MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2014 KATEŘINA ŘEZNÍČKOVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Bioaktivní látky používané k prodloužení údržnosti mléka a mléčných výrobků Bakalářská práce Vedoucí práce: prof. Ing. Květoslava Šustová, Ph.D. Vypracovala: Kateřina Řezníčková Brno 2014

3 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci: Bioaktivní látky používané k prodloužení mléka a mléčných výrobků vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb.,o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.... podpis

4 PODĚKOVÁNÍ Tímto bych chtěla velmi poděkovat paní prof. Ing. Květoslavě Šustové, Ph.D, že mi dávala cenné rady a za čas, který mi věnovala v rámci konzultací. Příteli a své rodině, kteří se mnou měli trpělivost a pevné nervy. Práce byla realizována s podporou projektu NAZV KUS QJ

5 ABSTRAKT Cílem práce bylo prozkoumat bioaktivní látky, které jsou schopny prodloužit údržnost mléka a mléčných výrobků. Práce se zabývá popisem druhů bakterií mléčného kvašení a jejich produkty, za které lze považovat kyseliny, peroxid vodíku a především bakteriociny, které jsou v bakalářské práci rozděleny do tříd a popsány. Ve druhé části se práce zabývá bioaktivními látkami, které jsou rostlinného původu. Nakonec jsou popsány mléčné výrobky, které přirozeně obsahují tyto látky. Klíčová slova: Bioaktivní látka, bakterie mléčného kvašení, bakteriocin, esenciální olej, mléčný výrobek. ABSTRAKT The aim of my work was to investigate bioactive substances, which are able to extend the shelf life of milk and dairy products. The work deals with the description of the species of lactic acid bacteria and their products, which can considered acid, hydrogen peroxide, and especially bacteriocins that are in the thesis divided into classes and described. In the second part of the thesis deals with bioactive substances, which are of plant origin. Finally, the are described dairy products that naturally contain these bioactive substances. Key words: bioactive substances, lactic acid bacteria, bacteriocin, essencial oil, dairy product.

6 1 Úvod Cíl práce Kažení mléka a mléčných produktů Čím je způsobeno kažení mléka a mléčných výrobků Jak se projevuje kažení mléka a mléčných výrobků Kažení a vady mléka Kažení a vady jogurtů Kažení a vady sýru Bakterie mléčného kvašení Obecná charakteristika bakterií mléčného kvašení Rod Streptococcus Rod Lactobacilus Rod Lactococcus Rod Enterococcus Rod Pediococcus Další druhy bakterií mléčného kvašení Ochranná funkce bakterií mléčného kvašení Organické kyseliny Kyselina mléčná Kyselina propionová Kyselina octová Peroxid vodíku Diacetyl a acetaldehyd Reuterin Bakteriociny Rozdělení bakteriocinů Třída I. Charakteristika, strukturální vlastnosti a způsob účinku Lacticin Lactocin S Nisin Třída II - Charakteristika, strukturální vlastnosti a způsob účinku Pediocin PA Enterocin A a B... 28

7 5.1.3 Třída III Helveticin J Třída IV Aplikace bakteriocinů ve fermentovaném mléce Bioaktivní látky rostliného původu Terpeny Esenciální oleje Allicin Karvakrol a thymol p cymen Eugenol Aldehyd skořicový Fenolické látky Chinony Flavonoidy Třísloviny Mléčné výrobky, kde se přirozeně vyskytují Bioaktivní látky Fermentované výrobky s termofilními kulturami Jogurty Acidofilní mléka Fermentované výrobky s bakteriální a kvasinkovou kulturou Kefír Závěr Seznam literatury Seznam obrázků... 45

8 1 ÚVOD Bioaktivní látka je látka nebo směs, která má biologickou aktivitu a má přímý účinek na živý organismus. Tyto účinky mohou být jak negativní, tak pozitivní v závislosti na látce, dávce nebo biologické dostupnosti. Termín bioaktivní látka nebo složka je obvykle spojován pouze s pozitivními účinky na organismus. Jedna definice je, že bioaktivní látky mají přímý vliv na stav zdraví a proto mají přidanou biologickou hodnotu za jejich kalorický obsah. Nicméně, neexistuje žádná jednotná definice. Tyto látky jsou přítomny v potravinách jak rostlinného tak i živočišného původu ( V potravinářském průmyslu je lze využít k prodloužení údržnosti, díky jejich antimikrobiální aktivitě. Široký výběr těchto látek umožňuje různé použití v různých potravinách, avšak v mléce a mléčných výrobcích je použití omezené, protože je nežádoucí aby se po použití výrazně změnily senzorické vlastnosti mléka nebo mléčných výrobků, a to především bioaktivní látky z rostlinných organismů nesplňují. Proto se mlékárenský průmysl zaměřuje na produkty produkované bakteriemi mléčného kvašení. Velký význam má kyselina mléčná a bakteriociny, které dosud nejsou příliš detailně prostudovány. 8

9 2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce bylo: prostudovat dostupnou odbornou a vědeckou literaturu zaměřenou na využití bioaktivních látek, které prodlužují údržnost mléka a mléčných výrobků. Zaměřit se při studiu na literární zdroje uvádějící technologické postupy umožňující využívání bioaktivních látek k zamezení kažení mléka a mléčných výrobků. Při studuju odborné literatury se zaměřit rovněž na složení mléčných výrobků umožňující prodloužení údržnost a také zvýšení bezpečnosti prostřednictvím bioaktivních látek přirozeně se vyskytujících v potravinách. Bioaktivní látky by měly splňovat požadavky jako: účinné potlačování nežádoucí mikroflóry, pouze slabý vliv na zákysové bakterie mléčného kvašení, příznivé senzorické a aplikační vlastnosti finálního výrobku, zdravotní bezpečnost a další. 9

10 3 KAŽENÍ MLÉKA A MLÉČNÝCH PRODUKTŮ 3.1 Čím je způsobeno kažení mléka a mléčných výrobků Největší význam při kažení potravin mají mikroorganismy, tedy bakterie, kvasinky a plísně ( Mléko je svým vyváženým složením živin a vysokým obsahem vody velmi vhodným prostředím pro růst MO, které mohou svou činností kvalitu mléka a mléčných výrobků ovlivnit jak příznivě, tak nepříznivě. Ke zdrojům kontaminace syrového mléka patří: - bakterie ze strukových kanálků (Propionibacterium, Micrrococcus, Enterococcus) - MO prostředí, jedná se hlavně o MO z povrchu vemene, těla a výkalů dojnic, z krmiv, prachu, vody, z rukou ošetřovatelů, z mléčného potrubí, z nádob, kde je mléko uchováno a transportováno (Escherichia coli a rody: Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus, Bacillus, Clostridium) - ze zánětu mléčné žlázy (Streptococcus agalactiae) (Šustová, Sýkora, 2013) Z uvedeného vyplývá, že k mikrobiální kontaminaci mléka, mléčných výrobků a potravin obecně může docházet na všech úrovních při získávání a uchovávání mléka v zemědělském podniku, při transportu ke zpracování do mlékárny, při zpracování mléka, při jeho distribuci a prodeji a v neposlední řadě i u samotného konzumenta. (Samková a kol., 2013) 3.2 Jak se projevuje kažení mléka a mléčných výrobků Při technologických operacích může docházet ke kontaminaci mléka/suroviny a následně rozvoji nežádoucí mikroflóry. Jejich činnost pak negativně ovlivňuje kvalitu, zdravotní nezávadnost a mimo jiné i senzorické vlastnosti jogurtů. (Šustová, Sýkora, 2013) Kažení a vady mléka Mikroorganismy v mléce mohou vyvolat různé změny, které jsou závislé především na druhu mikroorganismu a na složce mléka, kterou tyto mikroorganismy rozkládají. Protože se v mléce prakticky nikdy nenachází mikrobiální monokultura, je třeba počítat s kombinovaným působením mikroorganismů na mléko a tím i hůře definovatelnými 10

