VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav biochemie a mikrobiologie DIPLOMOVÁ PRÁCE

Transkript

1 VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Fakulta potravinářské a biochemické technologie Ústav biochemie a mikrobiologie DIPLOMOVÁ PRÁCE VÝZNAM EXPRESE TRANSKRIPČNÍHO FAKTORU HIF-1α U BUNĚČNÝCH LINIÍ ODVOZENÝCH OD NEUROBLASTOMU Vypracovala: Vedoucí diplomové práce: Školitel: Studijní program: Studijní obor: Bc. Helena Maříková Prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc. Prof. MUDr. Tomáš Eckschlager, CSc. Klinická bioanalytika Laboratorní metody a příprava léčivých přípravků Rok: 2011

2 Tato diplomová práce byla vypracována na Ústavu biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemicko-technologické v Praze a v Laboratoři průtokové cytometrie a molekulární biologie na Klinice dětské hematologie a onkologie, UK 2. LF a FN Motol v období září 2009 květen Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně s vyznačením všech použitých pramenů a spoluautorství. Souhlasím se zveřejněním diplomové práce podle zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách, ve znění pozdějších předpisů. Byla jsem seznámena s tím, že se na moji práci vztahují práva a povinnosti vyplývající ze zákona č. 121/2000 Sb., autorský zákon, ve znění pozdějších předpisů. Souhlasím s prezenčním zpřístupněním své práce v knihovně Ústavu biochemie a mikrobiologie Vysoké školy chemicko-technologické v Praze. V Praze dne 9. května 2011

3 SOUHRN Hypoxie je charakteristickým znakem mikroprostředí solidních nádorů. Adaptace nádorových buněk na hypoxické podmínky má řadu významných biologických dopadů, podílí se na agresivnějším chovaní nádorů, jejich dediferenciaci a je jednou z příčin snížení apoptózy indukované cytostatiky a zvýšení genetické nestability nádorových buněk. Hlavním faktorem, který adaptaci na hypoxické prostředí ovlivňuje, je hypoxií indukovaný transkripční faktor (HIF). Je tvořen dvěma podjednotkami, konstitutivně exprimovanou HIF-1β/ARNT a hypoxií indukovanou HIF-1α s homology HIF-2α a HIF-3α. Obě podjednotky patří do (bhlh)-pas rodiny proteinů. Doména bhlh je nezbytná pro vazbu transkripčních faktorů na DNA a doména PAS pro heterodimerizaci podjednotek α a β. Za snížené tenze kyslíku je HIF-1α podjednotka stabilizována, heterodimerizuje s HIF-1β/ARNT a tento dimer je následně translokován do jádra. Stabilizovaný heterodimer transaktivuje geny, které zprostředkovávají adaptivní odpověď nádorových buněk na hypoxii. Mezi geny regulované HIF-1α patří například vaskulární endotheliální růstový faktor (VEGF), erythropoetin (EPO) a glukosový transporter 1 (Glut1). Pochopení regulačních mechanismů HIF-1α může mít dopad na léčbu zhoubných nádorů. V této práci jsme se zaměřili na sledování dynamiky exprese HIF-1α v průběhu kultivace buněčných linií neuroblastomu v hypoxii (1 % O 2 ) a v normoxii (21 % O 2 ). Pro sledování jeho vlivu na chemorezistenci buněčné linie SK-N-AS odvozené od lidského neuroblastomu jsme se pokoušeli o zavedení metody silencingu genu HIF-1α a inhibici jeho aktivity nízkomolekulárními inhibitory chetominem, YC-1 a LW6. Zjistili jsme nejvhodnější koncentrace inhibitorů vzhledem k míře jejich inhibiční aktivity HIF-1α a cytotoxicitě, která ovlivňuje výsledky experimentů a při pokusu o zavedení do terapie by mohla negativně ovlivnit i nenádorové buňky. Prokázali jsme, že inhibicí HIF-1α je možné potlačit chemorezistenci hypoxických nádorových buněk k fázově nespecifickému cytostatiku cisplatině. Prokázali jsme i normoxickou expresi HIF-1α u buněčné linie SK-N-AS. Pro zjištění její příčiny bude však nutné provést další experimenty, které budou zaměřeny na subcelulární lokalizaci proteinu HIF-1α a DNA analýzu této buněčné linie, díky níž bude možné zjistit mutace v genu VHL.

4 SUMMARY Hypoxia is the hallmark of solid tumour microenvironment. Adaptation of tumour cells to hypoxic conditions has several important biological effects and contributes to the aggressive attitude of tumours and their dedifferentiation. Hypoxia is also one of the reasons for reduced apoptosis in chemotherapy-treated cancerous cells and increases their genetic instability. The main factor that is necessary for adaptation to hypoxic environment is the hypoxia-induced transcription factor (HIF). It consists of two subunits, constitutively expressed HIF-1β/ARNT and hypoxia-induced HIF-1α with its homologues HIF-2α and HIF-3α. Both subunits belong to (bhlh)-pas protein family. The bhlh domain is essential for binding of transcription factors to DNA and the PAS domain provides the heterodimerization of α- and β-subunits. HIF-1α subunit is stabilized at a reduced oxygen tension, forms the heterodimer with HIF-1β/ARNT, which is then translocated into the nucleus. Stabilized heterodimer transactivates genes that mediate the adaptive response of tumour cells to hypoxia. Such genes, as vascular endothelial growth factor (VEGF), erythropoietin (EPO), and glucose transporter 1 (Glut1), are regulated by HIF-1α. Understanding of the regulatory mechanisms of HIF-1α may have an impact on the treatment of malignant tumours. In this study, we focused on exploring the dynamics of HIF- 1α expression in human neuroblastoma cell line SK-N-AS in hypoxia (1% O 2 ) and normoxia (21% O 2 ). We tried to use gene silencing of HIF-1α and inhibition of HIF-1α transcription activity by small molecule inhibitors chetomin, YC-1 and LW6, for observation of its impact on chemoresistance of these cells. We found the best concentrations of these inhibitors with respect to their inhibitory activity of HIF-1α and cytotoxicity, which influences results of experiments and in an attempt to introduce these inihbitors to chemotherapy it could adversely affect the non-neoplastic cells. We have shown that inhibition of HIF-1α can suppress the chemoresistance of hypoxic tumour cells to cisplatin, the cell-cycle nonspecific antineoplastic agent. We demonstrated that HIF-1α is also expressed in normoxic conditions in SK-N-AS cells. To determine its cause, however, we will need to focus our future experiments on the subcellular localization of HIF-1α protein and DNA analysis of this cell line, which could adjust mutations in the VHL gene.

5 Na tomto místě bych ráda mnohokrát poděkovala celé své rodině a všem, kteří mě během studia podporovali, pomáhali mi a v nejedné chvíli mi projevili velkou dávku trpělivosti. Moc děkuji prof. MUDr. Tomáši Eckschlagerovi, CSc. a prof. Ing. Tomáši Rumlovi, CSc. za odborné vedení a za umožnění práce na Klinice dětské hematologie a onkologie UK 2. LF a FN Motol. Můj velký dík za odborné vedení při zpracování tématu patří také MVDr. Janu Hrabětovi, Ph.D. Jemu i RNDr. Jitce Poljakové, Ph.D., Ing. Janě Hřebačkové, Ph.D., MUC. Šimonu Ciprovi a Bc. Tomáši Grohovi děkuji také za vytvoření příjemné pracovní atmosféry a za ochotu vždy pomoci s jakýmkoliv problémem, za cenné rady a odborné připomínky k mé práci. Tato práce vznikla za podpory výzkumných záměrů MŠMT MSM a grantu GAČR č. P301/10/0356.

6 OBSAH 1 Úvod Současný stav řešené problematiky Hypoxie Hypoxií indukované transkripční faktory (HIF) Struktura transkripčního komplexu HIF Regulace transkripce a translace HIF-1α Regulace stability HIF-1α Vazba na DNA cílových genů a alternativní subcelulární lokalizace HIF-1α Regulace transkripční aktivity HIF-1α Biologická funkce HIF-1α HIF-2α HIF-3α Klinické využití dosavadních znalostí o transkripčních faktorech HIF Experimentální část Použité chemikálie, reagencie a protilátky Použité detekční kity Přístrojové vybavení, pomůcky a software Buněčné linie a kultivace buněk Rozmrazování buněčných linií Kultivace buněk Pasážování buněk Sklízení buněk Inhibice HIF-1α Transfekce buněk pomocí sirna Kontrola transfekce pomocí fluorescenčně značené nesilencující sirna Inhibice HIF-1α pomocí chemických inhibitorů Izolace RNA s TRIzol Reagent Kontrola čistoty RNA pomocí agarosové elektroforesy Izolace proteinů Určení koncentrace proteinů Stanovení buněčného cyklu a proliferace buněk SK-N-AS pomocí průtokové cytometrie Stanovení apoptózy a viability buněk SK-N-AS pomocí průtokové cytometrie I

7 3.10 Stanovení aktivity kaspázy Stanovení exprese HIF-1α pomocí metody Western blot (imunoblot) SDS-PAGE Přenos na membránu Blokování nespecifických interakcí Inkubace s protilátkami Detekce PCR Reversní transkripce Kvantitativní polymerasová řetězová reakce v reálném čase Výsledky a diskuse Stanovení exprese HIF-1α pomocí metody Western blot (imunoblot) Exprese HIF-1α v normoxii Ověření hypoxií indukované chemorezistence buněk SK-N-AS pomocí stanovení aktivity kaspázy-3 a vazby Anexinu V Inhibice HIF-1α Utlumení exprese HIF-1α pomocí sirna Inhibice HIF-1α pomocí chemických inhibitorů Vliv inhibice HIF-1α na hypoxií indukovanou chemorezistenci Závěr Literatura Seznam použitých zkratek II

8 1 ÚVOD Neuroblastom (NBL) je nejčastější extrakraniální nádor dětského věku odvozený z nediferencovaných buněk neurálni lišty, které osidlují paravertebrální sympatická ganglia, dřeň nadledviny a paraganglia. Je pro něj charakteristická značná biologická variabilita. Nádory nízkého rizika často samovolně regredují, případně spontánně či při léčbě diferencují 1. Vysoce maligní forma s amplifikací genu MYCN se vyznačuje mimořádně agresivním průběhem s neovlivnitelnou progresí a časným metastazováním 2. V NBL, stejně jako prakticky ve všech ostatních solidních nádorech, jsou v důsledku neadekvátní angiogeneze přítomny hypoxické oblasti. Nádorové buňky jsou schopny se na hypoxické podmínky adaptovat, což má dopad na jeho biologické chování 3. Hypoxie se podílí na agresivnějším chovaní nádorů, jejich dediferenciaci a je jednou z příčin snížení apoptózy indukované cytostatiky a zvýšení genetické nestability nádorových buněk v důsledku zvýšené frekvence mutací 4. Hlavním faktorem, který adaptaci na hypoxické prostředí ovlivňuje, je hypoxií indukovaný transkripční faktor (HIF). Je tvořen dvěma podjednotkami, konstitutivně exprimovanou HIF-1β/ARNT a hypoxií indukovanou HIF-1α s homology HIF-2α a HIF-3α. Za snížené tenze kyslíku je HIF-1α stabilizován a tvoří heterodimer s HIF-1β. Ten je následně translokován do jádra, kde aktivuje transkripci více než 100 genů, které zprostředkovávají adaptivní odpověď nádorových buněk na hypoxii. Mezi geny regulované HIF-1α patří například vaskulární endotheliální růstový faktor (VEGF), erythropoetin (EPO) a glukosový transporter 1 (Glut1) 5. Pochopení regulačních mechanismů HIF-1α může mít významný dopad na léčbu zhoubných nádorů a cévních chorob. Pro sledování jeho vlivu na chemorezistenci buněčné linie SK-N-AS odvozené od NBL jsme zavedli metodu silencingu genu HIF-1α a inihbici jeho aktivity nízkomolekulárními inhibitory chetominem, YC-1 a LW6. 1

