MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DISERTAČNÍ PRÁCE

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DISERTAČNÍ PRÁCE BRNO 2013 Mgr. NATALIA CERNEI

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústavv chemiee a biochemie MODERNÍ ANALYTICKÉ METODY PRO DETEKCI AMINOKYSELIN ASOCIOVANÝCH SE ZHOUBNÝMI NÁDORY PROSTATY Studijní Disertační prácee obor: 4106V017 Zemědělská chemiee Vedoucí práce: Vypracovala: prof. Ing. René Kizek, Ph.D. Brno 2013 Mgr. Natalia Cernei

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma MODERNÍ ANALYTICKÉ METODY PRO DETEKCI AMINOKYSELIN ASOCIOVANÝCH SE ZHOUBNÝMI NÁDORY PROSTATY vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně... dne podpis

4 Zpracovaná disertační práce byla finančně podpořena z prostředků specifického vysokoškolského výzkumu prostřednictvím projektu IGA AF č. IP 1/

5 Experimentální částt této disertační práce byla realizována na výzkumné infrastruktuře vybudované v rámci projektu CZ.1.05/ / Centrum senzorických, informačních a komunikačních systémů (SIX) operačního programu Výzkum a vývoj pro inovace. Finanční podpora byla poskytnuta Evropským fondem pro regionální rozvoj r a státním rozpočtem České republiky

6 Neexistuje nic skutečně cenného, čeho může být dosaženo bez práce a bez námahy. Joseph Addison - 4 -

7 PODĚKOVÁNÍ Na prvním místě bych chtěla poděkovat Renému Kizekovi za vedení, podporu a trpělivost, které mi věnoval. Ondřeji Zítkovi a Vojtěchu Adamovi za pomoc při interpretaci výsledků a tvorbě publikací, které byly základem pro tuto práci. Sylvii Skaličkové, Markétě Komínkové a Dagmar Uhlířové za spolupráci při realizaci praktické částí této práce. Děkuji také všem spoluautorům za pomoc při přípravě publikací, které tvoří základ výsledků v této práci. Dále děkuji všem spolupracovníkům Laboratoře metalomiky a nanotechnologií Mendelovy univerzity v Brně za všestrannou pomoc a vytvoření příjemné pracovní atmosféry. Za duševní podporu bych chtěla poděkovat Františku Bartoškovi a Dianě Cernei. A nakonec děkuji své matce a bratrovi za podporu, bez které bych nemohla své práci věnovat tolik potřebného úsilí

8 ABSTRAKT V předkládané disertační práci s názvem Moderní analytické metody pro detekci aminokyselin asociovaných se zhoubnými nádory prostaty byl studován sarkosin jako potencionální nádorový marker, který má význam pro diagnostiku agresivních forem karcinomu prostaty. Dále byl studován vliv přídavků sarkosinu na prostatické buněčné linii PC3. Další studovanou oblastí byly interakce sarkosinu s aminokyselinami, chloridem sodným, kyselinou močovou a uracilem. Primárně jsme se také zaměřili na vývoj metody pro detekci sarkosinu ve vzorcích moči pacientů s Cap a prostatických buňkách. Klíčová slova: nádorový markér, sarkosin, elektrochemická detekce, spektrofotometrická detekce, paramagnetické částice, HPLC-ED, iontové-výměnná kapalinová chromatografie, karcinom prostaty. ABSTRACT In the present thesis called "The modern analytical methods for detection of aminoacids asociated with malignant prostate tumours" sarcosine has been studied as potential tumor marker which has significance for the diagnosis of aggressive forms of prostate cancer. The effect of addition of sarcosine prostate line PC3 has been also studied as well. Next studied area was the interactions with amino acid sarcosine, sodium chloride, uric acid and uracil. We have primarily focused also on the development of methods for the detection of sarcosine in urine samples of patients with Cap and prostate cells. Keywords: tumor markers, sarcosine, electrochemical detection, spectrophotometric detection, paramagnetic particles, HPLC-ED, ion-exchange liquid chromatography, cancer of prostate

9 Obsah: 1 Úvod Cíle práce Literární přehled Charakteristika onemocnění rakoviny prostaty Diagnostika nádoru prostaty Léčba nádoru prostaty Statistika výskytu onemocnění nádory prostaty Markery nádoru prostaty Onkogeny Glycin jako marker karcinomu prostaty Methionin Sarkosin Metabolismus sarkosinu Metody detekce sarkosinu Iontově - výměnná kapalinová chromatografie s VIS detekcí Elektrochemické metody pro detekci sarkosinu Materiál a metodika Chemikálie Biologický materiál Vzorky moči pacientů Prostatická linie buněk PC Průtoková injekční analýza s elektrochemickou detekcí Iontově - výměnná kapalinová chromatografie s VIS detekcí Adsorptivní přenosová technika (AdTS) Spektrofotometrická analýza: Specord Spektrofotometrická analýza: BS Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody ABTS

10 Stanovení antioxidační aktivity pomocí DPPH testu Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody DMPD Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody FRAP Stanovení celkových proteinů pomocí pyrogalové červeně (Skalab test) Výsledky a diskuse Studium obsahu sarkosinu a ostatních markérů na úrovni buněčných linií Vědecký článek I Vědecký článek II Vývoj nových metod pro separaci a detekci sarkosinu Vědecký článek III Vědecký článek IV Vědecký článek V Závěr Literatura Seznam zkratek

11 1 ÚVOD Život je mnohem víc, než bude věda schopna popsat nebo pochopit. Věda, hlavně ta experimentální, je pouze omezeným nástrojem poznání současnosti, té její části, kterou je možné kdykoliv zopakovat. Vědci se pokoušejí už mnoho desítek let přinutit rakovinné buňky ke spolupráci mnoha různými způsoby, snaží se jim připomenout jejích původ, ale zatím bohužel bez prosperujících výsledků. Rakovina a v podstatě jakákoliv choroba je důkazem toho, že život nespočívá jen v příjmu potravy a vlastní existenci. Dosud odhaleno hodně důvodů, které mohou způsobit vývoj zhoubného bujení. Patří sem nezdravý životní styl a strava, nadměrné pití alkoholu, kouření a vliv toxických látek v okolí. V současné době není možné dosáhnout úspěchu v boji proti rakovině bez společné spolupráce různých vědeckých oborů společně s lékaři. Priorita spojuje výzkum molekulární podstaty a základních mechanismů života s aplikovaným výzkumem a vývojem špičkových biotechnologických procesů a výsledků s vysokou prospěšnou hodnotou. K největším prioritám současnosti patří výzkum a vývoj pokročilých diagnostických a biotechnických metod, zjišťováni biomarkerů chorob, výzkum a vývoj biologických léků pro humánní i veterinární medicínu a výzkum kmenových buněk pro tkáňové náhrady. Kvůli finanční a časové náročnosti vědeckých experimentů je nutno propojení byznysu s vědou. Takové propojení má svoje výhody, které spočívají v dostupnosti nejrůznějších diagnostických a biotechnických metod pro klinické laboratoře, ale má také svůj velký význam pro pacienty, kterým nové technologie zlepší kvalitu jejich života

12 2 CÍLE PRÁCE Studium caveolinu, metalothioneinu a PSA na buněčné úrovni Studium vlivů přídavků sarkosinu na antioxidační aktivitu a obsah metalothioneinu u prostatické nádorové linie PC3 Spektrofotometrické a elektrochemické metody stanovení sarkosinu Detekce sarkosinu pomocí iontově-výměnné kapalinové chromatografie Detekce sarkosinu v moči pacientů s diagnostikovaným karcinomem prostaty

13 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Charakteristika onemocnění rakoviny prostaty Rakovina je definována jako soubor onemocnění vycházející z poruch genomu, jako jsou mutace, delece, amplifikace DNA nebo nedostatečné reparace genových defektů. Tyto poruchy vedou k poruchám regulace růstu a množení poškozených buněk. V současnosti nejsou dostupné léčebné postupy, které by tyto poruchy na úrovni DNA cíleně opravovaly. Jednotný mechanismus vzniku a rozšiřování karcinomu prostaty (Cap) není dosud znám, avšak pravděpodobně se jedná o soubor různých vlivů. Předpokládá se, že nejvýznamnějším faktorem ovlivňujícím vznik karcinomu prostaty je věk. S každou dekádou života roste pravděpodobnost výskytu na dvojnásobek a nejvíce se iniciace rakoviny prostaty vyskytuje u mužů ve věku let. Důležitou roli při vzniku a rozvoji karcinomu prostaty hrají také androgeny. Z tohoto pohledu můžeme rozdělit karcinomy prostaty na androgen dependentní a non dependentní (Paquet, S., Fazli, L. et al. 2012; Vindrieux, D., Reveiller, M. et al. 2012). Dalšími faktory, které pravděpodobně přispívají ke vzniku nádorových onemocnění prostaty, jsou genetické dispozice (riziko výskytu pro syna otce majícího karcinom prostaty je asi trojnásobné) a etnický původ, kde byla zaznamenána nejvyšší incidence karcinomu prostaty u amerických černochů, ale také i u indoevropské populace. V neposlední řadě se na vzniku karcinomu prostaty podílí výživa s vyšším obsahem tuků, která podněcuje nádorový růst (Boyd, L. K., Mao, X. Y. et al. 2012) Diagnostika nádoru prostaty Pro karcinom prostaty neexistují typické příznaky. Obvykle roste v těle velmi pomalu, metastazuje relativně pozdě a díky svému umístění nezpůsobuje žádné viditelné symptomy (Noldus, J. 2011). Pokud vyvolá nějaké potíže, většinou se již nemoc nachází v pokročilejším stádiu. Tyto příznaky však stále nejsou specifické, a velmi často jsou shodné se symptomy benigní hyperplazie prostaty. Nejčastěji se tedy jedná o problémy spojené s močením, v pokročilejším stádiu se objevuje bolest zad, žeber, kyčlí či ramen, což znamená, že se karcinom rozšířil ke kostem a byly vytvořeny kostní metastáze (Boehmer, D., Koswig, S. et al. 2000) (Abrams, P., Chapple, C. et al. 2013). Diagnóza může být stanovena až na základě patologické fraktury nebo otoků dolních končetin, které svědčí o

14 postižení pánevních lymfatických uzlin (Choudhury, A. D., Eeles, R. et al. 2012). Avšak všechny uvedené symptomy jsou dosti specifické, většina pacientů uvádí jen několik málo symptomů, i když již trpí pokročilou fází nemoci (Ferreira, S., Dormehl, I. et al. 2012). V některých případech se dokonce stává, že nemocný netrpí žádnými symptomy, a přesto je u něj odhaleno pokročilé stádium nádoru prostaty (Nofiele, J. I. T., Karshafian, R. et al. 2013). Mezi základní metody, které se používají při diagnostice karcinomu prostaty, patří vyšetření per rectum (DRE), určení hladiny prostatického specifického antigenu (PSA) v séru a transrektální ultrasonografie (TRUS). Pro hodnocení a porovnání průběhu onemocnění, výsledků léčby a prognózy pacientů, je nutný jednotný klasifikační systém. Provádění gradingu karcinomu prostaty má zásadní význam z hlediska prognostického, neboť dobře diferencované karcinomy progredují pozvolna a naopak málo diferencované karcinomy rychle zakládají metastázy a prognóza je špatná (Noldus, J. 2011). U adenokarcinomu prostaty se nejčastěji užívá pro určování stupně histologické diferenciace nádoru Gleasonovo score (GS) (Egevad, L., Ahmad, A. S. et al. 2013). U tohoto systému se hodnotí architektonické uspořádání nádorových ložisek. Dle stupně diferenciace jsou nádory klasifikovány do pěti stupňů od G1 (dobře diferencovaný acinární karcinom) až po G5 (disociovaný karcinom)(egevad, L., Ahmad, A. S. et al. 2013). Vzhledem k tomu, že Cap často obsahuje minimálně dva typy různě diferencovaných okrsků buněk, stupeň nejvíce zastoupeného typu se uvede jako první, druhý nejvíce zastoupený jako druhý. Relativně příznivé skóre je v rozpětí 2-4, rizikové 5-7, nepříznivé Léčba nádoru prostaty Léčba karcinomu prostaty je závislá na rozsahu onemocnění, histopatologickém nálezu (GS), hladině PSA a předpokládané době života (Cruess, D. G., Benedict, C. et al. 2013). Základní podmínkou pro zvýšení úspěšnosti léčby karcinomu prostaty je jeho včasná detekce. Proto by měl každý muž po padesátém roce, i když nemá žádné problémy s močením, navštívit urologa a podstoupit preventivní urologické vyšetření. Muži s výskytem nádorových onemocnění v rodině a stejně tak muži afroamerického původu by měli začít s těmito preventivními vyšetřeními již od svých čtyřiceti let (Lindstrom, S., Schumacher, F. R. et al. 2012). Poté by preventivní vyšetření měli muži absolvovat pravidelně jednou za dva roky a po dovršení šedesáti let každoročně. V současnosti jsou

15 nejrozšířenější způsoby léčby ozařování, radikální prostatektomie, hormonální léčba a v neposlední řadě chemoterapie (Fritsche, H. M., Aziz, A. et al. 2012; Das, T. and Pillai, M. R. A. 2013). Ozařování je vhodné zejména pro kontrolu růstu rakovinných buněk a prevence jejich dalšího šíření (Brahme, A. 2004). Používají se cílené paprsky radioaktivního záření, na které jsou maligní buňky vysoce citlivé (Nettleton, J. S., Lawson, R. S. et al. 2004; Alonso-Basanta, M., Chapman, C. et al. 2011). Operativní odstranění předstojné žlázy a žláz k ní přilehlých se používá u nádorů, které dosud nemetastazovaly do dalších tkání (Spieth, M. E., Lin, Y. G. et al. 2002). Jedním ze standardních postupů léčby je hormonální terapie. U pacientů je buď provedeno odstranění varlat nebo podávání hormonálních injekcí s cílem snížit hladinu mužských hormonů (zejména testosteronu) na minimální hladinu (Hirst, C. J., Cabrera, C. et al. 2012). V případě, že všechny přístupy k léčbě rakoviny prostaty jsou neúspěšné, nasazuje se chemoterapie (Hensel, J. A., Flaig, T. W. et al. 2013). Nejčastěji je podáván Docetaxel (Sonpavde, G., Matveev, V. et al. 2012), avšak jsou testovány nová cytostatika, například Cabazitaxel (Mita, A. C., Figlin, R. et al. 2012). I když je úspěšnost léčby rakoviny prostaty poměrně dobrá (mortalita 80 mužů z )(Boniol, M., Boyle, P. et al. 2012), je třeba se této problematice ve vědecké sféře více věnovat, protože právě u včasně diagnostikovaných pacientů je léčba nejúspěšnější Statistika výskytu onemocnění nádory prostaty Adenokarcinom je nejčastěji se vyskytujícím nádorovým onemocněním u mužů, hned za rakovinou plic (Boyd, L. K., Mao, X. Y. et al. 2012). Rakovina prostaty je ze všech rakovin na třetím místě, co se týče úmrtnosti (Portalez, D., Mozer, P. et al. 2012). Incidence roste ročně asi o 2-3 %, za posledních 15 let se počet nahlášených nemocných ztrojnásobil. Pětašedesát procent případů rakoviny prostaty je sice diagnostikováno u mužů starších pětašedesáti let, ve věkové skupině mezi čtyřiceti a šedesáti lety je to ale každý devětatřicátý (Boyle, P. and Ferlay, J. 2005). Lékaři totiž předpokládají, že se u mladších mužů rozvíjejí agresivnější formy onemocnění než u starších ročníků (Ilic, D., Murphy, K. et al. 2012). U 85 % mužů starších šedesáti let je zaznamenán výskyt rakovinných ložisek a u mužů nad osmdesát let už je to dokonce 95 %. Z grafu (Obr. 1) je patrné, že se incidence karcinomu prostaty zvyšuje s věkem. U mužů ve věku let se výskyt onemocnění objevuje u 5-9 % populace

16 Obrázek 1: Incidence karcinomu prostaty (Cap) v závislosti na věku. U mužů ve věku let l bylo zaznamenáno zvýšení výskytu onemocnění karcinomem prostaty u % populace. Nejvyšší výskyt byl zaznamenán u mužů v rozmezí let, kdy incidence karcinomu prostaty vykazuje stoupající trend u 25 % populace Markery nádoru prostatyy Nádorovým markerem rozumíme molekuly převážně bílkovinné povahy, které se objevují v organismu v důsledku maligního zvratu (Choudhury, A. D., Eeles, R. et al. 2012). Lokalizace nádorových markérů je rozmanitá. Mohou být přítomny přímo ve tkáni nádoru (buněčný nádorový markér) nebo jsou nádorem produkovány ( s nádorem asociované antigeny), popř. jsou produkovány hostitelem jako odpověď na přítomnostt nádoru (Quek, S. I., Ho, M. E. ett al. 2012). Stanoveníí hladiny nádorových markérů je nedílnou součástí vyšetřovacích metod pro stanovení diagnózy, prognózy a kontroly průběhu léčby. V současné době je velký zájem o markéry neinvazivní, detekovatelné v moči. Jedním z nich je Prostatický karcinom antigen 3 (PCA3) marker, který byl detekován v moči pacientů po vyšetření biopsií (Goode, R. R R., Marshall, S. J. et al. 2013). Bylo prokázáno, že hodnoty prostatického karcinom antigenu 3 byly několika násobněě vyšší než hodnoty prostatickéhoo specifického antigenu (PSA).. V další studii s bylo potvrzeno, že testování karcinomu prostaty v močii pomocí PCA3 ve spojení s prostatickým specifickým antigenem má potenciál pro významné snížení počtu zbytečných aplikací biopsií (Crawford, E. D., Rove, K. O. et al. 2012). 2 Dalšími slibnými markery detekovatelnými v moči jsou annexin (A3), TMPRSS2 a ERG E (Cao, D. L., Ye, D. W. et al. 2011). Hledání nových nádorovýchh biomarkerů bylo usnadněno rozvojem technologií pro profilování biomolekul, které see používá v transkriptomice a proteomice. Pomocí

