Molekulární detekce herbicid rezistentních plevelů. Mgr. Michaela Švécarová, PhD. Katedra botaniky

Transkript

1 Molekulární detekce herbicid rezistentních plevelů Mgr. Michaela Švécarová, PhD. Katedra botaniky

2 Charakteristika plevelů Každá rostlina, která se na určitém stanovišti vyskytuje proti vůli člověka Rostliny plevelné a zaplevelující - plevelné (plané rostliny ježatka kuří noha, chundelka metlice, kopřiva dvoudomá, svízel přítula, turanka kanadská atd.) - zaplevelující (nežádoucí rostliny žito v porostu pšenice) výdrol - problém GMO plodina se může stát dominantní (Urtica dioica) (Taraxacum officinale)

3 Charakteristika plevelů Polní plevele - rostliny, které jsou schopny s porostem pěstovaných plodin negativně interagovat Negativní interakce konkurence, parazitismus, alelopatie Hospodářská škoda snižování množství či kvality sklízeného produktu Nejproblematičtější zaplevelující rostliny jsou obilniny, nejvíce v porostech ozimé řepky Z okopanin jsou zaplevelujícími rostlinami brambory Kromě konkurence jsou zaplevelující rostliny nebezpečné z hlediska přežívání chorob a škůdců

4 Klasifikace plevelů Plevele JEDNOLETÉ - Tyto druhy jsou odkázány na generativní rozmnožování (semena, plody), které probíhá pouze v rámci jedné sezony Plevele efemérní vyhraněný životní cyklus, vzcházejí na podzim či v zimě např. huseníček rolní (Arabidopsis thaliana) Plevele časné jarní typické plevele časně setých jařin oves hluchý (Avena fatua) Plevele pozdní jarní teplomilnější druhy plevelů ježatka kuří noha (Echinochloa crus-galli) Plevele ozimé druhově nejpočetnější skupina chundelka metlice (Apera spica-venti)

5 Klasifikace plevelů 2) Plevele DVOULETÉ AŽ VÍCELETÉ (rozmnožující se převážně generativně) - V prvním roce vytvářejí listovou růžici, teprve ve druhém roce vykvétají a produkují semena nebo plody - Typicky dvouleté druhy následně odumírají, víceleté druhy setrvávají na stanovišti několik let - Mezi dvouleté druhy patří mrkev obecná (Daucus carota) - Víceleté druhy pampeliška (Taraxacum), jitrocel kopinatý (Plantago lanceolata) (Taraxacum officinale)

6 Klasifikace plevelů 3) Plevele VYTRVALÉ (rozmnožující se převážně vegetativně) - Vytrvalé druhy se schopností intenzivního vegetativního šíření pomocí nadzemních či podzemních orgánů Plevele mělčeji kořenící - Plevele s plazivými kořenícími lodyhami mochna husí, mochna plazivá - Plevele s pevnými a tuhými oddenky hlavní zástupce pýr plazivý - Plevele s měkkými a křehkými výběžky máta rolní, čistec bahenní - Plevele vytvářející hlízy, cibule a ztlustlé kořeny česnek viničný Plevele hlouběji kořenící - Plevele vytvářející oddenky přeslička rolní, podběl lékařský - Plevele vytvářející kořenové výběžky pcháč oset, mléč rolní (Elytrigia repens)

7 Klasifikace plevelů 4) Plevele POLOPARAZITICKÉ a PARAZITICKÉ - Druhy s různou mírou závislosti na hostiteli, na němž parazitují Plevele POLOPARAZITICKÉ - Od hostitele odebírají především vodu a minerální látky - Bez hostitele nejsou schopny dokončit životní cyklus - Jmelí bílé (Viscum album) (Viscum album) Plevele PARAZITICKÉ - Výživou zcela závislé na hostitelské rostlině, od které odebírají všechny látky nezbytné k růstu - Mohou zcela postrádat chlorofyl, případně je překryt jinými barvivy - Kokotice jetelová (Cuscuta trifolii)