9 2 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 2.1 Hypoxie Parciální tlak kyslíku (po 2 ) v lidském těle je variabilní v závislosti na typu orgánu a je podstatně nižší než 21 % O 2 (~160 mm Hg) ve vzduchu, který dýcháme. V plicním parenchymu a krevním oběhu, v dobře vaskularizovaných orgánech, jako jsou ledviny, játra a srdce, se hladina kyslíku pohybuje v rozmezí 4 14 % O 2. V mozku se vyskytují oblasti, kde je pouze 0,5 % O 2, ale i oblasti se 7 % O 2, v oku se hladina O 2 pohybuje v rozmezí 1 5 % a v kostní dřeni 0 4 %. Téměř anoxické jsou chrupavky a rohovka 6. Hypoxie je definována jako stav sníženého po 2 pod kritickou hodnotu (po 2 <30 mm Hg, 0 3 % O 2 ) a může být způsobena sníženým přísunem kyslíku, například ve vyšších nadmořských výškách, nebo lokální ischemií způsobenou přerušením přítoku krve do dané oblasti, například při infarktu myokardu nebo mozkové mrtvici. Nekontrolovaná buněčná proliferace solidních nádorů spolu s neadekvátním cévním zásobením nádorové tkáně vyvolává vznik rozsáhlých hypoxických oblastí. Defektní vaskularizace vede navíc ke sníženému přísunu živin, které se spolu s nedostatkem O 2 podílí na snížení produkce ATP nutného pro buněčnou proliferaci 6. Transkripční odpověď na hypoxii je primárně zprostředkovávána dvěma hypoxií indukovanými faktory HIF-1α a HIF-2α. Ty aktivují transkripci mnoha různých genů nezbytných pro adaptaci buněk na hypoxii. Odpověď na hypoxii na buněčné úrovni zahrnuje přepnutí aerobního metabolismu na anaerobní glykolýzu a expresi stresových proteinů regulujících buněčnou smrt nebo přežití. Další adaptace na hypoxii pro zvýšení přísunu kyslíku probíhá na tkáňové úrovni, zahrnuje erythropoesu a angiogenezi 7,8. Adaptace buněk na hypoxii nádorového mikroprostředí má významné biologické důsledky. Hypoxie indukuje u nádorových buněk zvýšenou rezistenci k chemo- a radioterapii a zvyšuje jejich invazivitu a metastazování. Vyšší produkce kyslíkových radikálů a snížená exprese DNA reparativních enzymů se podílí na genetické nestabilitě nádorových buněk. V konečném důsledku je hypoxie a s ní spojené genetické, biochemické a biologické změny významnou příčinou vyšší agresivity nádorových onemocnění a snížení odpovědi na protinádorovou léčbu 9. Role hypoxie nádorů bude detailněji popsána v kap Hypoxie a chemorezistence. Hypoxie hraje důležitou roli i v patofyziologii plicních a hematologických onemocnění, onemocnění ledvin (akutní poškození ledvin, chronická ledvinná nedostatečnost a diabetická 2

10 nefropatie), hojení ran, zánětu a infekci. Buňky se však dostávají do stavu hypoxie i v rámci fyziologických podmínek. V průběhu rychlé buněčné proliferace v časné fázi embryogeneze stimuluje fyziologická hypoxie výstavbu hematopoetického a oběhového systému Hypoxií indukované transkripční faktory (HIF) Fylogeneticky vysoce konzervovaný transkripční komplex HIF (hypoxií indukovaný faktor) byl objeven v roce 1991 jako transkripční aktivátor erythropoetinu (EPO), až posléze bylo zjištěno, že se účastní celkové odpovědi buněk na hypoxii a že je nejvýznamnějším proteinem buněčné adaptace na hypoxické podmínky 10. HIF je heterodimer složený z HIF-α podjednotky, jejíž exprese je regulována převážně proteasomální degradací, a konstitutivně exprimované HIF-β podjednotky. Dosud byly popsány tři isoformy podjednotky HIF-α (HIF-1α, HIF-2α a HIF-3α), přičemž nejlépe charakterizovány byly HIF-1α a HIF-2α 11. Základní vlastnosti HIF-β podjednotky a jednotlivých HIF-α podjednotek budou popsány níže. Protože předmětem mé práce byl protein HIF-1α, bude v následujícím textu pojednáváno především o něm Struktura transkripčního komplexu HIF Transkripční faktor HIF je složen z podjednotky HIF-α a HIF-β. Nejlépe popsaná podjednotka HIF-1α je tvořena 826 aminokyselinami, gen pro HIF-1α se nachází na lidském chromosomu 14 (14q21-q24) 12. HIF-β podjednotka je kódována genem ARNT, který se nachází na lidském chromosomu 1 (1q21) 13. Tento gen kóduje dvě isoformy (774 AMK a 789 AMK) arylhydrokarbonového receptoru (AhR), který je známý jako arylhydrokarbonový jaderný translokátor (ARNT; AhR nuclear translocator) 5, Isoforma ARNT, která je tvořena 789 AMK, může dimerizovat s HIF-α podjednotkami v buňkách vystavených hypoxii, čímž vznikne transkripční komplex HIF. Mimo to je protein ARNT schopen dimerizovat i s dalšími proteiny z bhlh (basic-helix-loop-helix) rodiny, případně i homodimerizovat 16. Všechny HIF proteiny, HIF-α a ARNT (HIF-β), patří do bhlh rodiny transkripčních faktorů, která obsahuje základní strukturní motiv helix-loop-helix. Ten je lokalizován na N- konci proteinu a zprostředkovává dimerizaci α a β podjednotek. HIF proteiny navíc na rozdíl od ostatních proteinů rodiny bhlh obsahují i druhou doménu, která je důležitá pro heterodimerizaci PAS (Per-ARNT-Sim) doménu. Ta se nachází v centrální části proteinu a původně byla identifikována u proteinů Per, ARNT a Sim. Společně tedy bhlh a 3

11 PAS domény proteinů HIF-α a ARNT umožňují dimerizaci obou podjednotek, která je nezbytná pro vazbu celého transkripčního komplexu na DNA 7,16. (Obr. 1) Obr. 1 Schematické znázornění domén HIF proteinů (adaptováno podle Déry et al. 9 a Hu et al. 17 ). HIF proteiny patří do rodiny bhlh (basic-helix-loop-helix) proteinů, obsahují tedy bhlh doménu, která se spolu s PAS B doménou (Per-ARNT-Sim B domain) podílí na heterodimerizaci α a β podjednotky a vazbě na cílovou DNA. HIF-α podjednotky obsahují ODD doménu (oxygen dependent degradation domain), která je zodpovědná za regulaci jejich stability v závislosti na přítomnosti molekulárního kyslíku. TAD (transaktivační domény) regulují transkripční aktivitu celého transkripčního komplexu, pravděpodobně však na ni mají vliv pouze TAD α podjednotek 9. Znázorněny jsou i NLS (nuclear localization signals) a NES (nuclear export signal). Podjednotky HIF-α obsahují navíc dvě transaktivační domény (TADs, transactivation domains), které jsou zodpovědné za regulaci transkripce HIF cílových genů. N-koncová TAD (N-TAD) se u HIF-1α nachází mezi aminokyselinami , to znamená v tzv. oblasti ODD (oxygen-dependent degradation domain; res ), která je zodpovědná za regulaci stability HIF-1α (její funkce bude popsána v kap Hlavní regulační mechanismus stability HIF-1α za přítomnosti kyslíku). C-koncová TAD (C-TAD) se nachází na samém konci proteinu HIF-1α mezi aminokyselinami (Obr. 1) Tyto domény se podílí na regulaci vazby HIF komplexu na cílovou DNA pomocí koaktivátorů, jako je p300/cbp (viz kap Regulace transkripční aktivity HIF-1α). ARNT obsahuje také transaktivační doménu, ale zdá se, že ta nemá vliv na transkripční aktivitu komplexu. I když jsou α a β podjednotky strukturně podobné proteiny, hlavní funkční komponentou celého komplexu je podjednotka HIF-α. Svědčí o tom její vysoce kontrolovaná exprese v buňkách, která je ovlivňována mírou přítomnosti kyslíku 9 (viz níže) Regulace transkripce a translace HIF-1α Hladina exprese tohoto klíčového faktoru buněčné odpovědi na hypoxii je úzce kontrolována pomocí hladin jeho syntézy a degradace. Transkripce genu kódujícího HIF-1α probíhá konstitutivně, a to převážně díky transkripčnímu faktoru Sp1. V oblasti promotoru 4

12 genu HIF-1α se ale nachází i další specifická místa rozpoznávaná transkripčními faktory AP- 1, AP-2, NF-1 a NF-κB 9. Hladina transkripce HIF-1α bývá v normoxii a hypoxii téměř stejná, ale byla pozorována i zvýšená akumulace HIF-1α mrna v hypoxii 19,20. Na rozdíl od většiny proteinů probíhá translace HIF-1α v hypoxii dál. Předpokládá se, že za selektivní HIF-1α translaci jsou zodpovědné tzv. IRES (internal ribosome entry site) elementy, které se nachází na 5 -netranslatované oblasti (5 -UTR, 5 -untranslated region) HIF-1α genu. IRES jsou zodpovědné za alternativní způsob iniciace translace, který není závislý na 5 cap (7-methylguanosinová čepička). Studie ukázaly možnost vazby PTB (polypyrimidine tract-binding protein) na IRES, díky níž je aktivována translace HIF-1α v hypoxii 21,22. Ta je dále zvýšena, pokud je přítomen i HuR, který patří do rodiny RNAvazebných proteinů Hu/ELAV. Přesný mechanismus translace HIF-1α v hypoxii však dosud není zcela jasný 23,24. Exprese a transkripční aktivita HIF-1α se zvyšuje především v hypoxii (viz níže), někdy je však HIF-1α aktivován i v normoxii. Hlavním regulačním mechanismem stability HIF-1α v hypoxii je utlumení jeho normoxické degradace (viz kap Hlavní regulační mechanismus stability HIF-1α za přítomnosti kyslíku). U normoxické aktivace HIF-1α nemusí být jeho degradace utlumena, proto nejspíš spočívá normoxická indukce HIF-1α převážně ve zvýšení míry jeho translace 9. Další z možných příčin stabilizace HIF-1α v normoxii je v některých nádorech se vyskytující defekt genu VHL, který kóduje von Hippel-Lindau tumor supresorový protein (pvhl). Ten se, pokud není mutovaný, podílí na degradaci HIF-1α v normoxii 25 (viz kap Hlavní regulační mechanismus stability HIF-1α za přítomnosti kyslíku). Na rozdíl od hypoxie se zdá, že normoxická aktivace HIF-1α je tkáňově specifická. Zvýšení míry translace HIF-1α umožňují různé onkoproteiny, virové proteiny 26, růstové faktory, cytokiny a vazoaktivní hormony převážně prostřednictvím aktivace signální dráhy PI3K-Akt (fosfatidylinositol-3-kinasa-akt) 30. Tato dráha aktivuje množství signálních kaskád, které vedou k rozličným buněčným pochodům, řídí především růst buněk a syntézu proteinů, buněčnou proliferaci a přežití 31. Její aktivace je typická téměř pro všechny typy nádorů. Kromě zvýšení translace HIF-1α může být však dráha PI3K-Akt zapojena i do regulace jeho degradace pomocí proteinů OS-9, SSAT2 a RACK1 (viz kap a ). V některých případech je do indukce aktivity HIF-1α zapojena ještě dráha mtor (mtor mammalian target of rapamycin; dráha PI3K-Akt-mTOR) a dráha p42/p44 MAPK (mitogeny aktivované 5

13 protein kinasy, p42/p44 MAPK; původně zvané ERK2 a ERK1, extracellular signal regulated kinase) 29,32. Aktivace těchto signálních drah vyvolává fosforylaci translačního represoru eif4e-bp a ribosomální kinasy p70s6, která reguluje translaci mrna a zvyšuje translaci HIF-1α. Tím se i za normoxických podmínek zvýší transkripční aktivita HIF-1 komplexu a aktivují HIF-1 cílové geny 28,33,34. (Obr. 2) Obr. 2 Regulace translace HIF-1α pomocí signálních drah PI3K-Akt-(mTOR) a MAPK (adaptováno podle Koh et al. 24 ). Za jistých normoxických podmínek je aktivována fosfatidylinositol-3-kinasa (PI3K), která je nezbytná pro působení drah PI3K-Akt, PI3K-Akt-mTOR a MAPK. Do aktivace translace HIF-1α může a nemusí být zapojen komplex proteinů mtorc1 složený z proteinů mtor, Raptor, GβL, PRAS40 a DEPTOR. Ten je aktivován pomocí Akt kinasy a je schopen dále aktivovat p70s6 ribosomální kinasu (p70s6k). Tu aktivuje i samotná kinasa Akt, která je aktivována účinkem PI3K přes fosfatidylinositol trifosfát (PIP3). Nezávisle na PI3K může být Akt kinasa aktivována i pomocí komplexu proteinů mtorc2, který je složený z proteinů mtor, Rictor, GβL a msin1. Mitogeny aktivované protein kinasy p42/p44 (MAPK) mohou být také aktivovány pomocí PI3K a fosforylují jak p70s6k, tak p90s6k. Obě tyto ribosomální kinasy fosforylují ribosomální S6 protein, který indukuje syntézu proteinu na ribosomu Regulace stability HIF-1α Přestože i v normoxii dochází k transkripci a translaci HIF-1α, není v těchto podmínkách stabilní. Ve všech lidských tkáních byla detekována mrna HIF-1α i ARNT (HIF-β) 35. Na rozdíl od podjednotky ARNT, která je exprimována konstitutivně a je stabilní i za normoxických podmínek, je však stabilita HIF-α podjednotek velmi často závislá především na posttranslačních modifikacích probíhajících za přítomnosti molekulárního kyslíku. K expresi HIF-α podjednotek na úrovni proteinu tedy dochází hlavně za hypoxických podmínek, kdy je aktivace těchto proteinů nezbytná pro adaptaci buněk na hypoxii. Bylo však popsáno i množství drah regulujících stabilitu HIF-1α nezávisle na přítomnosti kyslíku. 6