17 spektroskopie nukleární magnetické resonance (NMR) byly porovnány intracelulární a extracelulární metabolické profily prostatické buněčné linie RWPE-1 a maligními fenotypy, WPE1-NB14 a WPE1-NB11, generovaných N-methyl-N-(nitrosourey MNU) mutageny. Společně tyto buněčné linie představují v modelu in vitro progrese a regrese onemocnění karcinomu prostaty. V této studii byly tedy zpozorované progresivní změny intracelulární hladiny cholinu a obsahu aminokyselin u prostatických buněčných linií RWPE-1, WPE1-NB14 a WPE1-NB11 (Teahan, O., Bevan, C. L. et al. 2011) Onkogeny Onkogeny mohou mít významný vliv na buněčný metabolismus a mutace u enzymůisocitrát dehydrogenázy 1 (IDH1), isocitrát dehydrogenázy 2 (IDH2), sukcinát dehydrogenázy (SDH), hydratázu fumarátu (FH) a pyruvát kinasy M2 (PKM2), které mají následný vliv na metabolismus rakoviny. Bylo zjištěno, že aerobní glykolýza a příjem z glutaminu a glycinu umožňují rakovinným buňkám produkci (ATP) potřebné pro tvorbu nukleotidů, aminokyselin a lipidů. Onkogeny způsobují zvýšení buněčné biomasy a usnadňují její růst. Byly nalezeny mutace isocitrát dehydrogenázy (IDH1/2) u zhoubných nádorů rakoviny prostaty, rakoviny tlustého střeva, rakoviny štítné žlázy. Tyto nově nalezené metabolické onkogeny mohou být použité v hledání nových protinádorových způsobů léčení PSA Objevení prostatického specifického antigenu (PSA) Wangem z Roswel Park Memorial Institute v r mělo zásadní vliv na diagnostiku, léčbu a monitorování karcinomu prostaty. V dnešní době patří PSA mezi nejdůležitější tumorové markery v urologické onkologii (Quek, S. I., Ho, M. E. et al. 2012). Přes jeho nesporný význam však není markerem ideálním, a to především pro nedostatečnou schopnost odlišit benigní hyperplazii prostaty (BPH) od Cap (Fukushima, K., Satoh, T. et al. 2010), (Page, S. T., Hirano, L. et al. 2011). PSA má molekulovou hmotnost 28,430 kda a se skládá z 237 aminokyselin a sacharidového řetězce. Z chemického hlediska se jedná o glykoprotein, kódovaný na 19. chromozomu, podílející se na likvefakci spermií, jenž je vylučován epiteliálními buňkami prostaty, jak normálními, tak nádorovými (White, K. Y., Rodemich, L. et al. 2009). PSA se vyskytuje v krvi, z větší části ve formě vázané (85 %) a ve volné

18 formě (fpsa) (Mao, Q. Q., Zheng, X. Y. et al. 2009). Zvýšená hladina PSA v krvi poukazuje na jakékoliv změny stavu prostaty, nejenom zhoubný nádor a také na výskyt benigní hyperplazie (Jiang, Y. Q., Cheng, X. L. et al. 2010). Za bezvýznamnou hladinu PSA v krvi mužů se považuje 0-4 ng.ml -1. V tabulce 1 jsou ukázané pozitivní a prediktivní hodnoty PSA. PSA PPV pro karcinom prostaty (ng/ml -1 ) 0-1 2,8-5% 1-2,5 10,5-14% 2, % % >10 69% PPV = pozitivní prediktivní hodnota (positive predictive value); PSA = prostatický specifický antigen Tabulka 1: Tabulka pro předpověď rizika pro karcinom prostaty na základě zjištěné hodnoty PSA dle údajů EAU Guidelines (European Association of Urology). Je zde patrné, že se stoupajícími hodnotami PSA se zvyšuje riziko onemocnění karcinomem prostaty. Hladina PSA stoupá ve vztahu k narůstajícímu věku, a taktéž poměru volného a vázaného PSA (fpsa) (Astigueta, J. C., Abad, M. A. et al. 2010; Song, L. M., Zhu, Y. C. et al. 2011) Glycin jako marker karcinomu prostaty Metabolismus syntézy aminokyselin popřípadě jejich modifikací je nádorovým onemocněním zcela jistě ovlivněn, jak ukazuje práce publikována v časopise Biological Chemistry, která odhalila významnou roli glycinu - N-methyltransferasy (GNMT) v nádorovém metabolismu karcinomu prostaty (Mukherjee, S., Cruz-Rodriguez, O. et al. 2012). Bylo zjištěno, že GNMT má podíl na metabolismu methioninu, stejně jako v glukoneogenezi. Avšak jeho konkrétní funkce v karcinogenezi není dosud zcela prostudována, jak naznačují výsledky publikované ve studii Hakimi,J. M. (1997) et al. Důležitou roli ve vývoje karcinomu prostaty hraje receptor pro androgen, obsahující glycin, který byl detekován ve vyšších koncentracích u pacientů s karcinomem prostaty (Hakimi, J. M., Schoenberg, M. P. et al. 1997). Ve studii, kterou publikoval Song et al

19 byly zkoumány účinky glycinu na buněčnou proliferaci a cyklus rakovinných buněk (Song, Y. H., Shiota, M. et al. 2011). Byl tedy prokázán vliv GNMT při podpoře růstu prostatických rakovinných buněk prostřednictvím regulace apoptózy a k progresi karcinomu prostaty (Huang, Y. C., Lee, C. M. et al. 2007). Modulace funkce GNMT může být zvolena jako nová strategie pro rozvoj nových léčiv rakoviny prostaty, stejně tak jako GNMT může představovat nový nádorový marker maligní progrese karcinomu prostaty (Song, Y. H., Shiota, M. et al. 2011). Dále byly prostudovány mechanismy, které koordinují chování kmenových buněk in vivo pomocí kanálu receptoru pro glycin chloridu v nativním stavu (GlyCl) (Blackiston, D., Adams, D. S. et al. 2011). Výsledky této studie prokázaly, že receptor GlyCl může sloužit jako molekulární marker nádorových onemocnění Methionin Metabolity methioninu mohou sloužit jako biomarkery agresivní formy karcinomu prostaty. Zvýšený obsah cysteinu, cystathioninu, a homocysteinu ve vzorcích séra a moči signalizovaly první tři prediktory recidivy u 70 % pacientů, takže další analýza metabolitů methioninu byla zaměřena na tyto tři metabolity (Stabler, S., Koyama, T. et al. 2011). Z literatury je známo, že žádná předchozí studie nekorelovala úplně s metabolickými cestami agresivity rakoviny. Ve studii (Stabler, S., Koyama, T. et al. 2011) bylo provedeno srovnání mezi pacienty s prokázanou diagnózou karcinomu prostaty. Zvýšené koncentrace homocysteinu, cystathioninu, a cysteinu ve vzorcích séra a moči pacientů s Cap zlepšily přesnost v současné době používaných klinických markerů. Bylo navrženo větší využití methylových skupin, jako markerů karcinomu prostaty prostřednictvím enzymu Glycin N- methyltransferázy (Stabler, S., Koyama, T. et al. 2011). 3.3 Sarkosin Sarkosin s chemickým vzorcem CH 3 NHCH 2 COOH byl poprvé izolován a pojmenován německým chemikem Justusem von Liebigem v roce Z chemického hlediska se jedná o přírodní, netoxickou a bezbarvou pevnou látku, která je dobře rozpustná ve vodě (Sreekumar, A., Poisson, L. M. et al. 2009). Sarkosin chemicky N-methylglycin je methylderivát glycinu (Jamaspishvili, T., Kral, M. et al. 2010), který vzniká v lidském

20 organizmu jako meziprodukt metabolismu cholinu na glycin (Struys, E. A., Heijboer, A. C. et al. 2010). V roce 2009 byla v prestižním časopise Nature uveřejněná studie, která naznačuje významnou roli sarkosinu u nádorových buněk (Sreekumar, A., Poisson, L. M. et al. 2009). Zároveň je diskutována možnost využití sarkosinu jako markeru raných stádií vývoje karcinomu prostaty (Armstrong, A. J., Eisenberger, M. A. et al. 2012). Velmi důležité je i to, že v moči zdravých pacientů není přítomen vůbec nebo ve velmi zanedbatelných koncentracích. Tím se snižuje riziko falešně pozitivních a falešně negativních výsledků. Vědecká obec je však v tvrzení ohledně vhodnosti sarkosinu jako markeru nejednotná. I přes potvrzení, že sarkosin je zapojen do metabolismu aminokyselin a metylačních procesů, které probíhají během progrese nádorových onemocnění prostaty (Cavaliere, B., Macchione, B. et al. 2011), se objevují publikace, které přímo vyvracejí spojení sarkosinu jako markeru se zhoubnými nádory (Jentzmik, F., Stephan, C. et al. 2010; Schalken, J. A. 2010) Metabolismus sarkosinu Metabolismus se jeví jako klíčová vlastnost, která odlišuje benigní buňky od nádorových tkání (Metallo, C. M. 2012). Metabolity dodávají zásadní význam pro pochopení biologických reakcí a následně přispívají k rozvoji diagnostických a léčebných metod pro konkrétní onemocnění (Burton, C., Gamagedara, S. et al. 2012). Biochemické dráhy tvorby a oxidace sarkosinu můžeme popsat jako dvě základní (Obr. 3). Na první dráze je fosfatidylethylamin opakovaně methylován pomocí S-adenosylmethioninem až na fosfatidylcholin za výtěžku betainu, který je následně přeměněn na sarkosin pomocí enzymu homocystein methyltransferasy (BHMT). Na další dráze, je sarkosin formován při transformaci methylové skupiny S-adenosylmethioninu na glycin za účasti enzymu glycin methyltransferázy (GNMT) (Mitchell, A. D. and Benevenga, N. J. 1976). Nadbytek sarkosinu způsobuje sarcosinemii, která se projevuje poměrně vysokými koncentracemi sarkosinu v krvi a moči díky nedostatku mitochondriálního flavoenzymu sarkosin dehydrogenázy, který se podílí na oxidativní degradaci cholinu na glycin (Bergeron, F., Otto, A. et al. 1998)

21 Fosfatidylethylamin Fosfatidylcholin Betain Methionin Serin S-adenosylmethionin S-adenosylhomocystein GNMT Dimethylglycin Glycin Sarkosin BHMT Jednouhlíkatý štěp H O CO 2 H 3 C N O H Obrázek 3: Biochemické dráhyy tvorby a oxidace sarkosinu 3..4 Metody detekce sarkosinu V poslední době stoupá s zájem o neinvazivní markery nádorových onemocnění, stanovené v moči. Za jeden ze slibných markerů je považována aminokyselina sarkosin (Sreekumar, A., Poisson, L. M. et al. 2009), (Jamaspishv vili, T., Kral, M. et al. 2010). Dle databáze Web of Knowledge se od roku 2009 zvýšit počet publikací pro analýzu sarkosinu o 30% (Obr. 4A) a zároveň roste i počet citací od roku 2009 (Obr. 4B) Obrázek 4: A) Publikace o sarkosinu od roku B) ) Počet citací za roky Vzhledem k perspektivitě sarkosinu jako nádorovéhoo markeru jsou neustále vyvíjenyy nízkonákladové a citlivé metody, které by mohly být do budoucna využity pro screeningové vyšetření rakoviny prostaty. Význam máá předevšímm stanovení sarkosinu v moči. Jilang et.al. popsal stanovení sarkosinu ve vzorcích močii pomocí kapalinové chromatografie v tandemu s hmotnostní spektrometrií (Jiang, Y. Q., Cheng, X. L. et al

22 2010). Limit detekce byl stanoven na 0,05-4 nmol.l -1, při koncentraci analytu 0, MU mol.l -1. Tuto metodu také využil Jenzmik et al. pro stanovení sarkosinu v moči pacientů s rakovinou prostaty (Jentzmik, F., Stephan, C. et al. 2011). Pro analýzu sarkosinu byla také využita izotopová plynová chromatografie (ID GC) v tandemu s hmotnostní spektrometrií (MS) po derivatizaci vzorků pomocí mikrovlnného zařízení (MAD) (Wu, H., Liu, T. T. et al. 2011). Dále bylo popsáno využití mikroextrakce vzorků moči na pevné fázi (SPME) s následnou analýzou pomocí plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií s limitem detekce 0,1 ng.ml -1 (Cavaliere, B., Macchione, B. et al. 2011). Výše popsaná metoda tak může byt použita při screeningových vyšetřeních karcinomu prostaty. Ve vzorcích moči, krevního séra a tkání pacientů s rakovinou prostaty Isaac et al. porovnal plynovou chromatografii s hmotností detekcí (GC/MS), vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii v tandemu s hmotnostní spektrometrií (HPLC/MS), kapilární elektroforézu s hmotnostní spektrometrií (CE/MS) a ultra-vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (UHPLC) (Issaq, H. J., Waybright, T. J. et al. 2011). Mimo separační metody byla také popsána Miccroaray metoda pro analýzu sarkosinu ze vzorků moči (Jamaspishvili, T., Kral, M. et al. 2010). Literatura se také zmiňuje o stanovení sarkosinu v krevním séru u pacientů s Cap pomocí kapalinové chromatografie v tandemu s hmotnostní spektrometrií (MS) s limitem detekce 2 ng.ml -1 (Meyer, T. E., Fox, S. D. et al. 2011). V další publikované studii byla využita plynová chromatografie (GC) s hmotnostní spektrometrií (MS). Výsledky byly porovnány s hladinou prostatického specifického antigenu (PSA) (Bohm, L., Serafin, A. M. et al. 2012). Koncentrace sarkosinu ve vzorcích séra u kontrolní skupiny byla v rozmezí od 1,7 MU mol.l -1 do 4,8 MU mol.l -1 a u pacientů s rakovinou prostaty v rozmezí od 2,8 MU mol.l -1 do 20,1 MU mol.l -1. Získané výsledky však naznačují, že sarkosin ve vzorcích krevního séra není vhodný marker karcinomu prostaty Iontově - výměnná kapalinová chromatografie s VIS detekcí Díky amfolytickým vlastnostem aminokyselin je pro jejich separaci vhodné použít iontově výměnnou kapalinovou chromatografii, kde se využívá separace na základě rozdílného náboje mezi aminokyselinou a stacionární fází, která je tvořena většinou katexem (Cernei, N., Zitka, O. et al. 2012). Jak je známo z literatury, isoelektrický bod dané aminokyseliny je hlavním faktorem, který určuje retenci aminokyselin (Wilkins, M

23 R. and Williams, K. L. 1997). Pro stanovení obsahu sarkosinu lze využít iontověvýměnnou kapalinovou chromatografii s postkolonovou derivatizací ninhydrinem při reakční teplotě 120 C. Tento systém je zobrazen na Obr. 5A. Ninhydrinové činidlo reaguje s primární aminoskupinou, následně vzniká purpurově zbarvený komplex (Ruhemanová červeň). Probíhá kondenzační reakce, při které se uvolňuje amoniak, oxid uhličitý, aldehyd, který je kratší o jeden uhlík, než původní struktura aminokyseliny a hydrindatin. (Obr. 5B). A PC program: Chromulan VIS detektor odpad Reakční spirála v reaktor Ninhydrin Pufr Průtok Chromatografické pumpy směšovací komora Chromatografická Nástřikový ventíl kolona B O OH OH O Ninhydrin O O O + H NH N + + OH CO 2 O O O Sarkosin Ruhemannova červeň Acetaldehyd Obrázek 5 A) Schéma instrumentace HPLC-VIS detekcí B) Schéma reakce ninhydrinu se sarkosinem. Díky hydrindatinu v detekčním činidle nevzniká vedlejší reakce, která by redukovala purpurově zbarvený komplex (Ruhemanovou červeň) (Yemm, E. W. and Cocking, E. C. 1955). Detekce probíhá při vlnové délce 570 nm, při které má barevný komplex absorpční maximum. Při kondenzační reakci se sekundárními aminokyselinami (prolin a hydroxyprolin) vzniká barevný komplex (Žlutý chromofor) a měření probíhá při vlnové délce 440 nm, kvůli vlivu absorbance nezreagovaného ninhydrinu. Pomocí reakce aminokyselin s ninhydrinem je možné detekovat všechny organické sloučeniny, které obsahují aminokyseliny (LeBoucher, J., Charret, C. et al. 1997). LeBoucher et al. stanovil obsah aminokyselin serinu, citrulinu, tyrozinu, v lidském krevním séru pomocí reakce aminokyselin s ninhydrinem (LeBoucher, J., Charret, C. et al. 1997).Ve studii Iwase,H., et

24 al. byl stanoven obsah 25 aminokyselin ve vzorcích lidské krevní plazmy pomocí ionexové kapalinové chromatografie s postkolonovou ninhydrinovou derivatizací, s průměrnou výtěžnosti vyšší než 90 % (Iwase, H., Ozawa, S. et al. 1995) Elektrochemické metody pro detekci sarkosinu Elektrochemické instrumentální metody vynikají snadnou instrumentací, nízkými provozními náklady, možností miniaturizace a vysokou senzitivitou a selektivitou. Elektrochemické metody jsou založené na změně struktury povrchu pracovní elektrody a analytu, což vede ke zvýšení citlivosti (Sezginturk, M. K. and Dinckaya, E. 2011). Dobrou odolnost s dostatečnou citlivostí zajišťují porézní grafitové elektrody, které jsou vhodné pro elektrochemickou detekci ve spojení s kapalinovou chromatografií (Micheli, L., Radoi, A. et al. 2004). Ve studii (Zhou,Y. et.al.) bylo provedeno stanovení enzymu sarkosinoxidázy pomocí přímé elektrochemie na skleněných uhlíkových elektrodách, byl stanoven limit detekce 1,0 MU M (Zhou, Y. L., Yin, H. S. et al. 2012). Výhodou elektrochemických metod v porovnání se spektrofotometrickými metodami, je vetší přesnost, kratší doba analýzy a minimální nároky pro přečištění vzorku (Micheli, L., Radoi, A. et al. 2004; Damiani, P. C., Moschetti, A. C. et al. 2005). Možnost miniaturizace elektrochemických průtokových metod poskytuje průtoková injekční analýza (Flow Injection Analysis - FIA). Tato metoda je založena na nástřiku vzorku do plynulého proudu reagentů (Ruzicka, J. and Hansen, E. H. 1975). Instrumentace pro FIA je podobná jako pro výše popsanou kapalinovou chromatografii, rozdílem ale je, že v systému není přítomna chromatografická kolona. FIA, na rozdíl od ostatních elektrochemických metod vyniká jednoduchostí instrumentace, možnosti automatizace a miniaturizace. K detekci aminokyselin pomocí FIA se jako pracovní elektrody nejvíce využívají skelno-uhlíkové nebo grafitové elektrody (Cernei, N., Zitka, O. et al. 2012) Spektrofotometrické metody pro stanovení sarkosinu Spektrofotometrie je jednou z nejpoužívanějších biochemických metod sloužících ke stanovení koncentrace látek na základě měření různé absorbance elektromagnetického záření, v určitém souvislém rozsahu vlnových délek, daných vzorků (BAPNA, MAYANK). Mezi přednosti této metody patří přesnost, citlivost a velké spektrum

25 detekovaných látek. Stanovení aminokyselin pomocí derivatizačního činidla ninhydrinu je jednou z nejpoužívanějších metod (Fitzpatrick, W. H. 1949). Je známo, že nejvyšší výnos derivatizační reakce s ninhydrinem byl dosažen u amino skupin v rozmezí od 400 až 800 nm (Cernei, N., Zitka, O. et al. 2012). Reakce ninhydrinu s aminokyselinami byla také využita pro stanovení cysteinu z jater, krve a mozku potkanů (Gaitonde, MK 1967). V literatuře je také popsáno využití kapilární elektroforézy s UV detekcí pro stanovení sarkosinu. Získané výsledky byly také porovnány s plynovou chromatografií s hmotností detekcí (Bianchi, F., Dugheri, S. et al. 2011)

