu (PSA) 8 Studie stanovení phi v České republice a na Slovensku 9 Unikátní menu pro stanovení nádorových markerů na analyzátorech Access 2/Unicel DxI 9 Systém IGF a nádory 10 Hematologický analyzátor UniCel DxH 800 Coulter 13 Mikropartikuly mikročastice s dôležitými regulačnými funkciami 16 Časopis vydává a distribuuje Beckman Coulter Česká republika s.r.o., Radiová 1, Praha 10, Časopis připravují Ing. Vanda Filová, PhD. Ing. Kateřina Kožaná Ing. Eva Králová Ing. Hana Krátká Mgr. Pavel Kružík RNDr. Helena Kurzweilová, CSc. Ing. Kateřina Lapišová, PhD. Ing. Petr Suchan Mgr. Patrik Šaf RNDr. Jozef Smolka Do časopisu přispěli RNDr. Štěpán Tintěra Mgr. Ing. Tereza Tietze Ing. Mgr. Ivana Mičíková Prof. MUDr. Ondřej Topolčan - FN Plzeň Mgr. Radek Kučera - Klatovská nemocnice Ing. Petr Boudal Doc. MUDr. Jozef Kollár, DSc. - Univerzita J.P. Šafárika Mgr. Pavel Kružík Ing. Vanda Filová, PhD. Mgr. Patrik Šaf Mgr. Jozefína Bernátová Ing. Eva Králová Mgr. František Vičar Ing. Hana Krátká RNDr. Jozef Smolka Lucie Rýglová Ing. Kateřina Kožaná Ivan Šarkan - autor křížovky Ing. Stanislav Čermák - autor tajenky Graf ická podoba Nina Nováková Tiskárna REPRO servis s. r. o. Starochuchelská 15/195, Praha 5 Náklad čísla 1800 výtisků Nový fluorochrom Krome Orange a reagencie pro průtokovou cytometrii 23 Nová verze software Kaluza Katalog reagencií a přístrojů pro průtokovou cytometrii e Průtokový cytometr MoFlo Astrios 24 Jak jsme zjišťovali očekávané hodnoty aneb upíři v Čechách ještě nevymřeli 24 Očekávané hodnoty reninu se soupravou Beckman Coulter aneb jak to vlastně celé dopadlo 25 AMH Gen II ELISA A79765/A79766 očekávané hodnoty 27 Prvé stretnutie užívateľov koagulačných systémov Instrumentation Laboratory 29 ( októbra 2010, Jasná) Studentská vědecká konference na VŠCHT 30 Odborná a společenská setkání s našimi obchodními partnery 31 Setkání uživatelů RIA a imunochemických systémů Beckman Coulter 33 (30. ledna 1. února 2011, Teplice nad Bečvou) Cieľom nie je vrchol cieľom je cesta 34 Křížovka o ceny 35 Kde se můžeme setkat 36 informační magazín číslo

4 Beckman Coulter Česká republika s.r.o., které si pronajala a zrekonstruovala během tří měsíců na adrese Murmanská 4 v Praze Vršovicích. Ve stejném termínu byl zaveden nový systém zabezpečování kvality společný pro komerční jednotky společnosti Beckman Coulter v Evropě (a nejen v Evropě). Dne byl spuštěn informační systém Oracle i pro ostatní produkty společnosti Beckman Coulter, dříve podporované společností Immunotech a.s. V průběhu května minulého roku došlo k zavedení systému Demantra. Ten slouží k plánování výroby ve výrobních entitách po celém světě v rámci koncernu Beckman Coulter, a to na základě poptávky a objednávek od zákazníků. Cílem tohoto systému je optimalizace a efektivní využití výrobních kapacit a plánování zdrojů pro výrobu. Ve 2. čtvrtletí roku 2010 bylo vrcholovým managementem určeno, že se Praha stane logistickou centrálou koncernu pro celou východní Evropu. Toto rozhodnutí souviselo s otevřením nových obchodních entit koncernu v Polsku, Maďarku a Chorvatsku. V červenci loňského roku tak byla zahájena rekonstrukce skladů v sídle společnosti Immunotech a.s., která zajišťuje veškerou logistiku zboží a zároveň surovin pro vlastní výrobu. Dále byl začátkem listopadu nainstalován nový skladový systém (zahrnuje především systém čárových kódů a nový regálový systém, tisk balicích a dodacích listů, systém pro konsolidaci objednávek, systém pro registraci objemu a hmotnosti skladovaného a přepravovaného zboží) pro zásoby, skladování, balení, vyskladnění a expedici. To vše za probíhající rekonstrukce skladových prostor. Koncem listopadu pak byly Česká republika a Slovensko převedeny z pohledu zajišťování logistických operací do tohoto nového centra. Veškeré zboží, do té doby na skladech, pro Čechy, Moravu a Slovensko bylo systémově převedeno do nové centrály. Opět za stále probíhající přestavby skladů. To byl výčet organizačních a systémových změn, jimiž prošla naše společnost v minulém roce. Jejich výsledkem je existence společností Beckman Coulter CZ, Beckman Coulter SK, Immunotech a.s. a v rámci společnosti Immunotech a.s. také nového logistického centra pro východní Evropu. Tyto transformační procesy nebyly samoúčelné. Vedly k tomu, že jak výrobní, tak i obchodní aktivity těchto společností mohly využívat glo- 4 informační magazín číslo

5 bální informační systémy koncernu s cílem zavést jednoznačně definované procesy a jejich standardizaci. Neméně významnou snahou je zefektivnění veškerých aktivit koncernu, rovněž v souvislosti s projektem Lean Six Sigma. Všechny uvedené změny byly a jsou zaváděny za účelem budování moderní společnosti, která nejenom že obstojí v dnešním velice náročném ekonomickém prostředí, ale přinese také nové hodnoty na trh s IVD zdravotnickými prostředky. V letošním roce bude převedena organizace logistiky Polska, Maďarska a Chorvatska do pražského logistického centra pro východní Evropu. Současně začínáme využívat služeb nového dopravce, a to společnosti TNT. Dříve jsme měli pro tyto účely uzavřenou smlouvu se 3 dopravci podle druhu přepravovaného zboží. Taková smršť změn má však i svou odvrácenou tvář. V průběhu celého loňského roku jsme monitorovali spokojenost našich zákazníků. Některé kroky, které jsme v rámci organizačních a systémových přeměn realizovali, měly jednoznačně negativní vliv na jejich spokojenost. Konkrétně se jedná o oblast vyřizování objednávek a dodávek. Již méně se pak tyto změny odrazily v technické, produktové či odborné podpoře zákazníka. Nicméně si uvědomujeme, že včasné a kompletní dodávky zboží patří k základním podmínkám toho, aby mohl být klient spokojený. V tomto ohledu jsme bohužel propadli. Co teď s tím? V roce 2011 se chceme více soustředit na jednotlivé procesy, a to z pohledu konečného uživatele. V minulém roce jsem se zaměřili především na zavedení nových systémů v plánovaných termínech a zvládnutí základní obsluhy, poznání a nastavení základních procesů. Letos je naším cílem revize a adaptace těchto procesů nikoliv z hlediska termínů, ale z pohledu vlivu na spokojenost zákazníka. Při eliminaci negativ se zaměříme především na zvládání nových systémů na profesionální úrovni. Celá řada chyb, jichž jsme se v minulém období dopustili, pramenila z velké části právě z neznalosti těchto systémů. Nedostatky hodláme odstranit intenzivním školením pracovníků. Rovněž jsme zavedli spokojenost zákazníka jako bonusovou položku pro zaměstnance, kteří mají přímý či nepřímý vliv na tento aspekt. Koncern Beckman Coulter zavedl celosvětově ve svém systému motivace, řízení výkonu a odměňování pracovníků spokojenost zákazníka jako jeden ze základních parametrů pro jejich odměňování. První reakcí dotčených zaměstnanců byl údiv či dokonce nepochopení. Jak zrovna oni mohou ovlivnit spokojenost zákazníka? To bude asi nejtěžším oříškem. Pomůckou, jak tento postoj změnit, může být otázka, kterou by si měl každý z nich při své práci položit: Co by tomu asi náš klient řekl?, Jak mohu zlepšit zákazníkovu důvěru v naši společnost? Těmito otázkami se dostávám k dalšímu tématu jak zlepšit zákazníkovu spokojenost pomocí změny firemní kultury, prostřednictvím změny uvažování lidí o tom, co je v rámci jejich práce posláním. Důvěra našich zaměstnanců prošla v minulém období značnou zatěžkávací zkouškou. Enormní nároky na jejich výkon při současném poklesu spokojenosti zákazníka vyvolaly pochyby, zda se naše společnost ubírá správným směrem. Naštěstí se rychle projevily i výhody některých změn a tím byl nástup deziluze zastaven. Nicméně úkolem vedení naší společnosti je jasná komunikace také dovnitř firmy, k vlastním zaměstnancům, stanovení jasné vize a mise společnosti, nastavení firemních pravidel komunikace a definování způsobů, jakými stanovených cílů dosáhneme. V průběhu psaní tohoto článku vrcholový management a správní rada koncernu oznámili, že vstoupili do akvizičního jednání se společností Danaher. Možná jste někteří z Vás koncem loňského roku zaregistrovali, či jste byli někým informováni, že se ve finančních světových mediích objevila zpráva, že je Beckman Coulter na prodej. Někteří nepřející z toho ihned vyvodili zcela nesprávný závěr, a to že Beckman má potíže. Jsem velice rád, že na jasném důkazu mohu tuto pomluvu vyvrátit. A co je tím důkazem? Cena, za kterou hodlá společnost Danaher koupit koncern Beckman Coulter. Hodnota akcie společnosti Beckman Coulter v únoru 2011 dosáhla rekordní úrovně za celé historicky sledované období, což je jasnou známkou toho, že Beckman Coulter potíže nemá. Vrcholní představitelé společnosti jednají o restrukturalizaci a konsolidaci vlastníků. Výsledkem by měl být pružnější způsob rozhodování vedení společnosti v otázkách dlouhodobé strategie. Co říci na závěr. Až budete číst toto vydání časopisu In Vitro Diagnostika, budeme mít za sebou první čtvrtletí roku To by se již měly dostavit první pozitivní výsledky našich snah. Pevně věřím a jsem o tom i přesvědčen, že naše společnost dosáhne cílů, jež si předsevzala, a to k vaší plné spokojenosti. ŠTĚPÁN TINTĚRA STINTERA@BECKMAN.COM FOTO: LUCIE RÝGLOVÁ informační magazín číslo