14 Hlavní regulační mechanismus stability HIF-1α za přítomnosti kyslíku Za aerobních podmínek je HIF-1α obvykle velmi nestabilní a prakticky nedetekovatelný, poločas jeho degradace je menší než 5 min 9. V roce 2001 byl definován základní mechanismus degradace HIF-1α závislý na přítomnosti kyslíku v buňce 31. Podjednotky HIF-α jsou za přítomnosti molekulárního kyslíku hydroxylovány na klíčových prolinech (u HIF-1α Pro402 a Pro564; u HIF-2α Pro405 a Pro531), které se nacházejí v tzv. ODD doméně (oxygen-dependent degradation domain) HIF-1α (res ,37 ). (Obr. 1) Specifickou hydroxylaci Pro402 a Pro564 zajišťují enzymy prolyl-4-hydroxylasy (PHDs, prolyl hydroxylase domain-containing proteins), jinak zvané EGLN (egg laying nine). Jedná se o homology produktu genu Egl-9 (egg laying abnormal-9 gene), který byl původně identifikován u Caenorhabditis elegans a Drosophila melanogaster. Byly identifikovány tři isoenzymy, které jsou schopny této specifické hydroxylace PHD1, PHD2 a PHD , přičemž na hydroxylaci prolinů HIF-1α se pravděpodobně nejvíc podílí PHD2, zatímco na hydroxylaci prolinů HIF-2α se více podílí PHD3. Reakce vyžaduje přítomnost molekulárního kyslíku a 2-oxoglutarátu jako substrátů a kyseliny askorbové a Fe 2+ jakožto kofaktorů PHDs 34, 41, 42. Hydroxylovaný HIF-1α je díky ODD doméně rozpoznán von Hippel-Lindau tumor supresorovým proteinem (pvhl). β doména pvhl je vysoce hydrofobní, ale obsahuje dva hydrofilní aminokyselinové zbytky (His-115 a Ser-111), které za nepřítomnosti HIF-1α, nebo pokud není HIF-1α hydroxylován, interagují s molekulami vody. Při hydroxylaci HIF-1α jsou molekuly vody vyměněny za vazbu s ním, hydroxylované proliny tvoří s His-115 a Ser-111 dva vodíkové můstky 43, 44. (Obr. 3) 7

15 Obr. 3 Struktura pvhl komplexu a vazba HIF-1α 43. Schematické znázornění N-segmentu HIF-1α (res ) s vyznačeným hydroxyprolinem 564, který tvoří vazbu s β doménou pvhl. Znázorněny jsou i proteiny elongin C a elongin B, které interagují i s dalšími komponentami E3 ubikvitin ligasového komplexu. Mutace β domény pvhl je zodpovědná za poměrně často se vyskytující Von-Hippel Lindauovu chorobu (VHL). VHL je autosomálně dominantně dědičné onemocnění, které je charakterizované typickou manifestací různých patologických změn, z nichž nejčastější jsou hemangioblastomy centrální nervové soustavy, renální cysty a nádory 25. Tato mutace se může vyskytovat i v nádorech, převážně karcinomech ledviny, které vznikly i mimo rámec VHL choroby 45. α doména pvhl obsahuje F-box motiv, který zprostředkovává interakci s proteinem zvaným elongin C. Ten je součástí komplexu proteinů (elongin B, elongin C, Cul2, Rbx1 (Ring-Box 1) a E2 (ubiquitin-conjugating enzyme)), který spolu s proteinem E1 (ubiquitin-activating enzyme) vykazuje aktivitu E3 ubiquitin ligasy. (Obr. 3) Vazba pvhl tedy zprostředkovává ubikvitinylaci HIF-1α, a tím jej označuje pro 26S-proteasomální degradaci 9, (Obr. 4) 8

16 Obr. 4 Regulace stability HIF-1α v hypoxii a normoxii (adaptováno podle Yee Koh et al. 24 ). V hypoxii nedochází k pvhl-dependentní proteasomální degradaci HIF-1α. Naopak dochází ke stabilizaci HIF-1α a jeho transportu do jádra, kde tvoří transkripční komplex s ARNT/HIF-1β podjednotkou. Za přítomnosti transkripčních koaktivátorů (nejsou vyznačeny ve schématu) může dojít k transaktivaci HIF-1α cílových genů a adaptaci buňky na hypoxické podmínky. Kromě hydroxylace prolinů hraje důležitou roli při degradaci HIF-1α v normoxii i acetylace Lys532, který se také nachází v ODD doméně HIF-1α. Tuto acetylaci zprostředkovává acetyltransferasa ARD1 přenosem acetylu z acetyl-coa. Díky tomu se zesílí interakce mezi HIF-1α a pvhl 9,49,50. V hypoxii ke specifické hydroxylaci Pro402 a Pro564 nedochází, acetylace Lys532 je také snížena a podjednotka HIF-1α nemůže být rozpoznána pvhl, je tudíž stabilizována a akumulována. Kromě toho, že hydroxylace prolinů vyžaduje molekulární kyslík, je v hypoxii inhibována aktivita PHDs i kvůli nedostatku kofaktoru 2-oxoglutarátu, který vzniká v citrátovém cyklu. K inaktivaci PHD v hypoxii pravděpodobně přispívá i zvýšení mitochondriální produkce reaktivních forem kyslíku (ROS, reactive oxygen species) 50. Ty přeměňují Fe 2+ na Fe 3+, který je jako kofaktor pro PHDs nepoužitelný PHDs mohou být regulovány i dalšími faktory, jako je například Siah2 (Seven in absentia homologs 2) E3 ubiquitin ligasa, která je aktivní v hypoxii a podílí se na degradaci PHDs. Zajímavé je, že exprese PHD2 a PHD3 je ale recipročně faktorem HIF-1α v hypoxii zvyšována, což reguluje stabilitu HIF-1α negativní zpětnou vazbou 34,54. 9

17 Modifikace aktivity pvhl závislá na přítomnosti kyslíku Deubikvitinilace Deubikvitinylace je důležitým regulačním prvkem stabilizace HIF-1α. Doposud byl identifikován jediný HIF-1α-deubikvitinylační enzym interagující s pvhl VDU2 (pvhlinteracting deubiquitinating enzyme 2), jinak zvaný USP20 (Ubiquitin Specific Protease 20). VDU2 váže a deubikvitinyluje HIF-1α, čímž jej chrání před proteasomální degradací. β doména proteinu pvhl, která bývá mutovaná u VHL nemoci, obsahuje vazebná místa pro HIF-1α i pro VDU2. VDU2 sám může být tedy také ubikvitinylován a degradován pvhl E3 ligasovým komplexem. Vzhledem k tomu, že je pvhl schopen ubikvitynylovat oba tyto proteiny, hladina HIF-1α v buňkách nádoru je pravděpodobně určena rovnováhou mezi pvhl zprostředkovanou ubikvitinylací a VDU2 zprostředkovanou deubikvitinylací. Jak je ovlivňována tato rovnováha a jaký je přesně vzájemný vtah mezi pvhl, VDU2 a HIF-1α v nádorových buňkách, zatím není zcela jasné. Stejně tak není dosud jasné, zda hraje VDU2 roli i při regulaci hladiny HIF-1α nezávisle na pvhl a dostupnosti kyslíku, tedy zda je VDU2 schopen regulovat hladiny HIF-1α i za některých fyziologických podmínek SUMOylace Několik studií ukázalo, že hypoxie indukuje expresi SUMO-1 (small ubiquitin-like modifier-1), díky čemuž může docházet ke zvýšení hladiny SUMOylace HIF-1α. Dříve se předpokládalo, že SUMOylace HIF-1α stabilizuje 56, nicméně dle novějších poznatků se zdá, že SUMOylace HIF-1α může vést i k jeho pvhl-dependentní degradaci 57. Stabilizace HIF-1α za přispění SUMOylace byla pozorována v hypoxii v nekrotických zónách gliomů. Tam je exprimován protein RSUME (RWD-containing SUMOylation enhancer), který je schopen interagovat s HIF-1α, a tím zvyšovat jeho SUMOylaci. To má v těchto případech za následek zvýšení hladiny HIF-1α a jeho transaktivaci 58. Hypoxií indukovaná HIF-1α SUMOylace může ale způsobit i vazbu pvhl E3 ligasového komplexu na HIF-1α, aniž by byly hydroxylovány Pro402 a Pro564. To má za následek degradaci HIF-1α. SENP1 (SUMO1/sentrin specific peptidase 1) jaderná SUMO proteasa je schopna v hypoxii dekonjugovat SUMOylovaný HIF-1α, čímž mu umožňuje uniknout pvhl-zprostředkované degradaci. Tomu odpovídá vyřazení SENP1, který snižuje expresi HIF-1α pomocí pvhl degradačního mechanismu. Bylo také zjištěno, že SENP1-/- 10

18 embrya vykazují závažnou fetální anémii v důsledku nedostatečné produkce erythropoetinu. To poukazuje na důležitou roli SENP1 v regulaci HIF-1α za fyziologických hypoxických podmínek 57. Mechanismus SUMOylace HIF-1α během hypoxie je však vzhledem ke kontroverzním výsledkům dosavadních studií stále nejasný Modifikace aktivity pvhl nezávislá na přítomnosti kyslíku Dle nových poznatků existuje také mechanismus degradace HIF-1α, který není závislý na množství dostupného kyslíku. pvhl samotný má složitý regulační mechanismus, který řídí jeho stabilitu a afinitu k HIF-1α. Jedním z jeho regulátorů je E2-EPF (endemic pemphigus foliaceus) UCP (ubiquitin carrier protein) 59. Ten je schopen specificky ubikvitinylovat pvhl, což vede k jeho proteasomální degradaci. Zvýšená exprese UCP vede proto k akumulaci HIF- 1α i v normoxii, ke zrychlenému růstu a metastazování nádoru. Naopak při vyřazení UCP se zvyšuje hladina pvhl, inhibuje HIF-1α a zastavuje růst nádoru. Úroveň exprese UCP navíc ve zkoumaných buněčných liniích, primárních a metastatických nádorech koreluje se sníženou expresí pvhl a zvýšenou expresí HIF-1α 60. UCP je zvýšeně exprimován v různých typech nádorů u lidí a právě jeho zvýšená exprese může být jedním z vysvětlení zvýšené hladiny HIF-1α, která je pozorována v normoxických oblastech těchto nádorů 61. Na negativní regulaci stability HIF-1α nezávisle na přítomnosti kyslíku se podílí i protein OS-9 (osteosarkom-9). Ten tvoří ternární komplex s HIF-1α a PHD2 nebo PHD3, čímž umožňuje efektivní hydroxylaci Pro402 a Pro564 HIF-1α. Jeho zvýšená exprese tedy podporuje pvhl-dependentní degradaci HIF-1α v normoxii i v hypoxii. Paradoxně je však OS-9 exprimován v osteosarkomech, které i nadále exprimují HIF-1α. Jeho význam v regulaci HIF-1α v nádorových buňkách tedy zůstává nejasný 62, 63. Další regulátor, jehož funkce není závislá na množství molekulárního kyslíku v buňce, je SSAT2 (spermidin/spermin-n 1 -acetyltransferasa 2). Ten se současně váže na pvhl a elongin C, čímž stabilizuje jejich interakci a umožňuje HIF-1α ubikvitinilaci. Zvýšená exprese SSAT2 snižuje hladiny HIF-1α, zatímco jeho vyřazení hladiny HIF-1α v normoxii i v hypoxii zvyšuje Regulace stability HIF-1α nezávislá na přítomnosti kyslíku a pvhl Kromě pvhl existují v buňkách další regulační mechanismy hladiny HIF-1α, které se zdají být méně závislé na množství kyslíku v buňce a naopak více na specifických podmínkách, např. na přítomnosti růstových faktorů. 11

