Spektroskopické metody. převážně ve viditelné, ultrafialové a blízké infračervené oblasti

Transkript

1 Spektroskopické metody převážně ve viditelné, ultrafialové a blízké infračervené oblasti

2 Elektromagnetické záření Elektromagnetické záření je postupné vlnění elektromagnetického pole složeného z kombinace příčného magnetického a elektrického vlnění.

3 Elektromagnetické záření

4 Elektromagnetické záření Využití elektromagnetického záření o různé energii a různé formy jeho interakce s okolní hmotou.

5 Interakce záření s hmotou Odraz a lom Absorpce Rozptyl Emise záření

6 Lom světla

7 Lom světla světlo se láme na rozhraní dvou prostředí, ve kterých se šíří různou rychlostí Index lomu n zpomalení světla v určitém prostředí n=c/v (c rychlost světla ve vakuu, v rychlost světla v prostředí)

8 Snellův zákon popisuje lom elektromagnetického záření na rozhraní dvou rozdílných prostředí n 1 sinθ 1 = n 2 sinθ 2 n 2 / n 1 = sinα 1 / sinα 2 = v 1 / v 2

9 a) Při šíření záření z prostředí opticky řidšího do opticky hustšího prostředí se paprsky lámou směrem ke kolmici. b) Při šíření záření z prostředí opticky hustšího do opticky řidšího prostředí se paprsky lámou směrem od kolmice. a b

10 Totální odraz (reflexe) Při přechodu paprsku z opticky hustšího prostředí do prostředí opticky řidšího nastává od určitého úhlu k totálnímu odrazu θ 2 = 90 o -> tedy -> sinθ 2 = 1 sinθ 1 = n 2 / n 1 = v 1 / v 2

11

12 Princip totální reflexe se využívá například v konstrukci světlovodičů

13 Evanescentní vlna Šíří se podél rozhraní Typicky při totálním odrazu Kolmo na rozhraní ubývá exponenciálně se vzdáleností od rozhraní

14 Absorpce záření Proces, kdy je energie fotonu (elektromagnetického záření) pohlcena látkou. Každá hmota (atom či molekula) má specifickou absorpci záření, v určitých oblastech frekvencí absorbuje více, jinde méně.

15 Charakter nebo mechanismus pohlcení záření je dán energií použitého záření Ionizace Excitace elektronů do vyšších excitačních stavů Změny ve vibracích vazeb v molekulách Změny v rotacích kolem vazeb v molekulách

16 Rozptyl záření Odchýlení od původního směru pohybu částice nebo vlny díky poruchám v prostředí (rozptylovým centrům)

17 Příčiny rozptylu v optické spektroskopii: různé částice, bubliny, kapky, lokální změny hustoty, poruchy krystalové struktury, nerovnosti povrchu, buňky v organismech, prach... Intenzita rozptýleného světla závisí na jeho vlnové délce a je nepřímo úměrná její čtvrté mocnině. S kratší vlnovou délkou se záření rozptyluje více.

18 Emise záření Emise záření je proces, při kterém atom nebo molekula vyzáří elektromagnetické záření při přechodu z vyššího do základního energetického stavu

19 Jablonského diagram

20 Fluorescence Fosforescence Zpožděná fluorescence

21

22

23 Maximum absorpčního a fluorescenčního spektra látky je posunuto díky vnitřní konverzi a vibrační relaxaci Stokesův posun

24 Kvantový výtěžek fluorescence Q = počet emitovaných fotonů počet absorbovaných fotonů látky s vysokým Q jsou účinnými emitory (rhodamin) Vyjádření kvantového výtěžku pomocí rychlostních konstant k r Q = = τ τ n = τ / Q k r + k nr τ n Q i τ lze experimentálně změřit a tím získat i τ n

25 Zdroje záření Žárovky, výbojky, LED diody, lasery

26

27 Detektory Fotonásobiče, fotodiody, diodová pole, CCD čipy

28 Fotonásobiče Fotony dopadají na fotokatodu, z té jsou vyraženy elektrony. Ty jsou postupně směrovány přes několik dinod k anodě. Na každé dinodě dochází k zesílení, vyražení většího počtu elektronů.