8 Klasifikace plevelů 5) Dělení plevelů dle taxonomického zařazení - 2 hlavní skupiny plevele JEDNODĚLOŽNÉ a DVOUDĚLOŽNÉ JEDNODĚLOŽNÉ - Řadíme sem hlavě trávy, tedy zástupce čeledi lipnicovitých (Poaceae) - Dále Juncaceae, Cyperaceae, Alliaceae DVOUDĚLOŽNÉ - Někdy se používá označení širokolisté plevele - Čeleď hvozdíkovité, merlíkovité, rdesnovité, brukvovité, lilkovité atd. - Mimo tento systém stojí krytosemenné rostliny přesličky - Nejhojnějším zástupcem je přeslička rolní (Equisetum arvense)

9 Rozmnožování plevelů 1) VEGETATIVNÍ (nepohlavní, asexuální) - Vede ke vzniku jedinců geneticky identických s rodiči - Velice efektivní, pokud jde o dlouhodobé obsazení prostoru - U tohoto typu rozmnožování je důležitá regenerační schopnost - Většinou stačí poměrně malý úlomek vegetativní části k tomu, aby dal základ celé nové rostlině 2) GENERATIVNÍ (pohlavní, sexuální) - Rozmnožování pomocí semen či plodů, vede ke vzniku nových kombinací vlastností rodičů a umožňuje rostlinám rychleji reagovat na měnící se podmínky prostředí

10 Způsoby rozšiřování plevelů Rozšiřování plevelů = disperze, migrace Pokud se jedná o rozšiřování semen a plodů, známe tyto způsoby: AUTOCHORIE - Šíření probíhá bez pomocí vnějších vektorů - Vzdálenost, na kterou se semena mohou šířit, je limitována, často se jedná o několik či desítky centimetrů ANEMOCHORIE - Spočívá v šíření semen či plodů vzduchem - Šíří se na delší vzdálenosti

11 HYDROCHORIE Způsoby rozšiřování plevelů - Šíření semen a plodů pomocí vody ZOOCHORIE - Šíření semen a plodů prostřednictvím živočichů ANTROPOCHORIE - Šíření prostřednictvím člověka, respektive lidských aktivit - Pro polní plevele nezastupitelný význam

12 Škodlivost plevelů PŘÍMÁ konkurence s pěstovanou plodinou (voda, živiny, světlo, prostor) NEPŘÍMÁ na plevelech přežívají četné choroby, nebo jsou dočasnými hostiteli řady škůdců polních plodin (Např. plevele z čeledi brukvovitých jsou napadány hlenkou kapustovou, která způsobuje nádorovitost kořenů košťálové zeleniny) mnohé plevele poskytují potravu a úkryt živočišným škůdcům snižují produktivitu práce zvyšují náklady na pěstování

13 Užitečnost plevelů Léčivé rostliny pampeliška lékařská (Taraxacum officinale) třezalka tečkovaná (Hypericum perforatum) jitrocel kopinatý (Plantago lanceolata) heřmánek pravý (Matricaria chamomilla) Pastva včel Humusový materiál Zabránění vodní a větrné erozi Zpevnění břehů Obohacení fytocenózy daného stanoviště Genofond

14 Zkušenosti z předchozích let Diagnóza plevelů Současný stav zaplevelení Technické možnosti aplikace Celý komplex metod Regulace plevelů Metody regulace A) Nepřímé prevence (kontrolované osivo, střídání plodin, půda) B) Přímé - fyzikální (mechanické) odstranění plevelů před dozráním (termické) přehřátí rostliny úhyn - biologické zavedení patogenů nebo živočišných škůdců - chemické HERBICIDY - (narušení biochemických procesů)

15 Regulace plevelů PESTICIDY chemické látky, které slouží v zemědělství k hubení živých škodlivých činitelů pěstovaných rostlin PESTICIDY Herbicidy Insekticidy Fungicidy

16 Projevy fytotoxického působení Popálení listů Retardace růstu Deformace rostlin Barevné změny Regulace plevelů

17 HERBICIDY Jsou chemikálie, které zpomalují nebo přerušují normální růst a vývoj rostlin Narušují základní biochemické a fyziologické pochody Použití především k regulaci plevelů v zemědělství Méně nákladné než ostatní regulace plevelů Rizika používání herbicidů - mohou způsobit poškození pěstované plodiny - negativní vliv na obsluhu postřikovačů a jiných osob - zatěžují životní prostředí - vznik rezistentních populací! Herbicidy nebo meziprodukty jejich rozkladu často přetrvávají v půdě, mohou být vyplavovány do podzemních a povrchových vod, popřípadě jejich rezidua mohou být obsažena i v potravinách!

