Cílem mé bakaláské práce bylo poskytnout pehled o problematice geneticky modifikovaných organism. Práce je rozdlena do nkolika kapitol, ve kterých

Transkript

1 Cílem mé bakaláské práce bylo poskytnout pehled o problematice geneticky modifikovaných organism. Práce je rozdlena do nkolika kapitol, ve kterých samostatn popíši jednotlivé oblasti, kde se geneticky modifikované organismy uplatují. Je to pedevším rostlinná výroba a živoišná výroba. Další velkou kapitolou je pak produkce potravin moderními biotechnologiemi. Novou technologií je napíklad biofortifikace, která bude v této práci také popsána. Nové biotechnologie rovnž produkují mikroorganismy pro mlékaský prmysl nebo pro pivovarnictví. Transgenní organismy se s úspchem využívají i v jiných oborech, a už je to farmaceutický prmysl, medicína nebo technické využití. Modifikované organismy jsou také vhodné pro výzkumné úely. Poslední kapitola bude vnována legislativ a jsou zde zmínny laboratoe, které se v eské republice zabývají diagnostikou geneticky modifikovaných organism. 1

2 Geneticky modifikovaný organismus (GMO) je organismus, krom lovka, jehož genetický materiál byl zámrn zmnn technikou genetické modifikace a zachoval si schopnost reprodukce [69] [70]. Organismem se rozumí biologická jednotka, bunná nebo nebunná, schopná rozmnožování nebo penosu ddiného materiálu vetn vir, viroid a živoišných a rostlinných bunk v kultue [69] [70]. Genetickým materiálem je deoxyribonukleová (DNA) nebo ribonukleová kyselina (RNA) [69] [70] Genetickou modifikací (neboli transgenozí) je cílená zmna ddiného materiálu organismu zpsobem, kterého se nedosáhne pirozenou rekombinací, a to vnesení cizorodého ddiného materiálu do ddiného materiálu organismu nebo vyntí ásti ddiného materiálu organismu [40] [69] [70]. Cisgenní organismy nenesou žádné cizorodé geny, mají pouze zmnny funkce gen, jež jsou nedílnou souástí jejich vlastní ddiné informace [33]. Genové inženýrství umožuje kontrolovan mnit DNA s ím zpravidla souvisí i fenotypová zmna, nejastji syntéza nového genového produktu. Jeho technikami lze penést izolovaný gen i mezi jednotlivými druhy organism (nap. eukaryotický gen do bakterií). Zabývá se vytváením pozmnných i nových gen nebo pípravou nových (nepirozených) kombinací gen a jejich zavádním do genomu organizm s cílem rekonstruovat jejich genetickou výbavu. Metodickým základem genového inženýrství jsou manipulace s DNA in vitro založené na píprav rekombinantních molekul DNA a jejich klonování. Tyto metody jsou možné díky objevení dvou typ enzym restrikní endonukleasy (pro získání požadovaného fragmentu) a ligasy (pro vložení fragmentu do takové molekuly DNA, která je schopna replikace ve zvoleném typu bunk). Potomci jsou pak oznaováni jako klon [8, 16, 17]. 2

3 V lahdkáství nedaleko pláže Waikiki na Havaji si v listopadu 1972 povídali pánové Herbert Boyer z Kalifornské university v San Francisku a Stanley N. Cohen ze Stanford University. První objevil zvláštní enzymy, které pestihují DNA v uritém míst tak, že se vzniklé konce zase snadno spojují. Druhý studoval malé kroužky DNA zvané plasmidy v bakteriích. Dohodli spolený pokus: pomocí Boyerových enzym vloží kousek cizorodé DNA do Cohenova plasmidu, který ji vnese do bakteriální buky; co to udlá? Když takto vnesli do bakterie DNA pedstavující jeden z gen žáby, bakterie produkovala píslušnou žabí bílkovinu. Tento výsledek pednesli v dalším roce na Gordonské konferenci v New Hampshire. Zrodila se technika rekombinantní DNA (rdna), neboli stíhání gen [12]. Herbert Boyer spolen s bankéem Robertem Swansonem založili biotechnologickou firmu Genentech vkladem 500 dolar. Dva mladí vdci Dennis Kleid a Dave Goeddel pracovali na penesení genu pro inzulín do bakterie, získání obou etzc inzulínu a jejich spojení. V noci ze dne 23. srpna na 24. srpna se jim to podailo. Díky tmto 20 nanogramm pišel 14. íjna 1980 historický den pro firmu Genentech. Burza na Wall Street po otevení zaala prodávat akcie této firmy za 35 dolaru, za 20 minut cena vzrostla na 89 a veer konila na 71 1/4. Zakladatelé tedy za svou ástku 500 dolar získali každý po 66 milionech. A tímto se odstartoval velký boom biotechnologického prmyslu [11, 12]. Následn zaaly vznikat nové biotechnologické firmy, z nichž nkteré fungují dodnes. Nejvýznamnjším produktem byl peptidy pro farmaceutický prmysl pipravované fermentací z transgenních kvasinek nebo bakterií. To mlo znaný medicínský význam, tímto došlo ke snížení ceny lék a zvýšení jejich bezpenosti. Pedtím byly získávány z lidských zdroj a v nkterých pípadech se tak mohly penést i nkteré závažné choroby [11]. Náhodné genetické zmny se djí spontánn i u divokých druh rostlin. Lidé se po staletí zapojovali do kížení rostlin, užitím selektivní hybridizace ke zvýšení užitených vlastnosti, následované zptným kížením pro eliminaci nechtných gen. Genové inženýrství mže spustit žádoucí vlastnost daleko preciznji pomocí penesení specifických genetických materiál do rostlinných bunk. Vlastnost by mla být ízena nejlépe jedním nebo nkolika málo geny a nkde v pírod tyto geny najít. Mže to být jakýkoli organismus, protože zpsob genetického kódování je univerzální [11, 55]. 3

4 Možnost modifikovat rostliny se poprvé objevila v roce 1978 (penos pomocí Agrobacterium tumefaciens) [31]. V roce 1994 byla na trh poprvé uvedena GM plodina. Bylo to raje FlavrSavr (Lycopersicon esculentum) s prodlouženou životaschopností [8]. Obr. 1: Antisence modifikace [60] Genetickou modifikací je snížení polygalakturonázové (PG) aktivity. Nová odrda byla vyvinuta pomocí inzerce další kopie genu kódující PG v antisense orientaci, výsledná redukce translace endogenních PG messenger RNA (mrna). PG enzym je hlavním mechanismem degradace pektin v rajeti vedoucí k mknutí plod. Transgenní odrdy dozrávají normáln,ale byla zaznamenána pozdjší degradace pektin. Mají zvtšenou tloušku a konzistenci, která setrvává ve všech fázích sklizn i zpracování. FlavrSavr raje bylo vyvinuto transformací pomocí Agrobacterium tumefaciens, který obsahoval transferovou DNA (T-DNA) a kopii rajecího genu kódujícího PG v antisense orientaci. Navíc T-DNA obsahovala sekvenci kódující enzym neomycin fosfotransferázu II (NPTII). Exprese aktivity NPTII se využívá k vyselektování transformovaných rostlin. Výsledkem transkripce antisense genu pro PG není žádný nový protein [4, 14] V roce 1996 to byly další plodiny jako sója, kukuice, epka nebo bavlník s odolností vi herbicidm i škdcm. 4