19 Ubikvitinylace a proteasomální degradace zprostředkovaná RACK1 nebo Hdm2 Stabilita HIF-1α proteinu je nezávisle na dostupnosti molekulárního kyslíku regulována dvěma proteiny, které soutěží o interakci s ním. Jedná se o molekulární chaperon Hsp90 (Heat shock protein 90kDa), jehož funkce je zde tumorsupresorová, a receptor aktivované proteinkinasy C (RACK1). Inhibice Hsp90 umožňuje vazbu RACK1 na HIF-1α, čímž dochází k degradaci podjednotky HIF-1α. RACK1 homodimerizuje a váže se na elongin C a další komponenty E3 ligasového komplexu, což vede k HIF-1α ubikvitinylaci a degradaci. Tato cesta degradace je velmi podobná pvhl-dependentní degradaci. Vazba RACK1-HIF-1α je navíc závislá na přítomnosti SSAT1, který stabilizuje jejich interakci. Na rozdíl od něj dříve popsaný SSAT2 napomáhá vázat právě pvhl 24. Hdm2 (Human double minute 2; lidský analog Mdm2, Mouse double minute 2) je další z možných komponent E3 ubiquitin ligasy, která je schopna indukovat proteasomální degradaci proteinů, na rozdíl od pvhl nezávisle na přítomnosti kyslíku. Hdm2 je jedním z cílových genů tumorsupresorového proteinu p53 a negativní zpětnou vazbou se v normoxii podílí na snižování jeho hladiny. V buňkách vystavených stresovým podmínkám, mezi něž patří i těžká nebo dlouhodobá hypoxie, dochází ke stabilizaci a akumulaci p53. Hladina Hdm2 se v hypoxických oblastech nádorů nemění, ale velmi často je jeho vazba s p53 znemožněna. Bylo prokázáno, že v některých případech se HIF-1α také podílí na stabilizaci p53. Zdá se, že vazbou na něj a Hdm2 znemožňuje HIF-1α degradaci p Namísto p53 pak Hdm2 pravděpodobně degraduje HIF-1α. Zvýšená exprese p53 v těchto studiích totiž korelovala se snížením transkripční aktivity HIF-1α právě kvůli jeho proteasomální degradaci zprostředkované Hdm2 66, 67. Naopak mutace p53, které jsou přítomny téměř u poloviny všech typů nádorů, mají za následek zvýšení hladiny proteinu HIF-1α a jeho transkripční aktivity 66. Bylo tedy prokázáno, že p53 je schopen za silně hypoxických až anoxických podmínek s HIF-1α přímo nebo nepřímo prostřednictvím Hdm2 interagovat 65. Problematika vztahu mezi HIF-1α a p53 je však velmi komplikovaná a leckdy se zdá kontroverzní. V jiné studii měla naopak zvýšená exprese Hdm2 za následek zvýšení hladiny a transkripční aktivity HIF-1α v buňkách. Tyto výsledky poukázaly na možnou funkci Hdm2 v regulaci HIF-1α, která není závislá na interakci s p53 a naopak přispívá k adaptaci nádorových buněk na hypoxii 68. Přesný mechanismus regulace HIF-1α pomocí Hdm2 zůstává také nejasný. 12

20 Ubikvitinylace a proteasomální degradace zprostředkovaná GSK-3β nebo FOXO4 Glykogen synthasa kinasa 3β (GSK-3β) je klíčovým regulátorem mnoha signálních drah, které ovlivňují metabolismus glykogenu, transkripci, translaci, cytoskeletální regulaci, intracelulární vezikulární transport, progresi buněčného cyklu a apoptózu 69. Zprostředkovává také fosforylaci HIF-1α, která vede k následné hydroxylaci prolinů a tím označení HIF-1α pro proteasomální degradaci nezávislou na pvhl 70. Byla zjištěna i interakce GSK-3β s p53, která může regulovat intracelulární lokalizaci p53, usnadnit transkripci p53-cílových genů nebo indukovat apoptózu buněk pomocí p53, v níž může svou roli plnit i již zmíněný Hdm2 71. S expresí transkripčního faktoru FOXO4 (forkhead box O4) souvisí snížení adaptivní buněčné odpovědi na hypoxii. Byla detekována snížená exprese vaskulárního endotheliálního faktoru (VEGF), glukosového transportéru 1 (Glut1) a erythropoetinu (EPO). Tyto proteiny jsou v hypoxii exprimovány právě díky transkripční aktivitě HIF-1α. FOXO4 snižuje i přímo hladinu proteinu HIF-1α, a to v případech, kdy byly inhibovány PHDs zodpovědné za specifickou hydroxylaci prolinů HIF-1α, která je nezbytná pro pvhl-dependentní ubikvitinylaci a následnou proteasomální degradaci HIF-1α. To je důkazem toho, že podobně jako GSK-3β je i protein FOXO4 zodpovědný za degradaci HIF-1α nezávisle na pvhl 72. GSK-3β i FOXO4 jsou negativně regulovány signální dráhou PI3K-Akt, která, převážně za normoxických podmínek, zvyšuje translaci HIF-1α (viz kap Regulace syntézy HIF-1α). Zdá se, že dlouhodobá hypoxie dráhu PI3K-Akt inhibuje, a tím zvyšuje aktivity GSK-3β a FOXO4, což má za následek snížení hladiny a aktivity HIF-1α Vazba na DNA cílových genů a alternativní subcelulární lokalizace HIF-1α Jakožto transkripční faktor je HIF-1α translokován do jádra, kde vytváří funkční transkripční komplex se stabilní podjednotkou ARNT 7,10. Vzniklý heterodimer se váže do tzv. HRE (hypoxia responsive element) oblasti cílového genu, ta obsahuje konzervovanou sekvenci 5'-(A/G)CGTG-3', kterou transkripční komplex HIF-1 rozeznává a váže se na ni (HIF-vazebné místo). Tato sekvence se může nacházet v oblasti promotoru, intronu a/nebo enhanceru cílového genu (možná přítomnost i druhého HIF-vazebného místa). HREs obsahují mimo to i další specifické DNA sekvence nezbytné pro správnou transkripci. Díky vazbě HIF-1 je transaktivován cílový gen, zvýšena jeho exprese a dochází k adaptaci na hypoxii 7,9,16,30,74. 13

21 Byly popsány i případy, kdy byl stabilizovaný protein HIF-1α přítomen v různých buňkách, ale nebyl transkripčně aktivní. Zdá se, že indukované transkripční faktory mohou být přemisťovány z cytoplasmy do jádra a naopak. V cytoplasmě mohou být pravděpodobně navázány na specializované struktury, nebo lokalizovány ve specializovaných vezikulách, které znemožňují jejich proteasomální degradaci a transport do jádra 75. To vysvětluje například stálou normoxickou expresi HIF-1α v neurogenních zónách mozku a v neurálních kmenových/progenitorových buňkách 76,77. Subcelulární lokalizace HIF-1α může být pravděpodobně důležitá i pro jeho proteasomální degradaci, která se zdá být tkáňově specifická. Například v buňkách hepatocelulárního karcinomu (HepG2 buňky) je HIF-1α degradován především v cytoplasmě, zatímco v buňkách ependymu mozku myší je HIF-1α degradován jak v cytoplasmě, tak v jádře 78. Různé regulační mechanismy HIF-1α se tedy mohou projevit různě v závislosti na jejich subcelulární lokalizaci Regulace transkripční aktivity HIF-1α Koaktivátory Jakmile je heterodimer HIF-1 (komplex HIF-1α-ARNT) navázán do HRE cílového genu, je nutná další aktivace transkripce genu transkripčními koaktivátory, se kterými HIF-1 navázaný na cílovou DNA tvoří iniciační komplex. Vazbu koaktivátorů zprostředkovávají TADs (transaktivační domény HIF-1α). (Obr. 1) Ačkoli ARNT podjednotka obsahuje také TAD, zdá se, že pro transkripční aktivitu komplexu HIF-1 není důležitá 79. N-koncová TAD (N-TAD) i C-koncová TAD (C-TAD) HIF-1α jsou vysoce konzervované u jednotlivých živočišných druhů, mezi sebou však vykazují jen asi 20% homologii, což svědčí pro jejich rozdílné transkripční cíle. N-TAD i C-TAD využívají vazbu koaktivátorů, jako jsou p300 a jemu velmi podobný CBP (CREB-binding protein), dále SRC-1 (steroid receptor coactivator 1) a TIF-2 (transcriptional intermediary factor 2) Koaktivátory zvyšují pravděpodobnost iniciace transkripce cílových genů prostřednictvím stabilizace vazby transkripčního faktoru na DNA. p300/cbp koaktivátor má navíc aktivitu histon acetyltransferasy, která je nezbytná pro modifikaci histonů a rozvolnění DNA před zahájením samotné transkripce. Transkripční aktivita HIF-1 může být dále zesílena dalšími transkripčními faktory, jako je Smad3 a STAT3. Ty jsou schopny stabilizovat komplex HIF-p300/CBP 85,86. Transkripční aktivitu 14

22 komplexu HIF-1 zvyšuje i fosforylace koaktivátoru p300/cbp signální dráhou p42/p44 MAPK 87. Na regulaci vazby koaktivátorů se může podílet i přítomnost standardního proteinu p53. Jeho vysoká exprese vede k degradaci HIF-1α, naopak jeho nízká exprese tlumí transkripční aktivitu HIF-1 kompeticí o transkripční koaktivátor p300 (viz kap Koaktivátory) 67, FIH-1 HIF-1α podstupuje kromě hydroxylace prolinů i další posttranslační modifikace, které mají vliv spíš na jeho transkripční aktivitu než na jeho stabilitu. Tzv. faktor inhibující HIF-1 (FIH-1) hydroxyluje specificky Asn803 v C-TAD HIF-1α 89,90, což ze sterických důvodů brání interakci HIF-1α s CH1 doménou p300/cbp koaktivátorů 91,92. Tato hydroxylace je opět závislá na přítomnosti molekulárního kyslíku, stejně jako PHDs vyžaduje i 2-oxoglutarát jako kofaktor a vede k potenciálnímu snížení transkripční aktivity HIF-1α v normoxii 9,93. Studie však prokázaly, že K M FIH-1 pro molekulární kyslík je téměř třikrát nižší než K M PHDs. To znamená, že v počátečních fázích hypoxie je HIF-1α stabilizován díky inhibici PHDs, ale jeho transkripční aktivita je nižší z důvodu stále probíhající hydroxylace Asn803 pomocí FIH- 1, který má k HIF-1α mnohem vyšší afinitu než PHDs. Maximální aktivace HIF-1α vyžaduje proto další snížení parciálního tlaku kyslíku, které již inaktivuje i FIH-1, a tím umožňuje vazbu transkripčních koaktivátorů 89, 94, 95. FIH-1-specifická hydroxylace asparaginu může být ovlivněna aktivací dráhy p42/p44 MAPK, která fosforyluje Thr796 HIF-1α, což hydroxylaci asparaginu pomocí FIH-1brání. Tím je HIF-1 aktivován a zvyšuje transkripční odpověď buněk na hypoxii 96. Na rozdíl od C-TAD domény HIF-1α není aktivita N-TAD domény na regulaci pomocí FIH závislá. HIF-1α má proto bifunkční transkripční aktivitu, která, v závislosti na aktivitě FIH, a tedy na hladině snížení po 2, umožňuje rozdílnou aktivaci genů, která je kontrolována N-TAD nebo C-TAD 97. To potvrzuje i studie s HeLa buňkami, ze které vyplývá, že hladina proteinu HIF-1α a vazba komplexu HIF-1 na DNA se při poklesu buněčného po 2 zvyšuje exponenciálně. Maximální hladina HIF-1α byla detekována při 0,5 % kyslíku a polovina maxima při 1,5 2 % kyslíku 16. Všeobecně je zvýšená exprese HIF-1α typická pro silně hypoxické, perinekrotické oblasti nádoru