26 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Chemikálie Kyselina citronová, citrát sodný, ninhydrin, NaCl, SnCl 2 a dithioglykol byly získání od firmy (Ingos, Česká republika) a PBS od firmy (Invitrogen, USA). Kyty pro stanovení antioxidační aktivity, sarkosin, EDTA, uracil, kyselina močová, glycin, prolin, cystein, homocystein, kyselina fosforečná, kyselina octová, kyselina boritá, NaH 2 PO 4 a Na 2 HPO 4 v ACS čistotě byly získány od firmy Sigma Aldrich (USA). Médium RPMI 1640, médium HAM S F12, fetální bovinní sérum, penicilin/streptomycin, trypsin byly zakoupeny od firmy PAA (Rakousko). Další chemikálie potřebné na přípravu kultivačních médií byly zakoupeny od firmy Duchefa (Holandsko). Kyt pro izolaci RNA a syntézu cdna byly zakoupeny od firmy Roche (Švýcarsko). Monoklonální myší protilátka proti MT a polyklonální králičí protilátka proti PSA byly získány od firmy Santa Cruz Biotechnology (USA) a ELISA kyt pro stanovení caveolinu-1 byl zakoupen od firmy USCN (Čína). Pracovní roztoky byly připravovány denně ředěním zásobních roztoků. Hodnoty ph byly měřeny s použitím WTW inolab Level 3 (Weilheim, Německo), spojeným s osobním počítačem (Něměcko). ph-elektroda (SenTix-H, WTW) byla pravidelně kalibrována souborem WTW pufrů. Všechny roztoky byly před analýzou filtrovány přes teflonový filtr 0,45 μm MetaChem (USA). Voda byla demineralizována pomocí reverzní osmózy na přístrojích Aqua Osmotic 02 (Aqua Osmotic, Česká republika) a dále čištěna pomocí Millipore RG (Millipore Corp., USA). 4.2 Biologický materiál Vzorky moči pacientů Pro analýzu sarkosinu bylo použito celkem 55 vzorků mužské moči; 23 kontrolních vzorků a 32 vzorků od pacientů s nádory prostaty (z Urologické kliniky FN U sv. Anny). Všechny biologické vzorky byly použity se souhlasem etické komise Lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně. Kontrolní vzorky byly získány od dobrovolníků Mendelovy univerzity v Brně

27 4.2.2 Prostatická linie buněk PC3 Pro analýzu sarkosinu byly použity buněčné lyzáty prostatické buněčné linie PC3 (byly odvozeny od 4. úrovně metastáze adenokarcinomu prostaty) připravených v laboratořích lékařské fakulty Masarykovy univerzity. Buňky byly pěstovány v živném médiu RPMI-1640 obohaceném o 7% FBS a antibiotika (penicilin, streptomycin). Uchovávány byly v Termoboxu při teplotě 37 C s 5% přísunem CO 2. Po prvním dosažení 50 až 60% konfluence došlo k výměně média. Po zhruba 24 hodinách od této výměny bylo médium opět vyměněno, tentokrát však bylo nové médium obohaceno o 10, 150, 250, 500, 1000, 1500 µm koncentrace sarkosinu. Buňky byly inkubovány po dobu 0, 6, 12, 24 a 72 hodin. Od tohoto rozdělení došlo k 80 90% konfluenci a buňky již byly připraveny k závěrečné sklizni. Kvůli zlepšení detekce vázaného sarkosinu byly vzorky buněk podrobeny mineralizaci v mikrovlnném zařízení (MW Anton Paar). Ke vzorku buněk (300 µl) bylo následně přidáno 300 µl 6 M HCl, mineralizace probíhala po dobu 90 minut (Výkon -80 W, zvyšování teploty -15 minut, délka trvání-90 minut, maximální teplota- 120 C, tlak - 25bar, Rotor-XF-100-6). Po mineralizaci bylo odebráno 100 µl vzorku, ke kterému bylo následně přidáno 300 µl ředícího pufru sodíkového cyklu (C 6 H 8 O 7 (14 g), N 3 Na 0,10 g, NaCl 11,50 g / 1 l H 2 O). Měření probíhalo pomoci aminoanalyzátoru AAA- 400 (Ingos ČR). 4.3 Přístroje Průtoková injekční analýza s elektrochemickou detekcí HPLC-ED systém Model 582 ESA (ESA Inc, Chelmsford, USA) byl složen ze dvou chromatografických pump (pracovní rozsah 0,001-9,999 ml min -1 ) a CoulArray elektrochemického detektoru (Model 5600A, ESA, USA), pracovní rozsah ml min -1 ) a dvanácti-kanálového Coul Array elektrochemického detektoru (Model 5600A, ESA, USA). Detektor byl složen ze tří průtočných analytických komůrek (Model 6210, ESA, USA). Každá komůrka obsahovala čtyři analytické cely. Jedna analytická cela obsahovala dvě referentní (hydrogen paladiové), dvě pomocné a jednu porézní grafitovou pracovní elektrodu. Elektrochemický detektor byl uložen v řídícím modulu, jehož celý prostor byl termostatován. Průtok mobilní fáze byl 1 ml min -1. Vzorek (5 µl) byl aplikován

28 pomocí ručního ventilu (Rheodyne, USA). Průtok mobilní fáze byl 1 ml.min -1. Detekce separovaných látek probíhala při aplikovaných potenciálech mV Iontově - výměnná kapalinová chromatografie s VIS detekcí Separace aminokyseliny sarkosinu byla provedena pomocí vysokoúčinné iontověvýměnné kapalinové chromatografie s VIS detekcí. Byl použit kapalinový chromatograf AAA 400 (Ingos, Česká republika.). Systém byl složen z náplňové skleněné chromatografické kolony a ocelové předklony, dvou chromatografických pump pro dopravu elučních pufrů a derivatizačního činidla, chlazeného karuselu pro 25 zkumavek o objemu 1,5-2 ml, dávkovacího ventilu, tepelného reaktoru, VIS detektoru a chlazeného zásobníku pro derivatizační činidlo. Skleněná chromatografická kolona s vnitřním průměrem 3,7 mm a délkou 350 mm byla naplněna silným katexovým ionexem v sodíkovém cyklu LG ANB (laboratoř při Spolku pro chemickou a hutní výrobu) s průměrnou velikostí částic 12 µm a sítěním 8 %. Skleněná kolona byla temperována termostatem pracujícím v rozsahu C. Předkolona byla plněna ionexem LG KS0804. Chromatografické pumpy pro dopravu elučních pufrů a derivatizačního činidla mohou pracovat při průtoku 0,01-10 ml.min -1 při nejvyšším tlaku 40 MPa. Objem nástřikové smyčky byl 100 µl při přesnosti nástřiku RSD 1 %. Dvoukanálový VIS detektor s objemem průtočné kyvety 5 µl pracoval při vlnových délkách 440 a 570 nm. Jako derivatizační činidlo byl použit roztok ninhydrinu (Ingos, Česká republika.). Nynhydrin byl rozpuštěn v 75% v/v organickém rozpouštědle metylcelosolve (Ingos, Česká republika) a v 25 % v/v 4 M acetátovém pufru (ph 5,5). K redukci byl použit SnCl 2. Derivatizační činidlo bylo po celou dobu uchováno pod inertní atmosférou N 2 a chlazeno. Eluce aminokyselin probíhala podle programu skokovým gradientem elučních pufrů o různé iontové síle a ph, a také gradientem teploty. Při analýze byl průtok mobilní fáze nastaven na 0,3 ml.min -1 a tlak se pohyboval v rozmezí 4,5-6 MPa. Teplota na reaktoru byla nastavena na 120 C Adsorptivní přenosová technika (AdTS) Stanovení koncentrace metalothioneinu bylo provedeno pomocí adsorptivní přenosové techniky (AdTS) s diferenční pulzní voltametrií (DPV). K analýze bylo odebráno 200 µl vzorku supernatantu, smícháno s 1800 µl Brdičkova činidla v měrné nádobce a následně

29 provedeno samotné elektrochemické stanovení pomocí klasického tříelektrodového zapojení. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm 2, referenční elektrodou byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou platinová elektroda. Základní elektrolyt (1 mmol.l -1 [CO(NH 3 )6]Cl 3 a 1 mol.l -1 a amonný pufr; NH 3 (aq) + NH 4 Cl, ph 9,6) byl pro každý měřený vzorek vyměněn. Parametry DPV byly: počáteční potenciál 0,7 V, konečný potenciál 1,75 V, probublávání 5 s, čas deposice 240 s, modulační čas 0,05 s, intervalový čas 0,25 s, potenciálový krok 0,00105 V, rychlost scanu 0,0042 V/s, modulační amplituda 0,02505 V. Měření bylo provedeno v automatickém systemu skládající se z autosampleru 695 Autosampler (Metrohm, Švýcarsko) propojeném s měřící jednotkou VA Stand 693 (Metrohm, Švýcarsko) a řízené pomocí řídící jednotky 693 VA TraceAnalyser (Metrohm, Švýcarsko). Celá měřící soustava byla chlazena na 4 C pomocí chladící oběhové soustavy Julabo F25 (Julabo, Německo). Získané voltamogramy byly exportovány do programu VA Database 2.2 (Metrohm, Švýcarsko). Analyzované vzorky byly zbaveny kyslíku pomocí aktivního probublávání argonu o čistotě 99,999 % Spektrofotometrická analýza: Specord Pro spektrofotometrickou analýzu byl použit UV-VIS spektrofotometr Specord (Jena Analytic, Německo). Spektrofotometr byl vybaven pohyblivým karuselem s osmi pozicemi pro kyvety. Byly použity plastové kyvety (Kartel, Itálie) o optické dráze 1 cm a celkovém objemu 1,5 ml (Microcuvette Kartell, Itálie). Karusel byl temperován na požadovanou teplotu v rozmezí C pomocí průtokového termostatu JULABO F12/ED (Labortechnik GmbH, Německo), kde jako tepelné médium sloužila destilovaná voda. Rozsah vlnových délek pro skenování byl nastaven na nm Spektrofotometrická analýza: BS-400 Byl použit automatický spektrofotometr BS 400 (Mindray, Čína), který byl složen z kyvetového prostoru (temperovaný na 37±0,1 C), reagenčního prostoru s karuselem pro reagencie a přípravu vzorků (temperovaný na 4±1 C) a optického detektoru. Zdrojem světla byla halogeno-wolframová žárovka. Přenos vzorků a reagencí zabezpečuje robotické rameno s dávkovací jehlou. Obsah kyvet byl promíchán automatickým míchadlem ihned

30 po přidání činidla nebo vzorku o objemu 2-45 µl. Kontaminace byla minimalizována díky proplachování jak dávkovací jehly, tak míchadla MilliQ vodou. Zařízení bylo plně kontrolováno softwarem BS400 (Mindray, Čína). Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody ABTS Do plastových kyvet bylo pipetováno 150 µl reagencie R1 (7 mm ABTS (2,2 azinobis 3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonová kyselina a 4,95 mm peroxodisíran draselný), následně bylo přidáno 3 µl vzorku. Absorbance byla měřena při λ = 660 nm po dobu 12 minut. Pro výpočet bylo použito hodnoty absorbance po přidání vzorku (2. minuta měření) a hodnoty absorbance po 12 minutách. Stanovení antioxidační aktivity pomocí DPPH testu Do plastových kyvet bylo pipetováno 150 µl reagencie R1 (0,095 mm 2,2-difenyl-1- pikrylhydrazyl- DPPH ), následně bylo přidáno 15 µl měřeného vzorku. DPPH test je založen na schopnosti stabilního volného radikálu 2,2-difenyl-1 pikrylhydrazylu reagovat s donory vodíku. DPPH vykazuje silnou absorpci v UV-VIS spektru. Absorbance byla měřena 12 minut při λ = 505 nm. Pro výpočet bylo použito hodnoty absorbance samotné a hodnoty absorbance po 12 minutách. Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody DMPD Do plastových kyvet bylo pipetováno 160 µl reagencie R1 (200 mm N, N-dimethyl-pfenylendiamin-DMPD, 0,05 M FeCl 3, 0,1 M acetátový pufr ph 5,25), následně bylo přidáno 4 µl měřeného vzorku. Absorbance byla měřena 12 minut při λ = 505 nm. Pro výpočet bylo použito hodnoty absorbance samotné a hodnoty absorbance po 12 minutách. Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody FRAP 1. roztok: 10 mm TPTZ, byl smíchán s 40 mm kyselinou chlorovodíkovou (HCl); 2. roztok 20 mm FeCl 3 ; 3. roztok acetátový pufr 20 mm, ph 3.6; tyto tři roztoky byly smíchány v poměru TPTZ: FeCl 3 : acetátový pufr 1:1:10. Reagencie byly použitelné týden při uskladnění v temném prostředí a teplotě 4 C. Pro analýzu bylo do plastových kyvet pipetováno 150 µl reagencie a následně byly přidány 3 µl vzorku. Absorbance byla

31 měřena 12 minut při λ = 605 nm. Pro výpočet bylo použito hodnoty absorbance samotné a hodnoty absorbance po 12 minutách. Stanovení celkových proteinů pomocí pyrogalové červeně (Skalab test) Do plastových kyvet bylo pipetováno 150 µl směsi reagencií R1+R2 v poměru 1:1 (50 mm kyselina jantarová, 3,47 mm benzoan sodný, 0,06 mm molybdenan sodný, 1,05 mm šťavelan sodný a 0,07 mm pyrogalová červeň) pro stanovení bílkovin pomocí pyrogalové červeně. Následně bylo přidáno 8 µl měřeného vzorku. Po 10 min inkubace při 37 C byla změřena absorbance při vlnové délce λ = 605 nm. Pro výpočet bylo použito hodnoty absorbance samotné reagencie a hodnoty absorbance po 10 minutové inkubaci se vzorkem

32 5 VÝSLEDKY A DISKUSE Markery, které se běžně používají pro screeningové vyšetření karcinomu prostaty, nejsou dosud dostačující (senzitivita 80 %) a většinou se také jedná o invazivní diagnostické metody. V současné době stoupá zájem o neinvazivní markery rakoviny prostaty, které by byly detekovatelné v moči pacientů. V této práci byl studován neinvazivní potencionální nádorový marker rakoviny prostaty - aminokyselina sarkosin. Zároveň byly studované i další potencionální nádorové markery rakoviny prostaty jako caveolin-1, metalothionein a prostatický specifický antigen, který se již běžně používá v klinické diagnostice. Pomocí ionexové chromatografie byly studovány interakce aminokyseliny sarkosin s jinými látkami, které mohou způsobit rušivý vliv v takové složité matrici jako moč, a tak mohou snižovat limit detekce a limit kvantifikace. První oblastí, která je v této práci studována, je z oblasti medicínské diagnostiky, přesněji studium nádorových markérů na úrovní prostatické buněčné linie a vliv přídavků sarkosinu na nádorové prostatické buňky Prostatický specifický antigen, metalothionein a caveolin-1 jako markery vzniku a rozvoje karcinomu prostaty a Effect of sarcosine on antioxidant parameters and metallothionein content in the PC-3 prostate cancer cell line (vědecké články I- II). Druhou studovanou oblastí je analytická chemie a biochemie, která se zabývá studiem interakce aminokyseliny sarkosin s látkami, které obsahuje reální vzorek moči. Dále byly optimalizovány postupy pro detekci a separaci sarkosinu - pomocí elektrochemických metod, ionexové chromatografie a spektrofotometrie. Výsledky studia jsou shrnuty ve třech vědeckých článcích Spectrometric and Electrochemical Analysis of Sarcosine as a Potential Prostate Carcinoma Marker, Determination of sarcosine as possible tumour marker of prostate tumours a Sarkosin v moči pacientů se zhoubným nádorem prostaty (vědecké články III-IV)

33 5.1 Studium obsahu sarkosinu a ostatních markérů na úrovni buněčných linií Vědecký článek I Prostatický specifický antigen, metalothionein a caveolin-1 jako markery vzniku a rozvoje karcinomu prostaty Markéta Sztalmachová, Jaromír Gumulec, Natalia Cernei, Marian Hlavna, Ondřej Zítka, Petr Babula, Vojtěch Adam, René Kizek a Michal Masařík. Chemické listy,106, ,(2012), 6 stran, IF 0,529 Podíl autorky Cernei N.: 40 % textové části práce a 60% experimentální části práce. Pokrok v diagnostice rakoviny prostaty umožnil vývoj metod, které jsou schopny detekovat agresivní formy onemocnění již v raných stádiích. V tomto experimentu jsou popsány metody detekce potencionálních nádorových markerů caveolinu-1 a metalothionenu. Získané výsledky byly porovnány s hladinou PSA, který je uznávaným markerem rakoviny prostaty (Cap). Zmiňované markery byly detekovány na proteinové úrovni a na úrovni mrna ve třech typech prostatických buněčných linií. V naší studii bylo prokázáno, že metallothionein a caveolin-1 jsou slibnými markery agresivní formy rakoviny prostaty. Nejprve byl v lyzátech buněčných linií stanoven PSA s limitem detekce stanovení 1 nm. Na proteinové úrovni byl PSA signifikantně zvýšen pouze u nádorové linie 22Rv1(36,2 ±0,1 ng.ml 1 proti 0,053 ±0,008 ng.ml 1 u PNT1A), což potvrzuje úlohu tohoto proteinu jako markeru onemocnění. U linie PC-3 bylo zjištěno nesignifikantní zvýšení hladiny PSA na hodnotu 0,069 ±0,005 ng.ml 1. Pro stanovení caveolinu-1 byl stanoven limit detekce 0,2 ng.ml 1. Hladina caveolinu-1 na proteinové úrovni byla u obou nádorových linií snížena, přičemž u linie odvozené z primárního tumoru (22Rv1) bylo toto snížení významnější (50násobně, P < 0,001), než u linie PC-3 (hraničně signifikantní snížení na P = 0,05). Trend tohoto zjištění (výrazné snížení u 22Rv1 a hraničně signifikantní změnau PC-3) je ve shodě s trendem pozorovaným na úrovni mrna

34 Z dosažených výsledků vyplývá, že hladina metalothioneinu na proteinové úrovni byla zvýšena u linie PC-3 (48,53 µg.ml 1 celkového proteinu oproti 40,28 µg.ml 1 u kontroly, P < 0,05), u linie 22Rv1bylo popsáno statisticky významné (P = 0,04) snížení na hladinu 31,96 µg.ml 1.Tato zjištění jsou ve shodě s hladinou mrna a korelují také s předchozími výsledky. Již dříve jsme publikovali, že izoforma metalothioneinu 2A je pro prostatickou tkáň výrazně dominantní a proteinová hladina MT opisuje stejný trend právě jako tato izoforma. Metalothionein díky jeho unikátní struktuře byl detekován pomocí separace paramagnetickými částicemi a následné elektrochemické detekce. Metalothionein i caveolin-1 vykazují stejné trendy na úrovni mrna a proteinu snížení hladiny u primárního nádoru a výrazné zvýšení u metastatické linie PC-3. Oba geny jsou tedy signifikantně zvýšeny až u agresivní formy onemocnění. Praktickou použitelnost je však nutné ověřit studiemi na reálných bioptických vzorcích