18 HERBICIDY Herbicid je přípravek obsahující účinnou látku a řadu dalších složek jako jsou ředidla, barviva atd. Herbicidy mají velmi složité chemické značení, proto se používá zjednodušeně pouze název účinné látky Jednotlivé přípravky mají také svůj obchodní název, pod kterým jsou registrovány a distribuovány V současné době je ve všech zemích (kromě Kanady, USA a Austrálie) používána klasifikace HRAC = Herbicide Resistance Action Committee, jež dělí herbicidy dle způsobu účinku do 22 tříd Klasifikace je vytvořena na základě místa a mechanismu účinku, poškození plevele a chemického složení herbicidu

19 HERBICIDY Klasifikace HRAC vznikla na základě iniciativy výrobců herbicidů. Jejím cílem je vytvoření jednotné klasifikace herbicidní účinnosti, použití v co nejvíce zemích světa a tím pádem co nejjednodušší výběr herbicidu zemědělcem Klasifikovat herbicidy můžeme dle několika kritérií např. podle selektivity, způsobu účinku, doby aplikace, doby trvání účinku nebo již zmíněného mechanismu účinku

20 DDT Aromatická halogenskoučenina - 1,1,1-trichlor-2,2-bis(4-chlorfenyl)ethan Nejstarší a nejznámější INSEKTICID! Poprvé syntetizován v roce 1874 rakouským chemikem Othmarem Zeidlerem Insekticidní účinky objevil švýcarský chemik Paul Hermann Müller 1939 Přípravek k hubení škodlivého hmyzu v zemědělství, ale především k likvidaci komárovitého hmyzu v tropických zemích Od 2. světové války použití v masovém měřítku Do Evropy DDT přivezla americká armáda

21 DDT

22 DDT Rachel Carson 1962 Silent Spring Mlčící jaro Přítomnost DDT v živočišných tkáních a potravních řetězcích byla zjištěna i v lokalitách daleko vzdálených od míst jeho nasazení a že se hromadí v tkáních živočichů BIOAKUMULACE Nejprokazatelnější negativní vliv DDT na životní prostředí byl zaznamenán u dravých ptáků. Hlodavci bioakumulace Predátor DDT zeslabení skořápky vymírání druhů Zákaz DDT v USA roce 1972

23 DDT Zamoření v Česku Zamořen DDT je bývalý sklad pesticidů v Lubech u Klatov Proniká do povrchové vody Obyvatelům této lokality se nedoporučuje, aby pili vodu z místních studní Náklady na odstranění zamoření se odhadují na 30 milionů korun Rizika DDT DDT zvyšuje riziko Alzheimera Změna hladin estrogenu a progesteronu Výskyt defektních spermií, pokles spermií Nádory prsu u dívek

24 Podle mechanismu účinku Klasifikace herbicidů - syntetické auxiny - inhibitory syntézy aminokyselin - inhibitory fotosyntézy - inhibitory buněčného dělení - inhibitory biosyntézy karotenoidů - inhibitory Acetyl-CoA karboxylasy Podle selektivity Podle doby použití (před setím, po zasetí, po vzejití plodiny) Podle způsobu účinku Podle doby trvání účinku

25 Formy herbicidních přípravků Práškové formy - ve vodě dispergovatelné prášky (DP, WP) - ve vodě rozpustné prášky (VRP, ST) Granule dispergované ve vodě (DF, DG, WG, WGD) Granule určené pro přímý rozptyl po pozemku Kapalné formy: - emulgovatelné koncentráty (EC, EK) - kapalný koncetrát pro ředění s vodou (SL, LC, KV) - dispergovatelný koncentrát pro ředění vodou (DK, DC) - suspenzní koncentrát pro ředění vodou (SK, SC)

