Journal of Metallomics and Nanotechnologies

Transkript

1 Journal of Metallomics and Nanotechnologies květen volume 1 issue 1

2 První číslo vychází v průběhu května Časopis Journal of Metallomics and Nanotechnologies vychází pouze elektronicky, čtvrtletně. Jeho obsahové zaměření je v oblastí nano-biochemie, nanotechonologie, biomedicína a nanomedicína. Časopis vychází bez regionálních mutací v českém, slovenském a anglickém jazyce. Vydavatel: Laboratoř metalomiky a nanotechnologií Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, , Brno, Česká republika. Časopis Journal of Metallomics and Nanotechnologies je novým výukovým a především vědeckým časopisem, který sdružuje nově vznikající vědecký směr Metalomiku a stále více se rozvíjející Nanotechnologie. Tento časopis je volně přístupný a šiřitelný skrze své webové stránky s minimální podporou reklamy. Cílem redakce je aby články vycházející v každém ze čtyř ročních čísel obsahovaly tématiku využití jakýchkoliv technologií v měřítku nanometrů pro účely biologického, chemického či biotechnologického výzkumu anebo přímo konkrétních nanobiotechnologických aplikací. Na obálce Nanotransportér s enkapsulovaným léčivem může být označen diagnostickou značkou, kterou může být například kvantová tečka. Po aplikaci do krevního řečiště díky cílícím ligandům vyhledá na základě chemické specifity nádorovou buňku. Transportér následně do této buňky uvolní svůj obsah cytotoxický obsah. Tím dojde k velmi efektivnímu usmrcení nádorové buňky bez výraznějších vnějších negativních vlivů na okolní zdravé buňky. Journal of Metallomics and Nanotechnologies Vydavatel: Mendelova univerzita v Brně, Vedoucí editor: Ondřej Zítka, Vydání: první 2014, Počet stran: 66, Vychází elektronicky, ISSN

3 Editorial 3 Journal of Metallomics and Nanotechnologies Ondřej Zítka 1,2, René Kizek 1,2 1 Ústav chemie a biochemie, Mendelova Univerzita v Brně, Zemědělská 1, CZ Brno, Česká republika Evropská unie 2 Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 3058/10, CZ Brno, Česká republika, Evropská unie První číslo prvního vydání vzniká v roce 2014, kdy laboratoř Metalomiky a nanotechnologií sídlící jako vědecké uskupení pod vedením Reného Kizeka na Agronomické fakultě Mendelovy univerzity v Brně zažívá velmi produktivní rok. Díky neúnavné práci se během 12ti let podařilo takřka z ničeho vybudovat centrum excelentní vědy, které je nyní velmi produktivní součástí dvou evropských vědeckých center a probíhá na něm řešení několika desítek vědeckých projektů. Nutno podotknout, že tomu tak je zejména díky existenci evropských projektů a podpory ze strany kolegů z dalších tří spolupracujících Brněnských univerzit (VUT, MU a VFU). Žádné z významných vědeckých pracovišť se neobejde bez výuky a školení svých mladých vědeckých pracovníků neboť spoléhat na import vědeckých kapacit bez masivní dotační podpory ze strany státu či evropských strukturálních fondů nelze. Proto je v tomto čísle věnován prostor právě těm nejmladším vědeckým pracovníkům z řad studentů, kteří na tomto pracovišti vykonávají svoji středoškolskou odbornou činnost anebo bakalářské či diplomové práce. Edukativní charakter časopisu tak spočívá nejen v obsahu tohoto vydání ale i v činnosti, která stojí na pozadí jeho zrodu. V dalším čísle bude v logické posloupnosti věnován prostor vědeckým článkům reprezentantů studentů postgraduálního studia, kteří představí konkrétní směry výzkumu. Tyto prezentované směry jsou jak součástí vědecké náplně jejich studia, tak součástí řešených vědeckých projektů na pracovišti. Postgraduální studenti jsou tak hlavní hybnou vědeckou silou v oblasti zejména základního výzkumu, který je na tomto pracovišti prováděn, byť s výhledem na posun do aplikační fáze.

4 Editorial Board of the Journal of Metallomics and Nanotechnologies: Chief Editor: Ondrej Zitka, Mendel University in Brno, Czech Republic Assistant Manager Editor: Michal Horak, Mendel University in Brno, Czech Republic Assistant Manager Editor: Sylvie Skalickova, Mendel University in Brno, Czech Republic Expert editorial board: David Hynek, Central European Institute of Technology, Czech Republic Gabriella Emri, University of Debrecen, Hungary Jaromir Hubalek, University of Technology in Brno, Czech Republic Jitka Petrlova, Lund University, Sweden Libuse Trnkova, Masaryk University, Czech Republic Marie Konecna, Central European Institute of Technology, Czech Republic Marketa Vaculovicova, Central European Institute of Technology, Czech Republic Michal Masarik, Masaryk University, Czech Republic Miroslav Pohanka, University of Defence, Czech Republic Pavel Kopel, Mendel University in Brno, Czech Republic Rene Kizek, Mendel University in Brno, Czech Republic Vojtech Adam, Mendel University in Brno, Czech Republic Redakční rada časopisu Journal of Metallomics and Nanotechnologies: Vedoucí editor: Ondřej Zítka, Mendelova univerzita v Brně, Česká republika Asistent vedoucího editora: Michal Horák, Mendelova univerzita v Brně, Česká republika Asistent vedoucího editora: Sylvie Skaličková, Mendelova univerzita v Brně, Česká republika Odborná redakční rada: René Kizek, Mendelova univerzita v Brně, Česká republika Libuše Trnková, Masarykova univerzita, Česká republika Pavel Kopel, Mendelova univerzita v Brně, Česká republika Jaromír Hubálek, Vysoké učení technické v Brně, Česká republika Vojtěch Adam, Mendelova univerzita v Brně, Česká republika Miroslav Pohanka, Univerzita obrany, Česká republika Michal Masařík, Masarykova univerzita, Česká republika David Hynek, Středoevropský technologický institut, Česká republika Markéta Vaculovičová, Středoevropský technologický institut, Česká republika Marie Konečná, Středoevropský technologický institut, Česká republika Jitka Petrlová, Lund University, Švédsko Gabriella Emri, University of Debrecen, Hungary

5 CONTENT 5 REVIEW Liposomální transportéry...6 Moderní zobrazovací metody...10 Shrnutí vzniku a mechanismu rezistence vůči těžkým kovům...15 MiRNA: od biogeneze po využití v lékařství...18 Prionové proteiny a jejich interakce s těžkými kovy...23 Sledování role iontů kovů a metalothioneinu při vývoji prionových onemocnění...27 Viry jako nanotransportéry léčiv...30 Miniaturizované detekční systémy a jejich aplikace...36 Biosyntéza kvantových teček...40 Vliv různých forem glutathionu na kulturu Lactobacillus casei subsp. Rhamnosus...43 Zelená syntéza stříbrných a zlatých nanočástic pomocí extraktů z vyšších rostlin...47 ARTICLE Apoferritin: nanotransportér pro cílené dopravování léčiv...50 Detekce nukleových kyselin pomocí metody dot-blot...55 Laboratory reports 38th International Symposium on Capillary Chromatography (ISCC) and 11th GCxGC Symposium...59 Detection of MIR-124 as prostate cancer marker by capillary electrophoresis...59