6 Stanovení Indexu zdravé prostaty (phi) na systémech Beckman Coulter Karcinom prostaty je jednou z hlavních příčin úmrtí na nádorová onemocnění. Co je PSA a jak nám znalost jeho struktury může v prevenci tohoto zpočátku často nenápadného onemocnění pomoci? Co je Index zdravé prostaty (phi)? Wang a jeho spolupracovníci identifikovali a izolovali čistý prostatický specifický antigen (PSA) v roce PSA (serinová proteáza) je produkován epitelovými buňkami prostaty, přičemž jej vytváří jak buňky benigní, tak i maligní. Abnormality architektury prostatické žlázy způsobené traumatem či onemocněním mohou vést k prosakování PSA do krevního řečiště. Sérový PSA existuje primárně buď ve volné nekomplexní formě (fpsa), nebo jako komplexní (cpsa), primárně s inhibitorem sérové proteázy, alfa 1-antichymotrypsinem. Obvykle je 70 až 90 % PSA v séru přítomno jako cpsa a zbytek tvoří fpsa. Bylo prokázáno, že znalost poměru fpsa vůči PSA (% fpsa) v séru významně zvyšuje možnost rozlišení karcinomu prostaty od benigních prostatických stavů, zvláště pak u pacientů s hladinami PSA v rozmezí od 4 do 10 ng/ml. Vyšší %fpsa v séru koreluje s nižším rizikem karcinomu prostaty, zatímco hodnoty %fpsa pod 10 % jsou mnohem více spojovány s karcinomem. ProPSA a BPSA představují rozdílné formy fpsa, které prokazují větší asociaci s onemocněním než PSA, fpsa nebo cpsa samotné. Ukázalo se, že zkrácené formy propsa jsou zvýšené v periferní zóně tkáně karcinomu v porovnání s tkáněmi BPH (benigní hypertrofie prostaty). ProPSA byl vyšší v tkáni tumoru prostaty, zatímco BPSA byl zvýšený v nodulární tkáni přechodové zóny BPH v porovnání s koncent- Název PN Access Hybridech PSA Access Hybridech PSA calibrators Access Hybridech PSA QC Access Hybridech fpsa Access Hybridech fpsa calibrators Access Hybridech fpsa QC Access Hybridech p2psa A49752 Access Hybridech p2psa calibrators A49753 Access Hybridech p2psa QC A56934 Detekce karcinomu prostaty: % specificity Beckman Coulter phi v porovnání s PSA a %fpsa při 90% klinické senzitivitě rací v tkáni periferní zóny. Bylo nalezeno několik isoforem propsa. Tyto isoformy jsou pojmenovány podle délky řetězce, tzv. pro-leader peptidu: [-7]proPSA (délka pro-leader peptidu je 7 aminokyselin), [-5]pro- PSA, [-4]proPSA a [-2]proPSA. Nejvíce pozornosti se věnuje právě [-2]proPSA, protože jde o primární formu nalezenou v extraktech z tumorů vykazující vyšší imunobarvení v tumoru prostaty než benigní tkáň. Kromě toho je [-2]proPSA in vitro nejstabilnější z pěti identifikovaných forem propsa. Access Hybritech p2psa vyvinula společnost Beckman Coulter pro měření [-2]proPSA v séru. Ve studiích, do kterých byli zařazeni muži, u nichž biopsie potvrdila karcinom prostaty, se ukázalo, že [-2]proPSA v rozsahu 2 až 10 ng/ml zlepšoval specificitu detekce karcinomu vůči %fpsa samotnému. Užitečnost [-2]proPSA u mužů s PSA pod 4 ng/ml je zvláště zajímavá, protože i u této skupiny se vyskytuje značné množství karcinomů. Údaje z literatury jsou ve shodě se zamýšleným použitím stanovení Access Hybritech p2psa společně se stanoveními Access Hybritech PSA a freepsa pro výpočet Beckman Coulter phi v dalším hodnocení pacientů s úrovněmi PSA v rozpětí od 2 do 10 ng/ml (při použití WHO kalibrace v rozpětí 1,6 až 7,8 ng/ml). Údaje z literatury podporují závěr, že prekurzorní formy PSA nastupují jakožto potenciální důležité diagnostické sérové markery pro rozšíření a zlepšení detekce karcinomu prostaty. Z výsledků multicentrického klinického hodnocení je zřejmé, že hodnoty Beckman Coulter phi významně přispívají ke zdokonalení klinické specificity stanovení při detekci karcinomu prostaty. Při 95% klinické citlivosti byla klinická specificita pro Beckman Coulter phi 18,2 % v porovnání s 6,6 % pro %fpsa u PSA v rozsahu od 2 ng/ml do 10 ng/ml. Zlepšení klinické specificity pro Beckman Coulter phi vůči %fpsa představuje zásadní výhodu při diferenciální diagnostice prostaty pro odlišení karcinomu od benigních prostatických stavů u mužů ve věku nad 50 let s celkovým PSA od 2 do 10 ng/ml, u nichž nálezy digitálního rektálního vyšetření nevzbuzují podezření na výskyt karcinomu. Beckman Coulter phi lze rovněž použít k hodnocení rizika stanovení pravděpodobnosti vzniku karcinomu u individuálního pacienta. Vyšší hodnoty Beckman Coulter phi jsou spojeny s vyšší rizikem karcinomu. TEREZA TIETZE TTIETZE@BECKMAN.COM IVANA MIČÍKOVÁ IMICIKOVA@BECKMAN.COM 6 informační magazín číslo

7 Hledáte ideálního PSA? HO MÁ! informační magazín číslo

8 Stanovování hladin prostatického specifického antigenu (PSA) tanovování hladin prostatického specifického antigenu (PSA) přináší značné zpřesnění časné diagnostiky v oblasti prostatických patologií, ale současně má bohužel i svá omezení. Nejčastějším problémem bývá zbytečně vysoký počet biopsií. Dále hladina celkového PSA a %fpsa nedostatečně korelují s agresivitou nádoru. Rovněž je problematická interpretace změn hodnot PSA v průběhu cytostatické a hormonální terapie. Existují navíc i karcinomy prostaty s nízkou hladinou celkového PSA. Proto se hledá další možnost, jak tuto diagnostiku zpřesnit a zjednodušit. Jednou z možností by mohlo být stanovování frakce fpsa označovaného jako propsa (p2psa). Tato frakce by se měla zvyšovat pouze za přítomnosti karcinomu prostaty. Současně je možné z hladin všech tří analytů (PSA, fpsa a propsa) vypočítat tzv. prostate health index (phi) pomocí vzorce: phi = (propsa/fpsa) x PSA. V následujících kazuistikách předkládáme první zkušenosti s tímto analytem. Cutt-off používané naší laboratoří: PSA 3 ng/ml Poměr fpsa/psa 20 % propsa 25 pg/ml phi 30 1) Pacient 43. ročník, v roce 2009 vyšetřen na urologické ambulanci pro obtížnou mikci, nykturii 2 x za noc. Palpačně prostata hladká, elastická, zvětšená cca 4 x 4 cm, ohraničená. USG benigního vzhledu, prominuje do mm. Hodnota PSA 6,91, poměr fpsa/psa 28 %. Nasazeno a-sympatolytikum a kontroly po 2 měsících (PSA 5 15). 12/2010 st. p. retenci moče, proud moči slabý, přerušovaný, nykturie 3 x. USG velikost prostaty 6 x 5 x 6 cm. Hodnoty: PSA 15,6, poměr fpsa/psa 18,3 %, propsa 19,8 a phi 27. Doporučena TVPE nebo TURP. propsa dle našich kriterií i hodnota phi potvrzovaly benigní etiologii. Výsledky umožňují volit operační řešení. 2) Pacient 49. ročník, vyšetřován v roce 2009, hodnota PSA 14,1 s nálezem biopsie lowpin. Dále nevyšetřován. V 11/2010 retence na dovolené v zahraničí, zaveden permanentní katétr, pokusy o spontánní mikci neúspěšné. Palpačně prostata hladká, spíše benigní, ohraničená. USG zvětšená s endovesikální prominencí (HWL 80 g). 12/2010 hodnoty: PSA (při cévce) 27, poměr fpsa/psa 20,7 %, propsa 15,6, phi 14, negativní biopsie (disperzní chronická zánětlivá celulizace, hyperplazie). Objednán k TURP. ProPSA i hodnota phi potvrzovaly benigní vzhled prostaty. Bude nutno ověřit zda propsa neumožní odlišit falešně positivní výsledky celkového PSA (u tohoto pacienta zánět). 3) Pacient 37. ročník, hospitalizovaný 12/2010 v léčebně respiračních nemocí s metastázami v obou plicních křídlech. Při pátrání po origu PSA 112. Vyžádáno urologické konzilium. USG prostaty, prostata hraniční velikosti, neprominuje, nehomogenní. Hodnoty: PSA 112, poměr fpsa/psa 15 %, propsa 587, phi biopsie prostaty negativní, objednána rebiopsie. Extrémní hodnoty propsa i phi jsou v souladu s PSA, nicméně se první biopsií nepodařilo prokázat origo. Výsledek propsa a phi vylučuje možnost nespecifického zvýšení a nutí k další biopsii. 4) Pacient 39. ročník, v péči urologů po resekci tumoru levé ledviny. V roce 2009 pro obtížné močení terapie fytofarmakem (PSA 9,8, poměr fpsa/psa 23 %). Palpačně prostata velikosti švestky, tužší pravý lalok. 8/2010 pro elevace PSA na 14 indikována biopsie, kde byl nález skupiny atypických žlázek. Hodnoty 1/2011: PSA 10,8, poměr fpsa/psa 8,3 %, propsa 26,7, phi 98. Doporučen odběr ze suspektního místa biopsie potvrdila adenokarcinom prostaty. Hodnota phi podpořila podezření na možnou malignitu a potvrdila nutnost rebiopsie, při které karcinom potvrzen. 5) Pacient 46. ročník, v 6/2010 si stěžuje na dyskomfort v dutině břišní a na intermitentní bolesti podbřišku. Vyšetření sono a CT břicha pouze hyperplazie prostaty. 11/2010 na urologické ambulanci prostata palpačně benigní. Hodnoty: PSA 12,57, poměr fpsa/psa 32 %, propsa 111, phi 99. Doporučena biopsie. 12/2010 histologicky ve všech vzorcích biopsie zastižen adenokarcinom prostaty Gleason 9 (4 + 5). Typický příklad toho, jak totální PSA nekoreluje s agresivitou nádoru. Bude korelovat propsa a phi? 6) Pacient 41. ročník, po RAPE pro středně diferencovaný adenokarcinom s perineurálním šířením G2 ptbpnxm0 Gleason 6 (PSA 9,17), Kompletní androgenní blokáda. Od pooperační hladiny PSA 0,2 navyšování na 0,96 v 6/2010 bez průkazu generalizace. Indikován k ozáření lůžka po PE a svodné lymfatiky. Hodnoty: PSA 0,87, poměr fpsa/psa 3,9 %, propsa 1,58, phi 46. Výsledky propsa a phi podle našich pracovních referenčních rozmezí problém neřeší, avšak narozdíl od poměru a nárůstu PSA svědčí pro stabilizovaný stav. PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN ODDĚLENÍ IMUNOCHEMICKÉ DIAGNOSTIKY FAKULTNÍ NEMOCNICE PLZEŇ DR.E. BENEŠE 13, PLZEŇ TOPOLCAN@FNPLZEN.CZ 8 informační magazín číslo