11 změnami mléka. Mezi hlavní změny, které vyvolávají mikroorganismy v mléce, jsou změny vyvolané fermentační činností mikroorganismů (tvorba plynu), dále změny vzniklé proteolýzou (sladké srážení), lipolýzou (hydrolýza mléčného tuku na mstné kyseliny a glycerol, oxidací nenasycených mastných kyseliny lojovitý pach a chuť. Kombinace oxidace a hydrolýzy se organolepticky projevuje tzv. žluklostí tukových složek mléka.), tvorbou alkalické reakce mléka (vyvolávají ji alkaliformní bakterie bez známek proteolýzy. Alkalická reakce je způsobena přítomností amoniaku, močoviny, uhličitanu apod.), slizovatění (mléko se stává viskózním, slizovatým), změnou barvy (na povrchu mléka, ve formě usazeniny, modré zbarvení, žluté zbarvení, černé zbarvení, hnědé zbarvení), spálenou nebo karamelovitou příchuť, hořkou (rody Clostridium, Penicillium, Mucor) nebo zatuchlou příchuť (tvorba trimetylaminu) (Cempírková a kol., 1997) Kažení a vady jogurtů Změny jogurtu vyvolané mikroorganismy se mohou nepříznivě projevit nejen u finálního výrobku, ale i v technologickém procesu. Z organoleptických změn jsou to nejčastěji: - slabá kyselost jogurtu, kterou způsobuje nekvalitní kultura nebo zákys. Na špatné kvalitě zákysu se může podílet i příliš nízká nebo vysoká kultivační teplota při přípravě provozního zákysu, silná kyselost, obyčejně spojená s hořkou chutí jogurtu, kterou vyvolává dlouhé ponechání jogurtu při teplotě optimálního zrání, tvorba plynu při silné kontaminaci koliformních mikroorganismů, ztráta typického jogurtového aromatu při potlačení lactobacilů v jogurtové kultuře - vločkovitost jogurtu vyvolána pomalým srážením Z technologického hlediska je vadou jogurtu jeho zdlouhavé srážení, nebo když se jogurt nesráží vůbec. Tuto vadu způsobuje příliš stará, překysaná nebo poškozená kultura. Další vadou je uvolňování syrovátky na povrchu jogurtu kultivací při vysoké teplotě, očkování mléka vysokou dávkou kultury a dlouhotrvajícím zráním jogurtu. Na této vadě se mohou podílet i méně vhodné kmeny jogurtové kultury, ale i nižší počet laktokoků. Organoleptické změny i technologické těžkosti může zapříčinit napadení jogurtové kultur bakteriofágem. (Cempírková a kol., 1997) 11

12 3.2.3 Kažení a vady sýru Rozdělení vad sýrů: 1. Vady vnějšího vzhledu - mechanické poškození sýra, nežádoucí povrchová mikrobiální kontaminace, nesprávný tvar a forma, poškozen obalu. 2. Vady vnitřního vzhledu - např. nepravidelné otevření těsta u sýrů s tvorbou ok, praskliny a trhliny v těstě sýra, časné a pozdní duření, ořechovitá oka, vady v konzistenci, vady v barvě těsta aj. 3. Vady chuti a vůně - ty jsou vždy nejvýznamnější, protože spotřebitel si kupuje sýr především podle chuti. Vadou může být již např. méně výrazná, fádní či necharakteristická chuť, cizí příchuť (např. po sanitačních prostředcích) či skutečná vada chutě, jako je štiplavost, hořkost, pálivost, zatuchlost aj. 4. Vady ve složení - když není např. dodržena garantovaná sušina, tuk, obsah soli atd. 5. Za chybu je ale možné považovat i závady v označování produktů (nesprávné deklarace na obalech), i když tato "závada" již nesouvisí s produktem jako takovým, ale pouze s administrativou při uvádění produktu na trh. Jednotlivé vady se mnohdy kombinují a vzájemně spolu souvisejí. Jedná-li se např. o zduřený sýr, což je zřejmá vada vnějšího vzhledu, není možné samozřejmě očekávat ani jeho odpovídající chutnost. Naopak zduřelé sýry vykazují vážné chyby v chuti a vůni, ale rovněž i v konzistenci (Kopáček, 2013) Možné příčiny vad a kažení sýrů: - nevhodná nebo i méně vhodná jakost mléka určeného k sýření (k výrobě sýrů je zapotřebí vždy mléko nejvyšší jakosti) - nedodržování nebo používání nesprávného technologického procesu - nevhodné teplotní a vlhkostní poměry ve zracím sklepě, nedostatečné ošetřování sýrů v průběhu zrání - mikrobiální a jiná kontaminace - a jiné příčiny - zde je možné uvést např. nedostatečné ostré nože sýrařských harf, které mohou zapříčinit nesprávné krájení sýřeniny na kotli, popř. i větší únik sýrového prachu do syrovátky, a řadu dalších (Kopáček, 2013) 12