29 Fotodiody Fotony, které dorazí na fotodiodu vybudí elektrony v polovodiči diody. Dioda se tak stává vodivou a může tak vést proud.

30 PDA (PhotoDiode Array) Diodové pole je tvořeno řadou malých nezávislých fotodiod Výhodou je to, že lze na tuto řadu detektorů promítnout celé spektrum a tak ho číst v jednou okamžiku

31 CCD (Charge Coupled Device) Tvořeno polem jednotlivých miniaturních elektrod (μm), pixelů Ty jsou schopny uchovat náboj vzniklý po jejich ozáření Čipy o velikosti až několika tisíc na několik tisíc pixelů

32 CCD Front illuminated Back illuminated front back

33 Disperzní prvky Difrakční mřížky a hranoly, monochromátor

34 Difrakční mřížka Světlo, které není monochromatické se na mřížce láme pod různým úhlem v závislosti na vlnové délce (barvě) světla

35 Hranol Světlo, které není monochromatické se stejně jako na mřížce i na hranolu láme pod různým úhlem v závislosti na vlnové délce (barvě) světla

36 Hlavní rozdíl mezi difrakční mřížkou a hranolem je nelinearita disperze světla u hranolu Naproti tomu u hranolu dochází k výrazně nižším ztrátám světla a je levnější na výrobu

37 Monochromátor zařízení které je schopno pomocí disperzního prvku (mřížky nebo hranolu) rozložit polychromatické světlo do spektra a z něho případně vybrat určitou vlnovou délku

38 Absorpční spektroskopie UV-VIS IR CD/LD AAS Fluorescenční spektroskopie Fluorescenční emisní fluorescenční excitační ICP

39

40 Absorpční spektroskopie Měření absorpčních spekter ve viditelné a ultrafialové oblasti UV-Vis spektroskopie Určení látek podle absorpčních spekter Měření koncentrace Změny v absorpci v závislosti na čase reakční kinetiky

41 Elektronová spektra (UV-Vis) Vibrační spektra IR Rotační spektra

42 Elektronová spektra σ -> σ * přechody n -> σ * přechody n -> π* a π -> π * přechody

43 Absorpce záření Teoretický základ -Bouguer-Lambert-Beerův zákon - log(i / I o ) = A = ε. l. c I = I o. 10 -ε. l. c ε... extinkční koeficient umožňuje, pokud jednu z těchto veličin neznáme, z ostatních 4 veličin ji dopočítat zdaleka nejčastěji to bývá koncentrace nějaké známé látky veličina c

44 A = e. l. c A absorbance e extinkční koeficient l optická dráha c koncentrace absorbující látky extinkční koeficient jakou absorbanci má látka při jednotkové koncentraci v kyvetě o jednotkové délce při dané vlnové délce molární extinkční koeficient (mol -1. cm -1 ) specifický extinkční koeficient (A λ 1% )

45 Základní uspořádání absorpčního spektrofotometru (jednopaprskového) Zdroj světla Mohochromátor Vzorkový prostor Detektor

46 Vyšší uspořádání absorpčního spektrofotometru (dvoupaprskového) Zdroj světla Mohochromátor Paprsek rozdělen na vzorkový a referenční Vzorkový a referenční prostor Dva detektory

47 Omezení použití: Absorbance nesmí být příliš malá (0,4) ani příliš vysoká (1) Rozptyl světla Luminiscence vzorku

48 Absorpční spektrum Absorpce záření o různé energii (frekvenci, vlnové délce) při interakci s hmotou Spektra čárová atomy prvků v plynném stavu Spektra pásová molekuly (atomy v jiném než plynném stavu) Pásy tvoří vzájemně se překrývající spektrální čary (homogenní rozšíření)

49 Čárová spektra absorpční a emisní

50 Čárové spektrum vodíku

51 Rozšíření spektrálních čar Jedna molekula má v principu velmi úzkou spektrální čáru. Homogenní rozšíření Vliv konečné doby života excitovaného stavu (důsledek Heisenbergova principu neurčitosti). Typické doby života excitovaných stavů do 10 ns dávají rozšíření čar do 10-4 cm -1 (resp. 100 khz). Nehomogenní rozšíření Vliv rozdílného lokálního pole v okolí jednotlivých atomů nebo molekul. Např. vliv rozpouštědla nebo krystalu na látku. Rotačněvibrační stavy molekul.