9 Na několika pracovištích v České republice a na Slovensku probíhá ve spolupráci s urology studie stanovení phi prostřednictví měření PSA, fpsa a [-2]proPSA na analyzátorech Beckman Coulter. Postupně bychom vás chtěli formou krátkých otázek a odpovědí s jednotlivými laboratořemi, resp. jejich představiteli seznámit. Dnes přinášíme rozhovor s prvním z nich. Prof. MUDr. Ján Kliment, CSc. Univerzitná nemocnica Martin Prof. MUDr. Ján Kliment, CSc. je urológom v Univerzitnej nemocnici v Martine a zároveň podpredsedom Slovenskej urologickej společnosti. Na jeho pracovisku jsme prezentovali a potom na analyzátore UniCel DxI zaviedli metodu pro2psa. Koľko biopsií prostaty ročne vykonáte? Ročne vykonávame na našom pracovisku okolo 300 biopsií prostaty. Studie stanovení phi v České republice a na Slovensku Ako sa rozhodujete pre biopsiu (podľa akých kritérií)? Indikáciou sú vyššie hodnoty PSA namerané v sére pacienta bez ohľadu na palpačný nález na prostate. Druhou indikáciou biopsie prostaty je suspektný palpačný nález na prostate aj pri hodnote PSA, ktorá nepresahuje normálne hranice. Opakované biopsie prostaty sa vykonávajú u pacientov, u ktorých bolo bioptické vyšetrenie negatívne a pretrváva podozrenie na prítomnosť karcinómu prostaty, napr. trvale vyššia alebo stúpajúca hodnota PSA, nález premalígnych lézii v predchádzajúcom bioptickom materiály. Opakované biopsie s ročným alebo aj dlhším odstupom od primárnej bioptickej diagnostiky sa odporúčajú tiež u pacientov s potvrdeným karcinómom prostaty, ktorí sú na aktívnom sledovaní s cieľom potvrdiť alebo vylúčiť progresiu ochorenia v histologickom obraze. Čo znamená biopsia pre pacienta (hospitalizáciu, )? Biopsia prostaty sa vykonáva punkciou prostaty cez konečník pod ultrazvukovou kontrolou. Robí sa ambulantne. Po biopsii pacient odchádza domov s odporučenou antibiotickou liečbou na niekoľko dní. Biopsiu pacienti dobre tolerujú, bolestivosť je minimálna. Unikátní menu pro stanovení nádorových markerů na analyzátorech Access 2/ Unicel DxI Hybritech PSA Hybritech free PSA Hybritech p2psa CEA AFP OV Monitor (CA 125 Ag) BR Monitor (CA 15-3 Ag) GI Monitor (CA 19-9 Ag) informační magazín číslo

10 Systém IGF a nádory nzulinu podobné růstové faktory (IGF, insulin-like growth factors, dříve somatomediny) jsou peptidy, které se podílejí na řízení růstu, metabolizmu, přežívání a diferenciaci buněk. Jsou regulovány růstovým hormonem (GH). IGF jsou syntetizovány v játrech. Vyskytují se v séru a dalších tělních tekutinách (viz tabulka 1). Dále je známa jejich extrahepatální produkce a působení autokrinním a parakrinním mechanizmem. Vazebné proteiny pro IGF, tzv. IGFBP (insulin-like growth factor binding proteins) se nacházejí v různých tělních tekutinách, jako je krevní sérum, plodová voda nebo mozkomíšní mok (viz tabulka 2). Jsou syntetizovány v játrech, nebo také různými typy nádorových buněk. IGFBP zvyšují poločas IGF v séru. Inhibují nebo podporují působení IGF vazbou na receptory cílových buněk. Tyto vazebné proteiny navíc fungují jako zásobárna IGF v mezibuněčném prostoru. Účinek IGF1 a IGF2 na buňku se odehrává prostřednictvím receptorů. Receptory IGF patří do skupiny receptorových protein tyrosin kináz (PTK), které fosforylují své substrátové bílkoviny na tyrosinových zbytcích. Patří sem receptory pro většinu peptidických růstových faktorů. Ty se uplatňují v regulaci růstu a diferenciace buněk (viz tabulka 3). Tabulka 1: IGF Růstový faktor Molekulová hmotnost (Da) Počet AK IGF IGF Tabulka 2: IGFBP Vazebný protein Molekulová hmotnost (kda) Fyziologická funkce Řízení růstu, metabolizmu, přežívání a diferenciace buněk v postnatálním vývoji Řízení růstu, metabolizmu, přežívání a diferenciace buněk v prenatálním vývoji Vazebná afinita Výskyt IGFBP1 34 IGF1, IGF2 placenta, plodová voda IGFBP2 27 IGF2 mozkomíšní mok IGFBP3 53 IGF1, IGF2 sérum IGFBP4 26 IGF1, IGF2 osteoblasty IGFBP5 23 IGF1, IGF2 nízká afinita ledviny, osteoblasty IGFBP6 22,8 IGF2 mozkomíšní mok IGFBP7 (mac25), váže IGF1 a IGF2, nádorový supresor IGFBP8 (CTGF), tkáňový pojivový růstový faktor, váže IGF2, proliferace kostních buněk Tabulka 3: Receptory pro IGF Receptor Struktura Vazebná afinita Přenos signálu IGF1R dimer 2α, 2β podjednotky IGF1, IGF2 ANO IGF2R monomer IGF2 NE IR (IR-A, IR-B) IR/IGF1R (IR-A/IGF1R, IR-B/IGF1R) dimer 2α, 2β podjednotky dimer 2α, 2β podjednotky IGF1, IGF2 IGF1, IGF2 ANO ANO Signální dráhy IGF Po úspěšném navázání na receptor pokračuje přenos signálu uvnitř buňky po signální dráze, což je vlastně kaskáda enzymů a jejich substrátů (viz Schéma 1). Po aktivaci IGF1R dochází prostřednictvím adaptorového proteinu inzulin receptorový substrát (IRS1) k aktivaci dvou hlavních kaskád. První je signální dráha PI3K/PKB (fosfatidylinositol-3-kináza/proteinkináza B) a druhou signální dráha ERK (extracellular signal regulated kinases), která patří mezi několik MAP kinázových drah (MAPK mitogen activated protein kinases). PI3K/PKB je mimořádně důležitá intracelulární signální dráha. Je zapojena do řady normálních buněčných procesů podílejících se na proliferaci, metabolizmu, růstu a přežití buněk. Její abnormality, způsobené izoformami a mutacemi různých regulačních komponent, vedou k některým formám nádorových onemocnění. Ústřední komponentou této dráhy je heterodimer PI3K tvořený regulační podjednotkou p85 a katalytickou podjednotkou p110, které nacházíme běžně pozměněné mutacemi u nádorových onemocnění. Aktivace PI3K vede ke zrušení inhibičního účinku regulační podjednotky p85 s následnou aktivací katalytické podjednotky p110. Ta obratem přeměňuje membránový fosfatidylinositol-3,5-bifosfát (PIP2) na trifosfátovou formu (PIP3). PIP3 poté indukuje fosforylaci PKB prostřednictvím proteinu PDK1. Komplex PI3K je za normálních okolností negativně regulován specifickou fosfatázou PTEN. PTEN působí jako negativní regulátor PI3K dráhy tím, že hydrolyzuje PIP3 na PIP2. V důsledku ztráty funkce PTEN mutací nebo epigenetickou modifikací se ale mohou vyskytnout alterace vedoucí k hyperaktivaci PI3K. Ztráta funkce PTEN podporuje akumulaci PIP3, která vede k deregulaci přenosu signálu přes kaskádu PI3K/PKB. PKB se účastní ještě řady dalších signálních kaskád. Zasahuje tedy do celé řady buněčných dějů (proteosyntéza, přežívání, proliferace, metabolizmus glukózy apod.). Aktivace deregulované signální dráhy PI3K/PKB poskytuje buňce signály pro neomezený růst a přežití. Druhou signální dráhou je kaskáda ERK (extracellular signal regulated kinases). Po aktivaci IRS1 se signál přenáší přes GTPasu Ras a kinázy Raf a MEK, které konečně vedou k aktivaci MAP kinázy, konkrétně ERK. ERK patří mezi první prozkoumané MAP kinázy savčích buněk. Skupina enzymů nazývaných MAP kinázy reguluje expresi genu, případně proliferaci a diferenciaci buňky. IGF a jejich vliv na nádorovou transformaci buněk Z mechanizmu účinku IGF1 a IGF2 na buňky se usuzuje, že vysoké sérové hladiny IGF zvyšují riziko vzniku nádorů a svým dalším působením zvyšují proliferaci a riziko maligního zvratu. Naproti tomu vysoké hladiny sérových vazebných proteinů IGFBP, zejmé- 10 informační magazín číslo