13 4 BAKTERIE MLÉČNÉHO KVAŠENÍ Bakterie mléčného kvašení, je skupina bakterií tvaru kokovitého nebo paličkovitých zahrnující některé druhy rodů: Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, a Bifidobacterium. Z potravinářsko - mikrobiologického hlediska má tato skupina bakterií nezanedbatelný potravinářko technologický funkční význam (Görner, Valík, 2004). Do této skupiny patří velký počet MO, které jsou charakteristické tím, že z glycidů tvoří menší nebo větší množství kyseliny mléčné. Část z nich tvoří skupinu kulturních mikroorganismů, která tvoří základ tzv. čistých mlékařských kultur. Další dělení bakterií mléčné fermentace závisí na tom, jaký druh kyseliny mléčné (pravotočivou, levotočivou inaktivní) bakterie vyprodukují a dále na tom, jaké množství jiných kyselin a aromatických látek vytvořily. Hovoříme o homofermentativních bakteriích, které produkují jen pravotočivou kyselinu mléčnou, zatímco heterofermentativní bakterie produkují levotočivou nebo opticky inaktivní kyselinu mléčnou a značné množství jiných kyselin a látek (kyselina octová CO 2 a ethanol vedle nejméně 50 % kyseliny mléčné) (Cempírková a kol., 1997). Bakterie mléčného kvašení tolerují kyselost mléka kolem ph 4 po několik týdnů, jsou grampozitivní, a anaeobní, mikroaerobní, resp. fakultativně anaerobní. Jejich tvary jsou především koky (sférické), ovoid nebo tyčinky. Mohou mít také tvar Y (bifid) jako v případě bifidobakterií. Bifidobakteria nejsou jednoznačně klasifikována jako bakterie mléčného kvašení (Gajdůšek, 1998). 4.1 Obecná charakteristika bakterií mléčného kvašení Rod Streptococcus Rod Streptococcus zahrnuje grampozitivní mikroaerofilní koky (kolo), které jsou nepohyblivé. Rod je definován jako kombinace antigenních, hemolytických a fyziologických vlastností do skupin A, B, C, D, F a G. Skupina A obsahuje jeden druh (streptococcus pyogenes) s 40 antigenní typy. Skupina D obsahuje pět druhů: Enterococcus (Streptococcus) feacalis, Enterococcus faecium, Streptococcus. durans, Streptococcu. avium, a Streptococcus bovis (Forsythe, 2000) V tomto rodě jsou zahrnuty zvířecí a lidské patogeny, ústní symbiotické, střevní symbiotické a pouze jeden druh Streptococcus thermophilus, který se používá při výro- 13

14 bě fermentovaných potravin. Obecně platí, že streptokoky jsou fakultativně anaerobní, s obligátním homofermentativním metabolismem. (Hutkins, 2006) Buňky jsou okrouhlé nebo vejcovité s průměrem < 2µm, když rostou v tekutém médiu jsou uspořádané v párech, krátkých nebo delších řetízcích. Netvoří spory, jsou grampozitivní a katalázo negativní. (Görner, Valík, 2004) Podle homolytických vlastností se streptokoky rozdělují na alfa-hemolytické, beta hemolytické a případně gama-hemolytické neboli anhemolytické (Klaban, 2001). Obrázek 1: Streptococcus termophilus ( Rod Lactobacilus Laktobacily rostou ve tvaru tyčinek, jsou to gram - pozitivní buňky, o velikosti 0,5-1,2 x 1,0-10 µm. Tyčinky jsou typicky dlouhé v krátkých řetízcích ale vyskytují se i velmi krátké tyčinky osamocené nebo v dlouhých řetízcích. Lactobacillus je největší rod BMK. Více než 80 druhů a poddruhů je známých a seznam se neustále rozrůstá. Rod lactobacillus je nevýznamnější rod mléčného kvašení. Patří sem: Lactobacilus acidophilus, skupina lactobacillus. casei, skupina lactobacillus delbrueckii, lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, jiné druhy (Roginski a kol., 2003). Rod Lactobacillus zahrňuje fakultativně anaerobní nebo mikroaerofilní nepohyblivé bakterie mléčného kvašení. Jejich hlavním metabolitem fermentace sacharidu je kyselina mléčná, ale i octová, ethanol a CO 2. Jdou saprofytické a velmi zřídka patogenní (Görner, Valík, 2004). Laktobacily lze nalézt v přírodních stanovištích, které obsahují zkvasitelné cukry, vitamíny, kofaktory, hydrolyzované bílkovinné výrobky a nízkou koncentraci kyslíku. Nacházejí se například v lidském organismu a zvířatech (dutina ústní, trávicí trakt, vagina) v hnoji a půdě, spojené s rostlinami, jako žádoucího organismus v potravinářských fermentacích (siláže, mléka, masa, zeleniny a obilovin). V mlékárenském průmyslu, se 14

15 pouze několik druhů Lactobacillus používají jako startovací kultura a větší množství se nacházejí ve vedlejší mikroflóře sýrů (Roginski a kol., 2003). Obrázek 2: Lactobacillus ( Rod Lactococcus V současné době je známo 5 druhů Lactococcu (Lactococcus lactis, Lactococcus Garvieae, Lactococcus Plantarum, Lactococcus piscium a Lactococcus Raffino-lactis). Lactococci rostou do kulového nebo vejčitého tvaru o velikosti (0,5-1,2 x0,5-1, 5 mm), zpravidla ve dvojicích a řetízcích. Pouze Lactococcus lactic subsp. lactis a Lactococcus lactis subsp. cremoris se používají jako startovací kultury pro potravinářské fermentace. Tyto lactococci jsou nejběžnější mezofilní kultury používané při výrobě široké škály druhů sýrů (Roginski a kol., 2003). Lactococcus lactis byl izolován z živočišných zdrojů a z prostředí mléčné farmy. Je pravděpodobné, že bakterie se spojily s mléčnou fermentací, když kontaminovali mléko v průběhu dojení a krmení. Mléko a prostředí zpracování mléka jsou nyní jejich nejčastější stanoviště (Roginski a kol., 2003). Lactococcus lactis ssp. lactis tvoří grampozitivní, ovoidní buňky, většinou v párech a kratších nebo delších řetízcích. Roste při 10 C ale neroste při 45 C, jeho optimální teplota je asi 30 C. Fermentuje glukózu, laktózu a maltózu homofermentativně na kyselinu mléčnou. Některé kmeny Lactococcus lactis ssp. lactis syntetizují polypeptidové antibiotikum, v současnosti označované jako jeho bakteriocin, zvané nisin (Görner, Valík, 2004). Lactococcus lactis ssp. cremoris obvykle doprovází L. lactis ssp. lactis. Má také podobné vlastnosti. Liší se od něho tvorbou větších buněk a tvorbou delších řetízek v mléce (Görner, Valík, 2004). 15

16 Obrázek 3: Lactococcus lactis Rod Enterococcus Buňky Enterokoků jsou zpravidla kulovité nebo vejčité (0,6-2,0 x 0,6-2,5), vyskytující se v párech a krátkých řetízcích. Rod Enterococcus byl definován, když vyšlo najevo, že "ústní" a "fekální" streptokokové jsou fylogeneticky vzdálenější, než se dříve myslelo. Několik fekálních streptokokových druhů bylo převedeno do rodu Enterococcus. V současné době je uznáno nejméně 19 druhů Enterococcus, které se nacházejí na různých stanovištích, včetně člověka a zvířat s jedním žaludkem, střev, zelených rostlin, silážích, mléce, půdě, i v souvislosti s hmyzem, ptáky a dalšími volně žijícími živočichy (Görner, Valík, 2004). Enterococcus faecium a Ec. faecalis se nacházejí v mnoha sýrech vyrobených ze syrového mléka, v sýru Fontina lze ovlivnit mikroflóru enterokoků. Streptococcus durans byl použit jako startér, v krátkém čase a při vysokých teplotách, u výroby sýru Chedar, ale kvalita sýru byla obecně špatná. Některé enterokoky jsou nyní navrhovány jako probiotické kmeny, většinou jako veterinární pomůcky. V siláži jsou enterokoky známé tím, že působí na začátku fermentačního procesu účinně v boji proti Gramnegativním bakteriím, a tím vytváří dobré prostředí pro laktobacily, které pokračují ve fermentaci (Roginski a kol., 2003). 16