35 Chem. Listy 106, (2012) Laboratorní přístroje a postupy PROSTATICKÝ SPECIFICKÝ ANTIGEN, METALOTHIONEIN A CAVEOLIN-1 JAKO MARKERY VZNIKU A ROZVOJE KARCINOMU PROSTATY MARKÉTA SZTALMACHOVÁ a,b *, JAROMÍR GUMULEC a, NATALIA CERNEI b,c, MARIAN HLAVNA a, ONDŘEJ ZÍTKA b,c, PETR BABULA d, VOJTĚCH ADAM b,c, RENÉ KIZEK b,c a MICHAL MASAŘÍK a,c a Ústav patologické fyziologie, Lékařská fakulta, Masarykova univerzita Brno, Kamenice 5, Brno, b Ústav chemie a biochemie, Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, Brno, c Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické, Technická 3058/10, Brno, d Ústav přírodních léčiv, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita, Palackého 1-3, Brno masarik@med.muni.cz Došlo , přijato Rukopis byl zařazen k tisku v rámci placené služby urychleného publikování. Klíčová slova: karcinom prostaty, metalothionein, prostatický specifický antigen, caveolin-1 Úvod Karcinom prostaty je druhým nejčastěji se vyskytujícím nádorovým onemocněním u mužů 1 3 a jeho incidence roste se vzrůstajícím věkem pacientů, kdy se toto onemocnění objevuje téměř u každého muže staršího osmdesáti let. K detekci onemocnění se v praxi používá stanovení prostatického specifického antigenu (PSA) v séru pacientů. Díky zavedení tohoto markeru do praxe stoupá počet záchytu tohoto onemocnění, mortalita však, díky včasné diagnostice, výrazně klesá 4 8. Přes vysoký výskyt tohoto onemocnění karcinom prostaty neohrožuje až v 90 % pacienta na životě 9, protože je známo, že pouze malý podíl nádorů se chová agresivně Dnes používané stanovení PSA v séru nedokáže odhalit, zda pacient trpí agresivní formou onemocnění, nebo u něj probíhá klinicky němá forma nemoci 13,14. Ze statistických studií vyplývá, že téměř 80 % pacientů je léčeno, jako by u nich probíhala agresivní forma nemoci, což snižuje kvalitu jejich života 1. Z tohoto důvodu jsou hledány další markery karcinomu prostaty jako proteiny metalothionein a caveolin-1, pomocí kterých by bylo možné diagnostikovat agresivní formu tohoto onemocnění. Metalothionein (MT) je protein s vysokým obsahem cysteinových aminokyselin a má důležitou roli při přenosu a detoxikaci těžkých kovů Podílí se také na ochraně buněk před oxidativním stresem a má antiapoptické působení Jeho zvýšená hladina byla také pozorována při vzniku některých nádorových onemocnění 18,21,22. Caveolin-1 je protein lokalizovaný v invaginacích buněčné membrány, zvaných calveolae 23. Je zodpovědný za přenos cholesterolu a podílí se na endocytóze. Jeho zvýšená hladina byla pozorována u agresivních forem karcinomu prostaty Cílem naší práce bylo popsat rozdíly mezi zdravou prostatickou tkání, nízce maligním primárním nádorem a agresivní formou onemocnění se schopností metastázovat. Pro naše experimenty byly vybrány geny metalothionein, caveolin-1 a PSA. U těchto genů byla stanovena exprese na RNA úrovni a také na úrovni proteinu u modelových buněčných linií. Experimentální část Chemikálie V našich experimentech byly použity následující chemikálie: médium RPMI 1640, médium HAM S F12, fetální bovinní sérum, penicilin/streptomycin, trypsin, EDTA (PAA, Rakousko), PBS (Invitrogen, Carlsbad), RIPA pufr (Sigma-Aldrich, USA), Hight pure total RNA isolation kit (Roche, Švýcarsko), Transcriptor first strand cdna synthesis kit (Roche, Švýcarsko), monoklonální myší protilátka proti MT, polyklonální králičí protilátka proti PSA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA), ELISA kit pro stanovení caveolinu-1 (USCN, Čína). Buněčné linie K experimentům byly použity tři buněčné linie. Jeden model zdravé prostatické tkáně a dvě nádorové tkáně prostaty. Jako kontrolní linie byla zvolena linie PNT1A, která byla odvozena z prostatické tkáně zdravého 35letého muže. Buněčná linie 22Rv1 je zástupcem primárního nádoru prostaty. Byla získána z xenograftu CWR22 opakovaně pasážovaného na kastrovaných myších. Tato linie je charakteristická vysokým obsahem PSA na proteinové úrovni a její růst je stimulovatelný androgeny. Linie PC-3, která byla odvozena z metastáz bederních obratlů 62 letého mu- *Prezentováno Markétou Sztalmachovou na 15. ročníku celostátní soutěže o nejlepší studentskou vědeckou práci v oboru analytické chemie, O cenu firmy Merck. 1075

36 Chem. Listy 106, (2012) Laboratorní přístroje a postupy že, je zástupcem agresivní formy onemocnění. Tato linie nereaguje na androgeny. Všechny linie byly zakoupeny u HPA Culture Collections (Salisbury, UK). Příprava buněčných lyzátů PSA, MT a caveolin-1 byly stanovány v buněčných lyzátech, které byly získány tepelnou denaturací nebo pomocí RIPA pufru a mechanickou homogenizací. RIPA lyzát byl získán po mechanické homogenizaci buněk se 75 l RIPA pufru a následném doplnění pufrem na celkový objem 200 l. Poté byla mikrozkumavka centrifugována při g a 4 C po dobu 30 min. Supernatant byl použit pro stanovení prostatického specifického antigenu a caveolinu-1. Při přípravě tepelného lyzátu byly buňky homogenizovány se 75 l PBS a doplněny na objem 200 l. Následně byla mikrozkumavka na 15 min vložena do termomixéru (99 C) (cit. 28,29 ). Po denaturaci byla mikrozkumavka centrifugována 30 min při 4 C a g. Supernatant byl použit pro stanovení metalothioneinu. Stanovení exprese genů K izolaci RNA z buněčných linií byl použit High pure total RNA isolation kit (Roche, Švýcarsko). Izolovaná RNA byla přepsána do cdna pomocí Transcriptor first strand cdna synthesis kit (Roche, Švýcarsko) dle pokynů výrobce. Real time PCR analýza byla následně provedena pomocí specifických TaqMan sond pro výše zmíněné geny (ABI Prism 7500, Applied Biosystems, USA). Veškeré analýzy byly prováděny v triplikátech. Stanovení metalothioneinu Pro stanovení metalothioneinu ve vzorku byl před vlastní detekcí zařazen krok separace proteinu z tepelného lyzátu pomocí paramagnetických částic. Paramagnetické částice konjugované s proteinem G (DB-G, 10 l), umístěné v mikrozkumavce, byly dvakrát promyty 100 l PBS. Na povrch mikročástic byla následně navázána polyklonální králičí protilátka proti MT 1A/2A (1 g) a tento komplex byl inkubován 60 min při pokojové teplotě a 800 ot min 1 na třepačce, aby nedošlo k sedimentaci. Mikrozkumavka byla poté umístěna na magnet, supernatant byl odsát a částice s navázanou protilátkou byly promyty 100 l PBS. Po odsátí PBS bylo přidáno 10 l testovaného vzorku a mikrozkumavka byla ponechána při pokojové teplotě 60 min. Mikrozkumavka byla poté opět umístěna na magnet a nanočástice s navázaným proteinem byly třikrát promyty 100 l PBS. K paramagnetickým částicím s navázaným proteinem byl přidán acetátový pufr (ph 4,3) a tento komplex byl inkubován při 70 C 15 min na termomixéru při 800 ot min 1. Poté byl supernatant přenesen do čisté mikrozkumavky pro následné měření diferenční pulzní voltametrií Brdičkovou reakcí 30. K analýze byl použit přístroj 747 VA Stand ve spojení se 746 VA Trace Analyzer a 695 Autosampler (Metrohm, Švýcarsko) ve tříelektrodovém uspořádání. Jako pracovní elektroda byla použita visící rtuťová kapková elektroda (HMDE), plocha kapky je 0,4 mm 2. Jako referenční elektroda byla použita Ag/AgCl/3 M KCl a pomocnou elektrodou byla platinová elektroda. Stanovení probíhalo v základním elektrolytu, který byl měněn po každých 5 měřeních (1 mmol 1 1 [Co(NH 3 ) 6 ]Cl 3 a 1 mol 1 1 a amonný pufr; NH 3 (aq) + NH 4 Cl, ph 9). Počáteční potenciál měření byl 0,7 V a konečný potenciál 1,75 V. Modulační čas 30 ms, časový interval 0,8 s. Potenciálový krok 3 mv, modulační amplituda 25 mv a teplota základního elektrolytu 4 C, která byla dosažena termostatem (Julabo F25, Labortechnik GmbH, Německo). Stanovení prostatického specifického antigenu (PSA) Pro stanovení PSA byla použita enzymoimunologická metoda s využitím automatického analyzátoru AIA 600 II (Tosoh Bioscience, Japonsko). Do testovacího kelímku ST AIA-PACK PSAII (Tosoh Bioscience, Japonsko), obsahující lyofilizované reagencie (12 magnetických mikrokuliček s myší protilátkou anti-psa, 100 l konjugované myší protilátky anti-psa s hovězí alkalickou fosfatázou, 0,1% azid sodný) bylo pipetováno 70 l lyzátu. Následně byl vzorek inkubován při 37 C po dobu 10 min. Nenavázané protilátky byly odstraněny promytím roztokem NaCl. Následně byl přidán fluorogenní substrát (4-methylumbelliferyl fosfát) a pomocí fluorescenční intenzity změřena aktivita enzymu. Stanovení caveolinu-1 K detekci caveolinu-1 bylo použito ELISA kitu (USCN Life Science Inc.). Standard caveolinu-1 (60 ng ml 1 ) dodaný výrobcem byl ředěn v daných intervalech a postup byl kalibrován. Do mikrotitrační destičky bylo pipetováno 100 l vzorku a destička byla inkubována 2 h při 37 C. Po inkubaci bylo přidáno 100 l polyklonální protilátky proti caveolinu-1, která byla konjugována s avidinem (reagencie A), a destička byla 60 min inkubována při 37 C. Poté byl roztok odsát a jamky byly třikrát promyty 350 l promývacím roztokem pro ELISA analýzy (fosfátový pufr, ph 7,4). Následně byl přidán konjugát peroxidasa + biotin (reagencie B) a destička byla inkubována 30 min při 37 C. Jamky byly poté pětkrát promyty 350 l promývacího roztoku, následně bylo přidáno 90 l substrátu a destička byla inkubována min při 37 C ve tmě. Nakonec bylo přidáno 50 l stop reagencie (1,5 M kyselina sírová) a výsledek vyjádřený změnou barvy substrátu byl detegován fotometricky při 495 nm. Vyhodnocení výsledků Výsledky byly statisticky vyhodnoceny v softwaru Statistica 9 (StatSoft, USA). K porovnání hladiny mezi kontrolní a nádorovou skupinou byl použit Studentův 1076

37 Chem. Listy 106, (2012) Laboratorní přístroje a postupy t-test. Hladina významnosti P = 0,05 byla zvolena jako signifikantní. Výsledky a diskuse Stanovení exprese genů U linií PNT1A, 22Rv1 a PC-3 byla stanovena hladina potenciálních markerů karcinomu prostaty, PSA, Cav-1 a MT, na úrovni ribonukleové kyseliny (mrna, obr. 1A, 2A a 3A) a proteinu (obr. 1B, 2B a 3B). Hladina mrna byla vyjádřena jako relativní násobek oproti expresi ve zdravé tkáni. Modelem zdravé tkáně je buněčná linie PNT1A. Hladina exprese genu PSA byla více než dvojnásobně zvýšena u obou nádorových linií 22Rv1 a PC-3 (P < 0,05, obr. 1A). Nádorové linie tak mohou být použity jako vhodný model nádorové tkáně. Hladina caveolinu-1 byla u primárního tumoru (22Rv1) signifikantně nižší (P < 0,001) proti kontrole, u linie PC-3, odvozené z metastázy, byla hladina naopak trojnásobně zvýšena (P < 0,001, obr. 2A). Stejný trend, signifikantní na hladině P < 0,04, byl pozorován také u metalothioneinu třídy 2A (MT2A). U metalothioneinu třídy 1A (MT1A) byla hladina mrna tohoto genu snížena (obr. 3A). Stanovení proteinů Nejprve byl v lyzátech buněčných linií stanoven PSA pomocí enzymoimunologické metody s limitem detekce 1 nm. Na proteinové úrovni byl PSA signifikantně zvýšen pouze u nádorové linie 22Rv1 (36,2 ± 0,1 ng ml 1 proti 0,053 ± 0,008 ng ml 1 u PNT1A), což potvrzuje význam A tohoto proteinu jako markeru onemocnění. U linie PC-3 bylo zjištěno nesignifikantní zvýšení hladiny PSA na hodnotu 0,069 ± 0,005 ng ml 1 (obr. 1B). Pro stanovení caveolinu-1 byl stanoven limit detekce 0,2 ng ml 1. Hladina caveolinu-1 na proteinové úrovni byla u obou nádorových linií snížena, přičemž u linie odvozené z primárního tumoru (22Rv1) bylo toto snížení významnější (50násobně, P < 0,001), než u linie PC-3 (hraničně signifikantní snížení na P = 0,05). Trend tohoto zjištění (výrazné snížení u 22Rv1 a hraničně signifikantní změna u PC-3, obr. 2B) je ve shodě s trendem pozorovaným na úrovni mrna. Výsledky hladiny caveolinu-1 u pacientů potvrdily signifikantní rozdíly v jeho hladině při srovnání s kontrolami. Navíc byly pozorovány signifikantně pozitivní asociace s histologickým stupněm onemocnění 27. Stanovení MT pomocí tzv. Brdičkovy reakce bylo provedeno následně po separaci paramagnetickými částicemi konjugovanými G proteinem 31. V dřívějších studiích jsme prokázali, že metalothionein je díky své neobvyklé struktuře s vysokým obsahem cysteinu a nízké molekulové hmotnosti 6 10 kda obtížně detegovatelný v matrici komplexního vzorku 21,28. Předřazení separačního mezikroku tak významně zlepšuje přesnost následné detekce. Protilátka k metalothioneinu se váže s vysokou afinitou ke G proteinu a MT může být následně selektivně izolován. Citlivost imunoseparace paramagnetickými částicemi je silně závislá na reakčních podmínkách, a proto bylo uskutečněno několik experimentů s cílem tyto podmínky optimalizovat. Byly testovány králičí a myší polyklonální protilátky. Koncentrace metalothioneinu ze standardizovaného vzorku detegovaná pomocí polyklonální protilátky byla vyšší (výtěžnost 95 %), než koncentrace získaná jinými protilátkami (výtěžnost 85 %), a proto byla dále B Obr. 1. Analýza prostatického specifického antigenu (PSA) u prostatických buněčných linií. (A) Relativní hladina PSA na mrna úrovni v nádorových buněčných liniích 22Rv1 a PC-3 vztaženo k nenádorové buněčné linii PNT1A a (B) koncentrace PSA na proteinové úrovni v buněčných lyzátech. * významné na P < 0,05, ** významné na P < 0,

38 Chem. Listy 106, (2012) Laboratorní přístroje a postupy A B Obr. 2. Analýza caveolinu-1 (Cav-1) u prostatických buněčných linií. (A) Relativní hladina Cav-1 na mrna úrovni v nádorových buněčných liniích 22Rv1 a PC-3 vztaženo k nenádorové buněčné linii PNT1A a (B) koncentrace Cav-1 na proteinové úrovni v buněčných lyzátech. * významné na P < 0,05, ** významné na P < 0,001 A B Obr. 3. Analýza metalothioneinu (MT) u prostatických buněčných linií. (A) Relativní hladina MT na mrna úrovni v nádorových buněčných liniích 22Rv1 a PC-3 vztaženo k nenádorové buněčné linii PNT1A, MT1A, MT2A a (B) koncentrace MT na proteinové úrovni v buněčných lyzátech. * významné na P < 0,05, ** významné na P < 0,001m v experimentech používána polyklonální protilátka. Dále byl testován vliv teploty potřebné k uvolnění komplexu částice protein. V rozsahu teplot 4 99 C byla pozorována signifikantně vyšší koncentrace získaného proteinu při teplotě 70 C. Při optimalizaci ph acetátového pufru bylo jako nejvhodnější zvoleno ph 4,3. Před detekcí MT ve vzorku byla sestavena ze standardního 1 mm vzorku metalothioneinu kalibrační křivka z koncentrací 0 M; 1,56 M; 3,125 M; 6,25 M; 12,5 M; 25 M; 50 M. Jako limit detekce byla určena koncentrace 100 pm (R.S.D. = 2,8 %). 1078