11 na dominantního sérového vazebného proteinu IGF- BP3, by měly riziko snižovat a růst buněk omezovat. Nezávisle na hladinách IGF je možné prohlásit, že nádorová transformace buněk je možná v případě přítomnosti funkčních IGF1R. Zajímavé je, že schopnost onkogenů způsobit transformaci, závisí na jejich schopnosti fosforylace IGF1R. Neporušená tyrosin kinázová doména je zásadní podmínkou toho, aby IGF1R vykonával své silné antiapoptotické a transformační činnosti (1). Schéma 1: Mechanizmus účinku IGF Shrnutím výše uvedeného dostáváme tři základní podmínky přenosu signálu IGF systému do buňky: přítomnost funkčních receptorů neporušená tyrosin kinázová (TK) doména fosforylace TK domény Pokud je buňka schopna přijímat signály, přichází na řadu role tří extracelulárních rizikových faktorů: lokální extrahepatální produkce IGF autokrinní a parakrinní funkce IGF zvýšená sérová hladina IGF Další dva faktory jsou intracelulární a jsou jednoznačně nejrizikovější: mutace v signální dráze genové mutace Spolu s narůstajícími znalostmi o fungování systému IGFs se začaly prověřovat teorie o odpovědnosti IGF za vznik některých maligních onemocnění. Zpočátku malé prospektivní epidemiologické studie neprokázaly spojení mezi zvýšenými hladinami IGF1 a nádory. Nicméně některé v poslední době provedené rozsáhlé studie podaly důkaz o tom, že jsou vysoké cirkulující koncentrace IGF1 a nízké hladiny IGFBP3 spojeny se zvýšeným rizikem rakoviny. Negativní korelace mezi úrovní IGFBP3 a rizikem rakoviny je v souladu s ochrannou rolí IGFBP3 (tj. vysoké koncentrace IGFBP3 vedou ke snížení hodnot volného IGF1). Některé studie však i přes svůj rozsah nepřinesly jasné potvrzení vztahu IGF a jejich vazebných proteinů ke vzniku nádorů. Významnou se ukázala být také autokrinní či parakrinní role IGF. U různých nádorových onemocnění bylo zjištěno zvýšení místní produkce IGF1 nebo IGF2 nebo jejich kombinace. Většinou se jednalo o pozitivní korelaci s progresí nádorů (2, 3). Co se týče exprese IGF1R, objevují se ve větší míře teorie, že zvýšená exprese znamená horší prognózu nádorového onemocnění. Avšak je neustále nutné hodnotit prognostický význam IGF1R s opatrností, a to v důsledku rozporných výsledků některých studií (4, 5). Nesoulad může být způsoben preanalytickou fází (konzervace tkání, velikost vzorků), použitou metodikou a interpretací dat. Sumarizací výsledků značného množství studií vznikly tabulky vztahu sérových hladin a tkáňové produkce jednotlivých složek IGF systému k nádorovým diagnózám (viz tabulka 4 a tabulka 5). Biologický účinek IGF je zprostředkován IGF1 receptorem (IGF1R). IGF1 a IGF2 se váží na extracelulární doménu IGF1R. Tyrosin kinasové receptory po aktivaci autofosforylují na cytoplasmatické doméně a přes aktivaci adaptorového proteinu inzulin receptorového substrátu (IRS1/2) se aktivují dvě hlavní signální kaskády. Signální dráha PI3K (fosfatidylinositol-3- kináza)/pkb (proteinkináza B) a signální dráha ERK (extracellular signal regulated kinases), která je jednou z několika MAP kinázových drah (MAPK mitogen activated protein kinases). Tabulka 4: Vztah sérových hladin IGFs, IGFBPs a nádorových diagnóz (6, 7, 8, 9, 10, 11) Diagnóza IGF1 IGF2 IGFBP3 jiný IGFBP Kolorektální adenom IGFBP1 Kolorektální karcinom IGFBP1 Endometriální karcinom Karcinom prsu Ovariální karcinom Karcinom děložního čípku Karcinom prostaty Karcinom žaludku Hepatocelulární karcinom Karcinom pankreatu IGFBP1 Adenom štítné žlázy Karcinom plic Melanomy Akutní lyfoblastická leukémie IGFBP2 Akutní myeloidní leukémie Sarkomy Vysvětlivky: zvýšená hladina snížená hladina nalezeny zvýšené i snížené hladiny údaje nenalezeny informační magazín číslo

12 Tabulka 5: Vztah tkáňové produkce IGFs, tkáňové exprese IGF1R a nádorových diagnóz (12, 13, 14, 15, 16) Diagnóza IGF1 IGF2 IGF1R Kolorektální adenom Kolorektální karcinom Endometriální karcinom Karcinom prsu Ovariální karcinom Karcinom děložního čípku Karcinom prostaty Karcinom žaludku Hepatocelulární karcinom Karcinom pankreatu Adenom štítné žlázy Karcinom plic Melanomy Akutní lyfoblastická leukémie Akutní myeloidní leukémie Sarkomy Vysvětlivky: zvýšená tkáňová produkce či exprese snížená tkáňová produkce či exprese údaje nenalezeny Závěr V současné době se podařilo objasnit fungování signální dráhy IGF a je známa již celá řada propojení s ostatními signálními drahami. Pro její fungování je klíčovým prvkem nepoškozený IGF1R. Jsou známé lokace genů pro IGF, vazebné proteiny a receptory. Díky těmto poznatkům bylo možné vyvinout IGF1R inhibitory, které přinášejí slibné výsledky v onkologické léčbě (prozatím ve farmakologických studiích). Přes veškeré naše aktuální poznatky není možné vztah sérových hladin IGFs a vazebných proteinů k riziku nádorových onemocnění jednoznačně specifikovat. V těchto dnech se vedou diskuze o tom, proč se výsledky provedených studií tak značně liší či dokonce proč některé studie dochází k vyloženě protichůdným zjištěním. Podle závěrů některých autorů by možné příčiny nesrovnalostí mohly být tyto: cirkulující hladiny IGF a jejich vazebných proteinů neodrážejí přesně jejich koncentrace ve tkáních do procesu aktivace signální cesty IGF receptoru a jejího konečného působení na buňku zasahují též jiné látky, které ji ve výsledku svého působení buď podporují, nebo zeslabují (inzulín, steroidní hormony, adiponektin apod.), a hodnocení hladin IGF se zřejmě neobejde bez zasazení do kontextu s hladinami těchto působků samotná signální cesta IGF receptoru je pozitivně i negativně ovlivňována mechanizmy, které známe (viz předchozí bod), ale také mechanizmy, jejichž existence se předpokládá, ale ještě nejsou detailně zmapovány někteří autoři poukazují na nedostatky ve výběru souborů pacientů a nedostatečné údaje z lékařských dokumentací, zejména co se týče délky působení zvýšených hladin IGF a přítomnosti některých dalších onemocnění působení dalších vlivů (např. dietní návyky, pohybová aktivita) a dalších onemocnění (diabetes, metabolický syndrom, jaterní onemocnění apod.) MGR. RADEK KUČERA ODDĚLENÍ KLINICKÝCH LABORATOŘÍ, KLATOVSKÁ NEMOCNICE A.S. PLZEŇSKÁ 569, KLATOVY, KUUCERA@SEZNAM.CZ PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN ODDĚLENÍ IMUNOCHEMICKÉ DIAGNOSTIKY, FAKULTNÍ NEMOCNICE PLZEŇ DR. E. BENEŠE 13, PLZEŇ, TOPOLCAN@FNPLZEN.CZ Literatura (1) Peterson JE, Kulik G, Jelinek T, Reuter CW, Shannon JA, Weber MJ. Src phosphorylates the insulin-like growth factor type I receptor on the autophosphorylation sites. Requirement for transformation by src. J Biol Chem Dec 6;271(49): (2) Samani AA, Yakar S, LeRoith D, Brodt P. The role of the IGF system in cancer growth and metastasis: overview and recent insights. Endocr Rev. 2007;28: (3) Werner H, LeRoith D. The role of the insulin-like growth factor system in human cancer. Adv Cancer Res. 1996;68: (4) Schnarr B, Strunz K, Ohsam J, Benner A, Wacker J, Mayer D. Down-regulation of insulin-like growth factor-i receptor and insulin receptor substrate-1 expression in advanced human breast cancer. Int J Cancer. 2000;89: (5) Tennant MK, Thrasher JB, Twomey PA, Birnbaum RS, Plymate SR. Insulin-like growth factor-binding protein-2 and -3 expression in benign human prostate epithelium, prostate intraepithelial neoplasia, and adenocarcinoma of the prostate. J Clin Endocrinol Metab. 1996;81: (6) Renehan AG, Zwahlen M, Minder C, O Dwyer ST, Shalet SM, Egger M. Insulin-like growth factor (IGF)-I, IGF binding protein-3, and cancer risk: systematic review and meta-regression analysis. Lancet. 2004;363: (7) Wolpin BM, et al. Circulating insulin-like growth factor binding protein-1 and the risk of pancreatic cancer. Cancer Res. 2007;67: (8) Chen B, Liu S, Xu W, Wang X, Zhao W, Wu J. IGF- I and IGFBP-3 and the risk of lung cancer: a metaanalysis based on nested case-control studies. J Exp Clin Cancer Res Jun 24;28:89. (9) Peeters PHM, Lukanova A, Allen N, et al. Serum IGF-I, its major binding protein (IGFBP-3) and epithelial ovarian cancer risk: the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC) Endocrine-Related Cancer. 2007;14(1): (10) Weiderpass E., Brismar K., Bellocco R., Vainio H., Kaaks R. Serum levels of insulin-like growth factor-i, IGF-binding protein 1 and 3, and insulin and endometrial cancer risk. Br. J. Cancer. 2003;89: (11) Vorwerk P, Wex H, Hohmann B, Mohnike K, Schmidt U, Mittler U. Expression of components of the IGF signalling system in childhood acute lymphoblastic leukaemia. Mol Pathol. 2002;55: (12) Linnerth NM, Siwicky MD, Campbell CI, Watson KL, Petrik JJ, Whitsett JA, Moorehead RA. Type I insulin-like growth factor receptor induces pulmonary tumorigenesis. Neoplasia. 2009;11: (13) Tomizawa M, Shinozaki F, Sugiyama T, Yamamoto S, Sueishi M, Yoshida T. Insulin-like growth factor-i receptor in proliferation and motility of pancreatic cancer. World J Gastroenterol Apr 21;16(15): informační magazín číslo