17 Obrázek 4: Enterococcus faecium ( Rod Pediococcus Bakterie z rodu Pediococcus patří mezi homofermentativní bakterie mléčného kvašení. Jejich hlavním metabolitem při fermentaci sacharidů je racemická (DL) a pravotočivá forma kyseliny mléčné. Jsou gram-pozitivní, nepohyblivé, netvoří spóry, neredukují dusitan na dusičnan, jsou fakultativně anaerobní. katalázově negativní. Jejich tolerance vůči kyslíku je variabilní (Görner, Valík, 2004). Pediococcus tvoří tetrad sférických buněk (1-2 µm v průměru), které je odlišuje od koků, tvořící řetízky. V současné době je uznáno sedm druhů Pediococcus. Fylogeneticky, jsou seskupeny s laktobacily. Jejich hlavním stanovištěm jsou rostliny, méně zvířata. Jsou snadno k dispozici na velkém množství rostlin, jako jsou listy révy vinné, v silážních, kysaném zelí, olivách a fermentaci piva. Tyto různé lokality ukazují univerzálnost tohoto rodu, aby se přizpůsobily různým a někdy extrémních podmínkám. Antimikrobiální vlastnosti některých kmenů Pediococcus byly v nedávné době využívány k jejich začlenění do mnoha fermentovaných potravin, a pediocin (bakteriocin produkovaný Pediococcem) je nyní komerčně dostupný jako aditivum pro lepší bezpečnosti potravin, a to zejména díky potlačení listerií (Roginski a kol., 2003). Obrázek 5: Pediococcus acidilactici (bionews-tx.com) 17

18 4.1.6 Další druhy bakterií mléčného kvašení Bifidobacterium, Brevibacterium, Micrococcus a Propionibacterium jsou Gram - pozitivní bakterie. Bifidobakterie jsou anaerobní bakterie, produkující kyselinu mléčnou a kyselinu octovou z fermentace cukru. Jejich hlavním stanovištěm jsou lidská a zvířecí střeva a mnohé kmeny se komerčně produkují jako probiotické kultury. Nejméně 31 druhů a poddruhů je v dnešní době uznáno (Roginski a kol., 2003). Obrázek 6: Bifidobacterium breve ( Brevibacterium je aerobní rod, a produkuje málo nebo žádnou kyselinu z metabolismu cukrů. Byly izolovány hlavně z kůže, uší a mléčných výrobků. Brevibacterium se široce používá jako nátěr při zrání sýrů. Taxonomie Brevibacterium si v posledních letech prošla mnoha změnami. V současné době je přijímáno 11 druhů (Roginski a kol., 2003). Propionibacteria je v současné době uznáno 11 druhů a poddruhů. Některé druhy (např. Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii, Propionibacterium jensenii) jsou tradiční přídavné komponenty startérů pro švýcarské sýry. Jejich metabolická přeměna kyseliny mléčné na propionovou a octovou kyselinu (s produkcí CO 2 ) dává těmto sýrům svou charakteristickou vůni a tvorbu ok. Propionibacteria se běžně vyskytují na kůži a v mléčných výrobcích (Roginski a kol., 2003). Mikrokoky jsou přísně aerobní, ale nachází se v různém prostředí včetně lidské kůže, říčních sedimentů, tropických řek a antarktických pláních, stejně jako v mléce, sýrech, zmrzlině a ve vakuově baleném masu. Po dlouhém taxonomické revizi, jsou jen tři druhy uznávány. Mikrokoky jsou obvykle v malém množství zastoupeny v mikroflóře zralých sýrů (Roginski a kol., 2003). 18

19 4.2 Ochranná funkce bakterií mléčného kvašení Ochranná funkce se uplatňuje především inhibicí růstu nežádoucích mikrobiálních druhů, produkcí řady antimikrobiálně aktivních metabolitů. Ochranná funkce byla zjištěna u: - organických kyselin, které působí jednak obecně snížením ph, a jednak přímým působením nedisociovaných molekul organických kyselin, degradačních produktů tuků, zejména volných mastných kyselin s počtem uhlíků a od nich odvozených, monoacylglycerolů, - peroxidu vodíku, který je produkován řadou bakterií mléčného kvašení, - diacetylu, který vzniká degradací citrátu (jeho inhibiční účinek je významný až při vysoké koncentraci, ale předpokládá se, že i v nízké koncentraci přispívá k inhibičnímu účinku dalších metabolitů synergickým efektem), - oxidu uhličitého, který přispívá ke snížení redoxního potenciálu a ovlivňuje membránové funkce, - reuterinu (3 hydroxypropionaldehyd), produkovaného Lactobacillus reuteri a bakteriocinů (Gajdůšek, 1998) Organické kyseliny Organické kyseliny, konzervující potraviny vznikají během výroby potravin, činností bakterií mléčného kvašení. Jedná se zejména o kyselinu mléčnou, octovou a propionovou. Tyto kyseliny omezují rozvoj MO jak snížením hodnoty ph, tak pozastavením metabolismu nežádoucích MO působením svých, v kyselém prostředí nedicosiovaných molekul. Nedisociované molekuly pronikají do buněk a porušují jejich normální metabolizmus inhibicí enzymů nebo porušením buněčných membrán (Vlková a kol., 2009). Potravinářství se nejčastěji uplatňuje biokonzervace pomocí mléčného kvašení, při kterém vzniká kyselina mléčná a často další organické kyseliny jako je kyselina octová atd. Mléčné kvašení se široce využívá při výrobě mléčných produktů (streptococcus sp., Lactobacillus sp., Lactococcus sp, Leuconostoc sp.) a kysaných zelenin jako je zelí a okurky (Lactobacillus sp., leuconostoc sp., pediococcus sp.) Kyselina propionová vznikající během propionového kvašení (propionobacterium sp.) při zrání sýrů s tvorbou ok dodává těmto sýrům nejen typické aroma, ale také napomáhá při jejich konzervaci (Vlková a kol., 2009). 19