52 Rozšíření spektrálních čar pásová spektra V (ν n ) elektronová pásy V rozšířené o vibrační hladiny ν ν(j n ) vibrační pásy ν rozšířené o rotační hladiny J

53 Typická absorpční spektra nejběžnějších rostlinných barviv Chlorofyl a Chlorofyl b Karotenoidy

54

55

56 Fluorescenční spektroskopie Měření fluorescenčních spekter ve viditelné a ultrafialové oblasti UV-Vis spektroskopie Určení látek podle fluorescenčních spekter Přenos energie FRET Měření koncentrace Změny ve fluorescenci v závislosti na čase reakční kinetiky

57 Fluorescenční spektroskopie Excitace molekulyabsorpce záření o energii odpovídající elektronovému přechodu Emise záření vyzáření energie ve formě fotonů při deexcitaci do základního stavu

58 Základní uspořádání fluorescenčního spektrofotometru Zdroj světla Excitační monochromátor Vzorkový prostor Emisní monochromátor Detektor

59 Emisní měření spektra emisního záření při jedné excitační vlnové délce Excitační monochromátor nastaven na fixní vlnovou délku (většinou maximum absorpce) Emisní monochromátor skenuje spektrum emitovaného záření

60 Excitační měření spektrální účinnosti excitace látky při jedné vlnové délce emise Emisní monochromátor nastaven na fixní vlnovou délku (většinou dál za maximem emise fluorescence) Excitační monochromátor skenuje spektrum ukazující, které vlnové délky jsou schopné excitovat zkoumanou látku

61 Emisní spektrum je většinou zrcadlovým obrazem absorpčního spektra.

62 Excitační spektrum molekuly v principu odpovídá spektru absorpčnímu. To neplatí pokud máme směs molekul kde dochází k přenosu energie, je přítomen zhášeč a podobně.

63

64 IR infračervená spektroskopie Spektra v oblasti infračervených vln charakterizují jednotlivé vibrace vazeb v molekulách Identifikace látek Určení jejich struktury

65

66 CD/LD cirkulární a lineární dichroismus metody polarizované spektroskopie

67 CD cirkulární dichroismus CD - rozdílná absorpce pravotočivě a levotočivě kruhově polarizovaného světla opticky aktivní látky Identifikace látek Sekundární struktura bílkovin Struktura DNA Excitonová interakce mezi molekulami

68 Asymetrický uhlík opticky aktivní látky Opticky aktivní látky mají rozdílnou absorpci pravotočivě polarizovaného a levotočivě polarizovaného světla

69 Rozdílná CD spektra pro různé proteinové sekundární struktury

70 LD lineární dichroismus LD - rozdílná absorpce navzájem kolmého lineárně polarizovaného světla Určení struktury o orientace chromoforů

71 Rozdíl mezi absorpcí rovnoběžně a kolmo lineárně polarizovaného světla spektrum lineárního dichroismu A LD = A - A A

72 Orientace vzorků

73

74 AAS atomová absorpční spektroskopie ICP indukčně vázané plasma / optická detekce Analytické metody schopné ve vzorku identifikovat takřka veškeré prvky periodické soustavy

75 AAS atomová absorpční spektroskopie Látka se převede do plynného stavu a atomizuje v plameni (AAS) Měří se absorpce jednotlivých atomů

76 Čárové absorpční spektrum absorpce atomů jednotlivých prvků

77 ICP indukčně vázané plasma / optická detekce Látka se převede do plynného stavu a atomizuje v plazmatu (ICP) Optická detekce měří se emise záření jednotlivých atomů excitovaných plazmatem

78 Čárové absorpční spektrum emise záření z plasmou excitovaných atomů prvků

79 Čárové spektrum absorpce a emise záření atomů jednotlivých prvků

80 Schematické shrnutí principů AAS a opticky detekovaného ICP AAS čárové absorpční spektrum - absorpce atomů jednotlivých prvků ICP čárové emisní spektrum emise atomů jednotlivých prvků

81

82