13 (14) Kim WY, Jin Q, Oh SH, Kim ES, Yang YJ, Lee DH, Feng L, Behrens C, Prudkin L, Miller YE, Lee JJ, Lippman SM, Hong WK, Wistuba II, Lee HY. Elevated epithelial insulin-like growth factor expression is a risk factor for lung cancer development. Cancer Res. 2009;69: doi: / CAN (15) Avnet S, et al. Insulin receptor isoform A and insulin-like growth factor II as additional treatment targets in human osteosarcoma. Cancer Res. 2009;69: (16) Yi HK, Hwang PH, Yang DH, Kang CW, Lee DY. Expression of the insulin-like growth factors (IGFs) and the IGF-binding proteins (IGFBPs) in human gastric cancer cells. Eur J Cancer. 2001;37: Hematologický analyzátor UniCel DxH 800 Coulter ematologický analyzátor UniCel DxH 800 vám představujeme postupně v seriálu článků, které podrobně přibližují unikátní novinky a technologická řešení použitá v tomto revolučním konceptu. Tentokrát se budeme podrobněji zabývat měřením trombocytů. Na konci 70. let se automatizovalo počítání trombocytů v plné krvi prostřednictvím hematologického analyzátoru COULTER Model S-Plus. Došlo tak k eliminaci pracného ručního počítání trombocytů, při němž se mohly vyskytnout chyby. Díky tomuto technologickému pokroku mají lékaři snadný a rychlý přístup k dalším klinicky důležitým informacím. Společnosti Coulter Corp. a Beckman Coulter jsou uznávanými špičkami v oboru počítání trombocytů, protože používají princip COULTER spolu se sofistikovaným použitím histogramů. Pokračují tak v dalším zdokonalování a vylepšování technologie počítání trombocytů. Po uvedení systému pro buněčnou analýzu UniCel DxH 800 Coulter dosáhla technologie počítání trombocytů dokonce ještě vyšší úrovně. Příprava vzorku a měření Pro počítání erytrocytů a trombocytů se připraví roztok plné krve v ředění 1: Erytrocyty a trombocyty se počítají v lázni RBC. Během počítání se na tři apertury 50 x 60 μm aplikuje vakuum (6 ), stejnosměrný proud a technika Sweep Flow; všechny impulzy odpovídající částicím v rozsahu velikostí 2 až 25 fl jsou počítány jako trombocyty (obrázek 1). Sweep Flow zabraňuje zpětnému průtoku buněk přes snímací zónu apertury. Ze surových dat pro trombocyty se vytvoří 256-ti kanálový histogram zahrnující trombocyty i část populace RBC (obrázek 2). Systém UniCel DxH 800 sčítá částice trombocyty po dobu 20 sekund, nebo do načtení částic (podle toho, co nastane dříve). První krok počítání trombocytů Trombocyty se sčítají a měří v lázni RBC, která je začleněna v sestavě CBC určené pro počítání a stanovení velikosti. Impulzy PLT jsou zesíleny na desce předzesilovače a odeslány na desku pro analýzu a testování signálu CBC za účelem jeho konverze z analogového na digitální. Z digitálních impulzů PLT je odstraněna elektronická interference a impulzy jsou pak odeslány do správce dat pro hloubkovou analýzu, která používá algoritmy DxH 800 pro analýzu trombocytů. Algoritmus DxH 800 pro analýzu trombocytů upraví impulzy, koriguje koincidence, vyhodnocuje počet a vygeneruje histogramy trombocytů. Druhý krok analýza histogramu trombocytů Digitální data o trombocytech se také používají pro generování histogramů trombocytů. Analýzou histogramu trombocytů se zjišťuje, zda má být korigován počet trombocytů zkreslený interferencí. Tyto analýzy zahrnují vyhlazení histogramu a hodnocení, extrakci vlastností histogramu trombocytů a klasifikaci histogramu populace trombocytů. Proces analýzy histogramu trombocytů začíná generováním průměrného histogramu trombocytů odvozeného z vyhodnocení histogramů trombocytů ze tří apertur. Analýza histogramu trombocytů extrakce vlastností histogramu trombocytů Průměrný histogram trombocytů je podroben extrakci vlastností. Tento proces identifikuje z histogramu PLT možné interference v počtu destiček. Extrakce vlastností analyzuje všechny oblasti histogramu trombocytů (obrázek 3) a zahrnuje: lokalizaci módu populace PLT (M) lokalizaci levého a pravého minima mezi populací PLT a interferujícími populacemi (L, R) relativní výšku minim vůči módu, analýzu poměru maxim vůči minimům analýzu shody histogramu k určení: rozdílů mezi horní částí a pravým minimem Vaše krev si zaslouží to nejlepší informační magazín číslo

14 histogramu s log-normálním proložením histogramu s tříbodovým proložením stupně shody histogramu z raw dat s log-normální křivkou velikost chvostu na log-normální křivce Obrázek 1: Normální histogram PLT (2 25 fl). Obrázek 2: 256-ti kanálový histogram zahrnující trombocyty a RBC. Obrázek 3: Extrakce vlastností histogram trombocytů Obrázek 4: Interference mikrocytárních RBC Obrázek 5a Obrázek 5b Algoritmus určí z informací o extrakci histogram populace trombocytů indikující interferenci. Pro klasifikaci populace jsou užitečné tři atributy určené z analýzy vlastností. Těmito atributy jsou: separace dolní části interference v horní části přítomnost obřích trombocytů v horní části Tyto atributy identifikují části histogramu populace trombocytů, ve kterých může docházet k interferenci. Histogram počtu trombocytů U každého vzorku se stanoví populace trombocytů a generuje se histogram jejich počtu. Histogram počtu trombocytů se může generovat z histogramu z raw dat, nebo z proloženého histogramu. Počet trombocytů se určí ze součtu všech jednotlivých měření v kanálech z histogramu počtu trombocytů po korekci interferencí. Generování příznaků pro trombocyty je nezávislé na jejich počtu. Součet všech jednotlivých měření načtených mezi levým a pravým minimem na histogramu z raw dat se použije k určení počtu trombocytů z trombocytového histogramu s následujícími populacemi: normální interference RBC menší interference v dolní části beze shody neklasifikovaná populace trombocytů u populace, která nemá shodu, platí speciální podmínky a počet je určen jinou metodou pokud je průměr (mean) trombocytové populace menší než kanál 5, generuje se histogram proložený třemi body k obnovení trombocytů v kanálu 5 a níže; tříbodový histogram s obnovením dolní části se pak kombinuje s histogramem z raw dat, a tak se dokončí histogram počtu trombocytů pokud je počet trombocytů za použití všech raw dat vyšší než 20, algoritmus generuje vyhlazený trombocytový histogram od 2 fl do 25 fl a vypočítá histogram počtu trombocytů ze všech jednotlivých měření ve vyhlazeném trombocytovém histogramu pokud je počet trombocytů za použití všech raw dat nižší než 20, algoritmus automaticky prodlouží počítací čas pro PLT tak, aby měl algoritmus pro vyhodnocení statisticky významný soubor dat proces extended count ; přínosem je statistické zpřesnění počítání nízkých a velmi nízkých počtů trombocytů; trombocytopenické vzorky jsou tak platně analyzovány již od počtu při rozsahu lineárního počítání trombocytů PLT Parametry trombocytů PLT (počet trombocytů), MPV (střední objem trombocytů), PDW (distribuční křivka trombocytů), PCT (hematokrit trombocytů) jsou odvozeny z histogramu populace trombocytů očištěného od interferujících částic. Tento proces analýzy histogramů PLT umožní např. eliminování vlivu mikrocytárních RBC na počet PLT (obrázek 4.). 14 informační magazín číslo

15 Stejně spolehlivě jsou započítány i malé trombocyty (obrázek 5a) nebo naopak obří, velké, giant trombocyty (obrázek 5b). Vždy je počet PLT odvozen z vyčištěné populace pod proloženou lognormální křivkou. Obrovské trombocyty Giant Platelets Obrovský trombocyt je trombocyt, jehož velikost je výrazně větší než velikost průměrného trombocytu ve vzorku (MPV, typicky cca 10 fl) a přibližuje se velikosti průměrného erytrocytu (MCV typicky fl). Výskyt těchto atypických trombocytů bývá obvykle spojen se stavy jako je Bernard Soulierův syndrom a s jinými anomáliemi. Obrovské trombocyty tvoří obvykle populaci zcela vlevo na histogramu WBC s výrazně odlišným tvarem populace než např. drť WBC nebo shluky trombocytů (viz dále). Pro přesné stanovení přítomnosti Giant Platelts se využívá tří informačních zdrojů: histogram WBC, histogram PLT a dataplot NRBCs. Obrovské trombocyty pozorujeme jako zmíněnou populaci zcela vlevo u hrany histogramu WBC, pravý okraj histogramu PLT nepřisedá k X-ose a zřetelně obsahuje abnormálně vysoký počet velkých a velmi velkých trombocytů. Na dataplotu NRBCs je vidět u levého okraje mírně nad středem (v rovině populace WBC) zcela charakteristickou populaci Giant Platelets (ve srovnání s populací charakteristickou pro shluky PLT viz dále). Shluky, agregáty trombocytů Platelet Clumps Shluk (agregát) trombocytů je skupina dvou a více vzájemně přilnutých trombocytů, bývá to většinou důsledek špatného míchání po odběru, nebo reakce vzorku na použitý antikoagulant EDTA (EDTA indukovaná pseudotrombocytopenie). Přesné určení shluků je obtížné vzhledem k nepředvídatelné a proměnné velikosti těchto útvarů. Využívá se stejných tří informačních zdrojů a oblastí histogramů jako u Giant Platelets s doplněním histogramu RBC, ale jednotlivé populace charakterizující shluky PLT jsou velmi zřetelně odlišné. Shluky trombocytů pozorujeme jako populaci zcela vlevo na histogramu WBC, histogram PLT opět zcela vpravo má nenulové hodnoty a navíc u vzorku se shluky trombocytů vždy chybí velikostní kontinuita PLT (chybí typické prosedlání log-normální křivky PLT za vrcholem srovnej s průběhem normálního vzorku). Dataplot NRBCs ukazuje naprosto typickou a jednoznačně identifikovatelnou populaci Platelet Clumps v levém horním rohu. Varovná návěští (Flagy) upozorňují na důležité vlastnosti populace PLT právě měřeného vzorku, ale v žádném případě nejsou pokynem pro korekci nebo reanalýzu trombocytů! Platné a vylisované výsledky jsou v lineárním rozsahu PLT/μL, celkový měřicí rozsah je PLT/μL. Použité Flagy jsou: Trombocytopenia Trombocytosis Small Platelets Large Platelets Giant Platelets Platelet Clumps Low Events PLT PLT Inter (Debris) RBC-PLT Overlap PLT pod uživatelem definovaným dolním limitem PLT nad uživatelem definovaným horním limitem MPV pod uživatelem definovaným dolním limitem MPV nad uživatelem definovaným horním limitem Výskyt obrovských trombocytů Výskyt shluků agregátů trombocytů Trombocytopenický vzorek, Extended Count Nečistoty na počátku trombocytového histogramu, fragmenty RBC, kontaminace vzorku/roztoku Interference částic objemově ležících mezi PLT a RBC Impedanční metoda počítání trombocytů Tato Coulter patentovaná léty prověřená (více než 50 let od objevu a patentu Coulter impedančního principu) a neustále zdokonalovaná metoda počítání trombocytů představuje zlatý standard v měření trombocytů. To, že impedanční metoda počítání trombocytů s technologií Coulter Fit Process zůstává oproti optickému počítání stále tou nejspolehlivější a nejlevnější metodou enumerace trombocytů, potvrzují četné klinické srovnávací studie mezi analyzátory různých výrobců. Impedanční metoda má vždy výrazně lepší korelaci s referenční metodou průtokové cytometrie PLT (znaky CD41 a CD61) než metody optické a rovněž u kombinovaných systémů je impedanční výsledek v případě nesouhlasu obou metod (optické a impedanční) považován za lepší a platný. PETR BOUDAL PBOUDAL@BECKMAN.COM informační magazín číslo