20 Kyselina mléčná Kyselina mléčná (pk = 3,83 při 25 C) se jako přirozený konzervační prostředek, vyskytuje v řadě fermentovaných výrobků (např. v jogurtech, kysaném zelí, olivách). V nedisociované formě difunduje buněčnou membránou bakterií a snižuje ph uvnitř buňky. Bakteriostaticky působí na bakterie Mycobacterium tuberculosis. Jako aditiví látka se používá především jako acidulant. Je účinná i proti jiným bakteriím, proto se používá např. k dekontaminaci povrchu masa a při výrobě lahůdek. Obvykle se aplikuje v kombinaci s mléčnanem sodným. (Velíšek, 1999) Nejdůležitější producenti kyseliny mléčné jsou rody bakterií např. Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Pediococcus a Leuconostoc. ( Bezbarvá tekutina bez zápachu a s nakyslou chutí, často sirupovité konzistence, snadno rozpustná. Vytváří bezbarvé krystaly. Je přirozeným meziproduktem metabolismu savců. Zvýrazňuje a zlepšuje chuť, zesiluje účinnost antioxidantů, ovlivňuje hodnotu ph a může být využita jako rozpouštědlo. Kyselina mléčná se vyskytuje ve dvou formách: D (negativní) a L (pozitivní), které se obě přirozeně vyskytují v kvašených potravinách. Slouží rovněž jako antimikrobiální látka a její L(+) forma nachází uplatnění v kojenecké výživě ( Kyselina propionová Propionová kyselina vzniká v některých mléčných výrobcích (sýrech typu Emmental) propionovým kvašením. Antimikrobiální účinky vykazuje v slabě kyselém prostředí (do ph 5, pk = 4,87 při 25 C) zejména vůči plísním a méně vůči bakteriím (gramnegativním), zatímco na kvasinky prakticky nepůsobí. Mechanismus účinku spočívá hlavně v akumulaci propionové kyseliny v buňkách mikroorganismů a inhibici pro metabolismus významných enzymů (Velíšek, 1999). Je to bezbarvá nebo lehce nažloutlá olejovitá tekutina s charakteristickým zápachem. Používá se jako potravinářské aditivum (spolu s jejími vápenatými, draselnatými nebo sodnými solemi) chránící potraviny před působením plísní (hnilobou). Nejčastěji se používá v mlékárenství, pekařství a cukrářství. Používá se však i při výrobě ovocných chutí a vůní a v kosmetice při výrobě parfémů. Působí efektivně proti Epidermophyton, Microsporum a Trichophyton spp. ( 20

21 Kyselina octová Kyselina octová (pk = 4,53 při 25 C) se používá jako konzervační prostředek a současně jako okyselující látka (acidulant). Je účinná proti kvasinkám a bakteriím, méně proti plísním. Tolerantní jsou bakterie octového, mléčného a máselného kvašení. Mechanismus účinku spočívá v působení na cytoplazmatické membrány (inhibice transportu látek membránami, inhibice elektronového transportu) Účinný konzervantem proti bakteriím a plísním je hydrogenoctan sodný (Velíšek, 1999). Je nejběžnější monokarboxylovou kyselinou vyskytující se v potravinách. Je pravidelnou složkou v ovoci (volná kyselina a její estry) a potravinách, při jejichž výrobě se uplatňují kvasné procesy. Vzniká také jako produkt degradace cukrů a jiných složek potravin při termických procesech. Pro potravinářské účely se vyrábí z ethanolu nebo ovocných vín nebo moštů jako kvasný lihový nebo ovocný ocet mikrobiální oxidací aerobními bakteriemi rodu Acetobacter (Velíšek, 1999) Peroxid vodíku Peroxid vodíku vyrábí velké množství bakterií mléčného kvašení. Inhibuje mikroorganismy jako jsou Staphylococcus aureus a Pseudomonas spp. je také vyrábí velké množství bakterií mléčného kvašení chybí enzymu katalázy, ale zejména tím, že Lactobacillus spp. Peroxid vodíku také inhibuje další mikroorganismy, jako jsou Staphylococcus aureus a Pseudomonas spp. Laktoperoxidázový systém v mléce je současně antimikrobiální systém, ve kterém je antagonistou hypothiokyanátový zbytek ([OSCN] - ) generovaný působením laktoperoxidázy na peroxid. H 2 O 2 + SCN - OSCN - + H 2 O Tento systém byl úspěšně použit k prodloužení trvanlivosti syrového mléka a sýra, k potlačení patogenů v mléčných výrobcích. Potenciál peroxidu vodíku produkovaného bakteriemi mléčného kvašení pro konzervování potravin může být omezen oxidačním charakterem molekuly a volného radikálu, může mít výrazné účinky na senzorickou kvalitu (žluknutí tuků a olejů) (Roginski a kol., 2003) Diacetyl a acetaldehyd Diacetyl a acetaldedyd, jakožto tvůrce aroma a chuti fermentovaných mléčných výrobků, má i antimikrobiální účinek. Acetaldehyd může inhibovat buněčné dělení Escherichia coli, a diacetyl inhibuje růst kvasinek, Gram-negativních a gram-pozitivní bakterií. Nicméně použití diacetylu, jako konzervačního prostředku, je vzhledem k jeho 21

22 intenzivnímu aroma a relativně velkému množství potřebného pro konzervaci vyloučeno (Roginski a kol., 2003) Reuterin Reuterin (β-hydroxypropanaldehyd) je inhibiční sloučenina, kterou produkuje Lactobacillus reuterii za anaerobních podmínek v přítomnosti glycerolu. Reuterin má velmi široké spektrum působení, včetně gram-pozitivních a gram-negativních bakterií, kvasinek, plísní a prvoků. Mezi organismy významné pro veřejné zdraví, které jsou inhibovány reuterinem patří druhy Salmonella, Shigella, Clostridium, Staphylococcus, Listeria, Candida, a Trypanosoma (Roginski a kol., 2003). 5 BAKTERIOCINY Bakteriociny produkované mléčnými bakteriemi jsou bílkovinné látky vykazující antimikrobiální aktivitu vůči významným potravním patogenům a mikroflóře způsobující kažení. Proto mohou kmeny bakterií, které je produkují, nebo přímo purifikované bakteriociny, nacházet uplatnění v systému konzervace potravin. V poslední době dochází u potravin ke změně převažující škodlivé mikroflóry vzhledem k tomu, že se k prodlužování údržnosti používají ve značné míře postupy, jako je vakuové balení, balení v modifikované atmosféře a chlazení, při nichž se negativně projevují hlavně psychrotrofní bakterie jako C. botulinum typ E, Aeromonas Hydrophila, Listeria monocytogenes a Yersinia enterocolitica. Proto se pro minimálně opracované potraviny zdá být vhodnou alternativou biologický proces využití konkurujících bakterií, které navíc produkují antimikrobiální látky. Tyto bakteriociny jsou produkovány řadou grampozitivních i gramnegativních bakterií, ale bakterie mléčného kvašení se zdají být obzvlášť vhodné vzhledem ke své nezávadnosti prověřené historicky dlouhodobým používáním při výrobě fermentovaných potravin ( Bakteriociny jsou antimikrobiální proteiny nebo peptidy, které jsou produkovány pouze bakteriemi a které zabíjejí nebo inhibují růst blízce příbuzných druhů a některých patogenů. Ty to sloučeniny jsou výrazně odlišné od antibiotik. Jsou to látky, které se vyrábějí jak z prokaryotických a eukaryotických mikroorganismů, a jsou inhibiční při nízkých koncentracích do jiných organismů (tj. jak prokaryot a eukaryot). Bakteriociny z bakterií mléčného kvašení byly studovány v průběhu posledních 10 let a nyní jsou 22