26 Herbicidy CHLOROSULFURON Herbicidní skupina ALS inhibitory (acetolaktát synthasa) Chemická skupina Sulfonylmočovina Účinná látka chlorsulfuron Obchodní název Glean, Balance PROPAQUIZAFOP Herbicidní skupina Inhibitory ACCasy (AcetylCoA karboxylasa) Chemická skupina Aryloxy-fenoxy propionáty Účinná látka Propaquizafop Obchodní název Agil, Garland

27 ROUNDUP Herbicidy Herbicidní skupina EPSP synthasy Firma Monsanto (USA) Účinná látka GLYFOSÁT Univerzální herbicid od roku 1974 v 21. století celosvětově nejpoužívanějšími herbicidy Rezistence rostlin 24 druhů plevelů (turanka kanadská, laskavec palmerův, přeslička rolní)

28 ROUNDUP Herbicidy Roundup Klasik je prodáván jako žlutá olejovitá látka, tekutina s nevýrazným aminovým zápachem U přípravku Roundup Rapid uvádí o 25% více účinné látky Roundup Expres - sloučenina glyfosátu 1%, kyselina pelargonová 1% hmotnosti, 98% voda a další aditivní látky Roundup Gel - sloučenina glyfosátu 1%, jiné látky 1%, další aditivní látky 98%. Roundup Klasik - sloučenina glyfosátu 480g/l Roundup Original MAX - sloučenina glyfosátu 49%, příměsi 51% Roundup Pro - sloučenina glyfosátu 480 g/l Roundup Flex sloučenina glyfosátu 480 g/l Roundup Bioaktiv - sloučenina glyfosátu 480 g/l Roundup Rapid - sloučenina glyfosátu 607 g/l Roundup WeatherMAX - sloučenina glyfosátu 540 g/l, přípravek je v technickém listu označen jako jed Roundup Ultra2 - sloučenina glyfosátu 540 g/l, přípravek je v technickém listu označen jako jed

29 Herbicidy Roundup ready plodiny Kmen bakterie A. tumefaciens Bakterie je rezistentní vůči herbicidu Roundup Z bakterie izolován gen pro bakteriální verzi enzymu EPSP synthasy Tento gen byl postupně vložen do některých zemědělských plodin Dnes je v tomto ohledu dostupná široká škála glyfosát-rezistentních plodin: (sója, řepka olejná, kukuřice, bavlník, vojtěška a cukrová řepa ) Roundup ready plodiny Rostliny odolné vůči glyfosátu

30 Současné problémy v zemědělství Rezidua syntetických pesticidů v potravinách a ve vodě REZISTENTNÍ populace (plevele, patogeny, škůdci) Negativní vliv na NECÍLOVÉ organismy

31 Nové trendy ochrany rostlin Nové a zdravotně bezpečné selektivní přípravky Geneticky modifikované organismy (GMO) Botanické pesticidy a pomocné látky Nové možnosti jak snížit spotřebu syntetických chemických přípravků! Environmentálně bezpečné (selektivní) Zdravotně nezávadné Zabraňují vzniku rezistence

32 Botanické pesticidy Přípravky na ochranu rostlin, které obsahují rostlinné extrakty s biologicky aktivními látkami obranného charakteru 1. generace (historicky staré, obvykle neselektivní insekticidy) 2. generace (environmentálně bezpečné, selektivní pesticidy a pomocné látky) 3. generace (pomocné látky zlepšující růst, vývoj a obranyschopnost rostlin, elicitory)

33 Detekce herbicid rezistentních plevelů Acetolaktát synthasa (ALS; EC ) Biosyntéza esenciálních aminokyselin (Val, Leu a Ile) Lokalizace enzymu v chloroplastech rostlinných buněk Herbicidy inhibice aktivity uvedeného enzymu Nejvýznamnějšími ALS inhibitory jsou sulfonylmočoviny Chlorsulfuron, tribenuron, amidosulfuron aj. Regulace plevelů v porostech obilnin Uplatnění i v kukuřici, bramborách, cukrovce a řada zeleniny Rozklad herbicidů mikrobiálně i chemicky Poločas rozkladu dny až týdny Vznik rezistentních populací! Rezistentní populace v ČR u chundelky metlice!