16 Mikropartikuly mikročastice s dôležitými regulačnými funkciami Súhrn Cieľ: V ostatných dvoch rokoch pribudlo veľa nových poznatkov o jestvovaní a následkoch mikropartikúl z dôvodu ich formovania sa a ich impaktu na genézu rozličných chorôb, ktoré zapríčiňujú. Popisujú sa tiež veľmi malé možnosti intervencií voči ich zvýšenému formovaniu, čo je bežný jav pri niekto-rých chorobách. Diskusia: Popisu neunikli predovšetkým dôležité funkcie mikropartikúl v regulácii procesov na úrovni bunka-bunky. Čo do štruktúry sú to mikrovezikuly. Formujú sa z poškodenej plazmatickej membrány a priľahlého cytosolického skeletu. Nie sú to mŕtve apoptotické telieska, ako sa to pôvodne predpokla-dalo, ale biologicky vysoko funkčné mikročastice o veľkosti jedného mikrometra. Ich deficit býva príčinou krvácavých stavov. Zvýšená a vysoká početnosť mikropartikúl je jedinečným znakom poškodenia buniek značného rozsahu. Zväčša účinkujú proinflamačne a prokoagulačne. Diskutuje sa, či sú pre uvedené funkcie iba dôležitým klinickým markerom poškodenia endotelia, resp. zvýšeného rozpadu krvných buniek a dôležitým markerom deštrukčných procesov oboch bunkových systémov. Narušujú hemostázu lokálne, alebo celkovo, pričom stimulujú k zvýšenému formovaniu trombov na aterómoch v aterosklerotických plátoch? A to je dôvod, prečo viacerí považujú ich vysokú početnosť a aterogénne účinky za rizikový faktor vaskulárnych príhod vzniknutých na podklade ischémie. Záver: Znalosť funkcií MPs obohacuje o poznanie príčin inciovania a akcelerovania mnohých chorôb, aj epidemicky sa vyskytujúcich na podklade ischémie, o čom sa ešte pred pár rokmi nič nevedelo. Kľúčové slová: mikropartikuly, endotelium krvné bunky, apoptóza, marker, riziko Úvod Cieľom je objasniť, čo sú to mikropartikuly (MPs) a akými účinkami participujú v genéze viacerých chorôb. Popis je aktuálny zo zorného uhla patofyziológie, štruktúry a ich impaktu na funkcie ostatných zdravých buniek a buniek krvného riečiska. Cieľom je povedať, či sa ich zvýšená početnosť a pôvod zo širokého spektra materských buniek prejaví klinicky, alebo je bez odozvy. Aktuálnou otázkou tiež je, či sú iba markerom chorôb, resp. daktorým rizikovým faktorom. Diskusia Mikropartikuly boli objavené pred viac ako štyridsiatimi rokmi. Sprvoti sa o nich nič nevedelo, objavitelia ich považovali prosto za bunkové smeti či bunkové trosky debris, trpasličie bunky, resp. trombocytové smeti [8]. A čo i len riadok napísať, že sú súčasťou jedného z regulačných systémov na celulárnej úrovni, znamenalo sa vedecky diskvalifikovať. Formujú sa z poškodených častí plazmatickej membrány a priľahlého cytosólového skeletu. Klbčia sa do mikrovezikúl. Obsahujú membránové fragmenty a rezíduá endozomálneho kompartmentu. Ako submikroskopické fragmenty sú v podstate rezíduami remodelovania plazmatickej membrány a priľahlého skeletu. Je to dômyselný geneticky zakódovaný epigeneticky ovplyvňovaný spôsob, ako sa elegantne zbaviť poškodených bunkových kompartmentov, hlavne poškodenej plazmatickej membrány. Ich veľkosť varíruje od 0,1 1,0 mikrometra a podľa niektorých výpočtov až do 2,0 mikrometrov (μm). To napovedá, že sú heterogénnej veľkosti, ale varírujú aj v denzite. Na obrázku 1. sú zobrazené MPs elektrónovou mikroskópiou. Vedia skrz mikrovezikuly a ich príslušenstvo komunikovať a nadväzovať interakcie medzi bunkami vo funkčne účinnom regulačnom systéme bunka-bunky [35]. Interakcie medzi MPs a ostatnými bunkami modulujú solubilné bioaktívne mediátory. Funkčne sa navzájom čulo ovplyvňujú za rozličných okolností, nielen v čase apoptózy buniek. Interakcie regulujú MPs v rámci väzby ligand-receptor [13] a receptor-ligand. Po vypúlení a sekvestrácii sa prevalia do extracelulárnych priestorov a odtiaľ do cirkulácie. Ich zdrojom sú aktivované a následne apoptóze podliehajúce krvné bunky a aktivované, resp. apoptóze podliehajúce endotelové bunky (EB) i bunky hladkého svalstva (BHS). Krvné aj vaskulárne zdroje MPs sú počas chorôb, hlavne infekčných, veľké. V závislosti od zdroja sa formujú MPs krvného pôvodu. Hovorí sa, že sú to cirkulujúce MPs. Vaskulárne endotelového pôvodu sú secernované do cirkulácie. Väzbou membránových ligandov MPs na receptory buniek tkanív sú ich posolstvá následne krvným tokom roznášané po celom tele. Prvotné konštatovanie sa trápne zapísalo do medicínskych análov, keď sa povedalo, že sú inertným celulárnym debris. Chaotickú mienku ospravedlňuje to, že vtedy sa nemohlo vedieť, že sú to biologicky vysoko funkčné substancie. Ich mnohé posolstvá, ktoré doručujú bunkám, napovedala, že to nemôžu byť mŕtve, nefunkčné apoptotické telieska buniek. Až po tridsiatich rokoch od ich objavu sa konštatovalo, že o biologických efektoch nerozhoduje ich veľkosť, ale substancie obsiahnuté v nich. Doručujú promiskuitne zdravým cieľovým bunkám bioaktívne efektory, aké obsahujú materské bunky. To vysvetľuje, prečo tieto drobučké membránové fragmenty komunikujú medzi bunkami a promptne i efektívne si vymieňajú biologicky dôležité posolstvá. Treba považovať za výdobytok bunka-bunky regulačnej osi, že eukaryotické buky disponujú schopnosťou v čase ohrozenia života formovať mikrovezikuly. Navrch toho majú jedinečnú schopnosť ich odvrhávať do extracelulárnych priestorov [7, 9, 28] a do cirkulácie. Strhávajú zo sebou početný set proteínov a lipidov ako súčasť zvyškov bunkových membrán. Obsahujú taktiež cytoplazmatické komponenty buniek [20, 23, 39], nielen cytoplazmatický skelet. Počas vypuľovania bunkovej membrány navonok, teda jej externalizácie, pohlcujú mikrovezikuly súčasne obsah častí cytosólu. Môžu obsahovať cytoplazmatické proteíny, dokonca aj mrna. Neobsahujú bunkové jadro, lebo bez zakódovaných inštrukcií v génoch by nebolo možné koordinovať formovanie mikropartikúl. Vo funkcii ligandov ovplyvňujú cieľové bunky priamo, skrz receptory. Uzatvárajú tak kruh dôležitého signálneho komplexu. Z plazmatickej membrány buniek určitej famílie môžu transferovať na cieľové bunky tiež receptory bunkového povrchu. Transferujú mikrovezikulami nielen bioaktívne lipidy, ale aj cytoplazmatické organely, k veľkému prekvapeniu taktiež mitochondrie, a teda iba u žien môžu skrz ne transferovať aj genetické posolstvá. Môžu sa správať taktiež ako vehikel pre transfer infekčných častíc medzi bunkami, napríklad prionov alebo HIV. Podľa Ratajczaka a kol. takýmto spôso- 16 informační magazín číslo

17 bom zavlečená infekcia pripomína nástrahu Trojského koňa [36]. Celulárne MPs môžu byť nosičmi až niekoľkých antigénnych markerov pohltených z materských buniek. V rámci patogénnej misie stimulujú inflamačne reakcie, lebo za vhodných okolností majú silný proinflamačný efekt. Varírujú medzi sebou nielen vo veľkosti, ale tiež v obsahu fosfolipidov aj v skladbe proteínov. Interakciou liganda MPs s receptorom cieľových buniek, resp. interakciou receptora MPs s ligandmi cieľových buniek sa im zaručuje participovať na širokom spektre biologických aktivít. Takéto procesné väzby umožňujú disponovať početnými regulačnými funkciami. Môžu regulovať nielen funkcie endotelových buniek, ale tiež krvných buniek. Môžu stimulovať angiogenézu, takže možno s veľkou opatrnosťou konštatovať, že benefičný efekt ovplyvňujú vaskulárne funkcie. Bunka má na patogénny stimul k dispozícii, dalo by sa povedať, algoritmy. Po poškodení sa buď vie adaptovať a dôjde k reparácii, alebo túto schopnosť už stratila (obrázok 2). Medzi ich početné biologické funkcie patrí ich schopnosť ovplyvňovať hemostázu [32] v negatívnom aj pozitívnom zmysle. Dokázalo sa totiž, že za určitých okolností promótujú koaguláciu, a treba zdôrazniť, že z viacerých príčin. Jednou z nich je signifikantný vzostup množstva navonok extracelulárne vyvrátenej bunkovej membrány s obsahom invertovaných fosfolipidov s negatívnym nábojom. Fosfolipidy sa navonok externalizujú v dôsledku puknutia bunkovej membrány (obrázok 3). Patrí k nim fosfatidylserín a fosfatidyletanolamín. Pre ich negatívny náboj sú dôležitým stimulom generovania trombínu. Ich externalizácia v súčinnosti so zvýšenou dostupnosťou tkanivového faktora (TF), ktorý sa rýchlo aktivuje z inaktívneho stavu, prezrádza, že v kauzálnom vzťahu koincidujú s prokoagulačnými stavmi. Okrem popísaných dvoch zdrojov MPs nemožno nespomenúť púl rozpadávajúcich sa apoptotických buniek sekvestrovaných do aterosklerotických plátov, eventuálne strhnutých do krvného obehu po ruptúre aterosklerotických plátov [5]. Mikropartikuly sa formujú počas aktivácie buniek stimulmi viacerých agonistov a zavliekajú sa do cirkulácie v dôsledku apoptózy buniek parciálnej, resp. komplexnej lýzy bunky, čiže v dôsledku poškodenia oxidačným stresom, toxínmi, LPS, ale aj v dôsledku neprimeraného fyzického stresu, resp. v dôsledku strihového stresu artériovej steny (obrázok 2). Zvýšená početnosť MPs pochádza taktiež z rozpadúvajúcich sa trombocytov a megakaryocytov. To sprvu navádzalo k chybnej domnienke, že sú hlavným zdrojom MPs len trombocyty. Začalo sa bezdôvodne hovoriť výlučne iba o trombocytových MPs. Onedlho po nich boli objavené MPs z leukocytov, erytrocytov, monocytov, endotelia i buniek hladkého svalstva [10, 24]. Príčiny uvoľňovania MPs z trombocytov sú v ich aktivácii trombínom, kolagénom a strihovým stresom cievnej steny. Trombocyty sa Obrázok 1: MPs cirkulujúce skrz prizmu elektrónovomikroskopického zobrazenia u pacientov s akútnym koronárnym syndrómom Zdroj: Baj-Krzyworzeka M, et al. Platelet-derived microparticles stimulate proliferation, survival, adhesion and chemotaxis of hematopoietic cells. Exp Hematol. 30, 2002, Tabuľka 1: Kalcifikácia koronárnych artérií (CAC) vyhodnocovaná metódou skóre zo 64 slices za použitia CT skenerov firmy Siemens CAC BMI TCH HDL Total PS PL der EC der Negative n-10 Low 0<50 n=18 High >50 n=5 26,1 1,2 27,9 1,0 28,6 3,1 208,5 11,3 213,2 9, ,6 62,8 3,9 57,3 4,4 59,1 8, ,3 9 2,7 Zdroj: Chou, J., et al.: Hematopoietic cell-derived microparticle tissue factor contributes to fibrin formation during thrombus propagation. Blood. 104, 2004, Vysvetlivky: PLder-platelet derived; EC der en-dothelial cells derived; PS-positive; TCH and HDL: mg/dl, BMI (kg/m2), CAC: score. Najväčšia početnosť MPs sa zisťuje u chorých s vysokým skóre kalcifikácie koronárnych ciev v porovnaní so subjektmi bez tohto ochorenia. Obrázok 2: Reaktivita bunky na stimuly so schopnosťou eliminovať ledované časti membrány a bez nej eliminácia MPs Stimulus, stimuly genetické, nutričné, fyzikálne, chemické, imunity L é z i a adaptácia -adaptácia -reparácia -apoptóza reparácia nekróza -eliminácia MPs V prípade neschopnosti adaptácie sa nemôže ledovaná bunka reparovať, podlieha nekróze. Ak je možnosť ledo-vanú časť bunky eliminovať skrz MPs, vyhne sa bunka apoptóze. Ak nedôjde k eliminácii, bunka apoptóze pod-lieha. Znamienko mínus znamená neschopnosť informační magazín číslo