23 2.2.6 Biologická funkce HIF-1α HIF-1α zprostředkovává buněčnou odpověď na hypoxii nádorových buněk aktivací transkripce více než stovky genů (Obr. 6) nezbytných pro přežití buněk a jejich adaptaci na hypoxické podmínky 8. Obr. 6 Příklady genů, které jsou aktivované transkripčním faktorem HIF-1α (adaptováno podle Semenza ). Mezi transkripční cíle HIF-1α patří geny podílející se na anaerobní glykolýze, která je za hypoxických podmínek nutná pro získání ATP. Posun od aerobního k anaerobnímu metabolismu, tzv. Warburgův efekt, je pro solidní nádory typický dokonce i za normoxických podmínek. Pro jeho dosažení je nutná aktivace glykolytických enzymů aldolasy A (ALDA, fruktosa-2,6-bisfosfatasa), enolasy 1 (ENO1), fosfofruktokinasy L (PFKL, 6-fosfofrukto-2- kinasa), fosfoglycerátkinasy 1 (PGK1), laktátdehydrogenasy A (LDHA) a glukosových transportérů Glut1 a Glut Při anaerobní glykolýze se zvyšuje produkce laktátu a CO 2, což vede k potenciálně toxické buněčné acidóze. Pro vyrovnání ph je aktivována exprese monokarboxylového transportéru 4 (MCT4), který zprostředkovává transport laktátu ven z buňky, a membránově vázané karbonáthydrolyasy IX (CA9), která katalyzuje přeměnu extracelulárního CO 2 na slabou zásadu, hydrokarbonátový iont (HCO 3 ) 2. HIF-1α aktivuje expresi několika pro-angiogenních růstových faktorů, jako je vaskulární endotheliální růstový faktor (VEGF), destičkový růstový faktor B (PDGF-B, platelet-derived growth factor B), placentární růstový faktor (PGF, placental growth factor), 16

24 angiopoetin 1 (Ang1) a angiopoetin 2 (Ang2). Díky vzniku nových cév se obnoví dodávání kyslíku a živin nádorovým buňkám, proto je zvýšení angiogeneze klíčovým dějem, který umožňuje přežití a růst nádoru (tzv. angiogenní switch) 24,103,104. Kromě toho aktivuje HIF-1α transkripci genů podílejících se na erythropoese (EPO, erythropoetin) 105 a zvýšení průtoku krve v nově vznikajících cévách pomocí syntézy vazoaktivních molekul CO a NO, které slouží jako intracelulární signální molekuly (HO1, hem oxygenase I a inos, induced nitric oxide synthase) 106,107. Růstové faktory, jako je IGF-2 (insulin-like growth factor-2 ) a EGF (epidermal growth factor) jsou oba jak aktivátory, tak cílové geny HIF-1α. Jejich indukce přispívá k proliferaci, růstu a přežití buněk. Exprese proteinů, jako je MMP2 (matrix metalloproteinase 2), CATHD (cathepsin D), UPAR (urokinase plasminogen activator receptor) a KRT (keratin 14/18/19), může být modifikována pomocí HIF-1α a zapojena do migrace endotheliálních či metastatických buněk 108. Aktivace HIF-1α má za následek expresi antiapoptotických, ale i proapoptotických proteinů. Například proapoptotický protein BNIP-3 (Bcl-2/adenovirus E1B 19 kda interacting protein 3) je pozitivně regulován pomocí HIF-1α a může být naopak v některých typech buněk potlačen pomocí HIF-2α 109. Proapoptotický transkripční faktor p53 může být pravděpodobně také exprimován pomocí aktivace HIF-1α, v těchto případech vede k apoptóze, která je p53-hif-1α-dependentní, jejich vzájemný vztah je ale velmi komplikovaný a stále nejasný 94. Zda tedy dojde v hypoxických oblastech nádoru k apoptóze nebo naopak přežití buněk závisí pravděpodobně na tom, zda převáží proapoptotická nebo antiapoptotická role hypoxií indukovaného HIF-1α. Protože k hypoxii dochází i v časné fázi embryogeneze, byly studie HIF-1α zaměřeny i na tuto oblast. Vyřazení HIF-1α v myších embryích vyvolalo kardiovaskulární malformace, nedostatečný neurální vývoj a prenatální úmrtí plodu 50,110. Mimo to byla zjištěna i důležitá role HIF-1α při hojení ran, obnově tkání a procesu zánětu 108, Hypoxie a chemorezistence Vysoká exprese HIF-1α je u různých typů nádorů spojována se zvýšenou úmrtností pacientů. Přežívání a proliferace nádorových buněk v hypoxii svědčí pro důležitou antiapoptickou roli HIF-1α. Zvýšená exprese HIF-1α byla navíc objevena u mnoha nádorů, které mají defektní p53 nebo jiné tumorsupresorové proteiny a které ztratily schopnost opravy 17

25 chyb párování bazí v DNA. To vysvětluje rezistenci mnoha solidních nádorů na ozařování a chemoterapii, jejich zvýšenou invazivnost, metastázování a celkově agresivnější fenotyp, který vede ke zvýšené mortalitě. Výsledný efekt zvýšené exprese HIF-1α však záleží na typu nádoru a na přítomnosti nebo absenci genetických změn, které ovlivňují rovnováhu mezi proapoptickými a antiapoptickými faktory 112. Kyslík v tkáních může difundovat do vzdálenosti µm od nejbližší kapiláry. Vzhledem k této omezené distribuci kyslíku a živin mimo cévní řečiště se hypoxické oblasti vyskytují již v nádorech o velikosti 2 mm 3, které jsou v tzv. prevaskulární fázi 113,114. Buňky, které nejsou schopny adaptace na nedostatek kyslíku a živin, podléhají apoptóze nebo nekróze, proto jsou často přítomny rozsáhlé nekrotické oblasti obvykle v centrální části nádorů 115. Pro nádory je typická odlišná vaskularizace, krevní cévy nádorů jsou obvykle dilatované a stočené a oproti normálním tkáním mají větvený charakter, pro který je příznačná přítomnost nadbytečných smyček a arteriovenózních aneurysmat 90. (Obr. 7) Obr. 7 Schematické znázornění mikroprostředí nádoru v závislosti na vzdálenosti od cévy (1a) a vaskulární systém normálních tkání (2a) a nádorových tkání (2b) 116. Cévy tumorů postrádají hierarchické uspořádání cévního řečiště do arteriol, kapilár a drobných žil. Ve stěnách cév nádorů jsou časté fenestrace, nespojité, nebo dokonce chybějící bazální membrány a menší množství pericytů. Na rozdíl od normálních cév může chybět i perivaskulární hladká svalovina a nádorové buňky mohou být včleněny i do cévních stěn 30,115,117. Všechny tyto abnormality cév a jejich komprese způsobená nadměrnou proliferací nádorových buněk, vedou k deorganizaci a chaotickému průtoku krve nádorem. Výsledkem toho je snížený přísun živin i kyslíku, snížená clearance produktů metabolismu a senzitivita nádorů k lékům, protože i ty jsou transportovány krví 30,118. Pokud jsou chemoterapií usmrceny nádorové buňky, které jsou v blízkosti krevních cév, může se zlepšit 18

26 přísun živin buňkám, které byly do té doby vystavené hypoxii a tak může dojít k následné regeneraci nádoru 110,119. Vliv na rezistenci hypoxických oblastí nádorů vůči chemoterapii může mít kromě neadekvátní vaskularizace tumoru i mechanismus působení léku. Řada cytostatik indukuje tvorbu volných radikálů, které poškozují DNA nádorových buněk. Například doxorubicin je redukován na semichinonový radikál. Ten reaguje s kyslíkem za vzniku superoxidu, který je cytotoxický. Tento mechanismus usmrcení nádorových buněk se však nemůže uplatnit v hypoxické oblasti 94. Pro mnoho chemoterapeutik je také typické, že efektivně působí především na proliferující buňky. Pro hypoxické oblasti nádorů je však typická zástava buněčného cyklu v G0 fázi, k rychlé proliferaci dochází v oblastech lépe zásobovaných kyslíkem. Čím dál od krevních cév se tedy buňky nachází, tím pomaleji proliferují, a tím vyšší je jejich rezistence k chemoterapii 120. Kromě toho aktivuje HIF-1α expresi genu MDR1 (multidrug resistanece 1), který kóduje ATP-dependentní P-glykoprotein MDR1. Ten chrání buňku před cizorodými látkami, např. chemoterapeutiky, které transportuje ven z buňky. MDR1 tak zprostředkovává mnohočetnou chemorezistenci, která je hlavním problémem léčby mnoha typů nádorů 30,121. Cytotoxicitu protinádorových léků ovlivňuje i ph. Extracelulární ph hypoxických nádorů je kvůli vysoké hladině laktátu nízké. Kyselé mikroprostředí nádorů může inhibovat aktivní transport některých slabě zásaditých léků do buňky. Intracelulární ph nádorových buněk je neutrální až zásadité 63, HIF-2α Protein HIF-2α, známý také jako EPAS1 (Endothelial PAS domain-containing protein 1), byl nezávisle objeven několika výzkumnými týmy při hledání nových proteinů rodiny bhlh-pas, které by byly podobné HIF-1α. Oba tyto transkripční faktory jsou vysoce homologní, jejich bhlh domény jsou z 85 % identické a rozpoznávají stejný DNA motiv (HREs), na který se vážou 17. Oba proteiny mají velmi podobnou strukturu (Obr. 8), mechanismus jejich stabilizace v hypoxii i způsob jejich transkripční aktivace je také v některých krocích téměř stejný, nicméně některé regulační mechanismy HIF-1α a HIF-2α se liší a jsou i nadále zkoumány

27 Obr. 8 Schematicky znázorněná strukturní podobnost domén HIF-1α a HIF-2α (adaptováno podle Hu et al. 17 ). Procenta značí podobnost jednotlivých domén. Vyznačena jsou i specifická místa podléhající hydroxylaci, která mají vliv na stabilitu a transkripční aktivitu HIF-α podjednotek. Jedním z příkladů rozdílné regulace HIF-1α a HIF-2α je jejich odlišná aktivace v hypoxii. HIF-1α je plně aktivován v silně hypoxických podmínkách (1 % kyslíku) jako akutní odpověď na hypoxii a jeho hladina postupně při dlouhotrvající hypoxii klesá. Naproti tomu hladina HIF-2α po delší době v hypoxii stoupá a umožňuje i následnou transkripci genů, jako je VEGF. Ten je tedy primárním transkripčním cílem pro HIF-1α v akutní fázi hypoxie a při dlouhotrvající hypoxii naopak primárním transkripčním cílem pro HIF-2α 122. Zdá se proto, že oba tyto transkripční faktory jsou schopny aktivovat transkripci většiny genů, které zprostředkovávají buněčnou odpověď na hypoxii, oba toho však dosahují za rozdílných podmínek. Pro příklad je možné uvést jako další společné transkripční cíle geny kódující proteiny EPO, Glut , CA9 125 a ADM (adrenomedullin), který zvyšuje toleranci buněk na oxidativní stres, hypoxii a podílí se i na angiogenezi. Z experimentů vyplývá, že HIF-2α je stabilizován v normálních i nádorových buňkách již za vyššího po 2, než je tomu u HIF-1α HIF-2α je totiž relativně odolný vůči inhibici pomocí FIH-1 za normoxických podmínek 95,126. Byla sice také prokázána FIH-1-specifická hydroxylace asparaginu HIF-2α (různé zdroje uvádějí různá místa Asn851 89,90,127, 847 nebo ), FIH-1 ale nemá k HIF-2α takovou afinitu jako k HIF-1α 126,127. To tedy vysvětluje, proč je HIF-2α transkripčně aktivní i za téměř fyziologického po 2, jak je tomu například ve vaskulárních endotheliálních buňkách 122,123,128,129. HIF-2α pozitivní jsou i nádorové buňky neuroblastomů v oblastech, které jsou v okolí cév nebo přímo v kontaktu s nimi, a stromální buňky obklopující nádor. Zvýšená exprese HIF-2α je také v buňkách hemangioblastomů, které jsou velmi bohaté na cévy 122. Nález aktivity HIF-2α za téměř normoxických podmínek vysvětluje fakt, že proteasomální degradace HIF-2α je tkáňově specifická 124. Normoxickou transkripční aktivitu 20