6 6 REVIEW Liposomální transportéry Jana Houbová a, Markéta Vaculovičová b, c, René Kizek b, c a b c Gymnázium Brno-Řečkovice, Terezy Novákové 2, Brno, Česká republika Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, Česká republika Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 10, Brno, Česká republika Liposomal transporters This review article is giving the overview on application of liposomes as carriers of compounds. The properties of liposomes are summarized and their advantages for transport are highlighted. Liposomes as drug carriers can encapsulate the substance or drug, which is then purposefully released. This is the reason why liposomes have wide range of using, because this is promising step in research, not only in medicine, but also in pharmacy, biopharmacy, biophysics and cosmetics industries. Numerous substances including various drugs, hormones and genes can be transported by liposomes. They can, due to its structure, penetrate into the deeper layers of the skin, even in some organs without damaging them (for example in the brain, which is one of the hardest transport ever). The utilization of liposomes for targeted delivery of drugs, hormones and nanoparticles is mentioned. Přijato k publikování: Klíčová slova: cílená doprava látek, enkapsulace léčiv, liposomy, terapie, léčiva Úvod Během posledních desetiletí se v nanomedicíně značně rozšířil zájem o používání liposomálních přenašečů, neboť vykazují pozitivní výsledky v klinické praxi. Liposomy jsou uzavřené, sférické membránové váčky tvořeny dvěma částmi s odlišnou rozpustností (hydrofobní a hydrofilní část), cholesterolem a lipidy, nejčastěji tělu vlastním lecitinem. Mohou obsahovat i další fosfolipidy (fosfatidylglycerol a fosfatidylethanolamin). Většina klinicky schválených lipsomů má průměr 50 až 300 nm. Kromě klinicky využívaných liposomů, se využívají i další skupiny. Nejmenší liposomy, neboli malé unilamelární vesikuly (SUV), mají rozměry zhruba mezi nm. O něco větší jsou pak velké unilamelární vesikuly (LUV), s průměrem přibližně 100 nm. Multilamelární vesikuly (MLV) jsou další ve skupině lipsomů. Dosahující velikosti 100 nm - 20 µm. Největšími liposomy jsou pak multivesikulární vesikuly (MVV) o velikosti 100 nm - 20µm 1. Liposomy mají roli skoro ve všech biologických procesech. Fungují jako stavební částice nebo jako signální molekuly 2. Ve složení liposomů hraje důležitou roli cholesterol, který má velký vliv na chování liposomů in vitro a in vivo 3. Liposomy, jako transportéry léčiv, jsou schopny enkapsulovat danou látku či léčivo, které jsou následně cíleně uvolněny. Tento komplex nalézá své širší využití ve farmacii, biofarmacii a biofyzice (membránový a distribuční model), v kosmetických a dermatologických přípravcích, ale hlavně v léčbě rakoviny, především rakoviny kůže, zhoubných novotvarů spojených s AIDS, rakoviny tlustého střeva a konečníku 4. U transportérů jako jsou liposomy, nebo makromolekulární nosiče se často provádí PEGylace, což je strategie pro úspěšnější dodávku terapeutických léčiv. Jedná se o navázání polyethylenglykolu (PEG) na povrch liposomu. Takto upravený liposom vykazuje odlišnou farmakokinetiku, jako je například pomalejší eliminace z organismu. PEGylace zvyšuje velikost a molekulovou hmotnost konjugovaných biomolekul a zároveň zlepšuje jejich famakokinetiku, rozpustnost ve vodě, enzymatickou degradaci a imunogenní a antigenní reakce. PEGylace zároveň zlepšuje stabilitu, ale především permeační retenční účinek, který zlepšuje chemoterapeutický efekt a snižuje toxicitu enkapsulovaného léčiva 5. Liposomální transportéry mohou transportovat obrovské množství látek nebo částic. Vzhledem k tomu, že jsou liposomy schopny zvýšit efektivitu enkapsulovaných složek tím, že zvyšují stabilitu a chemicko-fyzikální biologickou dostupnost in vitro a in vivo, získávají velkou pozornost, co se týče enkapsulace antioxidantů, enzymů, vitamínů, částic, atd. Nicméně je stále třeba neustále hledat nové způsoby, jak překonat některá omezení liposomů, jako je například přesné cílení v organizmu 6.

7 Houbová et al. 7 Liposomální transportéry léčiv Liposomální nosiče jsou hojně využívané pro přepravu mnoha typů cytostatických léčiv. Příkladem m ů ž e b ý t d o x o r u b i c i n, j e ž s e j a k o j e d i n ý v y u ž í v á v klinické praxi. Nicméně u komplexu liposomálního doxorubicinu (Obr. 1) je uvolňování cytostatika velmi pomalé, proto se hledají možnosti, jak tento proces urychlit, neboť pomalé uvolňování přímo ovlivňuje terapeutickou účinnost enkapsulovaného léčiva 7. Obr. 1: Enkapsulované cytostatikum doxorubicin v liposomálním přenašeči Dalším typem léčiv, enkapsulovaných v liposomu, jsou polyenová antibiotika. Kromě antibiotik polyenových, lze enkapsulovat i jiná antibiotika, jako například streptomycin, tobramycin a chinolony. Pozitivní účinky polyenových antibiotik byly zaznamenány v léčbě systémové mykózy. Díky začlenění polyenových antibiotik do liposomů se zvyšuje dostupnost a účinnost, především díky uvíznutí liposomů v cirkulujícím makrofágu/monocytu a dopravením tak až do místa infekce 8. Mezi méně obvyklé lékové formy, patří sprej. Liposomální léčiva jsou schopna proniknout přes nosní sliznici a nabízejí zvýšenou penetraci ve srovnání s podáním léčiva ve formě suchého prášku. Popsaný liposom je složený ze sójového fosfatidylcholinu (SPC) a dimyristoyl fosfatidylglycerolu (DMPG) potaženého alginátem, chitosanem nebo trimethyl chitosanem (TMC). Takto vzniklý komplex by měl nabízet větší stabilitu při skladování, snadnější manipulaci a větší terapeutickou účinnost 9. Jedinečnost liposomálních nosičů se potvrzuje i díky transportu léčiva do mozku, což představuje jeden z nejtěžších transportů, kvůli hematoencefalické bariéře (BBB), která odděluje krev z mozku a tím omezuje zavádění většiny terapeutických činidel. Liposomy mohou dodávat velké množství léčiv, neboť se na jejich povrch se může navázat velké množství ligandů 10. S použitím léčiva anti interleukin - 1 (IL - 1), navázaném v liposomu, lze léčit i revma- toidní artritidu a jiná zánětlivá onemocnění, jako například diopatická artritida, psoriatická artritida, ankylozující spondylitida, Crohnova nemoc, zánět šlach a bursitida. Metoda má tu výhodu, že nerozvíjí alergické reakce u pacientů, zvyšuje bezpečnost a účinnost léku po enkapsulaci do transportéru a v neposlední řadě zabraňuje extravazaci léčiva ve tkáních prostřednictvím krevních cév 11. Léčiva mohou být pomocí liposomů dodávána i do některých orgánů, jako jsou například plíce. Pro dodávku léčiva do plic byl povrch liposomu modifikován chitosanem (CH), xantanovou gumou (XG) a polyelektrolytem 12. Liposomální transportéry hormonů Do liposomálních přenašečů lze navázat i různé typy hormonů. Příkladem může být hormon inzulin transportovaný pomocí biotinylovaného liposomu (BLPs). Biotinylace (kovalentní vazba biotinu na protein) bylo dosaženo začleněním biotinu - konjugovaných fosfolipidů do liposomových membrán. Biotinylace byla dokázána na základě měření farmakologického účinku a hladiny krevního inzulinu. U BLPs byla zjištěna zvýšená buněčná absorpce a rychlá gastrointestinální doprava, což potvrzuje, že biotinylované liposomy mohou být využity jako potencionální nosič inzulinu pro orální podání 13. Pektin je další látkou, kterou lze enkapsulovat do dutiny liposomu. Jedná se o lineární polysacharid kys. galakturonové, který by měl ve spojení s liposomálním transportérem vytvořit ochranný biofilm na povrchu zubů. Experiment proběhl s rozdílnými typy pektinů o různých koncentracích. Liposomy byly adsorbovány na hydroxiapatit (HA) a pomocí fosfátového pufru byla použita zubní sklovina jako adsorbční médium. V různých časových intervalech bylo zkoumáno udržení nepřetržitého toku na zubní sklovině. Závěrem je, že pektinový povlak může adsorbovat na HA nebo na zubní sklovinu. Jejich schopnost udržet se na smaltovém povrchu podporuje koncepci o využití liposomů s pektinovým obalem jako ochrannou konstrukci zubů 14. Liposom může sloužit také jako transportér bombesinu. Bombesin je gastrointestinální peptid, který se tvoří v tenkém střevě a má stimulační efekt na trávicí ústrojí. Stimuluje uvolňování gastrinu z G buněk. Některé typy rakoviny (prostaty, plic, prsu, aj.) nadměrně exprimují receptory pro bombesin. Z tohoto důvodu by mohl být bombesin, enkapsulovaný v liposomu, užitečný pro identifikaci nádorů 15. Další látkou, která by v budoucnu mohla zabránit rozvoji rakoviny, především rakoviny kůže,