5 Prvním naklonovaným savcem na svt byla ovce Dolly v laboratoích Roslin Institutu ve Skotsku. Narodila se 5. ervence 1996 a mla ti matky. Jedna matka dodala DNA, druhá vajíko, do kterého byla DNA injektována a tetí donosila výsledné embryo. Ke klonování byla použita metoda jaderného penosu [44]. Obr. 2: Fáze jaderného penosu [44] Jde o penos jádra z diploidní buky (obsahující gen a plnou sadu párových chromozom) do neoplodnné vajené buky, ze které byl jaderný materiál odstrann (žluté obrázky). Technika zahrnuje nkolik krok. Jádro mže být peneseno (modré obrázky) nebo intaktní buky mohou být vloženy do oocytu. V jiném pípad dojde k fúzi oocytu a donorové buky a rekonstruované embryo je aktivované krátkými elektrickými pulzy. V ovci jsou pak embrya kultivovány asi 5 až 6 dní a pokud se vyvíjí normáln jsou implantovány do náhradních matek [44]. Genetické modifikace živoich prodlávají v poslední dob ohromný rozvoj, který však stále zstává nevyužit. To zpsobuje pedevším nejistota odbytu produkt geneticky modifikovaných hospodáských zvíat a v nkterých pípadech i nejasnostmi provázejícími dopad chovu GM živoich na životní prostedí. 5

6 ! " #$ % $& o výbr genu() pro dosažení požadovaných nových vlastností o izolace vhodného genu() a klonování genu v bakterii o úpravy genu() o vnesení a integrace genu do ddiného základu rostliny (transformace) o selekce transformovaných rostlin o sledování projevu transgenu o testy v uzavených prostorách laboratoí a skleníku o vyhodnocení biologické bezpenosti o polní zkoušky transgenních rostlin o hodnocení biologické bezpenosti o registraní zkoušky GM odrdy [64]! ' Ne všechny transgenní rostliny jsou využívány v zemdlství, ást je použita i pro výzkumné úely a poté zniena. Podle penosu DNA do bunk rozlišujeme nkolik metod: Pímé: a. elektroporace protoplast Narušení bunné membrány elektrickým pulzem, takže do ní mže vstoupit makromolekula DNA [3, 21, 58] Používá se pro pechodnou i stabilní transfekci. b. mikroinjekce DNA Roztok DNA aplikován pímo pes plazmatickou membránu do cílové buky tenkou jehlou mikromanipulátoru [21, 58] 6

7 c. bombardování mikroprojektily [3, 34, 58] Zaízení oznaované jako gene gun umožní vytvoit v bunné stn rostlinných bunk otvory. Tyto otvory vznikají nastelováním ástic zlata nebo wolframu pokrytých uritým genem. Takto byla modifikována vtšina dnešních transgenních obilovin. Úinnost transfekce závisí na bunném typu, bunné hustot a stupni proliferace, na kultivaním mediu, na nastavení parametr pušky a na typu a velikosti mikroprojektil. 2. Nepímé: a. Agrobacterium tumefaciens semena, listové disky, koeny, vakuová infiltrace Jednou z nejvíce používaných metod transformace rostlin je práv transformace pomocí rostlinného patogena Agrobacterium tumefaciens. Bakterie pevede ást své vlastní DNA (Ti-plasmid tumor-inducting ) do genomu rostlin a tento plasmid je pak schopen vyvolat tvorbu tumoru. Za to odpovídá ást Ti-plasmidu oznaovaná jako T-DNA (integrace do chromozomu). Buky nádoru pomocí nkterých gen bakteriální buky produkují opiny, které slouží jako zdroj energie, uhlíku i dusíku [3, 6, 17, 32 58, 66]. Obr. 3: Agrobacterium tumefaciens na rostlinných bukách [64] V laboratoích lze bakterii pizpsobit tak, aby byla schopna penosu zcela uritých gen. Transfekce však neprobhne ve všech pípadech úspšn, je tedy nutné tyto buky od sebe oddlit. Proto se penáší zárove i geny, které toto vyselektování umožují. Jsou to vtšinou geny rezistence vi antibiotiku kanamycinu nebo jinému faktoru. Z tchto bunk se pak v laboratoi vypstují rostliny [3, 6, 58, 66] 7

8 ! ( $%$) Transgenní plodiny mohou nést velmi odlišné vlastnosti, které je iní výhodnými pro pstitele, spotebitele i rzná odvtví prmyslu. asto se setkáváme s jejich rozdlením do nkolika skupin (generací), viz nap. systém, který uvádí Bedná (2000): I. generace: plodiny mají pínos pedevším pro pstitele ochrana proti chorobám, škdcm a plevelm, vtší šetrnost k životnímu prostedí (zjednodušení technologií) II. generace: rostliny odolné vi abiotickým stresm, rezistence nebo tolerance k chladu, suchu nebo zasolení pdy, výhody pro zemdlce III. generace: transgenní plodiny s vyšší nutriní hodnotou (vhodné složení mastných kyselin, zastoupení deficitních aminokyselin) a antikarcinogenními úinky, výhody pro spotebitele IV. generace: plodiny pstované jako ekologicky výhodné suroviny pro nkterá prmyslová odvtví V. generace: plodiny používané jako náhrada fosilních paliv (výroba etanolu a bionafty) Dnes jsou pstovány hlavn plodiny první generace [18] První genetické transformace rostlin byly provedeny v 80. letech a nkteré z nich byly dovedeny do formy registrovaných odrd. Mezi nejvýznamnjší GM plodiny patí sója, kukuice nebo bavlník [8, 22]. Obr. 4: Vývoj osevních ploch transgenních rostlin [18] 8

9 Podle pehledu ISAAA (The International Service for the Acquisition of Agri-biotech Aplications ISAAA) (Briefs No ) byly v uplynulém období GMO pstovány celkem na zhruba 400 milionech hektar pdy, 8,5 miliony farmá, v 21 zemích svta, vetn R. V roce 2005 bylo asi 90 milion hektar oseto schválenými GMO. Podle údaj ISAAA (2005) je oficiáln pstována nejvíce sója (54,4 m ha = 60%), kukuice (21,2 m ha = 24%), bavlna (9,8 m ha = 11%) a epka (4,6 m ha = 5%) [8, 48]. Mezi nejvtší pstitele geneticky modifikovaných plodin patí USA, Argentina, Kanada, ína a Brazílie. Dále se pstování rozšiuje i do íny a Indie nebo jihovýchodní Asie [8, 22].! Herbicidy Plevele omezují kulturní plodiny v rstu (slunení záení, voda, živiny). V konvenním zemdlství dominuje chemická ochrana proti plevelm v podob selektivních herbicid, které jsou toxické jen pro herbicidy. Neselektivní (totální) herbicidy se požívají jen mimo ornou pdu. Modifikované plodiny s geny pro toleranci k herbicidu tolerují ošetení neselektivními herbicidy. Nkteré plodiny mají schopnost metabolizovat pomocí enzym nkteré herbicidy na neúinné látky, jiné mají enzym necitlivý k úinku herbicidu další herbicid prost nepijmou [18] [31]. Místem toxického úinku herbicidu bývá obvykle jediný enzym, který je podstatný pro život rostliny. Pro navození rezistence rostlin k herbicidm existují ti hlavní mechanismy transgenoze: 1. transgen kóduje nadbytek enzymu, který je aktivován herbicidem transgen pro odolnost k glyfosátu Dne 14. kvtna 2001 byla v eské republice poprvé povolena ke zpracování (ale ne k pstování) transgenní rostlina. Byla to geneticky modifikovaná sója odolná vi herbicidu Roundup, linie GTS [34]. Aktivní složkou herbicidu Roundup je glyfosát (jednoduchá slouenina odvozená od aminokyseliny N-fosfinomethylglycin). 9