23 obecně považovány za důležitý nástroj pro konzervaci potravin a pro kontrolu bakteriálních infekcí u lidí a zvířat (Tamime, 2006). Byl objeven velký počet bakteriocinů různé rozmanitosti ale díky některým společným rysům, je šlo zařadit do několika tříd a podskupin. Zejména pánové Klaenhammer (1993), Nettle a Barefoot (1993) Nes a kol. (1996), Nes a Holo (2000) Sablon a kol. (2000) a Mc Auliffe a kol. (2001) navrhli následující kategorie: Třída I (< 5 kda) - lantibiotika, třída II (< 10 - > 5 kda) - malé tepelně stabilní peptidické bakteriociny, třída III (> 30 kda), velké a termolabilní bakteriociny (tabulka 1) (Tamime, 2006). 5.1 Rozdělení bakteriocinů Tabulka 1: Produkce bakteriocinů bakteriemi mléčného kvašení (Tamime, 2006) Kategorie Podskupina Příklady Třída I (termostabilní lantibiotika) Typ A Typ B Nisin, lacticin 481 a 3147, cytolysin, lactocin S Mersacidin, actagardine, cinnamycin, ancovenin, duramycin B a C Třída II (termostabilní peptidické bakteriociny Třída III (velké, termolabilní proteiny Podskupina (a) (Bacteriociny s dvěma peptidy) Podskupina (b) (silná antilisteriální aktivita) Podskupina (c ) (závislé na hlavním peptidu) Podskupina (d) (bez hlavního peptidu) Podskupina (e ) smíšené bakteriociny Lactococcin G, plantaricin S, lactacin F, plantaricin EF, plantaricin JK Pediocin PA-1, sakacin A a P, enterocin A, leucocin A-UAL 187 Divergicin A, acidicin B, enterocin P, Enterocin L50 Lactococcin A, lactococcin B, enterocin B Helveticin J, acidophilucin A, caseicin 80, lacticin A Třída I. Charakteristika, strukturální vlastnosti a způsob účinku Lantibiotika jsou skupinou peptidických antibiotik, která obsahují neobvyklou polycyklickou thioetherovou (C-S-C) aminokyselinu lanthionin nebo metyllanthionin a také nenasycené aminokyseliny dehydroalanin a kyselinu 2-aminoisomáselnou. Lantibiotika jsou produkována velkou skupinou Gram-pozitivních bakterií, jako jsou Streptococcus a Streptomyces, přičemž působí proti ostatním Gram-pozitivním bakteriím (poškozují 23

24 fyziologické funkce např.u klostridií), takže jsou považována za bakteriociny. ( Lantibiotika můžou zabít gram-pozitivní bakterie. V kombinaci s látkami kovově chelatačními, mohou lantibiotika inhibovat růst nebo dokonce zabíjet i gramnegativní bakterie. (Abbe, 1995) Tabulka 2: Příklady bakteriocinů třídy Ia a jejich producentů (Luquet, Corrieu, 2008) Bakteriocin Producent Nisin A Lactococcus lactis NIZO5 Nisin Z Lactococcus lactis NIZO22186 Subtilin Bacillus subtilis ATCC6633 Pep5 Staphylococcus epidermidis 5 Epidermin Staphylococcus epidermidis Tu3298 Gallidermin Staphylococcus epidermidis Tu3298 Mutacin III Streptococcus mutans JH100 Lactocin S Lactobacillus sakei L45 Lacticin 481 Lactococcus lactis ADRIA85LO30 Bacteriocin J46 Lactococcus lactis ssp. Cremoris J46 Streptococcin A-FF22 Streptococcus pyogenes FF22 Salivaricin A Streptococcus salivarius 20P3 Streptin Streptococcus pyogenes BL Plantaricin Lactobacillus plantarum C Lantibiotika se obvykle dělí na dva typy - A a B. Typ A lantibiotik jsou protáhlé a šroubovité peptidy, které působí především na membrány citlivých bakterií. Lantibiotika typu A (tabulka 2), produkují gram-pozitivní bakterií mléčného kvašení jsou všechny typy (tabulka 1), a " stupně non -food " Gram - pozitivní bakterie také produkují tento typ bakteriocinu. Lantibiotika typu B (tabulka 3), u kterých nebylo zjištěno, že by je produkovali bakterie mléčného kvašení, jsou menší a mají více globulární strukturu. Častěji působí jako inhibitory enzymů (Tamime, 2006). Citlivost bakterií na lantibiotika se značně liší. Některá lantibiotika, jako je nisin a lakticin 3174 (tabulka), jsou účinné proti širokému spektru gram-pozitivních bakterií, včetně několika kažení potravin a patogenních mikroorganismů. Nicméně, lakticin S má úzké spektrum aktivity, je hlavně účinný proti jiným bakterií mléčného kvašení, přičemž nisin je aktivní jak proti bakteriím tak i vegetativním sporám (Tamime, 2006). Teprve nedávno byl zjištěn mechanismus, kterým lantibiotika typu A na sebe vzájemně působí a zabíjí citlivé buňky. Řadu otázek nad tímto mechanismem působení ale stále 24

25 zůstává nezodpovězena. Je zdokumentováno, že hlavním cílem pro lantibiotika typu A, je poškodit cytoplazmatickou membránu, v rozporu s energetickou transdukcí a způsobit aby se membrána stala propustná pro ionty, aminokyseliny a ATP. Studie prokázaly, že lantibiotikem ošetřené buňky a uměle vytvořené póry rozptýlí membránový potenciál, což naznačuje, že tvorba pórů umožňuje příliv protonů a dalších iontů normálně umístěných vně membrány. Předpokládá se, že žádné specifické receptory v buněčné membráně nejsou nutné pro působení lantibiotik (Tamime, 2006). Tabulka 3: Příklady bakteriocinů třídy Ib a jejich producentů (Luquet, Corrieu, 2008) Bakteriocin Mersacidin Actagardin Ancovenin Duramycin C Mutacin II Producent Bacillus subtilishil Y85 Actinoplanes Streptomyces ssp. Streptomyces griseoluteus Streptococcus mutans V současné době, se používají v potravinářství dvě lantibiotika v potravinářství. Nisin byl schválen v rámci EU a v USA pro použití v některých potravinářských výrobcích. Kromě toho, je nisin také používán ve veterinářství, zejména pro prevenci bakteriálních infekcí, které způsobují krávám mastitidy. Také lakticin 3147 byl licencován pro použití proti bakteriálním infekcím u kravského vemene. Počet nových žádostí u různých potravinářských výrobků stále roste (Tamime, 2006) Lacticin 481 Lacticin 481, je bakteriocin vznikající při růstu Lactococcus lactis subsp. lactis, postupně se čistí srážením síranem amonným, gelovou filtrací, a preparativní a analytickou reverzně fázovou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (Piard, Muriana, 1992). Jeho cílová skupina působení jsou gram - pozitivní bakterie, široké spektrum bakterií mléčného kvašení a Clostridium tyrobutyricum ( Lactocin S Lactocin S je bakteriocin produkovaný Lactobacillus sake L45. Je čištěn do homogenity iontovou výměnou, hydrofobními interakcemi, chromatografií s reverzní fází a gelovou filtrací. Lactocin S obsahuje přibližně 33 aminokyselinových zbytků, z nichž asi 50 % jsou nepolární aminokyseliny alanin, valin a leucin (Mørtvedt, Nissen-meyer, a kol., 25