39 Chem. Listy 106, (2012) Laboratorní přístroje a postupy Detailní analytický postup byl popsán v naší předchozí práci 30. Hladina metalothioneinu na proteinové úrovni byla zvýšena u linie PC-3 (48,53 g g 1 celkového proteinu oproti 40,28 g g 1 u kontroly, P < 0,05), u linie 22Rv1 bylo popsáno statisticky významné (P = 0,04) snížení na hladinu 31,96 g g 1 (obr. 3B). Tato zjištění jsou ve shodě s hladinou mrna a korelují také s předchozími výsledky 21. Již dříve jsme publikovali zjištění, že izoforma metalothioneinu 2A je pro prostatickou tkáň výrazně dominantní, proteinová hladina MT opisuje stejný trend právě jako tato izoforma 21,32. Závěr Současná diagnostická omezení zhoubných nádorů prostaty poukazují na nutnost vývoje nových postupů k časnému odhalení agresivních forem tohoto onemocnění. Tato práce popisuje komplexní přístup k detekci potenciálních nádorových markerů s využitím rozdílných metod a s jejich optimalizací. Nadějnými geny jsou metalothionein a caveolin-1. Metalothionein díky jeho unikátní struktuře byl detegován za užití separace pomocí paramagnetických částic a následné elektrochemické detekce. Metalothionein i caveolin-1 vykazují stejné trendy na úrovni mrna a proteinu snížení hladiny u primárního nádoru a výrazné zvýšení u metastatické linie PC-3. Oba geny jsou tedy signifikantně zvýšeny až u agresivní formy onemocnění. Praktickou použitelnost je nutné ověřit studiemi na reálných bioptických vzorcích. Poděkování patří Grantové agentuře České republiky za finanční podporu projektu NanoBioTECell GA ČR P102/11/1068 a CEITEC CZ.1.05/1.1.00/ LITERATURA 1. Študent V., Grepl M., Král M., Hartmann I.: Urologie pro praxi 5, 214 (2006). 2. Murad A. S., Down L., Smith G. D., Donovan J. L., Lane J. A., Hamdy F. C., Neal D. E., Martin R. M.: Int. J. Cancer 128, 1442 (2011). 3. Gumulec J., Masařík M., Křížková S., Babula P., Hrabec R., Rovný A., Masaříková M., Kizek R.: Klin. Onkol. 24, 249 (2011). 4. Schroeder F. H., Hugosson J., Roobol M. J., Tammela T. L. J., Ciatto S., Nelen V., Kwiatkowski M., Lujan M., Lilja H., Zappa M., Denis L. J., Recker F., Berenguer A., Maattanen L., Bangma C. H., Aus G., Villers A., Rebillard X., van der Kwast T., Blijenberg B. G., Moss S. M., de Koning H. J., Auvinen A., Investigators E.: N. Engl. J. Med. 360, 1320 (2009). 5. Rigau M., Ortega I., Mir M. C., Ballesteros C., Garcia M., Llaurado M., Colas E., Pedrola N., Montes M., Sequeiros T., Ertekin T., Majem B., Planas J., Ruiz A., Abal M., Sanchez A., Morote J., Reventos J., Doll A.: Prostate 71, 1736 (2011). 6. Huang S. P., Bao B. Y., Wu M. T., Choueiri T. K., Goggins W. B., Huang C. Y., Pu Y. S., Yu C. C., Huang C. H.: Prostate 71, 1189 (2011). 7. Minamimoto R., Uemura H., Sano F., Terao H., Nagashima Y., Yamanaka S., Shizukuishi K., Tateishi U., Kubota Y., Inoue T.: Ann. Nucl. Med. 25, 21 (2011). 8. Djavan B., Kazzazi A., Dulabon L., Margreiter M., Farr A., Handl M. J., Lepor H.: Eur. Urol. Suppl. 10, E26 (2011). 9. Gumulec J., Masařík M., Křížková S., Babula P., Hrabec R., Rovný A., Masaříková M., Adam V., Eckschlager T., Kizek R.: Prakt. Lek. 91, 471 (2011). 10. Jamaspishvili T., Kral M., Khomeriki I., Student V., Kolar Z., Bouchal J.: Prostate Cancer Prostatic Dis. 13, 12 (2010). 11. Keizman D., Huang P., Antonarakis E. S., Sinibaldi V., Carducci M. A., Denmeade S., Kim J. J., Walczak J., Eisenberger M. A.: Prostate 71, 1608 (2011). 12. Dwek M. V., Jenks A., Leathem A. J. C.: Clin. Chim. Acta 411, 1935 (2010). 13. Canto E. I., Slawin K. M.: Annu. Rev. Med. 53, 355 (2002). 14. Payne H., Cornford P.: Urol. Oncol. Sem. Original Invest. 29, 593 (2011). 15. Ryvolova M., Krizkova S., Adam V., Beklova M., Trnkova L., Hubalek J., Kizek R.: Curr. Anal. Chem. 7, 243 (2011). 16. Ryvolova M., Hynek D., Skutkova H., Adam V., Provaznik I., Kizek R.: Electrophoresis 33, 270 (2012). 17. Adam V., Fabrik I., Eckschlager T., Stiborova M., Trnkova L., Kizek R.: TrAC, Trends Anal. Chem. 29, 409 (2010). 18. Eckschlager T., Adam V., Hrabeta J., Figova K., Kizek R.: Curr. Protein Pept. Sci. 10, 360 (2009). 19. Coyle P., Philcox J. C., Carey L. C., Rofe A. M.: Cell. Mol. Life Sci. 59, 627 (2002). 20. Krizkova S., Ryvolova M., Gumulec J., Masarik M., Adam V., Majzlik P., Hubalek J., Provaznik I., Kizek R.: Electrophoresis 32, 1952 (2011). 21. Krizkova S., Fabrik I., Adam V., Hrabeta P., Eckschlager T., Kizek R.: Bratisl. Med. J. 110, 93 (2009). 22. Gumulec J., Masarik M., Krizkova S., Adam V., Hubalek J., Hrabeta J., Eckschlager T., Stiborova M., Kizek R.: Curr. Med. Chem. 18, 5041 (2011). 23. Burgermeister E., Liscovitch M., Rocken C., Schmid R. M., Ebert M. P. A.: Cancer Lett. 268, 187 (2008). 24. Ando T., Ishiguro H., Kimura M., Mitsui A., Mori Y., Sugito N., Tomoda K., Mori R., Harada K., Katada T., Ogawa R., Fujii Y., Kuwabara Y.: Oncol. Rep. 18, 601 (2007). 25. Goetz J. G., Lajoie P., Wiseman S. M., Nabi I. R.: Cancer Metastasis Rev. 27, 715 (2008). 26. Karam J. A., Lotan Y., Roehrborn C. G., Ashfaq R., Karakiewicz P. I., Shariat S. F.: Prostate 67, 614 (2007). 27. Gumulec J., Sochor J., Hlavna M., Sztalmachova M., Krizkova S., Babula P., Hrabec R., Rovny A., Adam 1079

40 Chem. Listy 106, (2012) Laboratorní přístroje a postupy V., Eckschlager T., Kizek R., Masarik M.: Oncol. Rep. 27, 831 (2012). 28. Petrlova J., Potesil D., Mikelova R., Blastik O., Adam V., Trnkova L., Jelen F., Prusa R., Kukacka J., Kizek R.: Electrochim. Acta 51, 5112 (2006). 29. Adam V., Petrlova J., Wang J., Eckschlager T., Trnkova L., Kizek R.: PLoS ONE 5, e11441 (2010). 30. Adam V., Blastik O., Krizkova S., Lubal P., Kukacka J., Prusa R., Kizek R.: Chem. Listy 102, 51 (2008). 31. Masarik M., Gumulec J., Sztalmachova M., Hlavna M., Babula P., Krizkova S., Ryvolova M., Jurajda M., Sochor J., Adam V., Kizek R.: Electrophoresis 32, 3576 (2011). 32. Krizkova S., Adam V., Eckschlager T., Kizek R.: Electrophoresis 30, 3726 (2009). M. Sztalmachová a,b, J. Gumulec a, N. Cernei b,c, M. Hlavna a, O. Zítka b,c, P. Babula d, V. Adam b,c, R. Kizek b,c, and M. Masařík a,c ( a Department of Pathological Physiology, Faculty of Medicine, Masaryk University, Brno, b Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University in Brno, c Central European Institute of Technology, Brno University of Technology, Brno, d Department of Natural Drugs, Faculty of Pharmacy, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, Brno): Prostate Specific Antigen, Metallothionein and Caveolin-1 as Markers of Formation and Development of Prostate Carcinom The current diagnostic limitations of prostate cancer have shown that the development of new approaches to early detection of aggressive forms of of the cancer is very important. A comprehensive approach to detection of potential tumour markers using different methods and their optimization is described. We focused on caveolin-1 and metallothionein and the obtained results were compared with prostate specific antigen as a golden standard of prostate cancer markers. All the mentioned markers were detected on both the mrna and protein levels in three types of prostate cell lines. Metallothionein and caveolin-1 rank among the promising markers in prostate cancer diagnosis, especially for distinguishing aggressive silent forms of the disease. 1080

41 5.1.2 Vědecký článek II Effect of sarcosine on antioxidant parameters and metallothionein content in the PC3 prostate cancer cell line Natalia Cernei, Ondrej Zítka, Sylvie Skalicková, Jaromír Gumulec, Markéta Sztalmachová, Miguel Angel Merlos Rodrigo, Jiří Sochor, Michal Masařík, Vojtech Adam, Jaromír Hubálek, Libuše Trnková, Kruseova, Tomas Eckschlager and René Kizek. Odesláno:Oncology Reports,2012,8 stran, IF 1,835 Podíl autorky Cernei N.: 40 % textové části práce a 80 % experimentální části práce. Sarkosin je v současné době jedním z nejdiskutovanějších markerů rakoviny prostaty. Je zapojen do metabolismu aminokyselin a metylačních procesů, které nastanou v průběhu progrese karcinomu prostaty. V této studii sledován vliv přídavků sarkosinu (0, 10, 250, 500, 1000 a 1500 µm) v závislosti na čase (0-72 h) na PC-3 prostatickou buněčnou linii. Pro posouzení životaschopnosti buněk, byl použit MTT test. Iontově výměnná kapalinová chromatografie byla použita ke stanovení obsahu sarkosinu v nádorových buňkách PC-3. Současně byl v prostatických buněčných liniích s přídavky sarkosinu analyzován metalothionein (MT) pomocí čipové kapilární elektroforézy a Brdičkovy reakce. Antioxidační aktivita PC-3 buněk byla stanovena pomocí pěti různých spektrofotometrických metod DPPH test, FRAP, free radicals, DMPD ABTS test. K prostatickým nádorovým buňkám PC3 byl přidán standard sarkosinu o koncentraci (0-1,500 µm), následně buňky byly inkubovány po dobu (6, 12,24, 48 a 72 h), po uplynutí doby inkubace byla hodnocena jejich viabilita. Ve srovnání s kontrolními vzorkami buněk a buňek s přídavky sarkosinu byla viabilita významně snížena. Hodnota IC50 ve všech časových bodech byla ~ 325,5 µm. U všech použitých koncentrací byla viabilita buněk snížena o 30-40% po 10 hodinách a následně bylo pozorováno mírné zvýšení viability buněk (65-80%), ve srovnání s kontrolními buňkami. Se zvyšujícími koncentracemi sarkosinu (10-1,500 µm) doházelo ke snížení viability buněk (hladina významnosti p <0,05) v průběhu 6-24 h experimentu, v průměru o 34 %. Při sledování vlivu přídavků sarkosinu na hladinu MT pomocí čipové elektroforezy byly zaznamenány změny výšky píku při koncentracích sarkosinu 1000µM. Na druhou stranu signifikantní růst píku byl zaznamenán pro nejvyšších přídavcích sarkosinu (1500 µm), ale tento narůst byl nižší než hladina významnosti. Při stanovení vlivů přídavků

42 sarkosinu na antioxidační aktivitu prostatických nádorových buněk byla použitá metoda FRAP, antioxidační kapacita u buněk byla snížena o 10 % ve srovnání s kontrolními vzorky. Pokles antioxidační kapacity v závislosti na koncentraci přídavků sarkosinu byl evidentní. Nejvyšší antioxidační aktivita byla stanovena u buněk s přídavky sarkosinu po 6 hodinách inkubace, následně byl pokles zaznamenán po 48 h inkubace, zvýšení antioxidační kapacity bylo pozorováno u prostatických buněk PC-3 s přídavky sarkosinu µm. Při použiti metody ABTS a DPPH bylo pozorováno patrné zvýšení antioxidační aktivity u prostatických nádorových buněk PC-3 s přídavky sarkosinu o koncentraci 250 µm v časových intervalech 6, 12, 48 a 72 hodin. Vysoké koncentrace přídavků sarkosinu ( µm) vedly k významnému snížení antioxidační kapacity. Na druhé straně bylo zaznamenáno zvýšení antioxidační kapacity s rostoucími koncentracemi sarkosinu u buněk po dobu 48 hodin. DMPD metoda vykazovala klesající tendenci antioxidační aktivity s rostoucí koncentracemi sarkosinu po dobu 12 až 72 hodin

43 ONCOLOGY REPORTS 00: 0-00, 0000 Effect of sarcosine on antioxidant parameters and metallothionein content in the PC-3 prostate cancer cell line Natalia Cernei 1, Ondrej Zitka 1-3, Sylvie Skalickova 1, Jaromir Gumulec 1,4, Markéta Sztalmachová 1,4, Miguel Angel Merlos Rodrigo 1,3, Jiri Sochor 1, Michal Masarik 1,3,4, Vojtech Adam 1,3, Jaromir Hubalek 1,2,3, Libuse Trnkova 1,3,5, Jarmila Kruseova 6, Tomas Eckschlager 6 and Rene Kizek 1,3 1 Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, CZ Brno; 2 Department of Microelectronics, Faculty of Electrical Engineering and Communication, Brno University of Technology, CZ Brno; 3 Central European Institute of Technology, Brno University of Technology, CZ Brno; 4 Department of Pathological Physiology, Faculty of Medicine, Masaryk University, CZ Brno; 5 Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, CZ Brno; 6 Department of Paediatric Haematology and Oncology, second Faculty of Medicine, Charles University in Prague and University hospital Motol, CZ Prague 5, Czech Republic Received XXXXX; Accepted XXXXX DOI: /or_xxxxxxxx Abstract. Sarcosine is currently one of the most discussed markers of prostate cancer. It is involved in amino acid metabolism and methylation processes that occur during the progression of prostate cancer. In this study, we monitored the effect of the addition of sarcosine (0, 10, 250, 500, 1,000 and 1,500 µm) in a time-dependent manner (0-72 h) on the PC-3 prostate cancer cell line. For the assessment of cell viability, the commonly used MTT test was employed. Furthermore, ion-exchange liquid chromatography was used for the determination of sarcosine content in the PC-3 cells. We also determined metallothionein (MT) levels by chip capillary electrophoresis and Brdicka reaction in the cells treated with sarcosine. Sarcosine levels in the cells increased in a concentration-dependent manner [levels increased from only 270 nm with the lowest applied concentration of sarcosine (10 µm) to 106 µm with the highest applied concentration of sarcosine (1,500 µm)]. There was a marginal change observed in the MT concentration. Finally, the antioxidant activity of the PC-3 cells was determined using five different spectrophotometric methods [2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), ferric reducing ability of plasma (FRAP), free radicals, N,N-dimethyl-p-phenylenediamine (DMPD) and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS)]. A significant negative correlation was observed Correspondence to: Professor Rene Kizek, Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, CZ Brno, Czech Republic kizek@sci.muni.cz Key words: sarcosine, prostate cancer, metallothionein, antioxidant activity, chip electrophoresis, ion-exchange chromatography, Brdicka reaction between DPPH and FRAP (r=-0.68 at p<0.001) and between DMPD and ABST (r=-0.64 at p<0.001). Additionally, as regards the correlation between MT and DPPH, a significant positive trend (r=0.62 at p<0.001) was observed. Introduction Prostate cancer (PCa) is characterised as a non-coordinated proliferation of prostatic cells (1). However, the mechanisms behind tumour progression have not yet been elucidated, although the risk factors of cancer initiation have been defined (2). These include primary genetic predispositions, ethnicity, life style and age (3). Old age has been established as a significant risk factor for PCa (4,5). In addition to these factors, a family history of breast or PCa distinctly enhances PCa risk (6). In terms of ethnicity, a distinct gradient between Afro-Americans and Asians is evident (lower incidence in Asian populations) (7). Apart from these factors, androgens also play an important role in cancer development and progression. Therefore, PCa can be classified into either androgen-independent or androgen-dependent (8,9). Currently, there is no complex test available for the diagnosis of PCa (10). Usually used tests include examination per rectum, determination of prostate-specific antigen (PSA) levels (11) and transrectal sonography with a biopsy of prostate tissue. In specific cases, computed tomography (12), magnetic resonance (13) and positron emission tomography may be utilised (14). In this context, potential markers of PCa, which may be considered as a useful tool for earlier diagnosis without clinical examinations, are investigated. Currently, PSA, first described in 1977 (15), is the most perspective marker of PCa. However, it is used for diagnosis, for determining the stage of disease and for monitoring the treatment progression; however, its sensitivity (49-91%) and specificity (68-80%) are not sufficient confirm diagnosis (16). Novel potential markers, including

44 2 CERNEI et al: SARCOSINE and the PC-3 PROSTATE cancer CELL LINE alpha-methylacyl-coa racemase (AMACR) (17), prostate cancer antigen 3 (PCA3) and annexin A3 (18) have been identified. The most discussed marker of early-stage PCa is the amino acid, sarcosine (Fig. 1) as described by Sreekumar et al (19). In spite of the controversy in the scientific community and contradicting views on this marker, the role of sarcosine in methylation processes during cancer progression has been shown (19). A recent study demonstrated the effect of sarcosine on the increasing human epidermal growth factor receptor 2 (HER2/neu) expression levels (20). Therefore, it is important to investigate the function and involvement of sarcosine in PCa initiation and progression. The aim of this study was to investigate the effect of sarcosine on PC-3 PCa cells. PC-3 cells were treated with sarcosine at various concentrations (10, 250, 500, 1,000 and 1,500 µm). In addition, the antioxidant capacity of the PC-3 cells following treatment with sarcosine, as well as the metallothionein (MT) concentration were examined. Materials and methods Chemical and biochemical reagents. Ham's F12 medium, fetal bovine serum (FBS) (mycoplasma-free), penicillin/streptomycin and trypsin were purchased from PAA Laboratories GmbH (Pasching, Austria). PBS was purchased from Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA, USA). Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and all other chemicals of ACS purity were purchased from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA), unless stated otherwise. Cell culture conditions. In this study, the highly metastatic PC-3 prostate cancer cell line derived from bone marrow was used. Cells were cultivated in Ham's F12 medium supplemented with 7% FBS and antibiotics (penicillin and streptomycin). Cells were cultivated in a MCO-18AIC incubator (Sanyo, Osaka, Japan) at 37 C under 5% CO 2. Sarcosine treatment of cell cultures. Immediately after the cells grew to 50-60% confluence, the cultivation medium was replaced by fresh medium to synchronise cell growth. Cells were culti vated for 24 h under these conditions. Subsequently, the culture medium was supplemented with sarcosine (N-methylglycine) in the stock solution to a final concentration 10, 150, 250, 500, 1,000 and 1,500 µm. Treatment was carried out for 0, 6, 12, 24 and 72 h, and samples were collected at these strictly defined time points. Cell content quantification. Total cell number was analysed using a semi-automated image-based cell analyser (CASY, Roche Innovatis, Basel, Switzerland) according to the manufacturer's instructions. The cultivation medium was removed and the samples were washed twice with 5 ml of ice-cold PBS to maintain only viable cells. Cells were scraped and transferred to clean tubes. Trypan blue solution (Roche Innovatis) was diluted to 0.2% prior to use and added to the samples. The following settings were used in the operating software: cell type, standard cells; dilution, none; process type, standard. All samples were measured in duplicate. Light microscopy of treated cells. For light microscopy, cells were cultivated directly on glass microscope slides (75x25 mm, thickness 1 mm, Fischer Scientific, Pardubice, Czech Republic) in Petri dishes in the abovementioned cultivation medium as described in Cell culture conditions. Cells were transferred directly onto slides, which were submerged in cultivation medium. Following treatment, the glass microscope slides with a monolayer of cells were removed from the Petri dishes, rinsed with cultivation medium without sarcosine supplementation and PBS buffer and directly used for light microscopy under an inverted microscope (Eclipse TS100; Nikon, Tokyo, Japan). Images were taken using a digital camera (Olympus Camedia C-750, Olympus). MTT assay. To determine cell viability, MTT assay was carried out. MTT is yellow water-soluble stain (3-[4,5-dimethylthiazol- 2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) that is reduced by living cells to a non-soluble violet formazan precipitate. Cell suspension was pipetted to a microplate (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland) according to the following scheme: 1st and 12th well with 200 µl medium and 2nd to 11th well with 200-µl cell suspension. The assay was carried out in duplicate. Furthermore, the cells were incubated for 24 h and the media were exchanged. Subsequently, the columns were fed with 200 µl of medium with 50 µl MTT [5 mg/ml in PBS (Invitrogen)] and incubated for 4 h, wrapped in aluminium foil. Subsequently, medium-mtt was exchanged with 200 µl of 99.9% DMSO to dissolve the MTT-formazan crystals. A total of 25 µl of glycine buffer was then added to the wells with DMSO. Plates were read at λ=570 nm (VersaMax Microplate Reader; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Ion-exchange chromatography. An AAA 400 liquid chromatography apparatus (Ingos, Prague, Czech Republic) was used for the determination of sarcosine concentration. The system consisted of a glassy filling chromatographic column and a steel precolumn, two chromatographic pumps for the transport of elution buffers and derivatization reagent, a cooled carousel for 25 test tubes of ml volume, a dosing valve, a heat reactor, a Vis detector and a cooled chamber for the derivatization reagent. The glassy chromatographic column (i.d. 3.7 mm and 350 mm length) was filled with LG ANB strong catex in sodium cycle (Spolchemie, Ústí nad Labem, Czech Republic) with particles of ab average size of 12 µm and a netting of 8%. The glassy column was tempered by a thermostat at a temperature ranging from 35 to 95 C. The precolumn was filled with LG KS0804 ionex (Ingos). Chromatographic columns for the transfer of elution buffers and derivatization reagent function at a flow of ml/ min under a maximum pressure of 40 MPa. The volume of the injected sample was 100 µl with an application accuracy RSD of ~1%. A two-channel Vis detector with a 5-µl flow volume cuvette was operated at wavelengths of 440 and 570 nm. Ninhydrin solution (Ingos) was used as the derivatization reagent. Ninhydrin was dissolved in solution containing 75% (v/v) of the organic solvent, methyl cellosolve (Ingos), and 25% (v/v) of 4 M acetate buffer (ph 5.5). SnCl 2 (Lachema, Brno, Czech Republic) was used as a reducing agent. The derivatization reagent was stored under an inert atmosphere (N 2 ) with cooling at 4 C. During the analysis, the mobile phase flow was set at 0.3 ml/min under a pressure range of 4.5 to 6.0 MPa. The reactor temperature was set to 120 C