10 Obr. 5: vzorec glyfosátu Úinek tchto herbicid je založen na schopnosti blokovat rostlinný enzym 5-enolpyruvylšikimát-3- fosfosyntázu (EPSPS). Specifického enzymu biosyntézy aromatických aminokyselin (tryptofan, tyrozin, fenylalanin) vyskytujícího se pouze u rostlin, nkterých hub nebo mikroorganism. Všechny rostliny potebují aminokyseliny pro svj rst a funkce. Zablokováním této kritické dráhy, se znemožní rostlinám schopnost získání protein a enzym a rostlina hyne. Bakterie (Agrobacterium tumefaciens, Salmonella typhimurium, Escherichia coli) mají alternativní formu EPSPS enzymu, oznaovanou jako CP4-EPSPS, která není inhibována glyfosátem. Rozdíl mezi geny, kódující tyto enzymy je nepatrný. Jednoduchá bodová mutace v genu vymní guanin za cytosin, to má za následek výmnu aminokyseliny alaninu za glycin [43, 47]. Proto je glyfosát neselektivním herbicidem a psobí na všechny zelené rostliny. Geneticky modifikovaná sója Roundup Ready má ddinou informaci obohacenu o gen EPSPS izolovaný z bakterií [31, 32, 34, 43]. 10

11 Obr. 6: Místo psobení glyfosátu [60]: Inhibice glyfosátem Stejnou odolnost vi glyfosátu lze navodit i penosem genu produkujícího enzym glyfosát oxidoreduktázu (GOX), kterým je glyfosát v rostlinné buce rozložen. Tento gen byl klonován z bakterie Achtomobacter. Této metody bylo použito napíklad u epky. Vysoce odolných odrd bylo dosaženo kombinací obou modifikací [34, 47]. 2. transgen kóduje odlišnou formu enzymu, která není herbicidem inaktivována. Rezistence na herbicid fosfinotricin (4-hydroxy-methylphosphinol-D,L-homoalanin), známého jako glufosinát (Liberty, Basta). Herbicid blokuje enzym glutaminsyntázu, která odbourává amoniak, jinak by amoniakové ionty rostlinu otrávily. Z pdní aktinomycety Streptomyces hygroscopicus byl získán gen bar (bialaphos resistance) a ze Streptomyces viridochromogenes podobný gen pat 11

12 (phosphinothricin acetyltransferase). Tyto geny kódují enzym, který je schopen pemny herbicidu na netoxickou sloueninu, která se i rychle rozkládá [31, 47]. 3. transgen kóduje enzym, který rozkládá herbicid. Transgenní rostliny rezistentní proti herbicidu typu sulfonylmooviny (sulfuron) jsou schopny inaktivovat enzym acetolaktátsyntázu, která se úastní syntézy aminokyselin. Transgen byl získán z mutantní linie rostliny Arabidopsis thaliana [47]. V souasné dob existuje ada herbicid rezistentních odrd, které jsou používány v evropském a zejména svtovém zemdlství: Tab. 1 [31] Aktivní složka herbicidu chlorsulfuron isoxazol oxynil sulfonamid plodina cukrová epa, slunenice kukuice, epka, sója bavlník, epka epka Pro uvolování tchto odrd do prostedí nebo do obhu platí písné regulace [31]. Škdci K hubení škdc se využívají úinné chemikálie. V 50. letech se využívalo DDT, které se dnes nahrazuje toxinem z bakterie Bacillus thuringiensis ve form postiku. Vi škdcm jsou odolné Bt-plodiny. Rezistence je zpsobena pítomností genu bakterie Bacillus thuringiensis [31, 34]. Spory tohoto mikroba obsahují krystalický protein - Cry-protein (kódovaný plasmidem, díve deltaendotoxin), který vykrystalizuje a dokáže velmi specificky hubit uritý hmyz. Má úinek na vtšinu lepidopter (motýli, mry, moli), dipter, (mouchy), hymenopter (vosy, vely) a coleopter (brouci). Vzácn s úinkem na nematoda (háátka) [1, 18, 21, 34, 47]. 12

13 Obr. 7: Mechanismus toxicity Bt [67] Cry-protein sám o sob toxický není, na toxický protein se mní až v zažívacím traktu hmyzu. Trávicí proteázy odštpí jeden nebo oba konce molekuly, teprve takto upravená molekula je toxická a rozpouští se jen pi uritém ph. Larvy lepidopter a dipter mají siln alkalické prostedí v zažívací trubici, kdežto brouci a jejich larvy neutrální nebo mírn kyselé. Proto toxiny psobící na první skupinu mají ve struktue pevahu argininu, který je v pípad molekul úinných na brouky nahrazen mén zásaditým lysinem. Další rozhodovací stupe jsou trávicí enzymy, které musí odštpit správnou ást molekuly. Místem úinku upravených peptid jsou specifické povrchové receptory na epitelu hmyzí trávicí trubice. Jakmile se na n peptid naváže, zmní formu své molekuly a v membrán buky vytvoí otvor, který buka není schopna zacelit a hyne. V dsledku toho hyne i ten, kdo krystal pozel hmyzí larva nebo dosplec. U Bt plodin je do rostlinného genomu zaazen gen ídící tvorbu toxické ásti bílkoviny Cry [1, 18, 21, 34, 47]. Viry Ze 600 typ rostlinných vir jich 250 psobí vážnjší onemocnní, která mohou zpsobit ztráty sklizn asi 15%. Rostlinné viry mohou být ssrna, dsrna, ssdna i dsdna. Studia byla zamena pedevším na studium geminivir, které mají kružnicovou ssdna s autonomní replikací v jádrech jako mimochromozomová kružnicová kopie. Dalšími patogeny jsou viroidy tvoené krátkou kružnicovou ssrna [47]. Virová rezistence je tedy velmi dležitá ke zlepšení zemdlské produktivity. Testují se sladké brambory (feathery mottle virus), kukuice (maize streak virus) a africký maniok (mosaic virus). Významným patogenem brambor je luteovirus (Poleovirus sp.) penášený mšicemi. 13