8 8 Journal of Metallomics and Nanotechnologies 2014, 1, 6 9 je protizánětlivý nesteroidní lék celecoxib. Tento lék podporuje účinnost protinádorových léčiv na léčbu melanomu. Byl uzavřen do liposomu, právě kvůli jedinečným vlastnostem transportéru, jako je prostup do hlubších vrstev kůže bez jejího poškození 16. Díky této vlastnosti byl například použit i analog vitamínu D - kalcipotriol, který se běžně používá k léčbě psoriázy, neboli lupénky, představující jedno z nejčastějších kožních onemocnění 17. Liposomy byly také použity jako nanonosiče v případě oxidu dusnatého (NO), což je difúzní, plynný, volný radikál, spojený s řadou patologických a fyziologických procesů, jako neuronální signalizace, imunitní reakce a zánětlivé reakce. V organismu savců je NO vyroben z L-argininu na NADPH závislé reakci katalyzované enzymy z rodiny synthas oxidu dusnatého (NOS). Výkyvy v biologických systémech jsou spojeny s problémy, sahajícími až k závažným chronickým chorobným stavům. Liposomální nosiče by v tomto případě nesly rekombinantní NOS enzymy. Tento komplex slibuje v budoucnu velký potenciál v oblasti rozvoje platformy pro cílené doručení NO 18. Liposomální transportéry částic Další látky, které liposomální transportéry přenášejí, jsou částice, jakými mohou být například kvantové tečky (QDs). V případě kvantových teček bylo dosaženo kompletního zapouzdření do liposomální fosfolipidové dvojvrstvy (Obr. 2). U QDs bylo zjištěno, že efektivně působí pro zobrazovací aplikace. Tento hybridní nanosystém může být v budoucnu použit jako platforma pro synchronní terapeutické a diagnostické postupy 19. Dalšími částicemi, které můžeme transportovat liposomy, jsou zlaté nanočástice různých velikostí a tvarů. V použití s biologicky rozložitelnými liposomy mají lepší schopnost degradace. Tato schopnost je nezbytná pro jejich využití ve zdravotnictví. Částice zlata jsou na začátku procesu zhruba nm velké. Za použití infračerveného laseru s nízkým výkonem kontinuálních vln po dobu delší než 10 min, se partikule degradují do malých částic o velikosti 5 nm, které se tímto stávají kandidáty na renální clearance. Tyto částice jsou analyzovány pro jejich stabilitu, biokompatibilitu a fototepelné účinky na rakovinné buňky, které tak dokážou zničit. Dále jsou tyto materiály užitečné při zobrazování pomocí specifických NIR barviv pro vykazování multifunkčních vlastností pro rakovinnou teranostiku 20. Obr. 2: Kompletní zapouzdření kvantových teček do fosfolipidové dvojvrstvy Závěr Liposomy jsou transportéry látek s obrovským potenciálem pro uplatnění v klinické praxi. Jejich velká enkapsulační kapacita umožňuje transport nákladu ve velkém množství a navíc fyzikálně chemické vlastnosti umožňují přenos jak hydrofilních tak hydrofobních látek čímž se ještě rozšiřuje portfolio transportovaných molekul. Autoři děkují za finanční podporu projektu CEITEC CZ.1.05/1.1.00/ Literatura 1. Kraft J. C., Freeling J. P., Wang Z. Y., Ho R. J. Y.: Journal of Pharmaceutical Sciences, 103, 29 (2014). 2. Saliba A. E., Vonkova I., Ceschia S., Findlay G. M., Maeda K., Tischer C., Deghou S., van Noort V., Bork P., Pawson T., Ellenberg J., Gavin A. C.: Nature Methods, 11, 47 (2014). 3. Nie Y., Ji L., Ding H., Xie L., Li L., He B., Wu Y., Gu Z. W.: Theranostics, 2, 1092 (2012). 4. Pottier A., Levy L., Meyre M., Germain M.: Milla P., Dosio F., Cattel L.: Current Drug Metabolism, 13, 105 (2012). 6. Liu W. L., Ye A. Q., Liu W., Liu C. M., Singh H.: Agro Food Industry Hi-Tech, 24, 68 (2013). 7. Li L., ten Hagen T. L. M., Hossann M., Suss R., van Rhoon G. C., Eggermont A. M. M., Haemmerich D., Koning G. A.: Journal of Controlled Release, 168, 142 (2013). 8. Naik S. R., Desai S. K., Shah P. D., Wala S. M.: Recent patents on inflammation & allergy drug discovery, 7, 202 (2013). 9. Chen K. H., Di Sabatino M., Albertini B., Passerini N., Kett V. L.: European Journal of Pharmaceutical Sciences, 50, 312 (2013). 10. Lai F., Fadda A. M., Sinico C.: Expert Opinion on Drug Delivery, 10, 1003 (2013).

9 Houbová et al Smith H. J., Smith J. R.: Manca M. L., Manconi M., Valenti D., Lai F., Loy G., Matricardi P., Fadda A. M.: Journal of Pharmaceutical Sciences, 101, 566 (2012). 13. Zhang X. W., Qi J. P., Lu Y., He W., Li X. Y., Wu W.: Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine, 10, 167 (2014). 14. Nguyen S., Hiorth M., Rykke M., Smistad G.: European Journal of Pharmaceutical Sciences, 50, 78 (2013). 15. de Barros A. L. B., Mota L. D., Soares D. C. F., de Souza C. M., Cassali G. D., Oliveira M. C., Cardoso V. N.: Journal of Biomedical Nanotechnology, 9, 1636 (2013). 16. Bragagni M., Mennini N., Maestrelli F., Cirri M., Mura P.: Drug Delivery, 19, 354 (2012). 17. Knudsen N. O., Ronholt S., Salte R. D., Jorgensen L., Thormann T., Basse L. H., Hansen J., Frokjaer S., Foged C.: European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 81, 532 (2012). 18. Perera R. H., Peiris P. M., Peteu S. F., Bayachou M.: Electroanalysis, 24, 37 (2012). 19. Huang Z., Dong L., Chen J. J., Gao F. B., Zhang Z. P., Chen J. N., Zhang J. F.: Life Sciences, 91, 1207 (2012). 20. Rengan A. K., Jagtap M., De A., Banerjee R., Srivastava R.: Nanoscale, 6, 916 (2014). Článek je volně šiřitelný pod licencí Creative Commons (BY-NC-ND). Musí však být uveden autor a dokument nelze měnit a použivat pro komerční účely.

10 10 REVIEW Moderní zobrazovací metody Zuzana Krátká a, Iva Blažková b, Markéta Vaculovičová b,c, Vojtěch Adam b,c, René Kizek b,c a b c Gymnázium Brno-Řečkovice, Terezy Novákové 2, Brno, Česká republika Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, Česká republika Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 10, Brno, Česká republika Modern imaging techniques Quantum dots are small semiconductor nanoparticles with great fluorescence properties including broad excitation and narrow emission spectra, high quantum yields, high photostability, possibility to be synthesize in a wide variety of colors and suitability for functionalization they are new member of a family of fluorescent labels. Due to their unique optical and electrochemical properties they have proven to be very beneficial not only for biomolecule labeling for in vitro analysis but also for in vivo applications. This review article is focused on the current imaging methods. The usage of fluorescence methods in diagnosis is discussed. This paper concerns to the fluorescence imaging and possibilities of the usage of quantum dots in in vivo imaging. Přijato k publikování: Klíčová slova: fluorescence; kvantové tečky; zobrazování Úvod Diagnostika onemocnění je odjakživa nejdůležitější součástí medicíny a lékařství. Bez diagnózy jsou všechny moderní léky a léčebné postupy zbytečné. Některé nemoci nebo problémy zvládneme rozpoznat a určit například rýmu, vnější poranění nebo další. Ale biologické procesy uvnitř těla jsou hůře detekovatelné. Odjakživa se vědci zabývali tím, jak co nejméně invazivní formou nahlédnout do vnitřního fungování a uspořádání organizmu. Nejlepší metodou k poznání těla byla po smrti člověka pitva, kterou se lidé snažili objasnit a přiblížit životní funkce a udělat další krok ve svých vědomostech. Zobrazovací metody nám umožňují různými způsoby proniknout lidským tělem bez fyzického kontaktu, a tím nahlédnout do fungování těla a určení případných problémů či odchylek. K tomuto účelu se používá různých prostředků, ať už elektromagnetického záření, rentgenového záření, ultrazvukových vln a dalších. V současné době se však pozornost hodně zaměřila na výzkum fluorescenčních zobrazovacích metod. V tomto případě neslouží k zobrazování vnější činitel, ale do těla je vpravena látka s fluorescenčními vlastnostmi. Touto metodou by za pomoci vhodné povrchové funkcionalizace mohlo být umožněno například označování konkrétního objektu v těle (nádoru, orgánu či léčiva) 1. Například protilátka navázaná na kvantové tečky, která zaručí dopravení k objektu, proti kterému je protilátka určena (například protilátka proti prostatickám nádorovým buňkám) 2. Mezi potencionálně prakticky využitelné se řadí vedle organických fluoroforů také kvantové tečky, které projevují výborné fluorescenční vlastnosti a jeví se pro toto využití jako velice vhodné 3,4. Jsou však částečně toxické, takže jejich použití je omezeno použitím vhodné povrchové vrstvy, která eliminuje negativní toxické účinky kvantových teček na organismus 5. Kvantové tečky by mohly v budoucnu umožnit snadnou diagnostiku a tím dopomoci dalšímu významnému posunu v oblasti medicíny a lékařství. Obecně o zobrazovacích technikách Z o b r a z o v a c í t e c h n i k y j s o u t e c h n i k y p o u ž í v a n é v biochemii a medicíně k zobrazování tkání a buněk, k jejich přiblížení, podrobnějšímu zkoumání struktury povrchu pozorovaného objektu, vnitřní anatomii, případně k určení velikosti objektu a dalších vlastností. Zobrazování objektů například v medicinském in vivo zobrazování nám pomáhá určit anatomii člověka, zaměřit určitý druh buněk v těle, určit typ buněk neznámého původu ze vzorku a tím určit druh onemocnění, případně detekovat viry, bakterie aj. Zobrazovací techniky nám zejména v medicíně pomáhají k zaměření odchylek od normálního stavu organismu, zachycení určitých problémů v organismu, k diagnostice onemocnění nebo určitých abnormalit v těle, a tím urychlit a navést k jejich vyřešení a uvedení do normálu, v případě diagnostiky nemoci například k nasazení vhodné léčby 6.