45 ONCOLOGY REPORTS 00: 0-00, Differential pulse voltammetry Brdicka reaction. Differential pulse voltammetric measurements were performed with a 747 VA Stand instrument connected to 693 VA Processor and 695 Autosampler (Metrohm, Herisau, Switzerland), using a standard cell with three electrodes and a cooled sample holder (4 C) for the measurement of cells (Julabo F25; Julabo, Seelbach, Germany). A hanging mercury drop electrode (HMDE) with a drop area of 0.4 mm 2 was used as the working electrode. An Ag/AgCl/3M KCl electrode was the reference and the platinum electrode was the auxiliary electrode. For data processing, the VA Database 2.2 (Metrohm) was employed. The analysed samples were deoxygenated prior to the measurements by purging with argon (99.999%) saturated with water for 120 sec. Brdicka supporting electrolyte containing 1 mm Co(NH 3 ) 6 Cl 3 and 1 M ammonia buffer [NH 3 (aq) + NH 4 Cl, ph 9.6] was used. The supporting electrolyte was exchanged after each analysis. The parameters of the measurement were as follows: initial potential of -0.7 V; end potential of V; modulation time, sec; time interval, 0.2 sec; step potential, 2 mv; modulation amplitude, -250 mv; Eads = 0 V; volume of injected sample, 25 µl; measurement of cell volume, 2 ml (25 µl of sample and 1,975 µl Brdicka solution). Capillary electrophoresis-experion system. Analyses on an automated microfluidic Experion electrophoresis system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) were carried out according to the manufacturer's instructions with the supplied chemicals (Experion Pro260 analysis kit; Bio-Rad Laboratories). A sample (4 µl) was mixed with 2 µl of reducing sample buffer (3.3% mercaptoethanol), and after 3 min of boiling, 84 µl of water were added. After the priming of the chip with the gel and gel-staining solution in the diluted priming station sample, the mixture (6 µl) was loaded into the sample wells. The Pro260 Ladder included in the kit was used as a standard. For operation and standard data analysis, Experion software version 3.10 (Bio-Rad Laboratories) was used. Spectrophotometric analysis. For the determination of antioxidant activity, a BS-400 automated spectrophotometer (Mindray, Shenzhen, China) was used. It is composed of cuvette space tempered to 37±1 C, reagent space with a carousel for reagents (tempered to 4±1 C), sample space with a carousel for the preparation of samples and an optical detector. The transfer of samples and reagents was carried out by a robotic arm equipped with a dosing needle (error of dosage up to 5% of volume). Cuvette contents are mixed by an automatic mixer including a stirrer immediately after the addition of reagents or samples. Contamination is reduced due to its rinsing system, including rinsing of the dosing needle as well as the stirrer by Milli Q water. Determination of antioxidant activity by the 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) test. The ABST test was carried out as previously described by Sochor et al (21,22). Briefly, a 150 µl volume of reagent (7 mm ABTS and 4.95 mm potassium peroxodisulfate) was incubated with 3 µl of sample. Absorbance was measured at λ=660 nm for 12 min. For the calculation of the antioxidant activity, values determined before the decrease of the absorbance (2nd minute of measurement - A 2 ) and the last measurement value (12th minute of measurement - A 12 ) were used. The resulting value was calculated in accordance with the following formula: differential absorbance A = A 12 - A 2. Determination of antioxidant activity by the 2,2-diphenyl 1- picrylhydrazyl (DPPH) test. The DPPH test was carried out as described by Sochor et al (21,22). Briefly, a 150 µl volume of reagent (0.095 mm DPPH ) was incubated with 15 µl of sample. Absorbance was measured at 505 nm for 10 min and the output ratio was achieved by the difference of absorbance at the 10th and 2nd minute of the assay procedure. Determination of antioxidant activity by the N,N-dimethylp-phenylenediamine (DMPD) method. The DMPD test was carried out as previously described by Sochor et al (21,22). Briefly, a 160 µl volume of reagent (200 mm DMPD, 0.05 M FeCl 3, 0.1 M acetate buffer ph 5.25) was injected into a plastic cuvette with the subsequent addition of 4 µl of sample. Absorbance was measured at 505 nm. The difference between absorbance at the 10th and 2nd minute of the assay procedure was used for the calculation of the antioxidant activity. Determination of antioxidant activity by the free radical method. The determination of antioxidant activity using the free radical method was carried out as previously described by Pohanka et al (23). Briefly, a 150 µl volume of reagent was injected into a plastic cuvette with the subsequent addition of a 6 µl of sample. Absorbance was measured at 450 nm in the 2nd minute of the assay and the 10th minute. The difference of the two absorbances was considered as an output value. Determination of antioxidant activity by the ferric reducing ability of plasma (FRAP) method. The determination of antioxidant activity using the FRAP method was carried out as previously described by Sochor (21,22). Briefly, a 150 µl volume of reagent was injected into a plastic cuvette with the subsequent addition of 3 µl of sample. Absorbance was measured at 605 nm for 10 min. The difference between the absorbance at the final 10th minute and the 2nd minute of the assay procedure was used for the calculation of the antioxidant activity. Statistical analysis. Software Statistica 10 (StatSoft, Tulsa, OK, USA) was used for statistical evaluation. T-tests were used to compare levels across groups and correlations were performed to reveal trends between variables. A P-value <0.05 was considered to indicate a statistically significant difference, unless stated otherwise. Results and Discussion Cell treatment and viability test. The PC-3 PCa cell line was derived from a metastatic site in the bone marrow and represents a highly aggressive metastatic form of PCa. Compared to the widely used prostate cancer cell lines, DU145 and LNCaP, PC-3 is androgen-independent and does not express PSA (24,25). As mentioned in the introduction, sarcosine is considered a tumour marker for the diagnosis of PCa. A schematic diagram of the role of sarcosine in the biochemistry of PCa cells adopted from a previous study (26) is shown in

46 4 CERNEI et al: SARCOSINE and the PC-3 PROSTATE cancer CELL LINE Figure 1. Sarcosine metabolism in the mitochondria. Formed FAD folate is involved in the respiratory chain and glycine is involved in creatine metabolism. * ETF, electron transfer flavoprotein; ** ETF-Q 0, ubiquinone oxidoreductase (26). (Fig. 1). Therefore, the first experiments focused on the determination of cell viability and proliferation following treatment with sarcosine. The commonly used MTT assay was employed for these tests. For MTT assay, the cells were harvested and re-cultivated in a 96-well plate (5,000 cells/well). After 24 h of growth synchronization, the cells were treated with sarcosine at various concentrations ranging from 10 to 1,500 µm. The cells were further cultivated under these conditions, and samples were taken in the strictly defined time points (6, 12, 24, 48 and 72 h), when viability was evaluated. The results are shown in Fig. 2. Compared to the viability of the control cells (i.e., those not treated with sarcosine), the viability of the sarcosine-treated cells was significantly reduced. The determined IC 50 value at all the time points was ~325.5 µm. In all the applied concentrations, cell viability was reduced by 30-40% after 10 h of treatment; subsequently, a moderate increase in cell viability (65-80%) compared to the initial viability values was recorded. As shown in Fig. 2, the increasing sarcosine concentration (10-1,500 µm) led to a reduction in cell viability (significance level p<0.05) during the first 6-24 h of treatment (34% on average). After 12 h, the decreasing trend in cell proliferation slowly increased compared to the untreated control cells, where the decrease was only moderate and was characteristic of the growth curve of the PC-3 PCa cell line. These results confirm the microscopic observations, where the toxic effect of sarcosine at a high concentration (1,500 µm) was evident. At this concentration, changes in cell morphology (loss of typical shape, formation of round cells and loss of adherence) were determined. At lower concentrations, sarcosine reduced cell viability, although non-significant cellular morphological changes were observed. Sarcosine determination. In the following experiment, both the culture medium and sarcosine-treated cells were analysed for sarcosine content by ion-exchange chromatography (27). Figure 2. Viability of prostate cancer cells treated with various concentrations of sarcosine (0, 10, 100, 250, 500, 1,000 and 1,500 µm). Influence of selected markers, values are recalculated to determine viability. For measurements, the MTT assay was used as described in MTT assay. In the sarcosine-treated cells, sarcosine content was recalculated to the percentage of viable cells. The sarcosine content in the cells significantly increased until 24 h of treatment at all concentrations (10-1,500 µm). However, after 24 h of treatment, only a moderate sarcosine content increase was recorded. The untreated cells showed a similar tendency compared to the treated cells. These results indicate the possibility of sarcosine biosynthesis by PC-3 cells (19). The concentration of sarcosine in the culture medium was recalculated to determine cell viability. The obtained results indicated a contrary tendency compared to the sarcosine content in PC-3 cells, i.e., that the concentration of sarcosine in the culture medium increased at all concentrations (10-1,500 µm). This increase is characterised by the directional slopes from each applied concentration (Fig. 3). The most significant increase in sarcosine content was recorded at the highest applied sarcosine concentrations (500 1,500 µm). As regards statistical significance, a significant change in the sarcosine content was observed at the concentrations between 0-1,000 µm vs. 1,500 µm (p=0.02). On the other hand, the sarcosine content increased in the culture medium in the case of the untreated control cells. Determination of MT levels. MT is considered as a possible marker of PCa (28-34). As certain studies have indicated, its levels are elevated in the blood serum of patients suffering from PCa, independent of their state of health (35,36). Chip capillary electrophoresis (Experion) was used for the determination of MT levels. The assumed molecular weight of MT varies from 6 to 15 kda (37); however, this depends on the type of isoform and the rate of oxidation (38,39). From the Experion records, it is evident that PC-3 cells cultivated for 12 h synthesised MT with molecular weights of 11,

47 ONCOLOGY REPORTS 00: 0-00, Figure 3. Dependence of applied sarcosine concentrations (0, 10, 100, 250, 500, 1,000 and 1,500 µm) on the sarcosine concentrations determined in the culture medium. and 19 kda (see MT peaks, Fig. 4A). These results are also visible on virtual output (Fig. 4B). The height of these peaks increased depending on the applied sarcosine concentration up to 1,000 µm. On the other hand, a distinct increase in all three peaks was determined for the highest applied concentration of sarcosine (1,500 µm); however, this increase was below the level of statistical significance. This trend is shown in Fig. 4C. Furthermore, PC-3 cells affected by sarcosine were investigated electrochemically using the Brdicka reaction, which is a highly sensitive method for the determination of MT levels (40,41). As shown in Fig. 5A, the MT level was reduced with the highest applied sarcosine concentration (1,500 µm) in a time-dependent manner. This trend confirmed the results obtained by the chip capillary electrophoresis method. As regards the dependence of mentioned variables, we revealed a significant positive correlation between sarcosine and MT (r=0.41 at p=0.03, Fig. 5B). Moreover, no other significant dependencies were identified across variables, including markers of oxidative capacity. Antioxidant capacity determination. A number of methods have been introduced for the determination of antioxidant activity in the field of chemical and biological analysis (23,42 44). The methods differ according the molecular mechanisms of the particular group of antioxidants (45-47). These mechanisms usually involve the quenching/trapping of the radicals; however, the strictly specific mechanisms of the majority of these antioxidants remain unclear. Therefore, the approaches for the determination of antioxidant capacity are based on various techniques with different chemical principles. In our study, for the determination of the antioxidant capacity of PC-3 cells, we used five different methods, DPPH, TEAC, FRAP, DMPD and free radicals. The DPPH test is based on the ability of the stable 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl free radical to react with hydrogen donors and it is still one of the most commonly used methods. In this test, a radical solution is decolourised after reduction with antioxidant (AH) or a radical (R ) in accordance with the following scheme: DPPH + AH DPPH H + A, DPPH + R DPPH-R (48). The ABTS radical method is based on the quenching of substances which acts as a hydrogen radical cation created as one electron oxidation of synthetic chromophore ABTS which is thus reduced and changes its colour, which is monitored as a decrease in absorbance at a preferable wavelength (49). The FRAP method is based on the principle of redox reaction using Fe(III) complexes which are colourless and following reduction, it generates violet-coloured products. DMPD radical cation (DMPD + ) is generated through a reaction between DMPD and potassium persulfate and is subsequently reduced in the presence of hydrogen-donating antioxidants, similar to the DPPH test. After the addition of a sample containing antioxidants, DMPD + radicals are scavenged and as a result of this scavenging, the coloured solution is decolourised (50). The FRAP method is based on the ability of chlorophyllin (the sodium-copper salt of chlorophyl) to accept and donate electrons with a stable change of maximum absorption. This effect is conditioned by an alkaline environment and the addition of a catalyst (21). All methods were calibrated using the standard compound, Trolox. The obtained results were recalculated to the viable Figure 4. (A) Intensity of metallothionein (MT) peaks with the increasing sarcosine concentration. Capillary electrophoresis was used for all measurements as described in Capillary electrophoresis-experion system. (B) Virtual gel output. Arrows indicate further analysed peaks corresponding to molecular weight of 9.5 kda labelled as MT, respectively. (C) Intensity of MT peaks with the increasing sarcosine concentration

48 6 CERNEI et al: SARCOSINE and the PC-3 PROSTATE cancer CELL LINE Figure 5. (A) Influence of sarcosine addition on metallothionein (MT) concentration (converted to whole protein concentration). (B) Correlation between sarcosine and MT values obtained by analysis of cells treated with applied concentrations of sarcosine (0, 10, 100, 250, 500, 1,000 and 1,500 µm) (r=0.41 at p=0.03). Figure 6. Influence of sarcosine treatment (0, 250, 500, 1,000 and 1,500 µm) on antioxidant capacity [expressed as Trolox equivalent (TE)]. Values were recalculated to determine cell viability. The spectrophotometric methods: (A) free radicals; (B) FRAP; (C) DPPH; (D) ABTS; (E) DMPD was used. cells (% of viability) that were determined in as described above in Spectrophotometric analysis. The antioxidant capacity determined by the free radical method (Fig. 6A) showed a decreasing tendency in a concentration-dependent manner within the time interval of 0 to 48 h. Subsequently, the antioxidant capacity increased in a time-dependent manner. The highest antioxidant capacity was determined after 72 h of sarcosine treatment in a concentration-dependent manner. However, the antioxidant capacity was reduced by 10% compared to the untreated control cells. The results obtained using the FRAP method correlated with the results obtained by the free radical method (Fig. 6B). A decrease in antioxidant capacity in a concentration-dependent manner was evident. The highest antioxidant capacity was determined in the cells treated with sarcosine for 6 h; subsequently, a decrease was recorded. After 48 h of incubation, an increase in antioxidant capacity in the PC-3 cells treated with high sarcosine concentrations (500-1,000 µm) was observed. On the other hand, the highest sarcosine concentration (1,500 µm) led to a significant reduction in antioxidant capacity. Different results were obtained after 72 h of treatment. The lower sarcosine concentrations (up to 500 µm) led to a reduction in antioxidant capacity, and the higher concentrations led to a significant increase in antioxidant capacity. The DPPH method confirmed the results obtained by the previous two methods (Fig. 6C). The most evident increase in antioxidant capacity was recorded in the untreated PC-3 cells and in the PC-3 cells treated with sarcosine in the concentration of 250 µm at the time points of 6, 12, 48 and 72 h. The high sarcosine concentrations (500-1,500 µm) led to a significant reduction in antioxidant capacity. However, the obtained results indicate the role of the duration of the treatment. PC-3 cells incubated for 24 h showed an increasing tendency in antioxidant capacity in a concentration-dependent manner. This fact is particularly