14 Vývoj virus-rezistentní pšenice je zatím ve fázi laboratorního výzkumu, kvli složitému genomu této plodiny [15, 41, 47] Bakteriální a houbové choroby Rezistenci k tmto patogenm zvyšují transgeny kódující chitinázy. Polními pokusy byla otestována epka olejná modifikovaná tímto genem a vykazovala zvýšenou rezistenci k houbovým patogenm Cylindrosporium concentricum, Phoma ingram, Sclerotinia sclerotinium. Zesilující úinek na geny pro chitinázu mají geny kódující glukanázy [47]. Jiným mechanismem, který zvyšuje tuto rezistenci je lysozym bakteriofága T4, narušující bakteriální bunnou stnu. Tímto genem byl modifikován genom bramboru a navodil tak vysokou odolnost k Erwinia carotovora [47].!* +, Je to systém pravidel, které by mly zabránit konfliktm mezi pstováním geneticky modifikovaných plodin a konvenním nebo ekologickým zemdlstvím. Penos pylu z transgenních rostlin by mohl ohrozit ekofarmy, které mají zakázáno používat GM plodiny. Zemdlec by nedostal osvdení pro svj bioprodukt. To znamená, že produkty by se mohly prodávat pouze jako konvenní a tedy na nižší cenu ( v R by mohl být ekologický zemdlec pokutován až do výše 50 tisíc korun). V Evropské Unii je v souasné dob koexistence ešena formou doporuení pro lenské zem, vydaného dne 23. ervence 2003 [4, 5, 15, 25, 31, 42, 45]. Základem úspšné koexistence je dodržování tzv. izolaních vzdáleností mezi sousedními poli s transgenními a nemodifikovanými plodinami. Doplkem ochrany jsou tzv. pufrové zóny (nap. pole s GM plodinou bude obseto konvenní plodinou stejného druhu nebo rodu) [5, 15, 45]. Napíklad pro Bt kukuici jsou stanoveny tyto vzdálenosti: 100 m mezi polem s Bt kukuicí a polem s nemodifikovanou kukuicí, 50 m mezi polem s Bt kukuicí a polem s nemodifikovanou kukuicí, pokud je Bt kukuice obseta 6 ádky nemodifikované kukuice, 600 m mezi polem s Bt kukuicí a polem s kukuicí pstovanou ekologickým zpsobem, 300 m mezi polem s Bt kukuicí a polem s kukuicí pstovanou ekologickým zpsobem, pokud je Bt kukuice obseta 6 ádky nemodifikované kukuice. 14

15 Pokud zemdlec pstuje modifikované plodiny, ml by po dobu minimáln 5 let ukládat všechny dokumenty týkající se pstování i nakládání s plodinou i jejími produkty (nákup, skladování, transport nebo prodej) [5]. Tento systém má tedy vylouit nebo alespo co nejvíce omezit vzájemné poškození producent rzného typu zemdlství [5, 25, 45].!- % Za cisgenní jsou považovány rostliny, do jejichž ddiné informace byly peneseny úplné geny tedy geny obsahující všechny introny a s pipojenými regulaními a terminaními sekvencemi z druh, z kterých by rostliny mohly získat tentýž gen tradiním kížením. Cisgenní rostlina mže nést nkolik takových gen [20, 33, 50]. Do transgenní rostliny byl penesen jeden i nkolik gen z organism, z nichž by se tyto geny nemohly penést tradiním kížením. asto jde o geny i jejich ásti pevzaté ze ddiné informace zástupc jiných íší (napíklad geny bakterií nebo regulaní sekvence z vir) nebo nejrznjší kombinace tchto sekvencí [20]. Souasná legislativa mezi cisgenními a transgenními rostlinami nerozlišuje. Odborníci z university v nizozemském Wageningenu Henk J. Schouten, Frans A. Krens a Evert Jacobsen však míní, že cisgenní rostliny by nemly být posuzovány stejnými normami jako rostliny transgenní. Cisgenní rostliny neobsahují cizorodé geny, byly pouze obohaceny o kompletní geny, které pocházejí ze stejného druhu nebo druhu, se kterým lze rostlinu kížit. Rostliny se tedy v zásad neliší od rostlin, které vznikly klasickým šlechtním a jsou tedy s ohledem na životní prostedí nebo zdraví lovka stejn bezpené [20, 33, 50]. Dá se využít napíklad pi kížení kulturních plodin s plan rostoucími pro zvýšení rezistence vi škdcm nebo chorobám. Pi tradiním šlechtní se genotyp vysokoprodukní odrdy smísí s genotypem, který krom požadovaných gen obsahuje i adu gen nežádoucích, které se pak zdlouhav a složit odstraují dalším šlechtním. Cisgeneze tento proces významn urychlí, protože se penese pouze uritý gen [20, 33, 50]. Této metody se využívá napíklad pi píprav rostlin, které za své vlastnosti vdí vysoké míe heterozygotnosti, jež je udržována vegetativním množením, nap. brambor, jablo nebo banánovník. U plan rostoucí pšenice byly objeveny geny, které zvyšují množství živin a minerálních látek ukládaných do zrna. Bhem šlechtní kulturních plodin na zvýšení výnosnosti se tyto geny vytratily. 15

16 I moderní okrasné kvtiny bhem šlechtní nkteré své geny. U rží nebo karafiát bylo šlechtní zameno hlavn na trvanlivost a vzhled kvtu, piemž pozbyly geny pro svou intenzivní vni [20, 33, 50]. 16

17 *./0 *! Efektivita penosu gen závisí na druhu živoicha, který má být modifikován. Rozdílné metody se volí u savc, pták nebo ryb, protože každý má své specifické problémy. Pi modifikaci pták je nejvtším problémem to, že snesené vejce obsahuje zárodek již v pokroilém vývojovém stádiu. U ryb tyto problémy odpadávají, díky použití mikroinjekí techniky. Jikry ryb jsou dostaten velké a bez tvrdých obal. Geny mohou být do živoišných bunk vpraveny transfekcí: 1. Lipofekce Negativn nabitá lipidová transfekní inidla se váží k záporn nabité DNA, tyto agregáty se pipojí na bunnou membránu a umožní vstup do buky [21, 58]. 2. Pomocí retroviru Živoišné buky jsou modifikovány retrovirem, který obsahuje žádanou DNA. V infikovaných bukách se retroviry stabiln integrují do chromozomu ve form proviru. Pi této metod je omezena velikost penášeného genu (obvykle do 10 kilobazí) [17, 37, 58, 62]. 3. Mikroinjekce Vpravení genu pímo do raného zárodku pomocí sklenné kapiláry, zárodek je následn vpraven do tla náhradní matky, kde se vyvíjí. Tato metoda se používá hlavn u myší, u hospodáských zvíat není snadné získat potebný poet embryí [17, 37, 62]. 4. Embryonální kmenové buky Používá se hlavn k vyazení ( knock-out ) uritého genu. Embryonální kmenové buky se získávají z raných stádií savích embryí, nebo se dokáží neustále množit a jsou schopny diferencovat v jakoukoli tká. Embryonální kmenové buky jsou vpraveny do cizích zárodk a vzniká chiméra, která nese v nkterých ástech tla cizí gen [37, 62]. 5. Klonování Jádro je vpraveno do vajíka, které bylo pedtím zbaveno vlastní genetické informace. Vzniklý jedinec je totožný s dárcem buky. Úspšnost této metody je mnohem vtší už u metod pedchozích (okolo 10%). Klonování bylo s úspchem použito u skotu, koní, prasete, myší nebo králík [36, 37, 62]. 17