11 Krátká et al. 11 Zobrazovací techniky Mezi zobrazovací techniky patří například elektronová mikroskopie (EM), která umožňuje mnohonásobné přiblížení tkáně až na rozlišení jednotlivých buněk a jejich další anatomie. Umožňuje sledovat i objekty menší než 1 nm. Tato zobrazovací technika umožňuje například odlišení různých degradací buněk, pohyb buněk, pozorování mitochondrií, jejich uspořádání v pletivu atd 7. Elektronová mikroskopie využívá k zobrazení místo fotonů, které se používají u běžné optické mikroskopie, elektrony. Dělí se na různé typy, kterými jsou transmisní elektronová mikroskopie (TEM) a skenovací elektronová mikroskopie (SEM) 8. Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) využívá k zobrazení vzorku procházející elektrony. Touto metodou lze sice zachytit i vnitřní sktrukturu vzorku, ale dá se použít jen pro zobrazení tenké vrstvy vzorku 8. Skenovací elektronová mikroskopie (SEM) využívá k zobrazování sekundární nebo zpětně odražené elektrony. Slouží k zobrazení povrchu vzorku. Elektronový svazek se pohybuje po vzorku řádek po řádku a tím vytváří obraz 8. K mikroskopovému zobrazování s dostatečnou schopností zvětšení však nejsou řazeny pouze elektronové mikroskopy. Mikroskopie atomových sil (AFM) je mikroskopická technika, která slouží k 3D zobrazování. Základem je ostrý hrot, který bod po bodu zkoumá povrch vzorku, kontaktně nebo bezkontaktně za pomoci van der Waalsových sil 9. Mezi techniky používané především v medicinské praxi, patří rentgenové záření a počítačová tomografie (CT). Rentgenové záření je forma elektromagnetického záření o vlnové délce 10 nanometrů až 1 pikometr. Rentgen se hojně využívá při lékařských vyšetřeních, ale je nebezpečný pro lidské tělo, jelikož se jedná o formu ionizujícího záření. Tato schopnost trvalého poškození tkáně je sice v zobrazování nežádoucí, avšak v léčbě rakoviny využitelná ve prospěch pacienta. Nádor se ozařuje rentgenovým zářením v přesně odměřených dávkách, které způsobí jeho cílené odstraňování. Rentgenové záření dobře proniká měkkými tkáněmi těla, například pokožkou a svaly. Počítačová tomografie je zobrazovací technika, která využívá rentgenového záření k vytváření trojrozměrných snímků. Používá přístroj, který má kružnicový tvar, a do jeho vnitřní části se zasune pozorovaný objekt (vetšinou jde o in vivo zobrazování živý člověk). Kolem objektu se pohybuje rentgenka, která ho z různých stran prozařuje rentgenovým zářením a za pomoci počítače se vytvoří 3D snímek. V zobrazování se dále používá ultrazvuk, který využívá zvukových vln o vysoké frekvenci. Tyto vlny neprojdou skrze celé tělo, ale odrazí se od každého objektu v jiné míře a vrací se zpět k vysílači zvuku. Pomocí počítače je z těchto signálů tvořen na obrazovce obraz 10. Další technikou je magnetická rezonance (MR), která využívá velké magnetické pole a elektromagnetické vlnění s vysokou frekvencí. Přístroj vypadá podobně jako CT, ale na rozdíl od něj nenese žádná zdravotní rizika. Tento přístroj umožňuje tvorbu snímků řezů objektem, a při vytvoření dostatečného množství snímků také 3D obraz. Nevýhodou tohoto zobrazování je však hlučnost a délka vyšetření. Díky této délce, která se pohybuje okolo 30 min, je nekvalitní zobrazení pohybujících se částí v těle (např. kličky ve střevech) 11. Pozitronová emisní tomografie (PET) je další lékařská zobrazovací metoda. Principem metody je lokalizace místa vzniku fotonů, které v těle vznikají při anihilaci pozitronů uvolněných podanou radioaktivní látkou (radiofarmakem) a elektronů. Detekce uvolněných fotonů je uspořádána tak, že je možná trojrozměrná rekonstrukce aktivity podané látky v těle. Pozitronová emisní tomografie tedy nezobrazuje ani tak anatomickou strukturu, jako spíše ochotu konkrétní tkáně vychytávat příslušné radiofarmakum 12,13. Mezi další, méně rozšířené zobrazovací metody patří například optická koherentní tomografie, která je díky infračervenému záření schopná vytvořit kvalitní snímky biologické tkáně (vrstvy kůže, rohovky). Tento typ zobrazování se používá hlavně v oftalmologii 14. Využití fluorescence k zobrazování V současné době se věnuje velká pozornost fluorescenčnímu zobrazování 15. Ve fluorescenčním zobrazování je potřeba kvalitních zobrazovacích prostředků. Tyto fluorescenční značky, jiným názvem fluorofory, musí mít dobré fluorescenční vlastnosti, vysokou intenzitu fluorescence, dobře prozářit tkáň a také mít vhodnou velikost, která by měla být několikrát menší než zobrazované buňky, kvůli přesnějšímu zaměření objektu 16. Toto zobrazování je sice zatím ve fázi vývoje, avšak připisuje se mu velký potenciál a do budoucna by mohlo jít o další široce využívanou lékařskou zobrazovací techniku. Což by mohlo přinést velký pokrok v oblasti diagnostiky 17. Fluorescence

12 12 Journal of Metallomics and Nanotechnologies 2014, 1, je fyzikálně chemický děj, který je druhem luminiscence. Elektrony fluoroforů přecházejí po absorpci energie dopadajícího záření v atomovém obalu do vzdálenějších vrstev, takže energie atomu se zvyšuje. Tyto vyšší energetické stavy jsou však nestabilní a elektrony se během krátkého časového úseku vracejí do své původní pozice. Přebytečná energie je vyzářena v podobě fotonu 18. Fluorescenčních značek by mohlo být využito například při detekci nádorových onemocnění. Do těla by mohly být vpraveny fluorofory s navázanou cílenou látkou (například protilátkou proti nádorovým buňkám), tato látka by umožnila navázání fluoroforu na nádor a tím jeho detekci pomocí fluorescenčních metod. Tato technika by se také dala využít k navázání fluoroforu na léčivo a ke sledování jeho transportu v lidském organismu. Při kombinací různých fluoroforů by se mohlo zobrazit současně také více druhů objektů. Tato technika by mohla neinvazně a bezpečně přesně určit polohu objektu v těle. Případně po vpravení většího množství druhů protilátek s navázanými různými fluorofory bychom mohli určit, která protilátka se navázala a tím určit například typ nádoru. Za pomoci kvalitního fluorescenčního zobrazovacího přístroje v kombinaci s rentgenem bychom pak mohli pořídit snímek organismu a přesně určit velikost a rozsah nádoru 19,20. Takovým přístrojem je například Carestream In-Vivo Xtreme Imaging System (Carestream Health, Inc., Rochester, USA), který umožňuje vytvoření rentgenového snímku, a poté také excitaci aplikovaných kvantových teček a nasledné vytvoření snímku emitovaného záření za pomoci 4 MP CCD detektoru. Tento přístroj je vybaven 400 W xenonovou zářivkou, 28 excitačními (410 nm 760 nm) a 6 emisními filtry (535 nm 830 nm). Rentgenový a fluorescenční záznam objektu je poté spojen v softwaru a tím lze přesně určit polohu, software mimo jiné také umožňuje intenzitu fluorescence fluoroforu, která prošla skrze tkáň. Využití kvantových teček při fluorescenčním zobrazování Místo organických fluoroforů by mohly být použity anorganické materiály. Mezi takto využitelné materiály patří také kvantové tečky, což jsou polovodičové nanokrystaly s velikostí nm. Kvantové tečky jsou podle výzkumů 20 krát jasnější a 100 krát fotostabilnější ve srovnání s běžnými fluorofory 16. Jejich malá velikost je výhodná při kontaktu s buňkami. Mají velký kvantový výtěžek a emitují v celé viditelné oblasti spektra. Jedna nanočástice (kvantová tečka) může obsahovat atomů 21. Jejich emisní spektra jsou velmi úzká, ale excitovat mohou v celém spektru vlnových délek. Nejčastěji používané a studované kvantové tečky se skládají z jádra CdTe nebo CdSe. Kvantové tečky mohou mít různou velikost, což je způsobené odlišnými podmínkami při přípravě těchto látek. Kvantové tečky větší velikosti emitují záření větší vlnové délky (např. červené barvy vlnová délka kolem 700 nm), tečky menší velikosti záření nižších vlnových délek (např. zelené, kolem 550 nm) 22. Diskutovaná je otázka toxicity kvantových teček, což se jeví v biologickém a hlavně v in vivo zobrazování, jako určitá překážka. Proto se stále testují nové krycí povrchové vrstvy těchto kvantových teček, aby se zamezilo negativním účinkům na organismus na minimum 23,24. Kvantové tečky jsou pokrývány organickými molekulami a makromolekulami, aby byly schopné biokonjugace a byly rozpustné ve vodě. Tento povlak může být na bázi ligandu nebo polymeru, neutrální nebo nabitý. Ligandové povlaky jsou tvořené z malých molekul, které jsou přímo na anorganickém povrchu kvantové tečky. Nejčastějšími ligandy, které se používají k pokrývání kvantových teček, jsou kyselina merkaptopropionová a kyselina merkaptosukcinová 21. Popularita kvantových teček do značné míry těží z momentálního bouřlivého rozvoje nanotechnologií. Jako fluorescenční značky jistě přinesly některé výborné vlastnosti, například vysokou intenzitu fluorescence a možnosti odlišení kvantových teček zejména pomocí odlišných emisních vlnových délek různých druhů kvantových teček a různých absorbančních maxim, která jsou pro každý druh charakteristická. Komerční dostupnost kvantových teček je zatím poměrně omezená, a to zejména pokud je zapotřebí derivátů vhodných pro rychlé a pohodlné fluorescenční značení; v tomto aspektu zatím převládají organické fluorofory 25. Kvantové tečky mají však také některé nevýhody, především velkou velikost, která je srovnatelná se zobrazovanými buňkami, ale hlavně toxicitu, která se musí eliminovat povrchovými vrstvami. Výzkum a aplikace kvantových teček Zajímavou studii publikoval Choi a jeho kolegové, kteří zkoumali epigenomické a genotoxické chování CdTe kvantových teček v lidských buňkách karcinomu prsu. Naznačují tři úrovně buněčných změn