34 Detekce herbicid rezistentních plevelů Acetolaktát synthasa (ALS; EC ) Mutace Pro 197 (záměna za Ala, Ser, Thr) 3 mutace Mutace Trp 574 (záměna za Leu) 1 mutace Mutace Arg 377 (záměna za His) 1 mutace Další mutace Ala 122, Ala 205, Asp 376, Ser 563 a Gly 654

35 Detekce herbicid rezistentních plevelů

36 Detekce herbicid rezistentních plevelů Chundelka metlice (Apera spica-venti) Trsnatá plevelná tráva čeleď lipnicovité (Poaceae) Vlhké, písčité i štěrkovité půdy Orná půda, pastviny, podél cest Chundelka metlice je původní plevelnou rostlinou našich polí V současnosti již vyrůstá v ČR na všech druzích půd Běžná i ve víceletých pícninách a ozimé zelenině Tato konkurenčně silná rostlina dokáže při vyšším výskytu pěstovanou plodinu silně potlačit Řadíme ji mezi nejškodlivější plevele ozimých plodin Lze ji omezit střídáním plodin, vyséváním pouze čistého osiva a pravidelnými postřiky (Rezistence ALS) Chundelka přetrhovaná (Apera interrupta) Kladenské haldy

37 Detekce herbicid rezistentních plevelů Chundelka metlice (Apera spica-venti)

38 Detekce herbicid rezistentních plevelů Chundelka metlice (Apera spica-venti) Mapa výskytu chundelky metlice v ČR (Apera spica-venti) v ozimé pšenici pravidelný výskyt, nepravidelný výskyt, bez výskytu

39 Detekce herbicid rezistentních plevelů

40 Detekce herbicid rezistentních plevelů Vývoj počtu rezistentních plevelů vůči vybraným skupinám herbicidů v období

41 Detekce herbicid rezistentních plevelů Seznam detekovaných účinných látek, ke kterým byla vyvinuta rezistence u chundelky metlice (Apera spica-venti) ve světě

42 Detekce herbicid rezistentních plevelů TaqMan PCR Oligonukleotidy 2 TaqMan proby Fluorescenční značka Krátký úsek DNA Zhášeč (quencher) Velmi specifické oproti SYBR greenu I 5 -exonukleasová aktivita Taq polymerasy Uvolnění fluorescenční sondy do roztoku fluorescence Intenzita fluorescence přímo úměrná množství PCR produktu

43 Interactive Fluorophore and Quencher Pairs

44 Interactive Fluorophore and Quencher Pairs

45 Detekce herbicid rezistentních plevelů TaqMan PCR Křivky tání melting curve

46 Detekce herbicid rezistentních plevelů detekční PCR Izolace gdna - (CTAB) vysočina a olomoucký kraj Ošetření RNasou, detekční PCR Primery (ALS375F, ALS375R) Agarosová elektroforéza (1,5%; 45 min; 100 V) Přečištění PCR produktů (GenElute PCR Clean-Up Kit) Sekvenace (SeqMe ČR) Vyhodnocení výsledků (Geneious) ITS potvrzení daného druhu rostliny ALS375 CGAGCCCCGCAAGGGCGCCGACAT forward (F) GTGATGGAGCGGGTGACCTCTA reverse (R) ITS TCCGTAGGTGAACCTGCGG forward TCCTCCGCTTATTGATATGC reverse

47 Detekce herbicid rezistentních plevelů detekční PCR (Chundelka metlice) Neředěná gdna 300 bp 10x ředěná gdna 300 bp

48 ALS Apera spica-venti

49 ALS Apera spica-venti *

50 ALS Apera spica-venti 36/3 lokalita Mostkovice

51 Detekce herbicid rezistentních plevelů Polní lokality Olomouckého a Moravskoslezského kraje. Červeně je označená lokalita s alespoň jedním jedincem chundelky metlice (Apera spicaventi), u kterého byla analyzována mutace v Pro 197 související se vznikem rezistence vůči ALS inhibitorům