18 *! ( $%12/0$) Hlavní využití geneticky modifikovaných živoich je pedevším ve výzkumu v oblasti medicíny nebo biologie (nap. octomilka Drosophilla melanogaster, myši nebo potkani). V zemdlství se dá využít geneticky modifikovaných zvíat k nkolika úelm [36]. *!! 30& ## Nejvtšího úspchu se dosáhlo u myší (nap. penosem gen pro rstový hormon, protein c-ski, rstový faktor IGF1), stejný systém však u hospodáských zvíat nefungoval, zde se objevily spíše zdravotní problémy. S lepším výsledkem byla provedena modifikace lososa, do kterého byl vpraven gen pro rstový hormon pstruha. Takto upravení lososi dosahovali až 4krát vyšší hmotnosti (nkteré druhy transgenních ryb se využívají na Kub nebo v ín). U hospodáských zvíat se jeví být úspšnjší metoda knockoutování genu pro protein myostatin, který reguluje rst kosterní svaloviny. Pokud je tento gen vyazen ze své funkce, dochází k nadmrnému rstu svaloviny (píkladem skotu je plemeno belgické modré) [36, 37, 62]. *!! 30&/ # Vyšlechtní odolných hospodáských odrd by pedstavovalo velký pínos. V tomto ohledu nabízí genové inženýrství daleko vtší možnosti než šlechtní klasické. Významné ekonomické ztráty zpsobuje zánt mléné žlázy dojnic (mastitis). Mléko nemocné dojnice se nesmi používat, léba není dokonalá a onemocnní se asto vrací. Pvodcem je bakterie Staphylococcus aureus, jejíž bunnou membránu narušuje protein lysostaphin z bakterie Staphylococcus simulans. Transgenní zvíata by tedy obsahovala gen pro tuto bílkovinu, která by vznikala pímo v mléné žláze. Genového knockoutu lze také využít ke zvýšení odolnosti vi prionovým chorobám. Naruší se gen kódující prionový protein, který je ve správné konfiguraci neškodný, pokud ale dojde ke pemn vyvolá chorobné zmny nervové soustavy (hovzí BSE spongioformní encefalopatie, oví scrapie nebo lidská Creutzfeld-Jakobova choroba). V ín nebo Velké Británii byly zahájeny projekty s cílem zajistit odolnost drbeže k chipkovým vir A, hlavn vi subtypm, kde hrozí penos na lovka (nap. H5N1, H7N7) [36, 37, 62]. 18

19 *!! 342/0 #)& I zvýšení kvality živoišných produkt lze dosáhnout genetickými manipulacemi. Dala by se tak zvýšit i kvalita masa. Do prasat byl vpraven gen pro enzym ze špenátu (delta-12-desaturasa), který pemuje nasycené mastné kyseliny na nenasycené. Bohužel byly zmnny i chuové vlastnosti masa. Pokusy byly provádny také se složením kravského mléka, nebo se tam nachází látky, které mohou zpsobovat zdravotní potíže, nap. neschopnost štpit laktosu. Jedním ze zpsobu, jak snížit obsah laktosy v mléce, je penos genu pro enzym, který by laktosu štpil již v mléné žláze. Druhým je potlaení syntézy proteinu alfa-laktalbuminu, bez nj není syntéza laktosy možná. Pokud by ale došlo k úplnému vyazení tohoto genu z funkce, narušila by se tím i samotná sekrece mléka. Probíhají také pokusy o tzv. humanizaci mléka. Cílem tchto genetických manipulací je co nejvíce kravské mléko piblížit mateskému. V kravském mléce by se nahradil alfa-laktalbumin za lidský (zdroj esenciální aminokyseliny cysteinu) a zvýšila by se koncentrace laktoferinu, který váže ionty železa a transportuje je pes stevní sliznici, vykazuje také bakteriostatické úinky. V kravském mléce je koncentrace laktoferinu nižší. Bylo by tedy vhodnjší pro kojeneckou výživu [36, 37, 62]. *! ( $%1 # Tato problematika je obsahem zákona. 91/1996 Sb., o krmivech, ve znní zákona. 244/2000 Sb. Bezpenost a vhodnost GM plodin jako krmiva je ízena stejnými kriterii pro posuzování jako bezpenost potravin urených pro lidskou výživu. Krmiva mohou obsahovat transgenní plodiny ve velkém množství. Použitá technologie pi prmyslové výrob mže, ale také nemusí vést k degradaci pítomné DNA a protein. Nejsou však zatím žádné dkazy o jakémkoli škodlivém vlivu, vetn zdraví, produktivity a pohody takto krmených zvíat. Ale tyto závry nelze generalizovat, nebo každý pípad by ml být posuzován samostatn [35, 61]. 19

20 - + Potraviny produkované moderním biotechnologiemi jsou rozdleny do nkolika kategorií: 1. potraviny tvoené nebo obsahující živé/životné organismy (kukuice) 2. potraviny získané nebo obsahující ingredience získané z GMO (mouka, sojový olej) 3. potraviny obsahující jednotlivé složky nebo aditiva produkované GM mikroorganismy (barviva, vitaminy nebo esenciální aminokyseliny) 4. potraviny obsahující souásti zpracované enzymy, které produkují GM mikroorganismy (využití glukosoizomerázy) [15] V souasnosti je na trhu jen nkolik transgenních rostlin. Jsou to herbicid- a insekticid-rezistentní kukuice (Bt-kukuice), k herbicidu rezistentní sója, epka olejka a insekticid-rezistentní bavlník (pro výrobu oleje jako potraviny). Mimoto nkteré státy schválily odrdy papáji, brambor, rýže, tykve, cukrové epy a rajat. Novjší plodiny, jsou nicmén v souasné dob pstovány a je s nimi obchodováno jen omezeném potu zemí, pedevším pro tuzemskou spotebu [15]. V nkterých státech se oznaování GM potravin nevyžaduje. Mezi tyto státy patí pedevším USA a Kanada [7]. V eské republice jsou producenti od 1. ledna 2000 povinni oznaovat potraviny, které obsahují nebo byly vyrobeny z GMO (ale v potravin se již nevyskytují). Výrobcm to ukládá novelizovaný zákon. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a o zmn a doplnní nkterých souvisejících zákon ( 6 odst. 5) [10, 57]. Kontrolu znaení potravin provádí Státní zemdlská a potravináská inspekce, kontrolou živoišných potravin se zabývá Státní veterinární správa. Znaení GMO spadá pod kontrolu Inspekce životního prostedí [57]. Znaení se nevztahuje na výrobky, které obsahují mén než 0,9 % GMO, dle vyhlášky. 113/2005 Sb., ve znní pozdjších pedpis [4, 57]. Oznaují se na obalu nápisem geneticky modifikováno nebo obsahuje geneticky modifikovaný organismus, popípad vyrobeno z geneticky modifikované (-ho)... s názvem použité suroviny [4, 7, 10, 59]. 20

21 -! " # U GM potravin se posuzuje pedevším: 1. výskyt signálních a selekních gen (rezistence na antibiotika) 2. toxické úinky (toxiny jako ochrana proti hmyzu) 3. alergenní úinky (stabilní ásti protein) 4. nutriní úinky (antinutriní látky, zmna složení charakteristických živin, pítomnost nových živin) 5. patogenita (modifikované mikroorganismy) [15] Rezistence Pro vyselektování modifikovaných rostlin se používá gen pro rezistenci na antibiotika (kanamycin nebo hygromycin). Tyto antibiotika se však používají i v lékaství, z tohoto dvodu se objevila obava, že by se mohly geny kódující rezistenci penést do bakterií a dát tak vzniknou odolným kmenm. Bakterie rezistentní ke kanamycinu jsou však všeobecné pítomné a geny se mohou voln vymovat mezi rznými druhy bakterií pirozenou konjugací [47, 65]. Toxiny Mnoho rostlinných nebo živoišných toxických protein bylo vneseno do genomu rostlin, nap. toxiny záškrtu (zpsobuje letalitu rostlinných bunk, v nichž se projevuje, takže je jeho šíení vyloueno) nebo cholery (zvýšení odolnosti k rostlinným infekcím). Klonovány byly i rzné rostlinné lektiny toxické pro obratlovce, nap. ricin. Tyto rostliny ovšem nebudou nikdy pstovány mimo chránné prostory. Všechny laboratoe pracující s transgenozí rostlin musí zajistit písnou izolaci pokusných rostlin od prostedí [47]. Alergie Prevalence potravinové alergie je pibližn 1 2 % u dosplých a 6 8 % u dtí. Nejvíce alergií je zprostedkováno antigen-specifickými protilátkami IgE a jsou charakterizovány jako reakce I. typu. Celkov asi 90 % všech potravinových alergií je spojeno s malým potem specifických protein 21