13 Krátká et al. 13 vyvolaných nanočásticemi: negenomické, genomické a epigenetické. Epigenetické změny mohou mít dlouhodobý vliv na genovou expresi, a to i dlouho poté, co byl odstraněn původní činitel. To by mohlo vést k dlouhodobým nežádoucím účinkům v organismu 26. Yong prokázal, že dodáním manganu ke kvantovým tečkám a jejich následnou povrchovou funkcionalizací pomocí lyzinu docílíme jejich rovnoměrnému rozptýlení ve vodném roztoku a že tyto tečky emitující v blízké infračervené oblasti, nezpůsobují při injekčním podávání žádné dlouhodobé nežádoucí účinky u myší. Tyto kvantové tečky by mohly najít v blízké budoucnosti využití v zobrazování a detekci rakovinných buněk slinivky břišní v lidském těle 27. Chen a jeho kolegové sledovali životaschopnost, chování a zdraví myší, kterým byly nitrožilně aplikovány thiolem pokryté CdHgTe kvantové tečky, a to po dobu tří měsíců. Bylo zjištěno, že injekce 2 μg/g CdTeHg kvantových teček nevykazuje významnou toxicitu, a nebylo pozorováno abnormální chování myši v žádném z in vivo experimentů 17. Nicméně, klíčovou otázkou stále zůstává, zdali mohou být kvantové tečky posunuty do klinické fáze výzkumu. Před jejich použitím v lidských aplikacích je potřeba ještě provést kompletní toxikologmii kvantových teček 17. Závěr Mezi moderní zobrazovací techniky se řadí rentgen, ultrazvuk, CT a další zobrazovací metody, které jsou hojně využívané v medicinské praxi. O fluorescenčním in vivo zobrazování se mluví jako o potencionální nové diagnostické technice, která by mohla být srovnatelná se současnými technikami. Kvantové tečky mají podle výzkumu skvělé vlastnosti a potencionál pro budoucí využití v praxi, především ve fluorescenčním zobrazování. Tato metoda by mohla najít uplatnění v medicíně a biochemii. Kvantové tečky mají však také některé nevýhody, především velkou velikost, která je srovnatelná se zobrazovanými buňkami, ale hlavně toxicitu, která se musí eliminovat povrchovými vrstvami. V budoucnu by se však mohlo jednat o dobrou, levnou a účinnou metodu, při které by se kvantové tečky za pomoci vhodné povrchové úpravy navázaly na potřebný objekt v organismu a následně by se detekovaly v zobrazovacím přístroji. Jedná se však zatím pouze o vizi, výzkum kvantových teček zatím nedospěl do klinické fáze výzkumu, ale jejich využití v budoucnosti je více než pravděpodobné. Tato práce byla financována ze zdrojů CEITEC CZ.1.05/1.1.00/ Literatura 1. Medintz I. L., Uyeda H. T., Goldman E. R., Mattoussi H.: Nature Materials, 4, 435 (2005). 2. Walling M. A., Novak J. A., Shepard J. R. E.: International Journal of Molecular Sciences, 10, 441 (2009). 3. Bruchez M., Moronne M., Gin P., Weiss S., Alivisatos A. P.: Science, 281, 2013 (1998). 4. Resch-Genger U., Grabolle M., Cavaliere-Jaricot S., Nitschke R., Nann T.: Nature Methods, 5, 763 (2008). 5. Drbohlavova J., Adam V., Kizek R., Hubalek J.: International Journal of Molecular Sciences, 10, 656 (2009). 6. Leblond F., Davis S. C., Valdes P. A., Pogue B. W.: Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology, 98, 77 (2010). 7. Mohammadi-Gheidari A., Kruit P.: Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment, 645, 60 (2011). 8. Yoshimura N.: Historical Evolution toward Achieving Ultrahigh Vacuum in Jeol Electron Microscopes, 1 (2014). 9. de Pablo P. J.: Single Molecule Analysis: Methods and Protocols, 783, 197 (2011). 10. Hughes J., Velká všeobecná encyklopedie, Svojtka & Co., s.r.o., Seidl Z. V. M., Magnetická rezonance hlavy, mozku a páteře, Ter-Pogossian M. M., Phelps M. E., Hoffman E. J., Mullani N. A., Positron-emission transaxial tomograph for nuclear imaging (PETT), Phelps M. E., Hoffman E. J., Mullani N. A., Ter-Pogossian M. M.: Journal of Nuclear Medicine, 16, 210 (1975). 14. Fercher A. F., Mengedoht K., Werner W.: Optics Letters, 13, 186 (1988). 15. Ntziachristos V., Bremer C., Weissleder R.: European Radiology, 13, 195 (2003). 16. Tan W. H., Wang K. M., He X. X., Zhao X. J., Drake T., Wang L., Bagwe R. P.: Medicinal Research Reviews, 24, 621 (2004). 17. Chen H., Wang Y., Xu J., Ji J., Zhang J., Hu Y., Gu Y.: Journal of Fluorescence, 18, 801 (2008). 18. Fišar Z.: Multimediální podpora výuky klinických a zdravotnických oborů :: Portál 1. lékařské fakulty Karlovy Univerzity v Praze [online], (2012). 19. Gao J. H., Chen K., Xie R. G., Xie J., Yan Y. J., Cheng Z., Peng X. G., Chen X. Y.: Bioconjugate Chemistry, 21, 604 (2010). 20. Ghaderi S., Ramesh B., Seifalian A. M.: Journal of Drug Targeting, 19, 475 (2011). 21. Algar W. R., Tavares A. J., Krull U. J.: Analytica Chimica Acta, 673, 1 (2010). 22. Hoshino A., Hanada S., Yamamoto K.: Archives of Toxicology, 85, 707 (2011). 23. Mohs A. M., Duan H., Kairdolf B. A., Smith A. M., Nie S.: Nano Research, 2, 500 (2009). 24. Smith A. M., Duan H., Mohs A. M., Nie S.: Advanced Drug Delivery Reviews, 60, 1226 (2008). 25. Hlavacek A., Skladal P.: Chemicke Listy, 105, 611 (2011). 26. Choi A. O., Brown S. E., Szyf M., Maysinger D.: Journal of Molecular Medicine-Jmm, 86, 291 (2008). 27. Yong K.-T.: Nanotechnology, 20, (2009).