52 EPSPS geny Detekce herbicid rezistentních plevelů 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát synthasa (EC ) Šikimátová dráha biosyntéza aromatických AMK EPSPS1, EPSPS2 a EPSPS3 Jednobodová mutace Pro 106 Záměna za serin nebo threonin Turanka kanadská (Conyza canadensis)

53 Detekce herbicid rezistentních plevelů Turanka kanadská (Conyza canadensis) Čeleď hvězdnicovité (Asteraceae) Plodem je nažka Příkopy, železnice, rumiska, lesní mýtiny Písčité půdy, nedostatek vláhy Hlavní plevel ve vinicích Olivové a citrusové sady Velmi odolná proti herbicidům! Problém rezistentních jedinců! Glyfosátový anion (herbicid) Roundup (komerční)

54 Detekce herbicid rezistentních plevelů Turanka kanadská (Conyza canadensis)

55 Detekce herbicid rezistentních plevelů EPSPS1 Izolace gdna - 20 vzorků (CTAB) Ošetření Rnasou, detekční PCR 2 typy primerů (Primer3, Chodová et al., 2009) Agarosová elektroforéza (1,5%; 45 min; 100 V) Přečištění PCR produktů (GenElute PCR Clean-Up Kit) Sekvenace (SeqMe ČR) Vyhodnocení (Geneious) Primery (5-3 ) F: AGGAGGATGTTGCAATTAAA (návrh) R: TCAATGACAACGTCCAAATA (návrh) F: AACGTTGAGGAGGATGTTGC (Chodová et al., 2009) R: TTTCAACATGCAGTGTTCTCTG (Chodová et al., 2009)

56 Detekce herbicid rezistentních plevelů (Teplotní gradient) 44,9 C 45,3 C 46,6 C 48,5 C 50,8 C 53,4 C 56,1 C 58,7 C 61,1 C 63,1 C 64,5 C 65,1 C NÁVRH PRIMER3 200 bp * Chodová, bp *

57 Detekce herbicid rezistentních plevelů (Turanka kanadská) bp 2x ředěné Konc. 4 ul gdna 10x ředěné 2 ul Přečištění PCR produktů Nanodrop koncentrace Sekvenace SeqMe Hledání mutací EPSPS1

58 * EPSPS1 Conyza canadensis

59 Detekce herbicid rezistentních plevelů ACC gen (ACC1 a ACC2) Acetyl CoA karboxylasa (EC ) Klíčový enzym biosyntézy mastných kyselin Bodové mutace u rezistentních trav (např. psárka polní) ACC1 pozice 1781 záměna Ile za Leu pozice 2027 záměna Trp za Cys pozice 2041 záměna Ile za Asn pozice 2078 záměna Asp za Gly ACC2 pozice 2096 záměna Gly za Ala

60 Detekce herbicid rezistentních plevelů Ježatka kuří noha (Echinochloa crus-galli) Čeleď lipnicovité (Poaceae) Hojný polní plevel Plodem je obilka Podél cest, příkopy, břehy vod a nezemědělská půda V současné době patří mezi nejškodlivější plevele světa

61 Detekce herbicid rezistentních plevelů Ježatka kuří noha (Echinochloa crus-galli)

62 Detekce herbicid rezistentních plevelů (Ježatka kuří noha) Izolace gdna - 20 vzorků (CTAB) Vysočina a Olomouc Ošetření RNasou, detekční PCR 2 typy primerů (ACC1 a ACC2) Agarosová elektroforéza (1,5%; 45 min; 100 V) Přečištění PCR produktů (GenElute PCR Clean-Up Kit) Sekvenace (SeqMe ČR) Vyhodnocení (Geneious) (Délye et Michel, 2005)

63 Detekce herbicid rezistentních plevelů (Ježatka kuří noha) 300 bp

64 Detekce herbicid rezistentních plevelů (Ježatka kuří noha) (Stýblová, 2012) Nalezena mutace u vzorku J2

65 Děkuji za pozornost!