26 1991). Působí proti Leuconostoc, Carnobacteria, Lactobacilli, Pediococci, Lactococci, Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Staphylococcus, Bacillus cereus, Clostridium spp. ( Nisin Nisin je skupina velmi podobných polypeptidů tvořených 34 aminokyselinami. Je produkován některými kmeny bakterií Lactococcus (Streptococcus) lactis, ssp. lactis. Má široké spektrum aktivit ovlivňujících primárně vegetativní buňky a spóry grampozitivních bakterií. K bakteriím citlivým na nisin patří: ostatní mléčné bakterie, Bacillus, Clostridium, Listeria a Streptococcus. Pokud není použita další konzervační metoda, nisin neinhibuje gramnegativní bakterie, kvasinky a plísně. Proto je nisin často používán ve spojení s jinými synergicky působícími konzervačními metodami (jde o tzv. technologii překážek), např. vysokou koncentrací soli a nízkým ph (Kvasničková, 2006). U nisinu existují dva způsoby antimikrobiálního působení: váže se k lipidu II a následně dochází k inhibici syntézy buněčné stěny a také vytváří póry v cytoplazmatické membráně. Nisin je používán pouze jako konzervační prostředek pro potraviny a v současné době nemá žádné terapeutické využití. Sporadické mutanty rezistentní k nisinu nevykazují zkříženou rezistenci k terapeutickým antibiotikům. Panel odborníků EFSA došel k závěru, že k tomuto dochází pravděpodobně z důvodu rozdílného antimikrobiálního působení mezi terapeutickými antibiotiky a nisinem. Pokud jde o použití nisinu v potravinách, není vytvoření antibiotické rezistence předmětem obav (Kvasničková, 2006). Existuje 5 kompozičních variant nisinu, které jsou označeny písmeny A E. Komerčně dostupný je přípravek Nisaplin, což je sůl zředěného nisinu A, který je nejvíce biologicky aktivní (Lederberg, 2000). Nisin je používán u paterizovaných mléčných výrobků a tavených sýrů aby se zabránilo klíčení spór např. Clostridium tyrobutyricum, které mohou přežít i tepelné ošetření při tepelných až C. Nisin umožňuje použití u výrobků s vysokou vlhkostí a s nízkým obsahem solí a u výrobků uložených mimo chladící zařízení bez rizika znehodnocení. Množství nisnu záleží na složení potraviny, požadované doby trvanlivosti a předpokládané teplotě skladování. Nisin se používá k prodloužení trvanlivosti mléka a mléčných výrobků, který nemůže být plně sterilizován, aniž by došlo k poškození vzhledu, chuti a textury (Roginski a kol., 2003). 26

27 Nisin se přidává hlavně do mléka na Blízkém východě, kde může nastat problém s trvanlivostí kvůli tepelnému klimatu, velkým vzdálenostem přepravy mléka a špatných chladících zařízení. Nisin tak zdvojnásobí délku trvanlivosti a zabrání tak klíčení termofilních spór, které přežívají vysoké pasterační teploty a tak může být použit u konzerv s kondenzovaným mlékem (Roginski, Fuquay, Fox, 2003). Obrázek 7: Nisin (Fukase, Kitazawa, Sano, Shimbo, a kol, 1988) Třída II - Charakteristika, strukturální vlastnosti a způsob účinku V posledních letech bylo do třidy II zařazeno více jak 50 bakteriocinů produkovaných mléčnými bakteriemi. Tyto bakteriociny se obvykle skládají z 30 až 60 aminokyselinových zbytků a jsou větší jak bakteriociny ze třídy I typu A. Jsou kationtové a buď amfifilní nebo hydrofobní. Většina z těchto bakteriocinů je vyráběna bakteriemi mléčného kvašení, které byly izolovány z fermentovaných potravin (Tamime, 2006). Jelikož se třída II zabývá tak velkým počtem bakteriocinů, bylo nutné ji rozdělit do několika podskupin (tabulka 1). Je třeba zdůraznit, že mnoho bakteriocinů se zahrnují do podskupiny (d), protože obsahují pouze jeden peptid, bez zvláštních vlastností, které jsou tříděny do dalších podskupin (Tamime, 2006). Tabulka 4: Příklady bakteriocinů třídy IIa jejich producenti (Luquet, Corrieu, Bakteriocin Producent Lactococcin G Lactococcus lactis LMG2081 Lactococcin MN Lactococcus lactis 9B4 Lactacin F Lactococcus johnsonii VP Thermophilin 13 Streptococcus thermophilus Sfi13 Plantaricin EF Lactobacillus plantarum LCP010 Plantaricin JK Lactobacillus plantarum C11 Leucocin H Leuconostoc ssp. MF215B Carnocin H Carnobacterium ssp. Lactocin 705 Lactobacillus casei CRL 705 Acidocin J1132 Lactobacillus acidophilus JCM 1132 ABP Lactobacillus salivarius ssp. salivarius Enterocin 1071 Enterococcus faecalis BFE 1071 Mutacin IV Streptococcus mutans UA 140 Enterocin L50 Streptococcus faecium L50 27

28 Nějakou dobu se věřilo, že bakteriociny s jedním peptidem jsou pravidlem, až na nějaké výjimky. Nyní však je již známo, že nejčastěji se vyskytují bakteriociny o dvou peptidech (tabulka 4). V některých případech, oba peptidy produkují více synergický antimikrobiální účinek proti patogenním mikroorganismům. Podle definice, dvoupeptidové bakteriociny mají dva peptidové geny umístěny vedle sebe, a pouze jeden imunitní gen se nachází vedle dvou pre-peptidu genů (Tamime, 2006). Zajímavou vlastností třídy II (b), je jejich silný protilisteriální účinek, který se vyskytuje v široké škále bakterií mléčného kvašení (Pediaococcus spp., Leuconostoc spp., Lactobacillus spp. a E. feacium). Všechny tyto peptidy sdílejí 35-70% sekvenční identity, která je nejvýraznější v části N-terminální části bakteriocinu (Tamime, 2006) Pediocin PA 1 Pediocin PA-1 je širokospektrální bakteriocin produkovaný bakteriemi mléčného kvašení, který prokazuje obzvlášť silný účinek proti Listeria monocytogenes a alimentárním patogenům, které znepokojují potravinářský průmysl. Tento antimikrobiální peptid je studován ve třídě IIa (Rodríguez a kol., 2002) Enterocin A a B Enterocin je produkován Enterococcus faecium a ukázalo se jeho široké inhibiční spektrum proti gram - pozitivním a gram - negativním bakteriím, jako je Lactobacillus plantarum, Enterococcus facealis, Listeria monocytogens a Salmonella paratyphii. Optimální produkce bakteriocin (2400 AU / ml) z E. faceium bylo dosaženo, když byly udržovány kultivační podmínky, to je ph 6,0 a teplota 35 C. Maximální výnos byl 40% při ionexové chromatografii (Annamalai a kol.,2009) Třída III Bakteriociny třídy III jsou velké a termolabilní. Zatím nejsou více prozkoumány Helveticin J Lactobacillus helveticus 481 produkuje antimikrobiální činidlo aktivní proti pěti blízce příbuzným druhům. Citlivé jsou zejména Lactobacillus helveticus 1846 a 1244, Lactobacillus bulgaricus 1373 a 1489, a Lactobacillus lactis 970. Antimikrobiální látka je aktivní při neutrálním ph za aerobních i anaerobních podmínek a je citlivá na proteoly- 28