49 ONCOLOGY REPORTS 00: 0-00, evident in the PC-3 cells treated with 1,000 µm sarcosine. The ABTS method revealed similar results to those obtained by the DPPH method in both the untreated control (0 µm of sarcosine) and treated cells (Fig. 6D). On the other hand, the increasing antioxidant capacity with the increasing sarcosine concentrations in the treated cells for 48 h was evident. The DMPD method showed a decreasing tendency in antioxidant capacity with the increasing sarcosine concentrations within the time points of 12 to 72 h (Fig. 6E). On the other hand, the increase in antioxidant capacity is evident in the cells treated with sarcosine for 6 h. The results indicate the involvement of the compounds with antioxidant activity in the metabolism of the PC-3 cells following sarcosine treatment. The changes in antioxidant capacity demonstrate the rapid response to sarcosine treatment in a time-dependent manner. As regards the correlation of markers of oxidative capacity, we revealed a significant negative trend between DPPH and FRAP (r=-0.68 at p<0.001) and between DMPD and ABST (r=-0.64 at p<0.001). In addition, significant positive trends were observed only between MT and DPPH (r=0.62 at p<0.001). In conclusion, non-invasive markers for PCa, through which it would be possible to diagnose PCa by urine analysis, are required. The non-protein amino acid, sarcosine, is one of the substances with potential for use in the diagnosis of PCa by urine analysis. However, the exact function of this amino acid in tumour cells is not yet fully understood. In this study, we attempted to cast light on the effects of various sarcosine doses on PC-3 PCa cells and discovered that this compound significantly influences various determined markers. Acknowledgements The present study was financially supported by NANOSEMED GA AV KAN and NanoBioTECell GACR P102/11/1068. CYTORES GAČR P301/10/0356 is also greatly acknowledged. References 1. Boyd LK, Mao XY, Xue LY, et al: High-resolution genome-wide copy-number analysis suggests a monoclonal origin of multifocal prostate cancer. Gene Chromosomes Cancer 51: , Shimojo H, Kobayashi M, Kamigaito T, Shimojo Y, Fukuda M and Nakayama J: Reduced glycosylation of alpha-dystroglycans on carcinoma cells contributes to formation of highly infiltrative histological patterns in prostate cancer. Prostate 71: , Chang HH, Chen BY, Wu CY, et al: Hedgehog overexpression leads to the formation of prostate cancer stem cells with metastatic property irrespective of androgen receptor expression in the mouse model. J Biomed Sci 18: Song LM, Zhu YC, Han P, et al: A retrospective study: correlation of histologic inflammation in biopsy specimens of Chinese men undergoing surgery for benign prostatic hyperplasia with serum prostate-specific antigen. Urology 77: , Astigueta JC, Abad MA, Morante C, Pow-Sang MR, Destefano V and Montes J: Characteristics of metastatic prostate cancer ocurring in patients under 50 years of age. Actas Urol Esp 34: , 2010 (in Spanish). 6. Lindstrom S, Schumacher FR, Cox D, et al: Common genetic variants in prostate cancer risk prediction - results from the NCI Breast and Prostate Cancer Cohort Consortium (BPC3). Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 21: , Hall MJ, Ruth K and Giri VN: Rates and predictors of colorectal cancer screening by race among motivated men participating in a prostate cancer risk assessment program. Cancer 118: , vindrieux D, Reveiller M, Chantepie J, et al: Down-regulation of DcR2 sensitizes androgen-dependent prostate cancer LNCaP cells to TRAIL-induced apoptosis. Cancer Cell Int 11: 42, Paquet S, Fazli L, Grosse L, et al: Differential expression of the androgen-conjugating UGT2B15 and UGT2B17 enzymes in prostate tumor cells during cancer progression. J Clin Endocrinol Metab 97: E428-E432, Armstrong AJ, Eisenberger MA, Halabi S, et al: Biomarkers in the management and treatment of men with metastatic castrationresistant prostate cancer. Eur Urol 61: , Prensner JR, Rubin MA, Wei JT and Chinnaiyan AM: Beyond PSA: the next generation of prostate cancer biomarkers. Sci Transl Med 4: 127rv3, Lattanzi J, McNeely S, Hanlon A, Das I, Schultheiss TE and Hanks GE: Daily CT localization for correcting portal errors in the treatment of prostate cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys 41: , van Vugt HA, Roobol MJ, Busstra M, et al: Compliance with biopsy recommendations of a prostate cancer risk calculator. BJU Int 109: , Schoder H and Larson SM: Positron emission tomography for prostate, bladder, and renal cancer. Semin Nucl Med 34: , Fukushima K, Satoh T, Baba S and Yamashita K: alpha 1,2-Fucosylated and beta-n-acetylgalactosaminylated prostatespecific antigen as an efficient marker of prostatic cancer. Glycobiology 20: , Page ST, Hirano L, Gilchriest J, et al: Dutasteride reduces prostate size and prostate specific antigen in older hypogonadal men with benign prostatic hyperplasia undergoing testosterone replacement therapy. J Urol 186: , Luo J, Zha S, Gage WR, et al: alpha-methylacyl-coa racemase: a new molecular marker for prostate cancer. Cancer Res 62: , Cao DL, Ye DW, Zhang HL, Zhu Y, Wang YX and Yao XD: A multiplex model of combining gene-based, protein-based, and metabolite-based with positive and negative markers in urine for the early diagnosis of prostate cancer. Prostate 71: , Sreekumar A, Poisson LM, Rajendiran TM, et al: Metabolomic profiles delineate potential role for sarcosine in prostate cancer progression. Nature 457: , Dahl M, Bouchelouche P, Kramer-Marek G, Capala J, Nordling J and Bouchelouche K: Sarcosine induces increase in HER2/neu expression in androgen-dependent prostate cancer cells. Mol Biol Rep 38: , Sochor J, Ryvolova M, Krystofova O, et al: Fully automated spectrometric protocols for determination of antioxidant activity: advantages and disadvantages. Molecules 15: , Sochor J, Salas P, Zehnalek J, et al: An assay for spectrometric determination of antioxidant activity of a biological extract. Listy Cukrov Reparske 126: , Pohanka M, Sochor J, Ruttkay-Nedecky B, et al: Automated assay of the potency of natural antioxidants using pipetting robot and spectrophotometry. J Appl Biomed 10: , Ghosh A, Wang YN, Klein E and Heston WD: Novel role of prostate-specific membrane antigen in suppressing prostate cancer invasiveness. Cancer Res 65: , Tai S, Sun Y, Squires JM, et al: PC3 is a cell line characteristic of prostatic small cell carcinoma. Prostate 71: , Moolenaar SH, Poggi-Bach J, Engelke UF, et al: Defect in dimethylglycine dehydrogenase, a new inborn error of metabolism: NMR spectroscopy study. Clin Chem 45: , Cernei N, Zitka O, Ryvolova M, et al: Spectrometric and electrochemical analysis of sarcosine as a potential prostate carcinoma marker. Int J Electrochem Sci 7: , Eckschlager T, Adam V, Hrabeta J, Figova K and Kizek R: Metallothioneins and cancer. Curr Protein Pept Sci 10: , krizkova S, Fabrik I, Adam V, Hrabeta J, Eckschlager T and Kizek R: Metallothionein - a promising tool for cancer diagnostics. Bratisl Lek Listy 110: 93-97, krizkova S, Adam V, Eckschlager T and Kizek R: Easy-to-use and rapid detection of potential tumour disease marker metallothionein by using of PVDF membranes and chicken antibodies. FEBS J 276: , krizkova S, Fabrik I, Huska D, et al: An adsorptive transfer technique coupled with Brdicka reaction to reveal the importance of metallothionein in chemotherapy with platinum based cytostatics. Int J Mol Sci 11: ,

50 8 CERNEI et al: SARCOSINE and the PC-3 PROSTATE cancer CELL LINE Krizkova S, Masarik M, Majzlik P, et al: Serum metallothionein in newly diagnosed patients with childhood solid tumours. Acta Biochim Pol 57: , krejcova L, Fabrik I, Hynek D, et al: Metallothionein electrochemically determined using Brdicka reaction as a promising blood marker of head and neck malignant tumours. Int J Electrochem Sci 7: , Sochor J, Hynek D, Krejcova L, et al: Study of metallothionein role in spinocellular carcinoma tissues of head and neck tumours using Brdicka reaction. Int J Electrochem Sci 7: , Gumulec J, Masarik M, Krizkova S, et al: Evaluation of alphamethylacyl-coa racemase, metallothionein and prostate specific antigen as prostate cancer prognostic markers. Neoplasma 59: , krizkova S, Ryvolova M, Gumulec J, et al: Electrophoretic fingerprint metallothionein analysis as a potential prostate cancer biomarker. Electrophoresis 32: , Hamer DH: Metallothionein. Annu Rev Biochem 55: , krizkova S, Adam V and Kizek R: Study of metallothionein oxidation by using of chip CE. Electrophoresis 30: , krizkova S, Masarik M, Eckschlager T, Adam V and Kizek R: Effects of redox conditions and zinc(ii) ions on metallothionein aggregation revealed by chip capillary electrophoresis. J Chromatogr A 1217: , Adam V, Fabrik I, Eckschlager T, Stiborova M, Trnkova L and Kizek R: Vertebrate metallothioneins as target molecules for analytical techniques. TrAC Trends Anal Chem 29: , Ryvolova M, Krizkova S, Adam V, et al: Analytical methods for metallothionein detection. Curr Anal Chem 7: , Sochor J, Pohanka M, Ruttkay-Nedecky B, et al: Effect of selenium in organic and inorganic form on liver, kidney, brain and muscle of Wistar rats. Cent Eur J Chem 10: , jurikova T, Sochor J, Rop O, et al: Evaluation of polyphenolic profile and nutritional value of non-traditional fruit species in the Czech Republic - a comparative study. Molecules 17: , Rop O, Reznicek V, Mlcek J, et al: Antioxidant and radical oxygen species scavenging activities of 12 cultivars of blue honeysuckle fruit. Hort Sci 38: 63-70, Sochor J, Babula P, Krska B, et al: Evaluation of output signals from CoulArray detector for determination of antioxidant capacity of apricots samples. In: Analysis of Biomedical Signals and Images. Jan J, Jirik R, Kolar R, Kolarova J, Kozumplik J and Provaznik I (eds). Brno University of Technology VUT v Brně Press, Brno, pp , Krauth-Siegel RL and Leroux AE: Low-molecular-mass antioxidants in parasites. Antioxid Redox Signal 17: , Pohanka M, Karasova JZ, Musilek K, Kuca K, Jung YS and Kassa J: Changes of rat plasma total low molecular weight antioxidant level after tabun exposure and consequent treatment by acetylcholinesterase reactivators. J Enzyme Inhib Med Chem 26: 93-97, Parejo L, Codina C, Petrakis C and Kefalas P: Evaluation of scavenging activity assessed by Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical assay. J Pharmacol Toxicol Methods 44: , Nilsson J, Pillai D, Onning G, Persson C, Nilsson A and Akesson B: Comparison of the 2,2'-azinobis-3-ethylbenzotiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) methods to asses the total antioxidant capacity in extracts of fruit and vegetables. Mol Nutr Food Res 49: , Asghar MN, Khan IU, Arshad MN and Sherin L: Evaluation of antioxidant activity using an improved DMPD radical cation decolorization assay. Acta Chim Slov 54: ,

51 5.2 Vývoj nových metod pro separaci a detekci sarkosinu Vědecký článek III Spectrometric and Electrochemical Analysis of Sarcosine as a Potential Prostate Carcinoma Marker Natalia Cernei, Ondrej Zítka, Markéta Ryvolová, Vojtech Adam, Michal Masařík, René Kizek. Int. J. Electrochem. Sci., 7 (2012) , 15 stran IF 3,729 Podíl autorky Cernei N.: 40 % textové části práce a 90% experimentální části práce. Sarkosin, známý také jako N-methylglycin, je přírodní aminokyselina, která se vyskytuje jako meziprodukt, a jako vedlejší produkt při syntéze a degradace glycinu. V poslední době byl sarkosin testován jako nový marker rakoviny prostaty. Sarkosin byl identifikován jako diferenciální metabolit, jehož množství značně vzrůstá během progrese metastáz rakoviny prostaty a tak může být detekován v moči. Bylo také prokázáno, že přídavek sarkosinu do benigních, prostatických buněčných linií způsobilo zvýšení jejich invazivity a pohyblivosti. Cílem naší studie bylo navrhnout nízkonákladovou, robustní a jednoduchou metodu vhodnou pro stanovení sarkosinu v biologických vzorcích, např. moči nebo krevní plazmy. Za tímto účelem byla použita iontově-výměnná kapalinová chromatografie jako robustní separační technika. Tato metoda však trpí nedostatečným limitem detekce na úrovni koncentrace 70 µm sarkosinu. Pro citlivější detekci jsme optimalizovali off-line derivatizaci frakcí sarkosinu pomocí ninhydrinu. Tyto frakce byly po smíchání s ninhydrinem inkubovány a byla optimalizována teplota a čas reakce. Analýza byla provedena pomocí jednoduchého UV-VIS spektrometru. Získaný limit detekce metody pro stanovení sarkosinu byl 1,7 µm, což je hodnota podobná fyziologicky se vyskytující koncentraci sarkosinu u pacientů s rakovinou prostaty. Následně jsme optimalizovali metodu FIA-ED s coulometrickou detekcí pro analýzu získaných frakcí. Zde jsme získali limity detekce 110 nm, což je více než dostatečné pro jeho stanovení v různých matricích, jako jsou moč nebo plazma pacientů s rakovinou prostaty. Bylo prokázáno, že průtoková injekční analýza s elektrochemickou detekcí (FIA-ED) dosáhla nejlepšího limitu detekci 110 nm ve srovnaní s iontově-výměnnou kapalinovou chromatografií, kde limit detekce byl 70 µm. FIA-ED se jeví jako robustní a citlivá metoda

52 pro analýzu sarkosinu ve velmi nízkých koncentracích a může být použita pro analýzu vzorků moči

53 Int. J. Electrochem. Sci., 7 (2012) International Journal of ELECTROCHEMICAL SCIENCE Spectrometric and Electrochemical Analysis of Sarcosine as a Potential Prostate Carcinoma Marker Natalia Cernei 1, Ondrej Zitka 1,2, Marketa Ryvolova 1,2, Vojtech Adam 1,2, Michal Masarik 1,2,3, Jaromir Hubalek 1,2,4, Rene Kizek 1,2,* 1 Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, CZ Brno, Czech Republic, European Union 2 Central European Institute of Technology, Brno University of Technology, Technicka 3058/10, CZ Brno, Czech Republic, European Union 3 Department of Pathological Physiology, Faculty of Medicine, Masaryk University, Kamenice 5, CZ Brno, Czech Republic, European Union 4 Department of Microelectronics, Faculty of Electrical Engineering and Communication, Brno University of Technology, Technicka 3058/10, CZ Brno, Czech Republic, European Union * kizek@sci.muni.cz Received: 12 December 2011 / Accepted: 23 January 2012 / Published: 1 May 2012 Sarcosine, also known as N-methylglycine, is a natural ubiquitous non/protein amino acid which occurs as intermediate and side product in glycine synthesis and degradation. Recently, sarcosine has been investigated as a new putative marker in relation to prostate cancer. Sarcosine was identified as a differential metabolite that was greatly increased during prostate cancer progression to metastasis and could be detected in urine. It was also shown, that sarcosine addition to benign prostate cell cultures caused increase of their invasivity and motility. The aim of our study was to propose a low-cost, robust and simple method suitable for sarcosine determination in biological samples such as urine or blood plasma. For this purpose an ion exchange liquid chromatography as robust separation method was tested however this method suffers from insufficient limit of detection at the level of 70 µm of sarcosine. For more sensitive detection we optimized the off-line approach to ninhydrin derivatization of collected fractions. The fractions were collected and after addition of ninhydrin incubation of the mixture under the optimised temperature and time were done. Analysis of mixture was carried out by the simple UV-VIS spectrometer. The obtained limit of detection for this optimised procedure was promising 1.7 µm of sarcosine but this value is similar to physiologically occurring concentration of sarcosine in prostate cancer patients. Therefore we optimized the electrochemical method based on analysis of collected fractions by coulometric detection integrated as FIA-ED. Here we obtained the limits of detection of 110 nm of sarcosine, which is more than satisfactory for its determination in various matrixes such as urine or plasma of cancer patients. Keywords: Metabolomics; Cancer marker; Ninhydrin; UV-VIS detection; Ionic separation; Electrochemical detection; Carbon porous electrode

54 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, INTRODUCTION 1.1 Role of sarcosine in cancer Prostate cancer (CaP) continues to be one of the leading causes of cancer-related deaths among men. CaP more often affects elderly men and is thus a bigger health concern in developed countries. In 2004, there were incident cases of cancer of all forms (except non-melanoma skin cancer) diagnosed in men in European Union. There were new cases of lung cancer (19.4%), and CaP was the second most frequent incident form of cancer with new cases estimated (15.5%). Mortality reflects the cancer prognosis, and in men there were cancer deaths recorded, from which deaths were estimated by CaP (8.9%) [1]. Histologically, more than 90% of tumours are adenocarcinomas, and the remaining 10% are small cell, squamous and transitional cell carcinomas [2]. Adenocarcinoma has a small metastasizing potential and if it does, it affects lymphatic system and bones. Prostate cancer tumours are usually asymptomatic and slowly growing; thus tumours are often detected by autopsy only [3]. However, a minor part of patients suffers from aggressive form of CaP, which forms metastases readily and affects men in younger age and leads to death from CaP. The early and accurate diagnosis is essential especially for those patients. The current diagnostic procedure of CaP is based on prostatic specific antigen (PSA) screening in blood, and also on digital rectal examination and biopsy [4,5]. PSA is a kallikrein-like serine protease produced almost exclusively by the epithelial cells of the prostate. Therefore PSA is organ specific, but not cancer-specific, and serum levels may be elevated in the presence of benign prostatic hypertrophy, prostatitis and other nonmalignant conditions [6]. Thus searching for new potential CaP markers is highly desirable. New molecules, which can be used as CaP markers, were recently reviewed [7,8]. Prostate cancer antigen 3 (PCA3), early prostate cancer antigen (EPCA) and gene fusions of TRMPSS2 and ETS gene family belong to the most perspective serum CaP markers. These markers are, however, blood ones. Urine is more easily available and contains many molecules connected to numerous malignancies. Hence urine proteomics and metabolomics are widely investigated. Approximately 583 metabolites in urine were analysed for prostate cancer [9]. Technological tools for proteome-wide research include mass spectrometry, two-dimensional electrophoresis, high performance liquid chromatography (HPLC), capillary electrophoresis, protein array technologies and bioinformatics [10]. Urinary biomarkers include non-protein nitrogen metabolites, carbohydrates, proteins and amino acids and those biomarkers are searched for various diseases as nephropathies, transplanted kidney failures, diabetic nephropathy, renal and prostate carcinoma [11]. The major advantages of urine-based assays are their non-invasive character and ability to monitor CaP coming from heterogeneous foci. Approximately 30 urine-detectable prostate-specific markers at DNA, RNA, protein and metabolite level have recently been reviewed. Alpha-methyl coenzyme A racemase (AMACR), prostate cancer antigen 1 (PCA1), PCA3, 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OhdG), matrix metalloproteinase 9 (MMP9) and sarcosine belong to the most promising ones [12]. Recently, sarcosine also known as N- methylglycine, a natural ubiquitous non-protein amino acid has been investigated as a new putative CaP marker. Sarcosine, occurs as intermediate and by product in glycine synthesis and degradation and acts as an antagonist of glycine transporter I [13]. Published by Sreekumar et al., sarcosine was

55 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, identified as a differential metabolite that was greatly increased during prostate cancer progression to metastasis and could be detected in urine [9]. Sarcosine was warmly welcomed by professionals in the scientific field [14], however consequent studies bring contrary results. Measurements of sarcosine in blood serum by Struys et al. did not confirm Sreekumar s findings and conclusions and show that there are no major alterations in the extracellular concentrations of sarcosine, implying that the assessment of sarcosine in easily obtainable body fluids like urine and serum has limited potential in the diagnostic of prostate cancer [15]. Moreover, in another reported study authors measured sarcosine levels in urine samples from prostate cancer patients and concluded that sarcosine level in urine fails as a marker of prostate cancer detection and identification of aggressive tumours [16]. On the other hand, recently, Jiang et al. used liquid chromatography with tandem mass spectrometry for determination of sarcosine levels and other four putative CaP markers in urine samples and the results obtained show significant difference in sarcosine urine levels between CaP patients and healthy subjects [17]. Some authors attempted to detect sarcosine also in blood, but the results published are in well agreement that this way of determination of this marker cannot be used for prostate cancer diagnostics [15].Moreover, the influence of sarcosine on prostatic cancer cell cultures was also investigated. A significantly elevated level of sarcosine in prostatic cancer cell lines was found compared to benign cells. It has also been shown that addition of sarcosine to non-invasive benign prostate epithelial cells caused increasing of their invasivity and motility. This indicates that sarcosine has a direct role in changing of the cells phenotype [9]. 1.2 Methods for sarcosine determination To obtain more data about sarcosine significance for CaP diagnostics, robust analytical methods are needed. For sarcosine determination in biological matrix its good separation is critical due to its similarity with high-abundant L-alanine. Chromatographic methods in combination with mass spectrometry are most commonly used for sarcosine determination in urine [17]. Except abovementioned gas chromatography-mass spectrometry [9,16] and liquid chromatography with tandem mass spectrometry [17], electrospray ionization and tandem differential mobility analysis-mass spectrometry [18] were used for the same purpose. Sarcosine was also semiquantitatively evaluated in urine and serum by thin layer chromatography (TLC) [19], which was the first mention about level of this aminoacid in urine and blood serum of healthy persons. Previously mentioned instruments are accurate but expensive and analysis can be laborious, but to routinely determine sarcosine in large sets of clinical samples simple and inexpensive methods are needed. Therefore, techniques based on chromatographic and/or electrophoretic separation coupled with non-mass spectrometric detector are tested. Reversed-phase HPLC with UV detector and TLC was used to separate and detect dansyl derivatives of aminoacids and amine containing phosphonic acids produced by microbial conversion of N-phosphonomethylglycine. For HPLC-UV, the detection limit was estimated as 19.3 ng and isomers L-alanine and sarcosine were well separated [20]. A glass electrophoresis microchip integrated a flowtype chemluminescence (CL) detection cell was developed and evaluated and tested for dansylsarcosine determination [21]. Laser-induced fluorescence (LIF) was applied to the detection of 9-