14 14 Journal of Metallomics and Nanotechnologies 2014, 1, Článek je volně šiřitelný pod licencí Creative Commons (BY-NC-ND). Musí však být uveden autor a dokument nelze měnit a použivat pro komerční účely.

15 REVIEW 15 Shrnutí vzniku a mechanismu rezistence vůči těžkým kovům Matěj Sklenář a, Dagmar Chudobová a, Kristýna Číhalová a, Marie Konečná a,b, Vojtěch Adam a,b, René Kizek a,b a b Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, Česká republika Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 10, Brno, Česká republika REVIEW: General Mechanisms of Microbial resistance to metals In this review is presented general mechanism of bacterial resistence against metals. Bacteria was adapting to outer conditions during the evolotion. Ability of resistence is carried by genetic informations in DNA which may be located in different parts of cell. According to character of resistence there are different localization of genetic information where metal resistance is coded. It dependes on the fact if the metal is essential or non-essential (plasmid, chromosome, transposome). There are six postulated mechanisms of metal resistence in microorganisms, metal exclusion by permeability barrier, active transport of metal away from the cell, intracellular sequeatration of the metal by protein biding, extracellular sequestration, enzymatic detoxification to less toxic form, reduction in metal sensitivity of cellular targets. Přijato k publikování: Klíčová slova: bakteriální rezistence, mechanismus rezistence, těžké kovy, toxicita kovů Úvod Bakteriální rezistence představuje závažný globální problém pro lidskou populaci, nejvíce v oblasti zdravotnictví 1. Týká se všech hlavních bakteriálních patogenů, které se snadno šíří pomocí kapénkové infekce 2. V dnešní době se napříč odbornou zdravotnickou veřejností diskutuje o antibiotické rezistenci jako o zásadním problému. V posledních letech probíhá výzkum léčiv alternativních k dosud využívaným antibiotikům 3. Antimikrobiální účinky kovů jsou známé již z minulosti a díky moderním technikám na bázi nanotechnologie je možné vytvářet jejich nanočástice, čímž je dosaženo zvýšené antimikrobiální aktivity 4. Nanočástice se díky svým velmi malým rozměrům a velkou aktivní plochou ve srovnání s běžnými částicemi kovů snáze distribuují v lidském organismu 5. Pro udržení funkčnosti těchto léčiv po co nejdelší dobu je nutné zahájit výzkum zabývající se vznikem bakteriální rezistence vůči iontům těžkých kovů. Výzkum vychází ze základních poznatků, jako princip vstupu kovu do buňky a mechanismus, kterým kov buňku eliminuje 6. Dalším cenným zdrojem informací jsou poznatky z oboru ekologie, kde bylo vynaloženo velkých prostředků na výzkum bakteriálních kmenů v oblastech znečištěných těžbou kovů apod. Antibiotická i kovová rezistence jsou obě geneticky podmíněné, jejich informace je uložena v některé z buněčných částí. Geny uložené v chromosomech, plasmidech nebo transpozomech kódují rezistenci vůči specifickému kovu 7. Většina kovů však esenciálních není a jsou pro bakterie potenciálně toxické. Při vysoké koncentraci jsou i esenciální kovy pro buňku toxické a mohou narušovat cytoplazmatickou membránu 8. Přítomnost kovů v půdě vytváří stresové podmínky pro bakteriální kmeny. Tento proces vede k postupnému vývoji rezistence k téměř všem toxickým kovům 9. Bakteriální rezistence vůči kovům je heterogenní jak v biochemické, tak genetické podstatě. Od 70. let minulého století bylo identifikováno několik mikroorganismů rezistentních vůči kovům. Tyto studie se týkaly především aerobních bakterií Staphylococcus sp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa a Bacillus sp Systém kovové rezistence se pravděpodobně vyvinul krátce po vzniku prokaryotického života a v současnosti se nachází téměř u všech bakteriálních druhů 15. Kovová rezistence v mnoha případech spojena s antibiotickou 10, Tyto dvě rezistence jsou distribuovány mezi jinými populacemi konjugací nebo transdukcí 12. Mechanismus toxicity kovu a vstup kovu do buňky Mechanismus toxicity kovů v buňce je dán interakcí konkrétního kovu se specifickým biologickým druhem 9. Kovy vstupují do buňky dvěma způsoby 19. Prvním způsobem, skrze nespecifické transportéry, se do buňky dostávají nejen esenciální, ale i těžké kovy 20. Tato cesta umožňuje rychlý transport kovů do

16 16 Journal of Metallomics and Nanotechnologies 2014, 1, buňky přes cytoplazmatickou membránu, je řízena chemoosmotickým gradientem buňky 21. K transportu kovu do buňky však dochází i ve stavu přebytku kovu v buňce. Tento systém se nazývá open gate, při tomto transportu může dojít k průniku těžkého kovu do buňky a oškodit ji. Druhý způsob, specifický transport iontů, který je oproti prvně jmenovanému pomalejší, spotřebovává energii a probíhá pouze v situaci potřeby, jako je nedostatek výživy či jiných esenciálních látek 22. Hlavním mechanismem toxicity je lipidová peroxidace, kdy probíhá přímá reakce kyslíku s vícenenasycenými mastnými kyselinami, částmi lipidové membrány, vedocí k tvorbě radikálových meziproduktů. Tyto radikály snadno reagují s orgány buňky a dochází k jejich poškození. Železo nebo měď mohou fungovat jako katalyzátory reakcí, při kterých dochází k tvorbě radikálů. Ve výsledku dochází k tvorbě vysoce toxických hydroxylových radikálů. Tyto radikály jsou vysoce reaktivní a interagují s jakýmikoliv biologickými molekulami v bezprostředním okolí. Kovové ionty snižují nebo zvyšují enzymatickou aktivitu nebo mění enzymovou specifitu pomocí indukční konformace. Regulace esenciálních a neesenciálních kovů rozdílnými způsoby Některé kovy jsou důležité pro výživu buňky, nazýváme je esenciální, v nadbytku však mohou být toxické 15. Působení kovu na buňku tedy není pouze negativní. Esenciální kovy (např. kobalt, měď a nikl) fungují ve stopovém množství jako redoxní činitelé k stabilizaci molekul nebo při elektrostatické interakci jako součást enzymů pro regulaci osmotického tlaku. Mezi rezistencí zprostředkovanou chromosomy a plasmidy jsou značné rozdíly. Gen rezistence na chromosomu obvykle zodpovídá za regulaci nadbytku esenciálních kovů a mechanismus je složitější než u plasmidu. Gen rezistence obsažený v plasmidu pak odpovídá za ochranu před ionty neesenciálních toxických kovů, jedná se o efluxní mechanismus. Efluxní mechanismus přenášený plasmidem zajišťuje snadnou mobilitu v buňce a přenos mezi jednotlivými jedinci, zároveň pro buňku neznamenají zátěž v podobě dalších genů a jsou použity pouze v případech potřeby 23. Mechanismy rezistence neseny pomocí DNA plasmidu jsou nejběžnější, velmi specifické a byly nalezeny u téměř všech studovaných skupin eubakterií 24,25. Rezistence vůči kovu a zároveň antibiotiku může být zprostředkována jedním plasmidem 10. Způsoby ochrany buňky Buňka se stává rezistentní za účelem ochrany citlivých míst své struktury, toho docílí různými způsoby. Rezistence v buňce může mít různý rozsah, to závisí na následujících faktorech: počet a druh systémů, kterými je kov přijímán 15, způsob interakce kovu v metabolickém systému buňky, funkce kovu v buňce (esenciální x neesenciální) a také schopnost kazety genové rezistence plně se projevit 23. Počet faktorů ovlivní způsob a stupeň ochrany. Obecné mechanismy rezistence Je zprostředkována jedním nebo více geny kódovanými chromosomy, plasmidy nebo transposomy. Buňka zajišťuje rezistenci vůči kovům zabráněním nebo omezením přístupu kovu k citlivým částem buňky nebo snížením citlivosti daných částí buňky. Je stanoveno 6 obecných biochemických mechanismů, které se podílejí na výsledné rezistenci bakterií 9,23. Jedná se o vyloučení kovu pomocí propustné bariéry; vyloučení kovu pomocí aktivního transportu z buňky; vnitrobuněčné fyzické odloučení kovu pomocí obalení kovu proteinem, vedoucí k zabránění narušení části buňky, které jsou vůči kovům citlivé; mimobuněčná sekvestrace (vyloučení); průběh chemické reakce, v níž se toxická aktivita kovu sníží a v neposlední řadě snížení citlivosti cílových orgánů buňky, které jsou náchylné vůči působení kovů. Chemická reakce vedoucí ke snížení toxicity dané buňky probíhá zvýšením aktivity alternativní (přepínací) metabolické cesty, která zajišťuje relativní rezistenci vůči kovům. Různé mechanismy rezistence mohou působit samostatně nebo mohou participovat na rezistenci vůči různým kovům v jednom druhu 26. Specifická obrana těchto citlivých buněk může být dosažena čtyřmi způsoby: mutací citlivých částí buňky vedoucí k snížení senzitivity bez výrazného ovlivnění jejich běžné funkce; navýšením množství struktur náchylných na kov, buňka tak vytvoří prostor, kde toxická aktivita působí, ale nezničí prostor celý; opravou buněčných komponent, v praxi možné pouze pro DNA 27 nebo upravením metabolické cesty za využití plasmidu obsahujícího genetickou informaci pro rezistenci, tak aby toxická aktivita nepůsobila na chromosomální složku, jež odpovídá za slabost buňky 28. Tento mechanismus je analogický antibiotické rezistenci proti trimetoprimu.