18 Obrázok 3: Zmeny v štruktúre bunky aktivovanej a neaktivovanej Zdroj: Marja J. VanWijka, E. VanBavelb, A. Sturkc and R. Nieuwlandc,* Microparticles in cardiovascular disea-ses. Cardiovascular Research (2): Ak je bunka neaktivovaná, negatívne nabité fosfolipidy sa nachádzajú vnútri bunkovej membrány v cytoplazmatickej oblasti. Ak sa bunka aktivuje, relokalizujú sa negatívne nabité fosfolipidy na povrch do oko-litého prostredia. Šedé obdĺžniky sú špecifické antigény bunky, napríklad CD4 helperových buniek T. Čierno vyznačené elipsovité útvary sú molekuly, ktoré sa vo zvýšenej miery lokalizovali do bunkovej membrány. Vytvorili sa podmienky pro formovanie MPs. Obrázok 4: Zmeny, ak sa bunka aktivuje, a zmeny nastávajúci v prípade jej apoptózy Zdroj: Marja J. VanWijka, E. VanBavelb, A. Sturkc and R. Nieuwlandc,* Microparticles in cardiovascular disea-ses. Cardiovascular Research (2): Agonisti účinkujú vďaka vzostupu iontov cytosolického kalcia. Aktivujú sa kinázy a inhibujú fosfatázy. Ostatné zmeny popísané v texte. Apoptózu indukujú induktóry. Stimuly apoptózy aktivujú signálne dráhy, z nich sa transferujú na regulátory a napokon na exekútorov apoptózy. Patria k nim kaspázy (3 a 9), nukleázy a početné ďalšie mediátory. bežne aktivujú trombínom či kalciovým ionofórom A23187, aj účinkom ADP či kolagénom, resp. terminálnym komplementom komplexu C5b-9 [18] (obrázok 4). Mikropartikuly, ktorých materskými bunkami sú trombocyty, môžu priamo stimulovať bunky hematopoetické, lymfocyty a bunky endotelové [3]. U zdravých cirkulujú iba malé počty MPs, lebo poškodzovanie buniek je minimálne, pričom pri niektorých chorobách sú ich počty signifikantne zvýšené. Postačí napadnutie vírusmi chrípky a ich početnosť výrazne stúpne. Väčšina cirkulujúcich MPs, ktoré exprimujú denzný zhluk na membráne CD41 (CD41+MPs), spravidla neexprimuje povrchový marker CD62P [36]. Na zvýšené formovanie MPs po aktivácii monocytov, EB, hepatocytov a BHS vplývajú toxicky pôsobiace bakteriálne lipopolysacharidy (LPS) a zápal koordinujúce cytokíny zo skupiny interleukínov a okrem nich tiež chemokíny. Z nich prozápalový efekt má TNF-α, interleukín-1, C5b-9 komplex aj hydroperoxidy [12]. Hydroperoxidy obsahujú funkčnú skupinu peroxidu [ROOR ], ktoré sa správajú ako akcelerátory či promótory. Biochemické procesy vo formovaní MPs Formovaniu MPs spravidla predchádza aktivácia buniek patogénnymi stimulmi za asistencie zvýšenej koncentrácie kalciových iónov (obrázok 3). Formujú sa veľmi rýchlo, už po niekoľkých minútach po pridaní agonistu do média [24]. Zistilo sa to z ich správania v bunkových kultúrach. Tým sa vysvetľuje aktuálna potreba vzostupu koncentrácie cytosolického kalcia pri formovaní MPs [31], menovite v mieste vezikulácie membrány [2]. Vzostupom koncentrácie cytosolického kalcia sa aktivujú kinázy, inhibujú sa fosfatázy a aktivuje kalpain [11, 31] (obrázok 4). Aktéri apoptózy sú viacerí, lenže ich popis nie je aktuálny z priestorovej tiesne. Detekcia takejto spätosti umožňuje v klinickej praxi intervenovať a blokovať vzostup formovania MPs. Zablokovaním vzostupu cytosolického kalcia cheláciou iónov extracelulárneho kalcia skrze etylenglykoltetraoctovú kyselinu (EGTA) možno stlmiť, až výrazne spomaliť separáciu ďalších MPs od bunkovej membrány [31]. Štruktúrne zmeny bunkovej membrány Rozpadom membránového skeletu buniek a skeletu subcelulárneho systému sa začnú formulovať MPs. Neporušený bunkový skelet je nevyhnutnou zložkou stability štruktúr bunkovej membrány [19]. Membránový skelet pozostáva z aktínu, vinkulínu a talínu (obrázok 4). Je síce známa skladba skeletov, ale nie detailne mechanizmus inhibovania formovania MPs a akým spôsobom sa bunkový a membránový skelet poškodzuje. Vie sa napríklad, že talín sa degraduje skrz kalpain. Ten je premennou, účinkom ktoré sa facilituje zvýšená koncentrácia cytosolického kalcia pri formovaní mikropartikúl [30]. Mikropartikuly neobsahujú rovnaké substancie, lebo je ich obsah prísne determinovaný materskou bunkou. A to je jedinečnou pomôckou, ktorou sa v klinickej praxi umožňuje diagnostikovať ich pôvod napríklad MPs pôvodom z polymorfonukleárnych neutrofilov obsahujú špecifické selektíny, integríny, regulátory komplementu, antigény histokompatibility triedy-1 (HLA-1) a ostatné markery, špecifické pre neutrofily (22). Mikropartikuly, ktoré pochádzajú z EB, exprimujú receptory CD31, CD54, CD62E a α V β 3-integríny apod. [38]. Ak cirkulujúce MPs obsahujú prokoagulačné substancie, ohrozujú narušenie balansu hemostázy indukovaním zvýšenej koagulability krvi. Obsah týchto substancií determinujú viaceré stimuly, medzi ostatnými aj nežiaduce nutričné faktory. Heterogénnosť celulárnej populácie MPs Celulárne populácie MPs nachádzajúce sa v telesných tekutinách sú rozličného pôvodu a vyskytujú sa v nich v rozličných počtoch. Sú rôzne veľkosti, antigénnej skladby a rôznorodých funkčných vlastností. Už sa konštatovalo, že u zdravých cirkulujú iba v minimálnom množstve, ale napríklad u chorých na sepsu cirkulujú vo vaskulárnom riečisku ich obzvlášť veľké počty. To poukazuje na to, že sú dôležitým markerom progresie chorobného procesu. Najvýdat- 18 informační magazín číslo