56 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, fluorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl) derivatized amino acids separated by capillary electrophoresis. A limit of detection of 0.5 nm was obtained for FMOC-alanine. Separation of FMOCderivatized proline, hydroxyproline and sarcosine was achieved [22]. In addition, there were also suggested methods for detection of aminoacids, which can be also used for sarcosine. The chiral separation of enantiomeric forms of derivatized amino acids were achieved based on a metal-chelate chiral capillary electrophoretic method and a cyclodextrin mediated host-guest interaction approach in micellar electrokinetic chromatography (MEKC) mode with laser-induced fluorescence detection. Amino acids were analysed by complete hydrolysis and the hydrolysate was derivatized with either dansyl chloride for UV absorbance detection or fluorescein isothiocyanate for laser based fluorescence detection. This approach has been applied for the determination of enantiomeric forms of amino acids derived from novel peptide antitumour antibiotics, BMY and its analogues [23]. Construction of miniaturized sensors and biosensors has a great potential for simple determination of a wide spectrum of analytes in complex biological matrices. Electrochemical biosensors were also fabricated and tested for sarcosine determination [24-26]. Electrochemistry has numerous advantages including low operation cost, possibility to be miniaturized and sufficient sensitivity. There is numerous solid electrodes, which are useful for various types of analytes as glassy carbon [27,28]or various easily modified carbon paste electrodes [29,30]. It is not surprising that many approaches based on changing of structure of working electrode surface and material are being developed to enhance sensitivity [31-35]. Good robustness with sufficient sensitivity is provided by porous graphite working electrode, which is suitable to be used in electrochemical detectors coupled with HPLC [36-38]. The aim of this study was to suggest and optimize a simple and robust method for sarcosine determination in biological samples with minimal needs for sample pretreatment. For this purpose ion exchange liquid chromatography with post column derivatization by ninhydrin and VIS detection and flow injection analysis coupled with electrochemical detection were tested. 2. EXPERIMENTAL PART 2.1 Chemicals Working solutions as buffers or standard solution of sarcosine were prepared daily by diluting the stock solutions. Standard of sarcosine and others were in ACS purity purchased from Sigma Aldrich (USA) unless noted otherwise. The chemicals for Aminoacid analyser were prepared according the manufacturer s instructions and were purchased from INGOS (Prague, Czech Republic). All solutions were prepared in deionised water obtained using reverse osmosis equipment Aqual 25 (Czech Republic). The deionised water was further purified by using apparatus MiliQ Direct QUV equipped with the UV lamp. The resistance was 18 MΩ. The ph was measured using ph meter WTW inolab (Weilheim, Germany).

57 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, Ion-exchange liquid chromatography For determination of sarcosine an ion-exchange liquid chromatography (Model AAA-400) with post column derivatization by ninhydrin and absorbance detector in visible light range (Vis) was used (Fig. 1). Glass column with inner diameter of 3.7 mm and 350 mm length was filed manually with strong cation exchanger in sodium cycle LG ANB with approximately 12 µm particles and 8% porosity. Column was tempered within the range C. Double channel Vis detector with inner cell of 5 µl volume was set to two wavelengths: 440 and 570 nm. Solution of ninhydrin (Ingos, Czech Republic) was prepared in 75% v/v methylcelosolve (Ingos, Czech Republic) and in 2 % v/v 4 M acetic buffer (ph 5.5). Tin chloride (SnCl 2 ) was used as a reducing agent. Prepared solution of ninhydrin was stored under inert atmosphere (N 2 ) in dark at 4 C. Elution of sarcosine was done by buffer containing 10.0 g of citric acid, 5.6 g of sodium citrate, and 8.36 g of NaCl per litre of solution and ph was 3.0. Flow rate was 0.25 ml/min. Reactor temperature was 120 C. Fractions were collected by automated fraction collector (Biorad, USA). 2.3 Spectrophotometric analysis Spectrophotometric analysis was carried out using UV-Vis spectrophotometer Specord-210 (Jena Analytic, Germany). The instrument is equipped by the carrousel for eight cuvettes. Plastic disposable cuvettes with the optical pathlength of 1 cm and volume of 1.5 ml were used Microcuvette (Kartell, Italy). The carrousel was tempered to the required temperature ( C) using flowthrough thermostat JULABO F12/ED (Labortechnik GmbH, Germany) with distilled water as a medium. The wavelength range was set to nm. 2.4 Flow injection analysis with electrochemical detection Flow injection analysis with electrochemical detection (FIA-ED) system consists of two chromatographic pumps Model 582 ESA (ESA Inc., Chelmsford, MA) (working range ml/min) and CoulArray electrochemical detector (Model 5600A, ESA, USA). Detector consists of flow analytical chamber (Model 6210, ESA, USA). Chamber contains four analytical cells. One analytical cell contains two referent (hydrogen-palladium), and two counter electrodes and one porous graphite working electrode. Electrochemical detector is situated in control module, which is thermostated. Sample (5 µl) was injected by manual valve (Rheodyne, USA). Flow rate of mobile phase was 1 ml/min. 2.5 Mathematical data treatment and calculation of detection limits Mathematical analysis of the data and their graphical interpretation was realized by software Matlab (version 7.11.). Results are expressed as mean ± standard deviation (S.D.) unless noted otherwise (EXCEL ). The detection limits (3 signal/noise, S/N) were calculated according to Long

58 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, and Winefordner [39], whereas N was expressed as standard deviation of noise determined in the signal domain unless stated otherwise. 3. RESULTS AND DISCUSSION Simple analytes such as amino acids may play a very important role in cancer diagnostics and/or in monitoring of disease progression. Based on the previously published papers identifying urinary sarcosine as CaP marker, we tested whether methionine metabolites in urine and serum could serve as pre-surgical markers for aggressive disease [9,40]. Even though the applicability of sarcosine as a tumour marker can be considered [16,17,41-43], detailed investigation of its role in cancer development is required. 3.1 Sarcosine separation It is well known that due to the amphiphilic properties of amino acids they can be separated by ion-exchange liquid chromatography (IELC) [44]. Under ideal condition, the isoelectric point is the main factor defining the theoretical retention of the amino acid. The scheme of the IELC instrument using cation exchanger in the sodium cycle as a stationary phase is shown in Fig. 1. Determined amino acids are injected into the system under buffer flow rate of 0.5 ml/min (ph of the used buffer was 2.7). Subsequently the elution takes place by the increasing gradient of ph and ionic strength (Fig. 2). Due to the fact that sarcosine does not contain an amino but the imino group in the structure, slightly acidic properties can be expected. Its theoretical pi is 6.2. Figure 1. Scheme of IELC-Vis with post column derivatization with ninhydrin.

59 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, During the separation of mixture of 17 amino acids with addition of sarcosine its retention time was minutes (Fig. 2). It clearly follows from the chromatogram that sarcosine elutes between serine (pi 5.76) and glutamic acid (pi 3.22). The sarcosine peak is symmetrical and baseline separated. Figure 2. Chromatogram of standard mixture of 17 aminoacids (50 µm) with addition of sarcosine 100 µm. Aminoacids were eluted by the increasing gradient of buffers with increasing ph and concentration of salts: 0-7 min (ph 2.7, 4.06 M), 7-20 min (ph 3, 4.24 M), min (ph 4.25, 5.30 M), min (ph 9.7, 8.96 M), which is highlighted as blue dashed line. For other separation parameters see in chapter 2.3. The analysis of real biological samples is usually complicated by the sample composition with high content of both organic and inorganic components. Therefore the influence of NaCl, uric acid, proline (Pro) and glycine (Gly) was studied. Sarcosine sample (500 µm) was adjusted to contain required concentrations of studied compounds ( M) and analysed immediately. The influence of the NaCl and uric acid at concentrations present in real urine samples was investigated. Additionally the influence of Pro (pi 6.3) and Gly (pi 5.97) was tested due to their high similarity in chemical properties (pi). It was found that Gly and Pro elute from the column more than 5 minutes later (Gly RT: min, Pro RT: min) than sarcosine (RT: min). It follows from the results that the increased NaCl concentration had significant impact on the retention time of sarcosine. The linear increase of the ionic strength led to the linear decrease of the retention time (Fig. 3A). Within the

60 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, concentration range between 0 and 800 mm NaCl the retention time of sarcosine decreased for 2 minutes. The addition of uric acid into the sarcosine sample led, on the other hand, to the increase in retention time. The highest retention time change (0.51 min) was observed for concentration of 100 mm of uric acid (Fig. 3B). Higher concentrations of uric acid caused less significant RT shift. The addition of proline also led to the increase of RT, however, the trend is nonlinear (Fig. 3C). The highest RT shift (2.24 min) was reached for 900 mm proline solution. The increase of sarcosine RT can be caused by the high concentration of nonpolar proline side chain. This caused the increase of the affinity of more polar molecules such as sarcosine to the stationary phase similarly as in the normal phase separation. The addition of glycine to the sarcosine sample led to the significant increase of the RT mainly in the concentrations mm (up to 1 minute). Concentrations above 400 mm caused less significant RT increase (Fig. 3D). It was found that the influence of physiological concentrations of NaCl ( mm) and uric acid ( mm) is app. 15 %. Moreover it was found that addition of these compounds has no significant impact on the peak height (relative standard deviation (RSD) 1 %, n = 10). Figure 3. Change of retention time of peak of sarcosine in dependence on addition of various concentrations of (A) NaCl, (B) Uric acid, (C) Proline and (D) Glycine.

61 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, Detection of sarcosine Amino acid detection eluting from the chromatographic column is carried out using postcolumn derivatization by ninhydrin and detected by photometric detector at 570 nm. The device is mixing the mobile phase coming out from the chromatographic column with the ninhydrin solution in the ratio 1:1 and this mixture is subsequently heated up to 120 C in the reaction loop for the time required for the reaction (Fig. 1). Derivatization product is then transported to the photometric detector (Fig. 1). Using this instrument, the analysis of sarcosine within the concentration range from 100 to 5600 µm was performed reaching RSD of 3.4 % (n = 5). The overlay of the chromatographic signals is shown in Fig. 4A. The calibration curve determined as a dependence of the peak height on the concentration exhibited an excellent linearity (R 2 = 0.999, n = 5, RSD = 1.4%, Fig. 4B). Limit of detection for sarcosine of 70 µm was calculated (3 S/N). Obtained figures of merit are summarized in Tab. 1. It clearly follows from the results obtained that used ion-exchange liquid chromatography is robust and reliable method, however, the sensitivity expressed as limit of detection obtained using post-column derivatization with photometric detection is insufficient for detection of sarcosine in real samples. In biological samples, 1-20 µm (correlated to creatinine) and 1.59±1.08 µm of sarcosine was determined in urine and in blood plasma, respectively [19]. For these reason, the possibility of photometric detection optimization was tested. Figure 4. (A) Overlaying chromatograms from calibration dependence of sarcosine determined by AAA 400 and (B) calibration curve measured within the range from 5 to 1000 µg/ml under the experimental conditions mentioned in section 2.3.

62 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, Optimization of spectrophotometric detection To optimize the sarcosine detection, several parameters were tested. It is known that the highest yield of the derivatization reaction of ninhydrin is reached for amino-group containing compounds. Therefore, it was primarily required to confirm that the absorption maximum of the derivatization product of sarcosine and ninhydrin is corresponding. In Fig. 5A, the reaction between ninhydrin and sarcosine is shown. Based the comparison of absorption spectra of the glycine-ninhydrin and sarcosine-ninhydrin reaction products within the range from 400 to 800 nm it can be concluded that the there is no shift in the absorption maximum. However, it was found that there is a 50% decrease of the intensity for sarcosine-ninhydrin product in comparison to glycine-ninhydrin product of the same concentration (100 µm of glycine/sarcosine +101 mm ninhydrin) (Fig. 5B). Due to the fact that the molar ratio of nitrogen is same for both, glycine as well as sarcosine, the decreased intensity can be explained only by the structural difference. Table 1. Analytical parameters of AAA-400. Substance Regression equation Sarcosine y = x Linear Linear R2 1 LOD 2 LOD LOD LOQ 3 LOQ LOQ RSD 4 dynamic range dynamic range (µm) (µg/ml) (µm) (ug/ml) (nmol per injection) (µm) (µg/ml) (nmol per injection) (%) regression coefficients 2 limits of detection of detector (3 S/N) 3 limits of quantification of detector (10 S/N) 4 relative standard deviations The influence of the sarcosine/ninhydrin ratio was also studied. Ninhydrin solutions of various concentrations (5.6, 11.2, 16.9, 22.5, 28.1, 33.7, 39.3, 44.9, 50.5, 56.1, 61.7, 67.4, 73.0, 78.9, 84.2, 89.8 and 101 mm) were added to the sarcosine sample (100 µm) and the absorption spectra were measured within the range from 450 to 800 nm. The absorbance signal increased significantly (200%) with increased ninhydrin concentration (Fig. 5C). As noted previously, the absorption maximum is at 570 nm and therefore this wavelength was used to obtain the dependency of the absorbance signal on temperature and incubation time. Automated spectrophotometer was programmed to acquire the absorbance in 1 minute intervals and temperatures 50 C, 60 C, 70 C, 80 C, 90 C, 100 C were kept constant during the measurement using an external thermostatic unit. The highest absorbance signal was obtained at 90 C after 10 minute incubation (Fig. 5D). Using these optimised conditions, a calibration curve was determined within the concentration range from 1 to 50 µm. The calibration curve exhibited a good linearity with correlation coefficient R 2 = 0.994, R.S.D. = 2.1% (n = 5) (Fig. 5E). Limit of detection was improved by the factor of 35 (figures of merit are summarized in Tab 2), however, this is still insufficient for the analysis of biological samples.

63 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, Figure 5. (A) Chemical reaction of ninhydrin with sarcosine, after heating 110 C there is colour product. (B) Absorption spectrum ( nm) of 100 µm glycine and 100 µm sarcosine with ninhydrin after heating 90 C 10 min under 400 rpm. (C) Influence of concentration of ninhydrin ( µm) on sarcosine 100 µm. (D) Change of absorption of complex of sarcosine (100 µm ) with ninhydrin (56.1 mm) under various temperatures 50, 60, 70, 80, 90 and 100 C in time manner. (E) Calibration curve under the optimized conditions (570 nm, 10 min incubation and temperature of heating 90 C) within the range from 5to 891 µg/ml). Table 2. Analytical parameters of optimized UV-Vis detection. Substance Regression equation Sarcosine y = x Linear dynamic Linear dynamic R2 1 LOD 2 LOD LOD LOQ 3 LOQ LOQ RSD 4 range range (µm) (µg/ml) (µm) (ng/ml) (fmol per volume) (µm) (ng/ml) (fmol per volume) (%) regression coefficients 2 limits of detection of detector (3 S/N) 3 limits of quantification of detector (10 S/N) 4 relative standard deviations Due to the fact that the instrument of ion exchange chromatography is a compact automated appliance unsuitable for changing of the derivatization parameters, the separated analyte fractions were collected immediately after exiting the separation column (Fig. 6) and spectrophotometricaly analysed off-line. By abovementioned approach we were able to determine of sarcosine with maximal 10% error of determination.

64 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, Figure 6. Scheme of ion exchange chromatography connected to fraction collector. Fractions were incubated according the optimized conditions mentioned in caption 3.2. and then analysed using UV-VIS spectrometer. 3.4 Optimization of electrochemical detection Previously described procedure enabled to decrease the LOD of sarcosine from 70 µm to 1.7 µm, however even this method would be applicable to the real samples only after employing a powerful sample pre-treatment method. Such procedure would however increase the analysis time as well as costs. Therefore the electrochemical detection was tested as an alternative detection technique. First electrochemical experiments were presented in the papers by Cukrowski et al. [45,46]. Flow injection analysis setup with electrochemical detector CoulArray, containing analytical cells with applied potentials in the range from to mv was used. First, two hydrodynamic voltammograms (HDV) [47] of sarcosine sample (100 µm) were obtained for the whole potential range ( mv, 100 mv steps) using the Britton-Robinson buffer (buffering range 1.8-9) with concentration 100 mm and ph 2 and 8. The highest detector response was obtained for potential range mv at ph 8. Based on the obtained data it can be concluded that for the coulometric detection of sarcosine basic ph and high oxidation potential are preferable (Fig. 7). To investigate the influence conditions in details, three buffers as Britton-Robinson buffer (ph 7-9), borate buffer (ph 7-9) and phosphate buffer (ph 7-9) were tested. Using all buffers at ph values 7, 7.5, 8, 8.5, and 9, HDV were measured within the potential range from +400 to mv. Measured HDVs are shown in Fig. 8. The highest response using Britton-Robinson buffer was observed at ph 8.5 (Fig. 8A) where the peak height of 3 µa was reached. Using borate and phosphate buffer ph 9 the maximal reached peak heights were 1.8 and 6 µa, respectively (Fig. 8B and 8C, respectively). The maximum current values were obtained at mv for all three buffers. Finally, the flow rate was optimized as shown in Fig. 8D.

65 Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 7, Figure 7. Influence of ph 2 and 8 of Britton Robinson buffer on HDV of sarcosine (100 µg/ml), flow rate 1 ml/min, working electrode potential from -700 to mv. Figure 8. Influence of (A) Britton-Robinson buffer, (B) borate buffer and (C) phosphate buffer on HDV of sarcosine (100 µg/ml). (D) Influence of flow rate on peak height. (E) The typical FIA- ED record of calibration dependence of sarcosine as triplicate of each concentration under the best detection options (phosphate buffer ph 9 and flow rate 1 ml/min). (F) Calibration of sarcosine measured within the range from to 50 µg/ml. The highest signal of sarcosine was obtained using the flow rate of 0.75 ml/min. In addition for optimal detection we had to test the influence of concentration of phosphate buffer on electrochemical response. We found 100 mm concentration of the phosphate buffer as the best for sarcosine detection.