17 Sklenář et al. 17 Závěr Bakteriální rezistence vzniká přizpůsobením mikroorganismu stresovým podmínkám okolí. Pro úspěšné zavedení kovů nebo jejich nanočástic jako antiseptického činidla místo antibiotik v boji proti bakteriím je nutné znát přesný mechanismus rezistence. Pro stanovení typu mechanismu rezistence by bylo nutné sledovat přímý vývoj tohoto mechanismu. Z teoretických poznatků zmíněných v tomto příspěvku lze odvodit, že pokud by byla sledována genetická informace kultury, která není rezistentní vůči kovu a kultury vystavené umělým stresovým podmínkám v podobě přídavku malé koncentrace kovu v pravidelných intervalech, mělo by docházet u této stresované kultury k tvorbě rezistence, a tudíž genovým změnám. V případě zkoumání kovu esenciálního pro bakterie by docházelo ke změnám na chromosomální DNA a v případě neesenciálních kovů v kruhové DNA plasmidu. Sledováním změn v sekvenci nukleových kyselin odpovědných za rezistenci by bylo možné zcela pochopit její mechanismus. Tato práce byla podpořena grantem NanoCeva TA ČR TA Literatura 1. Paterson G. K., Harrison E. M., Holmes M. A.: Trends in Microbiology, 22, 42 (2014). 2. O Grady K. A. F., Whiley D. M., Torzillo P. J., Sloots T. P., Lambert S. B.: Bmc Infectious Diseases, 13, (2013). 3. Rasool R., Hasnain S., Nishat N.: Designed Monomers and Polymers, 17, 217 (2014). 4. Magdolenova Z., Collins A., Kumar A., Dhawan A., Stone V., Dusinska M.: Nanotoxicology, 8, 233 (2014). 5. Kanmani P., Rhim J. W.: Food Chemistry, 148, 162 (2014). 6. Passow H., Rothstein A.: Journal of General Physiology, 43, 621 (1960). 7. Altimira F., Yanez C., Bravo G., Gonzalez M., Rojas L. A., Seeger M.: Bmc Microbiology, 12, (2012). 8. Gutteridge J. M. C., Halliwell B.: Trends in Biochemical Sciences, 15, 129 (1990). 9. Rouch D. A., Lee B. T. O., Morby A. P.: Journal of Industrial Microbiology, 14, 132 (1995). 10. Nakahara H., Ishikawa T., Sarai Y., Kondo I., Kozukue H., Silver S.: Applied and Environmental Microbiology, 33, 975 (1977). 11. Marques A. M., Congregado F., Simonpujol D. M.: Journal of Applied Bacteriology, 47, 347 (1979). 12. Harnett N. M., Gyles C. L.: Applied and Environmental Microbiology, 48, 930 (1984). 13. Belliveau B. H., Starodub M. E., Trevors J. T.: Canadian Journal of Microbiology, 37, 513 (1991). 14. Wang Y. T., Shen H.: Journal of Industrial Microbiology, 14, 159 (1995). 15. Silver S., Ji G. G.: Environmental Health Perspectives, 102, 107 (1994). 16. Harnett N. M., Gyles C. L.: Applied and Environmental Microbiology, 48, 930 (1984). 17. McEntee J. D., Woodrow J. R., Quirk A. V.: Applied and Environmental Microbiology, 51, 515 (1986). 18. Schwarz S., Blobel H.: Journal of Veterinary Medicine Series B-Zentralblatt Fur Veterinarmedizin Reihe B-Infectious Diseases and Veterinary Public Health, 36, 669 (1989). 19. Nies D. H., Silver S.: Journal of Industrial Microbiology, 14, 186 (1995). 20. Schreurs W. J. A., Rosenberg H.: Journal of Bacteriology, 152, 7 (1982). 21. Nieboer E., Richardson D. H. S.: Environmental Pollution Series B-Chemical and Physical, 1, 3 (1980). 22. Nies D. H.: Applied Microbiology and Biotechnology, 51, 730 (1999). 23. Silver S., Walderhaug M.: Microbiological Reviews, 56, 195 (1992). 24. Misra T. K., Brown N. L., Fritzinger D. C., Pridmore R. D., Barnes W. M., Haberstroh L., Silver S.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-Biological Sciences, 81, 5975 (1984). 25. Ji G. Y., Silver S.: Journal of Industrial Microbiology, 14, 61 (1995). 26. Bagg A., Neilands J. B.: Biochemistry, 26, 5471 (1987). 27. Braun V., Gunter K., Hantke K.: Biology of Metals, 4, 14 (1991). 28. Cervantes C., Silver S., Inorganic cation and anion transport-systems of Pseudomonas, Amer Soc Microbiology, Washington, Článek je volně šiřitelný pod licencí Creative Commons (BY-NC-ND). Musí však být uveden autor a dokument nelze měnit a použivat pro komerční účely.

18 18 REVIEW MiRNA: Od biogeneze po využití v lékařství Veronika Vlahová a, Kristýna Šmerková a, Markéta Vaculovičová a,b, René Kizek a,b a Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, Česká republika b Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 10, Brno, Česká republika MiRNA: From biogenesis to medical utilization MicroRNAs are small non-coding RNA molecules that are involved in post-transcriptional regulation of gene expression. They take up about 2 % of the genome and affects up to one third of the protein-coding genes. Their biogenesis starts in the cell nucleus and passes into the cytoplasm where the functional forms of mirnas participate in the process of RNA interference. Nowadays, the biggest interest focuses on the role of mirnas during carcinogenesis. Mutations in the genes for various mirnas types is to promote proliferation and inhibition of apoptosis. Therefore, the mirna counts as a good diagnostic marker or even as a treatment method. Přijato k publikování: Klíčová slova: biogeneze, diagnostický marker, Dicer, Drosha, MiRNA, RNA interference Úvod MicroRNA (mirna) jsou malé endogenní molekuly RNA, které patří do skupiny nekódujících malých jaderných RNA. Velikost aktivních molekul mirna se pohybuje zhruba okolo 22 nukleotidů. Význam těchto molekul spočívá v jejich schopnosti regulovat genovou expresi na posttranskripční úrovni 1. Tento proces probíhá navázáním na 3 UTR konec cílové mediátorové RNA (mrna). Cílová mrna je poté buď degradována, nebo je pozastavena její translace. Jedna molekula mirna je navíc schopna ovlivnit více molekul mrna. Tímto způsobem je negativně regulována až třetina kódujících genů v genomu, což dělá z mirna nejpočetnější skupinu regulátorů v buňce 2. Její působení reguluje proliferaci buněk, jejich diferenciaci a apoptózu a všeobecně ovlivňuje množství důležitých biologických procesů 3,4. Geny pro mirna jsou rozprostřeny napříč celým genomem a jejich výskyt je značný, zabírají až 2 % celého genomu 5. Jejich výskyt je velmi konzervativní, u velmi příbuzných druhů jsou zachovány téměř všechny mirna a homology se vyskytují i u druhů velmi vzdálených 6. V dnešních dnech je výzkumu mirna věnována velká pozornost, a to hlavně díky jejímu vlivu na nádorovou transformaci buněk. Zhruba 50 % genů kódujících mirna se nachází na fragilních částech chromozomů, které bývají pozměněny buď amplifikací, nebo delecí v průběhu karcinogeneze 7. MiRNA se vyskytuje jak v pozici onkogenu, kdy exprese takovéto molekuly v tumorových buňkách narůstá, tak i v pozici tumor- -supresorového genu, kdy dochází ke snížení nebo naprosté absenci exprese dané mirna 4,8. Z tohoto pohledu je jasné, že díky svým vlastnostem by mirna mohly sloužit jako ideální diagnostické markery pro zjištění pravděpodobnosti recidivity onemocnění, její odpovědi na léčbu a pravděpodobnosti vzniku metastáz. Dalším pozitivem je její větší stabilita oproti mrna, která byla běžně používána jako diagnostický marker. Velký potenciál má mirna ve využití v protinádorové terapii. Díky procesu RNA interference, které se mirna účastní, lze cíleně umlčet určité geny podporující např. proliferaci v nádorovém bujení. V dnešních dnech probíhá velké množství studií, které se zabývají otázkou cíleného transportu mirna do buněk nádoru, a to aniž by došlo k aktivaci imunitní odpovědi. Další otázkou je, jak docílit tlumení pouze cílových mrna 9. Historie mirna V roce 1993 zkoumali Lee a Ambros se spolupracovníky molekuly RNA, vznikající z genu lin-4 u Caenorhabditis elegans 10. Tyto molekuly byly dvojího typu delší měla 61 nukleotidů a kratší 22 nukleotidů. 5 konce těchto molekul byly identické, což vedlo k domněnce, že delší molekula slouží v buňce jako