29 tické enzymy a teplotu (30 min při 100 C). Výroba helveticinu J byla maximalizován v anaerobním fermentoru při konstantní hodnotě ph 5,5 (Joerger, Klaenhammer, 1986) Třída IV V některých zdrojích (např. Gajdůšek) se uvádí i čtvrtá třída. Jde o tzv. komplexní bakteriociny, které jsou složené části proteinové a jedné nebo více dalších částí (sacharydické, lipidické). 5.2 Aplikace bakteriocinů ve fermentovaném mléce V uplynulých letech, byl rostoucí zájem o uchování potravin pomocí bakterií mléčného kvašení. Tlak spotřebitelů na potravinářský průmyslu ke snížení používání chemických konzervačních prostředků byl jeden z hlavních důvodů pro biologickou ochranu. Konzument chce přírodní potraviny vysoké kvality, které jsou bezpečné a minimálně opracovány. Kultury bakterií produkující bakteriociny jsou možnou odpovědí spotřebitele na tuto žádost (Tamine, 2006). Úmyslné užití mléčných bakterií, které produkují bakteriociny, není v potravinářském průmyslu běžné. Nicméně, několik kultur je již na trhu, které byly představeny jako "ochranné " kultury. Jejich hlavním cílem je zvýšit mikrobiologickou bezpečnost potravin. Funkce kultur k potlačení nežádoucích a patogenních bakterií, jako je například: Listeria monocytogenes a Staphylococcus aureus v jogurtu nebo Clostridium tyrobutyricum v sýru (Tamine, 2006). V současné době, je pouze nisin schválen jako konzervační prostředek. Byly provedeny mnohé studie na použití nisinu v sýru, včetně tavených sýrů, ale aplikace nisinu do mléka byla velmi omezená. Benkerroum a kol. (2002), přidal kmeny S. thermophilus a Lb. Delbrueckii subsp. Bulgaricus, schopné produkovat bakteriociny k jogurtu a jogurt kontaminoval L. monocytogenes a S. aureus. Výsledky ukázaly, že bakteriociny byly účinnější proti L. monocytogenes, než proti S. aureus (Tamine, 2006). 6 BIOAKTIVNÍ LÁTKY ROSTLINÉHO PŮVODU 6.1 Terpeny Terpeny jsou velká skupina organických látek přirozeného rostlinného původu, jejichž uhlíková kostra se skládá z různě uspořádaných isoprenových jednotek; obecný vzorec terpenických uhlovodíků je celistvým násobkem vzorce C5H8. Původem jde o složky 29

30 rostlinných esenciálních olejů, pryskyřic, výronů stromů apod. Co do chemického složení pak o alifatické a cyklické uhlovodíky a od nich odvozené alkoholy, aldehydy, ketony a karboxylové kyseliny. Velikost molekul je od deseti uhlíků v molekule až po polyterpeny např. přírodní kaučuk. K terpenům patří např. geraniol, citral, menthol, thymol, karvakol, pinen, kafr, retinol atd. ( Esenciální oleje Esenciální olej je produkt sekundárního metabolismu rostlin, během kterého dochází k degradaci látek metabolismu primárního, teda tuků, bílkovin a sacharidů. Látky obsažené v esenciálních olejích vznikají dvěma biogenetickými pochody. Hlavním je tzv. mevalonátová cesta, kdy se tvoří látky terpenické. Dalším pochodem je tzv. šikimátová cesta, kdy jsou tvořeny například kumariny, furokumariny a fenolické látky (Nováková, Šedivý, 1996). Esenciální oleje jsou obsaženy v různých částech rostlin ve zvláštních pletivech. Jsou především v květech, plodech, ale najdeme je i v listech, kůře a kořenech. Nacházejí se v žláznatých chlupech, žláznatých buňkách, papilách, kanálcích, mezibuněčných prostorách atd. V rostlině plní funkci fytoncidů, tedy látek s protipatogenními účinky (Nováková, Šedivý, 1996). Esenciální oleje jsou definovány jako těkavé, intenzivně vonící směsi přírodních rostlinných látek olejovité konzistence, lipofilní, ve vodě těžko rozpustné. Zpravidla jsou bezbarvé, zvláště v čerstvém stavu, delším uchováváním snadno oxidují, pryskyřičnatí a tmavnou. Přírodně žlutohnědá je hřebíčková silice, zeleně nebo modře jsou zbarveny silice obsahující azulen. Za pokojové teploty jsou zpravidla tekuté; některé, např. silice růžová nebo anýzová, částečně tuhnou. Hustota silic je většinou menší než 1. Výjimkou jsou silice s vysokým obsahem aromatických a síru obsahujících sloučenin (silice skořicová, hřebíčková, hořčičná). Vyznačují se optickou aktivitou a vysokým indexem lomu, daným přítomností nenasycených látek s dvojnými a trojnými vazbami (Bacílková, Paulusová, 2012). 30

31 Obrázek 8: Působení esenciálních olejů na bakteriální buňku (Šestáková, 2007) Allicin Allicin je hlavní biologicky aktivní složka česneku. Byl objeven pány Cavallito a Bailey v roce 1944, a je to klíčová složka zodpovědná za široké spektrum antibakteriální aktivity v česneku ( Jedná se o účinky: antibakteriální, antimykotické, antivirové, larvicidní a enzymy inhibující. Je účinný proti patogenům, které se nejčastěji objevují v potravinářství, zejména proti Staphylococcus aureus, Escherichia coli, proti které je nejvíce účinný, Salmonella typhi a Listeria monocytogenes, kde naopak allicin má nejmenší účinnost. Proto má česnek potenciál pro využití k uchování potravin (Kumar, Berwal, 1998) Karvakrol a thymol Thymol je monoterpenový fenolový derivát cymenu, izomerický s karvakrolem a obsažený v silici tymiánu. Extrahuje se jako bílá krystalická látka příjemné vůně a silných antiseptických vlastností ( Karvakrol a thymol jsou základními esenciálními oleji v tymiánu a oreganu. Sloučeniny se vyznačují tím, že dělají buněčnou membránu propustnou. Karvakrol a thymol způsobují dezintegraci buněčné membrány G bakterií uvolněním lipopolysacharidů a zvyšují tak propustnost cytoplazmatické membrány pro ATP. Studie, která byla provedena s bakterií Bacillus cereus, ukázala, že karvakrol interaguje s buněčnou membránou, kde se rozpustí ve fosfolipidové dvojvrstvě a je přijatý mezi řetězce mastných kyselin (Burt, 2007). 31