28 HIF-2α může zlepšit jeho interakce s proteinem NEMO (NF-κB essential modulator), který je znám také jako IKK-γ (inhibitor of nuclear factor κb kinase subunit γ) a usnadňuje vazbu koaktivátorů p300/cbp na HIF-2α. Interakce mezi HIF-1α a NEMO zjištěna nebyla 130. Mezi proteiny, které jsou přednostně exprimovány pomocí HIF-2α, patří receptor pro angiopoetin-1 (Tie-2/Tek) a VEGF receptor-2 (KDR) podílející se na angiogenezi, LOXL2 (lysyl oxidase like-2), homolog lysyloxidasy, který se podílí na invazivnosti a metastázování nádoru, a CITED2 (CBP/p300-interacting transactivator 2), který je možným negativním regulátorem HIF-1α 131. Specifickým cílovým genem HIF-2α je Oct-4, který kóduje transkripční faktor nezbytný pro pluripotenci kmenových buněk. Jeho aktivace v nádorových buňkách je zodpovědná za dediferenciaci buněk, což bylo prokázáno u neuroblastomů a rakoviny prsu a pravděpodobně je tomu tak i u jiných nádorů Na ztrátě schopnosti diferenciace buněk se zároveň podílí i aktivace signální dráhy Notch Všeobecně tedy HIF-2α transkripční cíle zahrnují geny podílející se na erythropoese, angiogenezi, metastazování, proliferaci a dediferenciaci buněk. HIF-2α se stejně jako HIF-1α podílí jak na fyziologických, tak na patologických dějích, jeho exprese v normoxii je však častější než u HIF-1α a pravděpodobně se více než HIF-1α podílí na embryogenezi. Jeho exprese je tkáňově specifická 3, HIF-3α Regulace a funkce HIF-3α dosud není zcela jasná, je nejméně prozkoumaným proteinem rodiny HIF proteinů. Byl detekován v brzlíku, ledvinách, Purkyňových buňkách mozečku a epitelu rohovky. Zdá se, že může také dimerizovat s ARNT, vázat se na HREs cílových genů a tak aktivovat jejich transkripci 139. Nicméně může podstoupit i alternativní sestřih, který dává vznik tzv. proteinu inhibujícímu PAS doménu (IPAS). IPAS neobsahuje transaktivační domény (TADs), je také indukován hypoxií a je schopen soutěžit s HIF-1α o vazbu s ARNT, čímž působí jako dominantně negativní inhibitor HIF-1α Klinické využití dosavadních znalostí o transkripčních faktorech HIF Aktivace HIF hraje ústřední roli v hypoxických, a za některých okolností i normoxických oblastech mnoha typů nádorů. V hypoxii se podílí na indukci rezistence nádorů vůči radiační léčbě a cytostatikům. Pomocí selektivní inhibice těchto transkripčních faktorů můžeme lépe porozumět jejich úloze v indukci rezistence a inhibici programované buněčné 21

29 smrti, což může mít významný dopad na léčbu nádorových onemocnění. Léky zaměřující se na inhibici aktivity HIF-1α nebo na signální dráhy ovlivňující stabilizaci HIF-1α představují novou skupinu látek, které by mohly pomoci k potlačení chemorezistence nádorů a být tak důležitou součástí kombinované protinádorové terapie 9,30,94. Zvýšená exprese HIF-1α a HIF-2α může být u některých typů nádorů využívána jako marker pokročilého stadia nebo špatné prognózy. Stanovení hladiny exprese HIF-2α je již za tímto účelem využíváno u nemalobuněčného karcinomu plic 141, rakoviny prsu 142,143, močového měchýře 144,145, kolorektálního karcinomu 146 a neuroblastomu 122. Vzhledem ke složité regulaci indukce a aktivace HIF-1α, ke komplikovanému vzájemnému vztahu mezi HIF-1α a proapoptotickými proteiny jako je p53, Bcl-2, NOXA a BNIP3, protoonkogeny, jako je cmyc a dalšími faktory však nemůže sloužit HIF-1α jako univerzální marker agresivního fenotypu všech typů nádorů. Některé studie, zaměřené například na nádory vaječníků, ukázaly, že aktivace HIF-1α může korelovat i s apoptózou nádorových buněk spojenou s expresí standardního proteinu p53. U buněk s mutantním p53 k apoptóze nedocházelo a zvýšená exprese HIF-1α odpovídala zvýšené úmrtnosti pacientů 147. U karcinomu jícnu byla zjištěna vyšší úmrtnost pacientů při zvýšené expresi HIF-1α a Bcl , u nemalobuněčného karcinomu plic korelovala naopak exprese HIF-1α s apoptózou nádorových buněk 149. Dalším možným využitím komplexních znalostí o HIF proteinech je léčba kardiovaskulárních chorob způsobených nedostatečnou perfuzí (infarkt myokardu, cévní mozková příhoda a onemocnění periferních cév). V tomto případě by aktivace HIF mohla sloužit k obnovení angiogeneze a vaskularizace poškozených tkání 150,

30 3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 Použité chemikálie, reagencie a protilátky 40% Akrylamid/Bis roztok (Bio-Rad, USA) BLOCK-iT Fluorescent Oligo (Invitrogen, USA) Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk (Bio-Rad, USA) deoxycholát sodný (Sigma Aldrich, USA) DMSO (Amresco, USA) Fetal Bovine Serum (PAA Laboratories Inc., USA) Foma LP-D regenerátor vývojky (FOMA BOHEMIA spol. s.r.o., ČR) Foma LP-DS startér vývojky (FOMA BOHEMIA spol. s.r.o., ČR) Fomafix + Fomafix H ustalovač (FOMA BOHEMIA spol. s.r.o., ČR) Glutamin (PAA Laboratories Inc., USA) HIF-1 Inhibitor: sc (Santa Cruz Biotechnology, USA) HIF1A ON-TARGETplus sirna (Dharmacon, USA) Chetomin (Sigma Aldrich, USA) IGEPAL CA-630 (Sigma Aldrich, USA) inhibitor proteas Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Roche, USA) Iscove's Modified Dulbecco's Medium without L-glutamine (IMDM; Lonza, Švýcarsko) Iscove's Modified Dulbecco's Medium with L-glutamine (IMDM; Lonza, Švýcarsko) transfekční činidlo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) mix primerů a sond SLC2A1 (GENERI BIOTECH, s.r.o., ČR) mix primerů a sond B2M (GENERI BIOTECH, s.r.o., ČR) mix primerů a sond VEGFA (GENERI BIOTECH, s.r.o., ČR) ON-TARGETplus sicontrol Non-targeting Pool (Dharmacon, USA) Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (Invitrogen, USA) PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas, USA) PBS (Invitrogen, USA) PCR vkládací pufr (Top-Bio s.r.o., ČR) Platidam 50 (PLIVA - Lachema a.s., ČR) primární protilátka HIF-1α (3C144): sc (Santa Cruz Biotechnology, USA) 23

31 sekundární protilátka goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 (Santa Cruz Biotechnology, USA) CO 2 (Linde Gas, ČR) směs plynů v lahvi O 2 1%, CO 2 5%, N 2 94% (Linde Gas, ČR) TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems, USA) TRIzol Reagent (Invitrogen, USA) Trypsin 0,25% (PAA Laboratories Inc., USA) YC-1 (AG Scientific, Inc., USA) Ostatní použité chemikálie (kyseliny, hydroxidy, soli a organická rozpouštědla) byly v čistotě p. a. nebo vyšší. 3.2 Použité detekční kity Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BioVision, USA) Caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit (BioVision, USA) DC Protein Assay Kit (Bio-Rad, USA) DNA Prep kit (Beckman Coulter, Inc., USA) Immun-Star HRP Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, USA) 3.3 Přístrojové vybavení, pomůcky a software Aura PCR box (BIO-Cabinets, Australia) BD CellQuest Pro Software (BD Biosciences, USA) průtokový cytometr BD FACSCalibur (BD Biosciences, USA) blotovací aparatura pro elektrotransfer (Bio-Rad, USA) CAWO ABS X-ray cassette (CAWO, Německo) centrifuga UNIVERSAL 320 (Hettich, Německo) Centrifuge 5415 R (Eppendorf, Německo) Direct-Q 3 Water Purification system (Millipore, USA) filmy na vyvolání Western blotu (FOMA BOHEMIA spol. s r.o., ČR) Gel Doc 2000 (Bio-Rad, USA) GyroTwister S1000 (Labnet, USA) hypoxická komůrka (Billups-Rothenberg Inc., USA) 24

32 laminární box 1 (Clean Air Technology Inc., USA) laminární box 2 (Jouan, France) laboratorní CO 2 inkubátor 1 (Jouan, France) laboratorní CO 2 inkubátor 2 (Shel Lab, USA) IX51 INVERTED MICROSCOPE (Olympus, USA) MS Excel (Microsoft, USA) ph metr Cyber Scan510 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) Quantity One 1-D analysis software (Bio-Rad, USA) REST-MCS beta software (Gene Quantification, Německo) SoftMax Pro Software (Molecular Devices, USA) Spectrofotometer Biomate 3 UV Vis (Thermo Scientific, USA) systém pro detekování proteinů SNAP i.d. (Millipore, USA) Techne Dri-block DB-2A heater (Bibby Scientific Limited, UK) termocyklér ABI 7300 cycler (Applied Biosystems, USA) termocyklér Perkin Elmer GeneAmp 9600 (Certified GeneTool, Inc., USA) VersaMax Microplate Reader (Molecular Devices, USA) VERTICAL ELECTROPHORESIS UNIT Z33,956-3 (Sigma Aldrich, USA) vyvolávací automat (FOMA BOHEMIA spol. s r.o., ČR) zdroj napětí (Bio-Rad, USA) 3.4 Buněčné linie a kultivace buněk Pro studium významu transkripčního faktoru HIF-1α byla použita buněčná linie SK-N- AS odvozená od lidského neuroblastomu S-typu (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, UK). Práce s buněčnými kulturami byly prováděny za sterilních podmínek v laminárním boxu Rozmrazování buněčných linií 10% IMDM (kompletní kultivační médium) IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Lonza) 10% FBS (Fetal Bovine Serum, PAA Laboratories Inc.) (1% glutamin v případě IMDM without L-glutamine, PAA Laboratories Inc.) Médium bylo skladováno při 4 C. 25

33 Buňky jsou dlouhodobě uchovávány zmražené v 1 ml kompletního kultivačního media s 10 % DMSO (dimethylsulfoxid) v kryozkumavkách uložených v tekutém dusíku při teplotě -196 C. Buňky byly rozmrazovány v původních kryozkumavkách ve vodní lázni (37 C, 1 min) a následně přeneseny do uzavíratelné centrifugační zkumavky (15 ml) s 1 ml kompletního kultivačního média. Byly centrifugovány při 1250 x g (centrifuga UNIVERSAL 320, Hettich), 2 min při pokojové teplotě. Po centrifugaci byl odstraněn supernatant. Buňky v peletě byly jemně resuspendovány s částí média, přeneseny do kultivační lahve (25 cm 2 ) s 10 ml 10% IMDM a pěstovány při 37 C v normoxii Kultivace buněk Buněčná linie SK-N-AS byla kultivována v IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) s přídavkem 10 % fetálního bovinního séra (FBS, fetal bovine serum) a 1 % L- glutaminu, dále v textu uváděno jako 10% IMDM. Kultivace probíhala v inkubátoru při 37 C v normoxii (O 2 21 %, CO 2 5%, vlhkost 80 %) a v hypoxii (O 2 1 %, CO 2 5 %, N 2 94 %) v kultivačních lahvích nebo na kultivačních miskách (21 cm 2 a 55 cm 2 ) či v šesti jamkové kultivační desce (9,5 cm 2 ). Počáteční množství buněk určené pro následné experimenty se pohybovalo v rozmezí buněk/cm 2 v závislosti na celkové době a podmínkách kultivace a na kultivační ploše. Buněčnou smrt jsme indukovali přidáním cisplatiny (Platidam 50, PLIVA - Lachema a.s.) v koncentraci 5 µg/ml do kompletního kultivačního média a kultivovali podle uspořádání pokusu 8 72 hod v normoxii a v hypoxii Pasážování buněk Pasážování buněk probíhalo jednou až dvakrát týdně. Všechny chemikálie byly před pasážováním temperovány na 37 C. Inverzní mikroskopií byl zkontrolován nárůst buněk a optimálně při 70% pokrytí kultivační plochy byla prováděna pasáž. Původní kultivační médium bylo odstraněno, dno kultivační lahve s adherovanými buňkami bylo opláchnuto PBS pro usnadnění trypsinace. Následně byly buňky trypsinovány (0,25% trypsin, 2 4 min, 37 C) a poté resuspendovány v menším množství 10% IMDM. Část buněk byla odstraněna, případně použita pro kultivaci na kultivačních miskách. Ke zbylému množství buněk bylo přidáno čerstvé 10% IMDM (10 15 ml pro kultivační plochu 25 cm 2, ml pro kultivační plochu 75 cm 2 ) a buňky byly dále pěstovány při 37 C v normoxii. 26