22 pítomných v osmi nejvtších alergenech: burské oíšky, oechy, kravské mléko, slepií vejce, ryby, korýši (nap. kreveta), pšenice nebo sója [13, 23, 53, 54, 65]. V pípad GM produkt je testování na alergenitu velmi dležité, nebo v tomto produktu dochází k produkci nové bílkoviny. Mohly by nastat dv nebezpené situace : o u nov produkovaného proteinu není alergenita známa (bakteriální protein) o alergenita proteinu je již známa z organismu dárce (protein sóji) [61] Existují mezinárodn uznávaná doporuení na testování, která sestavila Mezinárodní zdravotnická organizace za pomoci FAO v roce Dležitá kritéria používaná pi testování zahrnují (decision tree rozhodovací strom): o pvod peneseného genetického materiálu o sekvenní homologie: aminokyselinová sekvence mnoha alergen je snadno dostupná o imunoreaktivita nového proteinu: pokud je tento protein odvozený ze známého alergenního zdroje nebo pokud má homologní sekvenci se známým alergenem, potom je reaktivita tohoto proteinu s IgE ze séra pecitlivlého jedince stanovena o vliv ph a/nebo trávení: mnoho alergen je odolných ke kyselým žaludením šávám a trávicím proteazám o teplota a stabilita: labilní alergeny v jídle, které jedí vaené nebo prošly jiným procesem ped konzumací jsou mén závažné [13, 23] Když GMO obsahuje geny získané ze zdroje se známým alergenním efektem, potom se musí pedpokládat, že i nový genový produkt je alergenní, jestliže nebyl zjištn opak. Jestliže jsou v GMO obsaženy geny ze zdroj, kde nebyla prokázaná alergenita, bžné testování závisí primárn na srovnání sekvenní homologie se známým alergenem a na stabilit nového proteinu pi trávení nebo zpracování. Ale pouze tato dv kriteria nestaí pi posuzování potenciálního rizika alergenity GM potravin. Zkoumání stability bhem trávení se jeví být pomrn užiteným znakem pi stanovování alergenity GM potravin. Nové proteiny modifikovaných potravin by mohly také hrát dležitou roli pi vyvolání glutensenzitivní enteropatie. Pokud je požadovaný gen získán z pšenice, žita, jemene, ovsa nebo 22

23 píbuzných obilovin, musí být pozorn posuzována možná úloha nového proteinu v podnícení gluten-senzitivní enteropatie [13, 54]. Genetické modifikace nabízejí možnost snížení nebo eliminace proteinových alergen, které pirozen vznikají v uritých potravinách. Píkladem je transgenní rýže, kde bylo touto technologií výrazn redukováno množství hlavních rýžových alergen [13]. -! 5 Biofortifikace je vývoj plodin, které budou mít vyšší obsah mikronutrient.za použití tradiních šlechtitelských meto nebo nových biotechnologií. Genetická modifikace rostlin pro zvýšení obsahu mikronutrient je doplková cesta. Genetické modifikace mže být provedena dvma podstatn odlišnými pístupy. První je použití konvenního šlechtní a selekních technik, vznikají kultivary s vyšším obsahem stopových prvk, lepší využitelností mikronutrient a/nebo sníženým obsahem inhibitor vstebávání stopových prvk. Druhým pístupem je genové inženýrství. Tyto techniky jsou použity k vytvoení nových kultivar s požadovanými vlastnostmi. Píkladem takové metody jsou inzerce nových gen, zvýšení exprese gen již pítomných, ale exprimovaných v malé míe a deprese exprese gen nebo perušení dráhy zapojené do syntézy inhibitor absorpce stopových prvk [26, 28]. -!! 2 # 6 Tato rýže, také známá pod názvem zlatá rýže, má vyšší obsah -karotenu (prekurzor vitaminu A). Vitamin A (retinol) je nezbytný pro zvýšení rezistence k chorobám, chrání ped poruchami zraku a slepotou. Deficience vitaminu A je problém, který pispívá k vážným chorobám a dtské mortalit. Deficience vitaminu A je velkým problémem zdravotnictví rozvojových zemí. Obohacená rýže byla vyvíjena pro pstování v rozvojových zemích. Nynjší úsilí je zamené na zajištní toho, že vitamin A bude efektivn absorbován v lidském stev [15, 19, 38, 56, 68]. 23

24 Obr. 8: Zrno rýže [56]: Dr. Ingo Potrykus (the Swiss Federal Institute of Technology in Zurich) a Dr. Peter Beyer (the University of Freiburg in Germany) vložili do rýže dva geny narcisu a jeden bakteriální gen (bakterie Erwinia uredovora), které realizují tyi kroky potebné pro produkci -karotenu v endospermu rýže. Tyto ti geny produkují enzymy nezbytné pro pemnu geranylgeranyl difosfátu (GGDP) na provitamin A. inzertované geny jsou pod kontrolou specifických promotor. Endosperm je vyživovací tká obklopující embryo semene a tvoí vtšinu rýžového zrna, které jsou konzumovány. Zrna mají žlutou barvu díky pítomnosti provitaminu A [38, 56, 68]. -!! 2 # 2 Prevalence deficitu železa je znan vysoká v tch ástech svta, kde je rýže hlavní denní potravinou, protože v rýži je železa velice málo. Doposud byly dva železo-vázající proteiny inkorporovány do rýže, protože rýže má ve srovnání s jinými rostlinami nkolik výhod. Rýžové proteiny mají velmi nízkou alergenitu, neobsahuje toxické složky a lze dosáhnout velmi vysokých úrovní exprese. Do rýže byl inkorporován železo-vázající protein mateského mléka laktoferrin s vysokou úrovní exprese (5 g laktoferrinu/kg zrna), která byla stabilní po více než pt generací [15, 26]. Každá molekula laktoferrinu váže dva atomy železa a rekombinantní laktoferrin byl pln saturován. Tato metoda je vhodná spíše pro kojence a malé dti, ale u dosplých nemá vtší význam. Proto se u dosplých využívá spíše ferritinu, jehož každá molekula mže vázat až 4500 atom železa [15, 26, 42]. 24