19 Vlahová et al. 19 prekurzor její kratší variantě. Důležitým zjištěním bylo, že tyto molekuly RNA se nepřepisují do žádného proteinu. Navíc obě tyto molekuly byly komplementární k 3 nepřekládanému konci (3 UTR konci) mrna genu lin-14. Vědci zjistili, že lin-4 se váže na mrna genu lin-14 a tím zamezuje jejímu přepisu do proteinu. Pokles hladiny tohoto proteinu zapříčiňuje přechod z prvního larválního stádia do druhého. V roce 2000 byla objevena další malá molekula RNA s názvem let-7 u C. elegans 11. Vědci objevili, že tato malá molekula RNA s délkou 21 nukleotidů se váže podobně jako lin-4 na mrna genů ovlivňujících larvální vývoj C. elegans. Po zvýšení exprese let-7 dochází k posttranslační regulaci mrna genů lin-41 a lin-42, což způsobí přechod z larválního stádia do stádia dospělce. Také bylo zjištěno, že geny pro let-7 jsou vysoce konzervované a objevují se u různých živočišných druhů, jako u dospělých stádií kroužkovců a měkkýšů, zebřiček a u octomilek 12. Biogeneze mirna Geny pro mirna se kromě chromozomu Y nacházejí na všech chromozomech. Nejčastější výskyt je v klastrech, ale mohou se vyskytovat i samostatně. Jejich největší zastoupení (asi 40%) je v intronech kódujících genů nebo v genech pro nekódující RNA 13. K biosyntéze mirna (Obr. 1) dochází v jádře buňky a to prostřednictvím RNA polymerázy II, která vytváří transkript zvaný pri-mirna, který je opatřen na 3 konci guanidinovou čepičkou a na 5 konci nese polyadenylový zbytek 14. Tyto transkripty vznikají z intronových částí genomu o velikosti zhruba 400 nukleotidů a k jejich přepisu dochází po vystřihnutí z primárního transkriptu 13. Pri-miRNA má částečně komplementární strukturu a tvoří vnitřní vlásenkové struktury 15. Tyto struktury jsou rozeznávané komplexem zvaným Mikroprocesor. Tento komplex se skládá ze dvou základních proteinů z RNázy III, který je nazýván Drosha a z proteinu DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region gene 8), který je znám jako Pasha 16. Protein Drosha je schopný rozeznat pri-mirna od ostatních prekurzorů RNA, které také nesou vlásenky, a protein Pasha rozeznává dsrna a vyhledává na molekule místo sestřihu, který zajistí RNázová aktivita proteinu Drosha 17. Po sestřihu zprostředkovaným Mikroprocesorem se mění prekurzor na pre-mir- NA. Tento prekurzor má strukturu úplné vlásenky s přesahem 2 nukleotidů na 3 konci a délkou zhruba 70 nukleotidů 18. Tyto procesy probíhají v jádře. Za přepravu prekurzoru pre-mirna skrze jaderné póry z jádra do cytoplazmy je zodpovědný transportní komplex Exportin Ten za přítomnosti kofaktoru Ran rozpoznává specifickou sekvenci vlásenky pre-mirna. Na kofaktor Ran se váže GTP. Po hydrolýze GTP na GDP dochází k aktivaci komplexu Exportin 5 a k transportu pre-mirna do cytoplazmy buňky 20. V cytoplazmě je pre-mirna rozpoznávána enzymem Dicer, což je ATP-dependentní multidoménový enzym, který se řadí do skupiny RNáz typu III o velikosti až 200 kd 9. Dicer je v komplexu s dsrna vazebným proteinem TRBP (trans-activator RNA binding protein). Tento komplex štěpí dlouhé pre-mirna na krátké fragmenty o délce zhruba 22 nukleotidů, které se účastní RNA interference 21. RNA interference Po působení enzymu Dicer vznikly tedy krátké duplexy RNA:RNA 22. Tento duplex se rozděluje na vedoucí ( guide ) řetězec a za passenger řetězec (často značený RNA*), přičemž vedoucí řetězec se účastní umlčování mrna, zatímco vedlejší řetězec je degradován. Nicméně v posledních studiích se zjistilo, že se aktivními řetězci mohou stát oba řetězce z duplexu RNA:RNA, kdy jeden je značen 5p a druhý 3p. Preference jednoho či druhého řetězce závisí na druhu tkáně 23. Řetězec mirna je navázán na komplex RISC (RNA- -induced silencing complex), zatímco druhý řetězec je v cytoplazmě ihned degradován. Aktivní mirna navázaná v RISC se váže na 3 UTR konec mrna podle komplementarity bází, tento proces probíhá na polyribozomech. Centrum komplexu RISC tvoří proteiny z argonautové rodiny, speciálně Ago Tento protein se váže se dvěma doménami, které jsou důležité v procesu RNA interference domény PIWI a PAZ 25. Na doménu PAZ se vážou dva nukleotidy přesahující na 3 konci mirna. Na PIWI doménu se váže 5 konec mirna. PIWI doména funguje jako endoribonukleáza a štěpí mrna, která se páruje s danou mirna v komplexu. Ago 2 protein je řídícím centrem štěpící aktivity komplexu RISC 26. Proces RNA interference (RNAi) může probíhat dvěma způsoby a je závislý na míře komplementarity sekvencí mirna a cílové mrna. Jestliže dochází k přesnému párování sekvencí mezi mirna a mrna,

20 20 Journal of Metallomics and Nanotechnologies 2014, 1, dochází k degradaci mrna. Tento případ není u savců příliš běžný 28. Jestliže dochází jen k částečnému párování sekvencí, vznikají v duplexu vlásenky a výdutě. V tomto případě dochází k potlačení translace 29. Díky nepřesnému párování má jedna mirna vliv na velké množství různých mrna a má tak velký vliv na buněčnou fyziologii 5 MiRNA a rakovina Zjištění, že více jak polovina genů pro mirna leží na fragilních částech chromozomů, které nejvíce podléhají mutačním změnám při rakovinném bujení, ať už se jedná o delece, amplifikace či translokace, vedlo k přesvědčení, že tyto malé molekuly hrají velikou roli ve vývoji rakoviny. V dnešních dnech probíhají mnohé studie ohledně výskytu a role jednotlivých mirna v různých typech nádorů. Jak už bylo dříve zmíněno, mirna se vyskytují v genomu v podobě onkogenů i v podobě tumor-supresorových genů a podle toho také kolísá hladina jejich výskytu v rakovinové tkáni. Proto se s mirna počítá jako s dobrým diagnostickým markerem, který by mohl určit jak druh tumoru, tak prognózu nebo stanovit míru reakce na podané léčivo. Příkladem je studie z roku 2005, kdy bylo využito stanovení mirna pro určení progresu u chronické lymfoidní leukémie 30 nebo určení 7 typů mirna u rakoviny žaludku, jejichž přítomnost zaručila přežití pacientů bez relapsu onemocnění 31. Obdobně u kožního melanomu bylo zjištěno, že nízká hladina mir-191 a vysoká hladina mir-193 byla spojena s krátkou dobou přežití 32. Ovšem důležitější využití mirna jako biomarkeru je v predikci reakce na specifickou terapii. Například u pacientů trpících hepatocelulárním karcinomem je snížená hladina mir-26 spojena s horší prognózou, avšak tito pacienti lépe reagují na léčbu interferonem- -α 33. Tím by bylo možné určení pacientů, pro které je léčba interferonem vhodnější. Naopak při určení zvý- Obr. 1: Biogeneze mirna. Prekurzor mirna (pri-mirna) je přepsán RNA polymerázou II. Pomocí komplexu Drosha/Pasha je pri-mirna sestřihnuta na pre-mirna, která je následně transportována do cytoplazmy pomocí komplexu Exportin 5. V cytoplazmě je pre-mirna vyhledána komplexem Dicer, který sestřihne prekurzor na krátké duplexy RNA:RNA. Jeden řetězec z duplexu je degradován a druhý je navázán do komplexu RISC. Převzato a upraveno dle 27