34 3.4.4 Sklízení buněk Sklízení buněk pro stanovení apoptózy a viability Médium s mrtvými a uvolněnými buňkami bylo přeneseno do centrifugační zkumavky, kultivační plocha misky s živými buňkami byla opláchnuta 1 ml PBS a poté byly buňky v inkubátoru trypsinovány (0,5 1 ml 0,25% trypsinu, 2 min). Po trypsinaci byla k buňkám přidána část předem odebraného média s mrtvými buňkami a všechny buňky byly resuspendovány a následně s médiem přeneseny do centrifugační zkumavky. Centrifugace probíhala 2 min při 1250 x g při pokojové teplotě (centrifuga UNIVERSAL 320, Hettich). Supernatant byl odstraněn a buňky v peletě byly resuspendovány v 1 ml PBS, následně centrifugovány za stejných podmínek. Supernatant byl opět odstraněn a buňky v peletě byly analyzovány vybranou metodou Sklízení buněk pro izolaci proteinů nebo RNA Buňky byly seškrábány buněčnou škrabkou z kultivační plochy misky a spolu s médiem pipetou přeneseny do centrifugační zkumavky, ve které byly centrifugovány 2 min při 2500 x g při pokojové teplotě (centrifuga UNIVERSAL 320, Hettich). Buňky byly promyty PBS, centrifugace probíhala při 2500 x g. Promytí PBS bylo ještě jednou zopakováno a zbylá peleta s buňkami byla skladována v -80 C v mikrozkumavce, nebo resuspendována v 1 ml TRIzol Reagent pro následnou izolaci RNA a skladována v -80 C. 3.5 Inhibice HIF-1α Pro utlumení exprese HIF-1α byla použita sirna cílená proti HIF-1α (HIF1A ON- TARGETplus sirna, Dharmacon) a specifické inhibitory HIF-1α (chetomin, YC-1 a LW6). Pro kontrolu transfekce byla použita i nesilencující sirna (ON-TARGETplus sicontrol Non-targeting Pool, Dharmacon) a fluorescenčně značená nesilencující sirna (BLOCK-iT Fluorescent Oligo, Invitrogen) Transfekce buněk pomocí sirna IMDM bez FBS IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Lonza) (1% glutamin v případě IMDM without L-glutamine) Médium bylo skladováno při 4 C. 27

35 Transfekce byla většinou prováděna na miskách s kultivační plochou 21 cm 2, množství použitých látek bude proto uváděno pro tuto plochu. Pokud byly buňky určené pro transfekci kultivovány na miskách s kultivační plochou 55 cm 2 nebo v šesti jamkových deskách s kultivační plochou jamky 9,5 cm 2, byla příslušná množství upravena adekvátně velikosti kultivační plochy. První den byly buňky přeneseny na kultivační misky v počtu buněk/cm 2. Druhý den, kdy byly buňky z 90 % konfluentní, jim bylo vyměněno 10% IMDM za IMDM bez FBS (5,6 ml média). K 560 µl média Opti-MEM I Reduced-Serum Medium (dále jen Opti-MEM médium) bylo přidáno 28 µl 20µM sirna (5 min inkubace, pokojová teplota). K druhým 560 µl média Opti-MEM bylo přidáno 11 µl Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen; dále jen LF) a 5 min inkubováno při pokojové teplotě. Ze směsí LF a sirna s médiem Opti-MEM byla spojením obou složek vytvořena transfekční směs, která byla inkubována 20 min při pokojové teplotě. Následně byla transfekční směs aplikována buňkám do média. Transfekce probíhala po dobu 4 hod, poté bylo do média přidáno 10% FBS. Buňky byly následně kultivovány v normoxii a v hypoxii po dobu požadovanou pro daný experiment Kontrola transfekce pomocí fluorescenčně značené nesilencující sirna Pro ověření účinnosti transfekce byly buňky transfekovány sirna konjugovanou s FITC (fluorescein isothiokyanát; BLOCK-iT Fluorescent Oligo, Invitrogen). Transfekce probíhala stejným způsobem, jako je uvedeno v protokolu 3.5.1, pomocí Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen). Buňky byly následně kultivovány 24 hod v normoxii a poté bylo fluorescenční mikroskopií ověřeno, zda FITC-značená sirna pronikla do jader buněk a došlo k transfekci Inhibice HIF-1α pomocí chemických inhibitorů Kromě sirna byly pro utlumení aktivity HIF-1α použity chemické inhibitory chetomin (Sigma-Aldrich), YC-1 (Sigma-Aldrich) a LW6 (Santa Cruz Biotechnology). Všechny inhibitory byly rozpuštěny v DMSO a skladovány v -20 C. 24 hodin před přidáním inhibitoru byly buňky nasazeny na kultivační misky. Druhý den byly do média přidány jednotlivé inhibitory HIF-1α. Inhibitory byly používány v koncentracích uvedených v Tab. I. Buňky byly následně kultivovány v normoxii a v hypoxii po dobu požadovanou pro daný experiment. 28

36 Tab. 1 Používané koncentrace inhibitorů HIF-1α. zásobní koncentrace (skladování v -20 C v DMSO) výsledné koncentrace v médiu chetomin 1 mm 0,1µM, 0,5µM a 1,0µM YC-1 15 mm 10µM, 50µM a 100µM LW6 20 mm 10µM, 50µM a 100µM 3.6 Izolace RNA s TRIzol Reagent Buňky určené pro izolaci RNA uchovávané v -80 C v 1 ml TRIzol Reagent byly rozmraženy a inkubovány 4 hod při pokojové teplotě. Poté bylo k 1 ml TRIzol Reagent přidáno 200 µl chloroformu, vzorek byl 15 s vortexován a poté 5 min inkubován při pokojové teplotě. Poté byl centrifugován při 4 C po dobu 15 min při x g (Centrifuge 5415 R, Eppendorf). Po centrifugaci byla odebrána horní vodná fáze s RNA do nových mikrozkumavek. Bylo k ní přidáno 500 µl isopropanolu a opatrným překlápěním mikrozkumavky byla RNA precipitována z roztoku. Vzorek byl 10 min inkubován při pokojové teplotě a poté byl centrifugován při 4 C po dobu 10 min při x g. Supernatant byl opatrně odstraněn, k peletě s RNA byl přidán 1 ml 70% EtOH a RNA v něm byla lehce protřepána. Následně byla centrifugována při 4 C po dobu 5 min při x g. Supernatant byl odstraněn, peletka byla zlehka vysušena ponecháním otevřené mikrozkumavky na vzduchu. Poté byla 10 min rozpouštěna ve 40 µl PCR-H 2 O ve vodní lázni (55-60 C). 5 µl vzorku bylo odebráno pro spektrofotometrické určení koncentrace RNA a 5 µl pro elektroforetickou kontrolu čistoty RNA. Koncentrace byla měřena jako absorbance vzorku při vlnové délce 260 nm, čistota RNA byla stanovena jako poměr absorbancí vzorku při vlnových délkách 260 nm a 280 nm, který by se měl pohybovat v intervalu 1,8 2,2. Izolovaná RNA byla uchovávána v -80 C Kontrola čistoty RNA pomocí agarosové elektroforesy TBE pufr 10x 890mM Tris 890mM kyselina boritá 20mM EDTA (ph 8,0) Skladování při 4 C. 29

37 TBE pufr Naředěný TBE pufr 10x v poměru 1:10 redestilovanou, sterilní vodou. Připravován čerstvý. 1% agarosový gel agarosa TBE pufr 1x 2 g 20 ml Čistota izolované RNA byla kontrolována pomocí horizontální agarosové elektroforesy. Připravený 1% agarosový gel byl přelit do sestavené aparatury pro horizontální elektroforesu, byla do něj ponořena šablona pro vznik jamek pro nanesení vzorků. Po zatuhnutí byl gel přenesen do vany pro elektroforesu a převrstven TBE pufrem. Do jamek bylo naneseno 5 µl vzorku s 2 µl PCR vkládacího pufru (Top-Bio s.r.o.). Elektroforesa probíhala ze začátku při napětí 75 V, po chvíli bylo napětí zvýšeno na 100 V a dál probíhala elektroforesa při konstantním napětí po dobu 30 min. Gel byl poté vyjmut z aparatury a barven v roztoku připraveném přidáním 10 μl 1% ethidium bromidu do 200 ml ddh 2 O. Po min působení tohoto interkalačního činidla byl vizualizován UV světlem v ethidium bromidu pomocí přístroje Gel Doc 2000 (Bio-Rad) a softwaru Quantity One. 3.7 Izolace proteinů RIPA pufr IGEPAL CA-630 deoxycholát sodný SDS PBS Skladování při 4 C. 0,5 ml 0,25 g 0,05 g 49,5 ml Peleta buněk určených pro analýzu proteinů pomocí metody Western blot byla na ledu rozmražena a resuspendována v dvojnásobku jejího objemu v roztoku RIPA, ke kterému byl přidán v poměru 1:25 Complete Protease Inhibitor Cocktail. Buněčná suspenze byla inkubována min na ledu, poté centrifugována při 4 C po dobu 20 min při X G. Supernatant obsahující proteiny byl přenesen do nové mikrozkumavky a takto mohl být skladován v -80 C. 30

38 3.7.1 Určení koncentrace proteinů Koncentrace proteinů byla stanovena kolorimetricky kitem DC Protein Assay Kit (Bio-Rad) v mikrotitračních destičkách. Všechna stanovení vzorků byla prováděna v tripletu. Jako standard byla použita koncentrační řada BSA (bovinní sérový albumin). Vzorek byl ředěn 8x ddh 2 O, k 5 μl naředěného vzorku bylo přidáno 25 μl roztoku A a 200 μl roztoku B. Vzorky byly po přidání těchto roztoků inkubovány 15 min a poté byla měřena jejich absorbance při 750 nm na spektrofotometru VersaMax Microplate Reader (Molecular Devices). Výsledná koncentrace proteinů byla získána pomocí softwaru SoftMax Pro Software (Molecular Devices). 3.8 Stanovení buněčného cyklu a proliferace buněk SK-N-AS pomocí průtokové cytometrie Množství a míra kondenzace DNA v buňkách se mění v závislosti na fázi buněčného cyklu. Pro měření množství DNA v buňkách je využívána vazba propidium jodidu (PI), fluorescenčního barviva interkalačně se vážícího na DNA, po předchozí permeabilizaci buněk detergentem. Využívali jsme kitu DNA Prep kit (Beckman Coulter, Inc.), barvení bylo prováděno podle návodu výrobce, měření probíhalo na cytometru BD FACSCalibur Flow Cytometer (BD Biosciences) a zastoupení jednotlivých fází buněčného cyklu (G0/G1, S a G2/M) jsme zjišťovali za využití softwaru BD CellQuest Pro Software (BD Biosciences). 3.9 Stanovení apoptózy a viability buněk SK-N-AS pomocí průtokové cytometrie Viabilita buněk byla stanovena pomocí kitu Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BioVision). Principem stanovení je vazba Annexinu V konjugovaného s FITC (fluorescein isothiokyanát) na fosfatidylserin, čímž jsou označeny časně apoptotické buňky. Pro stanovení množství mrtvých buněk (nekrotických a pozdně apoptotických) je využíván průnik PI do buněk a jeho vazby na DNA. Viabilita je stanovena jako množství živých buněk, které nejsou značeny Annexinem V-FITC ani PI. Získaná peleta buněk byla resuspendována v 500 µl 1X Binding Buffer z kitu. K této suspenzi pak bylo přidáno 5 µl Annexinu V-FITC a 5 µl PI (koncentrace PI 50 µg/ml). Vzorek byl poté minimálně 5 min inkubován při pokojové teplotě. Vazba Annexinu V-FITC na buňky a průnik PI byly analyzovány na cytometru BD FACSCalibur Flow Cytometer (BD Biosciences). 31