25 Do rýže byt inzerován sojový ferritin, obsah se tak zvýšil dvakrát až tikrát. Jiným genem vloženým do rýže byl gen pro ferritin z Phaseolus vulgaris. Transformace byla zprostedkována bakterií Agrobacterium tumefaciens a s pomocí rýžového glutellinového promotoru se zdvojnásobil obsah železa [15, 26]. -!! 7&12 # & Kyselina fytová je inhibitorem vstebávání železa i zinku a je považována za jednoho z initel pispívajícího k celosvtovému problému deficience železa a zinku. V lidských i zvíecích studiích bylo dokázáno, že exogenní i endogenní fytáza mže redukovat obsah fytátu ve strav a zlepšovat využitelnost stopových prvk. Jinou možností je inzertovat gen pro fytázu do bžných plodin a exprimovat ji ve vysokých hladinách. Píkladem je vložení genu pro fytázu z plísn Aspergillus fumigatus do rýže. Tato fytáza byla vybrána, protože je tepeln stabilní a proto se pedpokládá, že zstane aktivní i po takových procesech jako je vaení. V rýži dosahuje velmi vysoké exprese, ale var porušuje fytázovou aktivitu a je tedy zjištna pouze promnlivá redukce fytát. Nové objevy extremn termofilních mikroorganism mohou pomoci v hledání odolnjších fytáz. Nicmén musí být detailn prozkoumána jejich alergenita [26, 47]. -!! 30$0) #& Cystein nebo peptidy bohaté na cystein vykazují pozitivní vliv na vstebávání železa a histidin má vliv na usnadnní absorpce zinku. Jiné organické kyseliny jako fumarát, sukcinát a citrát také zlepšují absorpci stopových prvk. Pro zvýšení obsahu cysteinu ve strav byl inzertován gen pro rýžový matallothionein-like protein. Tento protein je normáln indukován stresem. Byly vypstovány brambory obsahující nealergenní protein AmA1 izolovány z rostliny Amaranthus hypochondriacus. Hlízy takto modifikovaných plodin se, ve srovnání s kontrolními plodinami, vyznaují vyšším obsahem všech aminokyselin. Produkce cysteinu, methioninu, lyzinu a tyrozinu je obzvlášt dležitá. Jejich množství je znan limitováno v bžn pstovaných plodinách [26, 41, 52]. 25

26 -!!* 30 $ Aminokyseliny jsou základními stavebními kameny protein. Nkteré jsou použity jako prekurzory hormon, neurotransmiter, pigment a jiných biomolekul. Lidé a monogastrická zvíata nedokáží syntetizovat 10 z 20 aminokyselin a potebují tedy tyto esenciální aminokyseliny ve strav. Ale tyto aminokyseliny jsou pítomny ve strav jen v nízkých koncentracích. Mnoho plodin obsahuje pedevším nízké hladiny lysinu, proto se v minulosti rzné pokusy zabývaly zvýšením koncentrace lysinu v rostlinách klasickým šlechtním nebo mutaní selekcí. Lysin je syntetizován spolen s jinými esenciálními aminokyselinami threoninem, methioninem a izoleucinem z aspartátu metabolickou dráhou, která je regulována primárn nkolika cykly se zptnou inhibicí koneným produktem, které ovlivují aktivitu klíových enzym [26, 41, 52]. Konený produkt lysin mže blokovat aktivitu prvního klíového enzymu, který je spolený všem aminokyselinám této dráhy, aspartátkinázy (AK). Krom toho mže lysin také inhibovat aktivitu dihydrodipikolinátsyntázy (DHDPS), prvního enzymu dráhy vedoucí k syntéze lysinu. DHDPS je dokonce citlivjší než AK. Bakteriální geny kódující bakteriální enzymy AK a DHDPS jsou stokrát mén citlivé ke zptné inhibici. Exprese nesenzitivního enzymu DHDPS má za následek šestinásobný vzrst lysinu, exprese AK zvyšuje osmkrát množství threoninu a dvakrát methioninu [52]. -!!- 5$&1/ # Metody biotechnologie byly využity i pi zvyšování zdraví prospšných složek rajat. Flavonoidy tvoí velké a rozdílné skupiny polyfenolických složek, které jsou ubikvitární v rostlinách. Flavonoidy se úastní v mnoha ohledech rstu a vývoje rostlin, jako rezistence vi patogenm, produkce pigmentu a ochranu proti UV záení. Mimoto, díky antioxidaním vlastnostem jsou prospšné lidskému zdraví. V epidemiologických studiích bylo zjištno, že zvýšená konzumace flavonoid by mohla pomáhat chránit proti chronickým chorobám nebo má význam v prevenci nádorových onemocnní. Mnoho hlavních plodin urených pro lidskou stravu bohužel obsahuje jen malé množství flavonoid a jejich jedlý podíl nebo produkce flavonoid nemá optimální antioxidaní vlastnosti. Vtšina enzym úastnící se na biosyntéze rzných flavonoid byla dobe popsána a byly izolovány jejich kódující a regulaní geny [52]. 26

27 Flavonoly jsou skupinou flavonoid, která má velmi dobré antioxidaní vlastnosti a protektivní úinky vi kardiovaskulárním chorobám. Jak biochemické, tak data o genové expresi poukazují na to, že kritickým krokem v biosyntéze flavonol je chalconizomeráza (CHI), klíový enzym této biosyntézy. Biosyntéza flavonol byla up-regulated v rajeti pomocí over-expressing CHI genu z Petunie v transgenních rajatech [52]. -! 8 $/ #)& Mléné výrobky nejsou sami o sob modifikované produkty, ale nkteré z nich mohou být vyrábny pomocí transgenních mikroorganism. Chymozin V potravináství se vyrábí sýry srážením mléka pomocí enzymu chymozinu. V souasnosti je nkolik zdroj tohoto enzymu: sající telata, dosplé krávy a prasata, dále jsou to houby Rhizomucor miehei (neboli Mucor miehei), Endothia parasitica a Rhizomucor pusillus (neboli Mucor pusillus). Dnes se díky moderním biotechnologiím proces získávání chymozinu znan zjednodušil. Chymozin je produkován bakterií Escherichia coli, která byla modifikována telecím genem kontrolující expresi genu pro chymozin. Genem kódujícím chymozin byly také modifikovány kvasinky (Kluyveromyces lactis) a plísn (Aspergillus niger var. awamori). Chymozin produkovaný mikroorganismy je identický se zvíecím enzymem a je také kvalitnjší [2, 24, 27]. Startovací bakteriální kultury Primární funkcí tchto bakterií, oznaovaných jako bakterie mléného kvašení, je pemna laktózy na kyselinu mlénou. Genetické manipulace tchto bakterií by tedy mohly zahrnovat tyto cíle: o rezistenci k infekci bakteriofágem o produkci antibakteriálních látek jako dalších ochranných faktor o specializovaných startovacích kultur, které budou schopny vtší produkce urité chuové látky Jsou to však stále jen potenciální cíle, které dosud nebyly realizovány [2, 24]. 27