19 nejším zdrojom MPs pri sepse sú trombocyty, monocyty a endotelové bunky. To svedčí o rozsiahlom poškodení endotelia a o zvýšenom poškodzovaní trombocytov a monocytov. Ich početnosťou a prokoagulačnou dispozíciou sa konštituujú vhodné podmienky pre narušenie hemostázy v artériách i vénach (obrázok 5). Bez zveličovania by sa dalo povedať, že v nej zohrávajú kľúčovú rolu. Sú z tohto dôvodu markerom závažného poškodzovania krvných a vaskulárnych buniek [15, 16]. Ukazuje sa, že hlavným zdrojom cirkulujúcich MPs aj pri ostatných chorobách sú trombocyty a megakaryocyty. Oprávnene sa im pripisuje funkcia senzorov hemostatických aktivít. Ich impakt na cieľové bunky varíruje od patofyzio-logických situácií ich vzniku a rozsahu celulárneho poškodenia. Nežiaduco ovplyvňujú rozličné biologické funkcie cieľových buniek priamo skrz receptory a to im umožňuje kedykoľvek modifikovať rozličné patogénne reakcie. To by zdanlivo mohlo viesť k dedukcii, akoby by boli v príčinnom stave s chorobami a nie ako ich markery. Z pohľadu markera sa na celulárnej úrovni považujú za generálneho indikátora poškodenia buniek, stresu bunkového, závažnosti trombózy v aterosklerotických plátoch a inflamácie v stene artérií. V genéze určitých chorôb sa správajú ako mediátory inflamácie, koagulácie, účinné faktory zrážavosti krvi, angiogénne faktory, rastové faktory a antigény bunkového povrchu. Takéto funkčné dispozície poukazujú na ich kauzálnu súvzťažnosť s určitými chorobnými procesmi, čiže opatrnosť hodná vedeckého myslenia velí, že nie sú iba markermi. Zvýšená početnosť MPs sa generuje viacerými stimulmi. Jedným z prvých podnetov je aktivácia trombocytov a priame poškodenie vaskulárneho endotelia (obrázok 6). Poškodzujú sa napríklad aj v dôsledku aktivácie trombínu na bunkovom povrchu, resp. sa indukujú skrz aktiváciu C5b-9 a v rámci interakcie s PF4-heparín protilátkami. Asociujú stavy krvácavosti s aktivitou MPs, alebo niet súvisu? Z kontextu zdanlivo vyplýva, že MPs akoby asociovali iba s aktivovaním koagulácie, pričom akoby vôbec neparticipovali v etiológii krvácavých stavov. Štúdium sepsy indukovanej meningokokmi poskytlo podrobný prienik do podstaty vzniku choroby a veľa prezradilo o funkciách MPs pochádzajúcich z trombocytov, EB a monocytov. Faktory asociujúce s krvácavými stavmi počas heparínom indukovanej trombocytopenie a taktiež počas trombotickej trombocytopenickej purpury či aplastickej anémie [27] sú v súčasnosti detailnejšie preskúmané ako nikdy predtým. Paroxyzmy nočnej hemoglobinúrie a anémie z dôvodu výskytu kosákovitých buniek sú z hľadiska etiológie a patofyziológie takisto veľmi podrobne prebádané. Zriedkavo sa vyskytujúca hereditárne zapríčinená ťažká hemoragická porucha Scottov syndróm je Obrázok 5: Odlišné následky aktivity TF v stene artérií a v stene venóvej Zdroj: Nigel Mackman; Rachel E. Tilley; Nigel S. Key: Role of the Extrinsic Pathway of Blood Coagulation in Hemostasis and Thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2007;27:1687. Podľa tohto zdroja zohrávajú MPs a TF dohromady dôležitejšiu rolu vo vénovej trombóze než cievna stena a TF dohromady. Naproti tomu ruptúra aterosklerotického plátu v stene artérií poskytne také zvýšenie hladiny TF, ktoré môže zapríčiniť rozsiahlu trombózu s úplnou obštrukciou prietoku krvi. Obrázok 6: Schematické zobrazenie následkov interakcie MPs a TF vo formovaní a stabilizácii trombu Zdroj: Marja J. VanWijka, E. VanBavelb, A. Sturkc and R. Nieuwlandc,* Microparticles in cardiovascular disea-ses. Cardiovascular Research (2): Názorný príklad toho, ako MPs za kooperácie TF iniciujú väzbu trombocytov na obnaženú intimu, na kolageno-vé vlákna a ako následne participujú na formovaní trombu, ktorý sa stabilizuje povlečením trombínom. Rovnako sa trombocyty podieľajú na stabilizácii trombu. spôsobená defektom formovať MPs. Pri tejto poruche je deficitný prokoagulačne pôsobiaci fosfatidylserín, ktorý by sa externalizoval v rámci mikrovezikulizácie plazmatickej membrány. Výskum tejto poruchy poskytol cenné poznatky o fyziológii koagulácie. Hereditárne syndrómy s poruchami v mikrovezikulácii bunkových membrán majú za následok znížené formovanie MPs. Takýto defekt je v príčinnej súvislosti so stavmi krvácavosti, teda prezrádza kauzálny vzťah. Stimulujú mikropartikuly koaguláciu? Už bola popísaná aktívna kooperácia MPs, najmä z materských trombocytov so stavmi krvácavosti, ale iba načrtnuté to, že stimulujú ako silný induktor hemokoaguláciu. Ich katalytické vlastnosti v koagulácii sú determinované prítomnosťou aniónových fosfolipidov a patričného množstva fosfatidylserínu, ktorý má prokoagulačné účinky. No nielen to. Fosfolipidy s negatívnym nábojom majú schopnosť ovplyvniť remodelovanie bunkovej membrány z dôvodu ich hereditárne zakódovanej externalizácie. Takýto mechanizmus poskytuje jedinečnú príležitosť TF, aby sa bezprostredne skontaktoval s fosfolipidmi. Väčšina TF je totiž naviazaná na plazmatickú membránu EB aj ostatných, akoby účelom bolo takouto väzbou zašifrovať jeho aktivitu do driemajúceho, inaktívneho stavu. Hoci má schopnosť sa viazať na hemokoagulačný faktor VIIa, nezvláda ešte spustiť koagulačnú kaskádu. Ale v momente, ak už sa aktivuje, indukuje sa protrombotický stav. Aktivujú sa komplikované dráhy kaskády koagulácie, aby sa skrz ne indukovali trombocyty, monocyty a endotelové bunky a aby sa od nich odseparovali mikropartikuly. Fosfolipidy s negatívnym nábojom v dvojici s TF informační magazín číslo

20 Obrázok 7: Normálne pomery neaktivovaná bunka (horná časť obrázku) a sled uda lostí pri formovaní MPs (stredná a dolná časť obrázku) Zdroj: Bénédicte Hugel, M. Carmen Martínez, Corinne Kunzelmann and Jean-Marie Freyssinet :Membrane Microparticles: Two Sides of the Coin. Physiology, Vol. 20, No. 1, 22-27, February nadobúdajú silný prokoagulačný potenciál. Kumulujú sa v lipidickom jadre aterosklerotických plátov (obrázok 5). Pripisuje sa im maliciózny efekt, lebo sú určujúcimi faktormi formovania trombov v aterosklerotických plátoch. Veľká početnosť MPs, ktoré sa formujú z EB, v cirkulácii, je jedinečný znak rozsiahleho celulárneho poškodenia endotelia. Participujú na ňom okrem toxínov a infekcií taktiež častice LDL(-) v spolčení s TF. V spojení sú rizikovejšími spúšťačmi aj vypuľovania plazmatickej membrány navonok. Promótujú protrombogénne a proinflamatórne procesy, lebo došlo k zapríčineniu celulárnej dysfunkcie vo vaskulárnom kompartmente. Takto vzájomne úzko poprepletané interakcie oprávnili považovať ich za náhradného, no nie menej dôležitého markera vaskulárnej dysfunkcie. TF sa do koagulácie indukuje skrz receptor pre selektín-p, jeho liganda a skrz reaktívne kyslíkové druhy (ROS). Ligandom receptora pre selektín-p je ligand selektin-p, glykoproteín-1 (PSGL-1). Skrz receptor pre selektín-p ligand PSGL-1 sa promótuje aktivovanie TF, alokovaného do membránových agregátov. V alokáciách poškodených endotelových buniek sa s nimi rýchlo sformuje komplex TF+MPs skrz interakcie, ktoré sprostredkúva väzba liganda PSGL-1 na receptor pre selektín-p. To umožní kumulujúcemu sa množstvu TF, aby sa prevýšil prah jeho aktivity, čím sa spustí koagulačný proces [21] extrintickej kaskády v súčinnosti s vybudenou intristickou. Mikropartikuly z trombocytov majú silné trombogénne účinky Mikropartikuly eliminované z trombocytov pôsobia trombogénne [37]. Potvrdilo sa to opakovane na myšiach, u ktorých sa modeloval stav trombózy. U myší s nízkou koncentráciou tkanivového faktora (1% množstvo) sa súčasne zistil zvláštny úkaz. Vyskytli sa malé trombocytové tromby, ktorých príčiny formovania sa nevedeli vysvetliť. Napodiv neobsahovali fibrín. Deficit TF a fibrínu sa nezistil u chiméry s divokým typom kostnej drene. Tento zaujímavý jav by mohol svedčiť aj o hematopoetickej roli TF počas formovania trombov [26]. To a ostatné indície aktualizovali otázku, či promótuje TF vyskytujúci sa v MPs formovanie trombózy v aterosklerotických plátoch, alebo nie? Dôkazy o možnosti promótovania formovania trombu na aterómoch potvrdili ako možné komplikácie účinkom cirkulujúcich MPs s vysokým obsahom TF (obrázok 5 a 6). Z ich aktivitou kooperuje adhezívna funkcia receptora pre selektín-p. Tento selektín hrá dôležitú rolu v inflamácii generovanej mikropartikulmi. Receptor pre selektín-p sa totiž translokuje z aktivovaných trombocytov na ich povrch, čím sa mu sprístupní možnosť adherovať na EB. Takáto väzba napovedá, že selektín-p v súčinnosti s TF podstatne ovplyvňuje hemostázu. Expresia selektínu-p na EB indukuje na povrchu týchto buniek rolovanie trombocytov, ktoré napokon agregujú a adherujú na endotelium. Endotelium získava takýmto spôsobom protrombogénne vlastnosti. Skrz receptor pre selektín-p a väzbou liganda PSGL-1 sa tiež leukocytom signalizuje posolstvo, aby indukovali generovanie TF v MPs. V dôsledku takejto signalizácie sa aj leukocyty ku podivu stanú vysoko proko-agulačné. Receptor pre selektín-p na aktivovaných trombocytoch intenzívne napomáha invázii MPs do trombov. Znalosť takýchto aktivít, ako to z popisu vyplýva, nemá iba akademický význam, lebo poskytuje praktické riešenia skrz vypracovanie stratégií k aktívnemu modulovaniu hemostázy. Do stratégie má byť zahrnutá okrem doposiaľ známych postupov taktiež inhibícia aktivity selektínu-p, TF a koagulačnej triády. Je dôležité vedieť, že množstvo TF v MPs varíruje od choroby k chorobe. Počas endotoxémie sa na povrchu MPs zvýši obsah TF až o 800 % (2). Aj u chorých na meningokokovú sepsu sa zisťuje vysoký obsah TF a vysoká početnosť MPs. Pochádzajú z rozpadnutých trombocytov a granulocytov. Neprekvapuje, že týmito dvoma premennými sa indukujú prokoagulačné aktivity [1, 34]. Aktivitu TF v čase potreby inhibuje inhibítor dráhy tkanivového faktora (TFPI). Ním sa inhibuje faktor Xa a trombín (faktor IIa). Pokým je faktor Xa v stave inhibície, môže komplex FXa-TFPI inhibovať komplex FVIIa-TF. Aj napriek veľmi nízkej koncentrácii (2,5nM) TFPI má schopnosť signifikantne inhibovať aktivitu Xa. Extrintickú Xázu indukuje a finalizuje faktor VII s TF ako kofaktorom a to je dôvod, prečo je prominentný člen finálnej dráhy koagulácie, resp. koagulačnej dráhy trombínu. Inhibičný efekt TFPI ochromuje, inhibuje zvýšená koncentrácia cirkulujúceho komplexu TF+MPs. Tento komplex je ďalším dôležitým narušovateľom hemostázy. Prokoagulačné vlastnosti tohto komplexu boli experimentálne aj invivo opakovane preukázané. MPs osve, resp. ako komplex s TF sú účinným dispozičným činiteľom hemostatických reakcií v dôsledku vysielania koagulačných stimulov. Po popise takýchto interakcií možno hovoriť o markeroch trombotických porúch a následne vaskulárneho poškodenia. Alebo o kauzálnych faktoroch [33]? Ak by sa malo sumarizovať, ako 20 informační magazín číslo