28 -! 8 První fází výroby piva je získání mladiny, která je následn fermentována kvasinkami (Saccharomyces cerevisie). Mladina se vytvoí smícháním sladovnického jemene s horkou vodou a pítomné enzymy degradují sacharidy do formy, kterou kvasinky fermentují. Kvli limitující enzymatické aktivit sladovnického jemene fermentativní promnlivosti pivovarských kvasnic, okolo 20 % sacharid extrahovaných do mladiny zstane v pivu. Vtšina sacharid se skládá z dextrin a škrob. K pevedení tohoto materiálu na fermentovatelné sacharidy se používá enzym glukoamyláza, kterou v dnešní dob produkují GM kvasinky. Na konci procesu dojde k odstranní kvasinek filtrací a pasterací [24]. -!* +) / Posuzování bezpenosti GM potravin není v praxi jednoduchý proces, nebo se jedná o komplexní posuzování vzorku, ve kterém je množství chemických látek. Proto byl vyvinut nový zpsob testování bezpenosti produkt biotechnologií, oznaovaný jako substantial equivalence (testování podstatné shody). Testování by mlo vystihnout nepímé úinky genetické modifikace. Je založeno na pozorování míry shody modifikované plodiny s výchozím organismem. Organizace pro hospodáskou spolupráci a rozvoj (zkrácen OECD z angl. Organisation for Economic Co-operation and Development) vydává tzv. konsensuální dokumenty, ve kterých jsou výchozí organismy popsány. Zatím existují dokumenty pouze pro rostliny [2, 34, 54]. Sleduje se zastoupení nutrient, antinutrient a toxických látek. Pokud nejsou zjištny vtší rozdíly mezi potravinami, znamená to, že v dsledku modifikace nedošlo k žádným nežádoucím zmnám a GM potravinu lze považovat za bezpenou. V pípad, že ale rozdíly zjištny byly, nelze potvrdit substantial equivalence, je na vin nkolik vliv. Prvním je tzv. pleiotropní efekt vnášeného genu vyvolaný bu neekanou interakcí produktu vnášeného genu s nkterou komponentou rostliny, neekanou interakcí metabolické cesty podmínné vnášeným genem s jinou metabolickou cestou, jež je rostlin vlastní, nebo neekanou aktivací metabolické cesty, jež není v rostlin obvykle aktivní. Vylouit nelze ani tzv. inzerní mutaci, která vznikne nabouráním vnášeného genu do genu, jenž je rostlin vlastní a je tímto zásahem narušen, takže nemže zajišovat obvyklé funkce. Nejsložitjší je hledání dsledk tzv. somatoklonální variace, která nastala v dsledku chromozomální nestability i epigenetických zmn pi laboratorní regeneraci geneticky 28

29 modifikované rostliny z geneticky modifikovaných. Poté probíhá další testování a zjišování, zda je tato zmna závažná z hlediska bezpenosti rostliny jako potraviny [13, 34, 53, 54]. Konzultace FAO/WHO urila obecné požadavky na stanovení nezávadnosti potravin a potravinových složek odvozených z mikroorganism: o mikroorganismy musí být taxonomicky i genotypicky identifikovány o vnesený materiál nesmí kódovat škodlivou látku a musí být geneticky stabilní o vektory musí být modifikovány tak, aby nemohlo dojít k penosu na jiné mikroby o markerové geny kódující rezistenci na antibiotika se nesmjí použít v mikrobech, které budou v potravin pítomny živé o do potravin se nesmjí zavádt živé mikroorganismy o nezávadnost modifikovaného produkního organismu je testována s ohledem na nezávadnost produktu s vneseným genem, schopnosti pemnit nežádoucím zpsobem výživovou strukturu potraviny a jakékoli píslušné biologické omezení [2] 29

30 9 0)2% #%& 9! ( $%)) Možnost genetických manipulací byla dokázána asi ped 25 lety a s tím také zaal ohromný rozvoj molekulární biologie, nebo se naskytly nové možnosti pro studium ddiných struktur. Díky geneticky modifikovaným organismm se výrazn urychlilo studium i mapování genomu rzných organism. Usnadnilo se studium funkcí promotor, zejména u vyšších organism, kde je jich mnoho. Lze je z organismu izolovat a vložit do jiného vhodného, kde se snadno zjistí jeho funkce. Ve vhodných systémech se dá stanovit síla i tkáová specifika promotor (pírodních i zámrn upravených). Transgenní organismy jsou také vhodné ke zkoumání složitých kaskád vývojových a jiných proces, ale také metabolických drah v rámci biochemie i fyziologie [7]. 9! ( $% 4 Léiva, která byla díve získávána ze zvíecích tkání, se dnes vyrábí pomocí geneticky modifikovaných organism. Píkladem mže být inzulín pro diabetiky, díve získávaný z praseích slinivek. Tento inzulín pomáhá lidem s diabetem, ale lidský inzulín nenahradí nebo se od nj ponkud liší (dvmi aminokyselinami). Imunitní systém nkterých lidí mže tedy na tento inzulín reagovat citliv. Vdci zjistili, že se gen pro lidský inzulín dá vpravit do lidské stevní bakterie Escherichia coli a tu je pak možné pstovat na umlých pdách. Inzulín vyrábný bakterií je zcela istý a v dostateném množství. Takto byl inzulín poprvé pipraven v roce 1982 (rdna technologie) a od devadesátých let 20. století se produkuje ve velkém a levn lidský inzulín pomocí transgenních kvasinek (Saccharomyces cerevisie) - Humulin [8, 30]. Geneticky modifikované organismy pomáhají i pi léb dtí s poruchami rstu (tzv. nanismus). Takto postižené dti si v tle nevyrábí dostatek vlastního rstového hormonu. Zvíecí rstový hormon v tle lovka nepsobí, a proto se využíval hormon izolovaný z ásti mozku (hypofýzy) mrtvých lidí. Hrozilo ovšem nebezpeí Creutzfeldt-Jakobovy nemoci [8]. Jsou však bílkoviny, které bakterie nemohou vyprodukovat v použitelné kvalit. Proto se zaaly pro tuto produkci využívat transgenní zvíata. Takto se napíklad získává srážlivý faktor (VIII a IX) nutný pro lébu lidí postižených hemofilií, alfa-1-antitrypsin pro lébu rozedmy plic, antitrombin 30

31 pro prevenci tvorby nebezpených krevních sraženin apod. Chov tchto tzv. živých bioreaktor je pedmtem innosti specializovaných biofarmaceutických firem a zemdlství se na nm nebude podílet významnjší mrou [8, 36]. Také se zkoumá možnost syntézy antigen savích patogen, které by po konzumaci píslušné rostliny mohly vyvolat imunitní reakci a fungovat jako vakcíny. V transgenních bramborách se podailo ovit (u myší) vakcínu pro hepatitidu B a posléze se podobného výsledku dosáhlo i u tabáku [40, 41]. Transgenních organism se dá také využít pro xenotransplantaci, zde se využívá hlavn transgenních živoich. Pi transplantacích ale dochází k velmi rychlému odvržení práv transplantované tkán (hyperacute rejection). Této reakci by mohla zabránit pítomnost lidských povrchových antigen. Za slibné jsou považovány pedevším geny pro DAF (decay accelerating factor), gen pro MCP (tzv. membrane cofactor protein) a gen pro CD59. Praseí srdce nesoucí na povrchu bunk antigen DAF vydrží 4hodinový prtok lidské krve bez zjevného poškození. Byla získána prasata s rznými kombinacemi gen pro DAF, MCP a CD59 [37]. 9! ( $% 1& ) I v tomto odvtví se dá využít transgenních živoich. Píkladem mže být výroba nového materiálu BioSteel transgenními kozami. Kanadská soukromá spolenost Nexia Bioscience zabudovala strukturní gen pro bílkovinu pavouího vlákna do sekvence pro kozí mlénou bílkovinou. Bílkovina je v mléce v rozpuštném stavu a vysráží se pi snížení ph. Z bílkoviny je pak spádáno vlákno o nízké hmotnosti a velké mechanické odolnosti. Je asi tikrát odolnjší než kevlarové vlákno, využívá se tedy k výrob neprstelných vest nebo v leteckém prmyslu. V medicín se používá k chirurgickému šití pi operacích oka nebo mozku. Je velmi dobe snášeno lidským organismem a po ase je beze zbytku vstebáno [29, 37, 62]. 31