39 3.10 Stanovení aktivity kaspázy-3 Kaspáza 3 paří do podrodiny CED-3 kaspáz a je kritickým enzymem apoptózy. Zvýšení její aktivity je možné považovat za průkaz apoptózy. Měření aktivity kaspázy 3 jsme použili pro zjištění citlivosti buněčné linie SK-N-AS na cisplatinu v normoxii a v hypoxii. Aktivita kaspázy 3 byla měřena pomocí Caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit (BioVision) po 48hodinové kultivaci buněk s cisplatinou. Metoda je založena na hydrolýze značeného substrátu acetyl-asp-glu-val-asp-p-nitroaniline (Ac- DEVD-pNA) kaspázou 3 a následné spektrofotometrické detekci odštěpeného chromoforu p- nitroanilinu (pna). pna je kvantifikován použitím spektrofotometru při vlnové délce 400 nm nebo 405 nm. Při měření aktivity bylo postupováno podle protokolu výrobce kitu. 5 x 10 6 buněk bylo zpracováno podle protokolu výrobce. Všechny chemikálie a byly vychlazeny na teplotu 4 C. Získaná peleta buněk byla resuspendována v µl (dle velikosti pelety) vychlazeného lyzovacího pufru (Cell Lysis Buffer) a inkubována 10 min na ledu. Poté byla centrifugována při x g, 1 min, 4 C. Supernatant s cytosolickým extraktem byl přenesen do nové mikrozkumavky a analyzován nebo uskladněn při -80 C a vyšetřen později. Pro stanovení aktivity kaspázy 3 bylo použito 150 µg proteinů rozředěných v 50 µl vychlazeného lyzovacího pufru z kitu. Koncentrace proteinů byla stanovena pomocí kitu DC Protein Assay Kit (Bio-Rad) viz výše. K takto připravenému vzorku bylo přidáno 50 µl 2X Reaction Buffer s 10mM DTT. a 5 µl 4mM DEVD-pNA substrátu (výsledná koncentrace substrátu byla 200µM) a vzorek byl inkubován 1 2 hod při 37 C. Aktivita kaspázy 3 byla měřena spektrofotometricky (VersaMax Microplate Reader, Molecular Devices) v mikrotitračních destičkách při 400 nm. Všechna Stanovení byla provedena v tripletu, získané hodnoty byly vyhodnoceny pomocí MS Excel (Microsoft) Stanovení exprese HIF-1α pomocí metody Western blot (imunoblot) Metoda Western blot (WB) se skládá z několika kroků. Proteiny jsou nejprve rozděleny podle své molekulové hmotnosti pomocí SDS-PAGE (elektroforesa v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsíranu sodného). Následně jsou přeneseny na nitrocelulosovou membránu a detekovány specifickou protilátkou. 32

40 SDS-PAGE 1M Tris-HCl ph 6,8 Tris base 60,57 g Doplněno do 500 ml redestilovanou, sterilní vodou (ddh 2 O). ph upraveno pomocí HCl. Skladování při 4 C. 1,5M Tris-HCl ph 8,8 Tris base 90,8 g Doplněno do 500 ml ddh 2 O. ph upraveno pomocí HCl. Skladování při 4 C. APS 10% vodný roztok SDS 10% vodný roztok Separační gel (~ 11%) 1,5M Tris ph 8,8 2,5 ml 40% Akrylamid/Bis roztok 2,5 ml 10% SDS 100 μl TEMED 10 μl Doplněno ddh 2 O do 10 ml, promícháno. 10% APS 100 μl APS přidáváno vždy těsně před nalitím gelu, promícháno. Zaostřovací gel (~ 6%) 1M Tris ph 6,8 1,25 ml 40% Akrylamid/Bis roztok 750 μl 10% SDS 50 μl TEMED 10 μl Doplněno ddh 2 O do 10 ml, promícháno. 10% APS 100 μl 33

41 Vzorkový pufr Laemmli 6X 375mM Tris-HCl ph 6,8 9% SDS 50% glycerol 9% merkaptoethanol 0,03% bromfenolová modř Elektrodový pufr 5X Tris base 7,55 g Glycin 47 g SDS 2,5 g Doplněno do 450 ml ddh 2 O. ph 8,8 (neupravováno). Elektrodový pufr 1X Running buffer 5x 50 ml Doplněno do 250 ml redestilovanou vodou. Připravený separační gel byl nalit mezi skla a po zatuhnutí přelit zaostřovacím gelem, do nějž byla vložena šablona pro jamky určených k nanesení vzorků. Poté byl přenesen do aparatury pro vertikální elektroforesu. Do aparatury byl přidán elektrodový pufr 1X, šablona pro vznik jamek byla vyjmuta a do jamek bylo po povaření naneseno 5 μl vzorku s 1 μl vzorkovacího pufru Laemmli 6X. Do první jamky byly nanášeny 4 μl proteinového standardu (PageRuler Prestained Protein Ladder, Fermentas). Vzorky byly připravovány v požadované koncentraci ředěním ddh 2 O. Elektroforesa probíhala při konstantním proudu 0,25mA/cm 2 po dobu 80 min Přenos na membránu Transferový pufr 5X Tris base 30,5 g Glycin 145 g Doplněno do 2000 ml redestilovanou vodou. Skladován při 4 C. 34

42 Transferový pufr 1X Transferový pufr 5x 200 ml Doplněno do 900 ml redestilovanou vodou. Doplněno do 1000 ml methanolem. Připravován vždy čerstvý. Po skončení SDS-PAGE byl proveden elektroforetický transfer rozdělených proteinů z gelu na nitrocelulosovou membránu. Přenos probíhal v blotovací aparatuře v transferovém pufru 1X při 4 C, konstantním proudu 350 ma po dobu 80 min Blokování nespecifických interakcí Ponceau S 2% Ponceau S 2 g Kyselina trichloroctová 30 g Kyselina sulfosalicylová 30 g Doplněno do 100 ml ddh 2 O. Skladování při 4 C. PBS/Tween PBS 1x 400 ml 20% Tween 1 ml Skladován při 4 C. 5% mléko v PBS/Tween Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk (Bio-Rad) Doplněno do 100 ml PBS/Tween. 5g Pro ověření úspěšnosti přenosu byly po převedení na nitrocelulosovou membránu proteiny reverzibilně detekovány pomocí diazobarviva Poceau S, které se dá snadno odstranit promytím membrány v PBS 1x. Poté proběhlo blokování membrány v 5% mléce v PBS/Tween, aby se omezily nespecifické interakce mezi proteiny a primární protilátkou. Blokování trvalo 1 hod za mírného míchání na přístroji GyroTwister S1000 (Labnet) při pokojové teplotě. 35

43 Inkubace s protilátkami 0,1% mléko PUFR C 4 ml 5 % odtučněné mléko 80 µl Po zablokování nespecifických interakcí byla membrána inkubována s primární protilátkou (Santa Cruz Biotechnology) ředěnou v poměru 1:500 v 5% mléce v PBS/Tween přes noc ve 4 C, nebo ředěnou v poměru 1:250 v 5% mléce v PBS/Tween po dobu 2 3 hod při pokojové teplotě. Po skončení inkubace s primární protilátkou byla membrána 3x promyta 20 ml roztoku PBS/Tween pomocí vakuového systému Snap i.d. (Millipore; Obr. 9). Poté byla přidána sekundární protilátka (goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005, Santa Cruz Biotechnology) ředěná v poměru 1:2000 v 0,1% mléce. Po 10 min inkubace při pokojové teplotě byla protilátka vakuově odsáta a membrána byla opět 3x promyta 20 ml roztoku PBS/Tween. Obr. 9 Snap i.d. Systém pro vakuové promývání a inkubaci s protilátkami (Millipore, USA) Detekce Vizualizace signálu sekundární protilátky, která umožňuje detekci proteinu HIF-1α o molekulové hmotnosti 120 kda, byla provedena pomocí kitu Immun-Star HRP Chemiluminescent Kit (Bio-Rad). Sekundární protilátka (goat anti-mouse IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology) byla konjugována s enzymem HRP (křenová peroxidasa, horseradish peroxidase), který v přítomnosti peroxidu vodíku katalyzuje oxidaci substrátu luminolu za vzniku chemiluminiscence. Immun-Star HRP Chemiluminescent Kit obsahuje roztok luminolu se zesilovačem signálu a pufr s peroxidem. Roztok luminolu byl smíchán s pufrem 36

44 v poměru 1:1 (dále uváděno jako substrát) a aplikován na membránu (2 ml na membránu o velikosti 7 cm x 5 cm). Membrána byla se substrátem inkubována 3 4 min, poté byl přebytek substrátu odstraněn a membrána vložena do kazety na film (CAWO ABS X-ray cassette, CAWO). Ve fotokomoře byl pak do kazety vložen film, na nějž byl exponován chemiluminiscenční signál PCR Pro ověření transkripční aktivity HIF-1α bylo provedeno kvantitativní Real Time PCR (qrt-pcr) pro HIF-1α cílové geny VEGFA a SLC2A1, které kódují proteiny VEFG-A a Glut1. Jako referenční gen byl zvolen B2M (β-2 microglobulin), který je exprimovaný konstitutivně, nezávisle na aktivitě HIF-1α. Pro qrt-pcr je nejprve nutné získat cdna z izolované mrna Reversní transkripce Pro reverzní transkripci mrna do cdna byly použity vzorky RNA získané z buněk SK-N-AS (viz kap. 3.6 Izolace RNA s TRIzol Reagent). Pro vzorky byl připraven Master Mix 1, jeho přehled je v Tab. II. Master Mix 1 byl rozdělen na alikvoty a přidán k 2 µg izolované RNA rozředěné v PCR-H 2 O. Směs o celkovém objemu 25 μl byla inkubována 10 min při 25 C, 50 min při 37 C, 5 min při 95 C a 1 min při 4 C. Tab. II Master Mix 1. Uvedená množství jsou pro 1 vzorek. 10x RT Buffer 2,5 µl 5mM MgCl 2 5,5 µl dntp mix 5 µl Random hexamers 1,25 µl RNAse ihibitor 0,5 µl RT 1,5 µl RNA (2 µg) + H 2 O 8,75 µl Kvantitativní polymerasová řetězová reakce v reálném čase Pro kvantitativní polymerasovou řetězovou reakci v reálném čase (qrt-pcr) byla jako templát použita cdna získaná reversní transkripcí. 2 μl cdna byly přidány k Master Mixu 2, jeho složení je uvedeno v Tab. III. 37

45 Tab. III Master Mix 2. Uvedená množství jsou pro 1 vzorek. TaqMan gene expression MM 12,5 µl 10x proba + primery 2,5 µl H 2 O 8 µl cdna 2 µl Exprese každého genu byla analyzována v tripletu. Byly použity komerční primery a sondy HIF-1α cílových genů od firmy GENERI BIOTECH, s.r.o. VEGFA a SLC2A1, jako referenční byl zvolen gen B2M. Reakce probíhala v přístroji ABI 7300 cycler (Applied Biosystems, USA). Reakce probíhala za následujících podmínek: 95 C 15 min (iniciace polymerázy a úvodní denaturace DNA) a 40 cyklů 95 C 10 s (denaturace DNA) a 60 C 40 s (připojení primerů, a syntéza DNA). Výsledné hodnoty získané z termocykléru byly zpracovány a statisticky vyhodnoceny programem Relative Expression Software Tool (REST). Pro výpočet statistické významnosti používá REST Pair Wise Fixed Reallocation Randomisation Test, všechny uváděné výsledky byly vyhodnoceny jako statisticky významné (p 0,05)

46 4 VÝSLEDKY A DISKUSE Sledovali jsme význam transkripčního faktoru HIF-1α na hypoxií navozenou chemorezistenci u buněčné linie lidského neuroblastomu. Již dříve byla prokázána souvislost mezi vysokou expresí HIF-1α u různých typů nádorových buněk a špatnou prognózou onemocnění 143, Je známo, že hypoxie navozuje chemorezistenci na chemoterapii i radioterapii, ale podíl exprese HIF-1α na těchto hypoxií indukovaných jevech není přesně znám. Pro ověření významu HIF-1α na hypoxií indukovanou chemorezistenci jsme použili buněčnou linii neuroblastomu SK-N-AS. Buňky byly kultivovány v normoxii a v hypoxii (1 % kyslíku). Expresi HIF-1α jsme prokazovali pomocí metody Western blot, buněčnou smrt jsme detekovali Anexinem V a PI na průtokovém cytometru nebo jako zvýšení aktivity kaspázy 3. Pro snížení exprese nebo transkripční aktivity HIF-1α jsme použili silencing pomocí sirna a nízkomolekulární inhibitory LW6, YC-1 a chetomin. Zjistili jsme, že hypoxie snižuje citlivost buněk SK-N-AS k cisplatině a že je možné tuto hypoxií navozenou rezistenci zvrátit snížením exprese HIF-1α. 4.1 Stanovení exprese HIF-1α pomocí metody Western blot (imunoblot) Pomocí metody Western blot byla sledována dynamika exprese proteinu HIF-1α v různých kultivačních podmínkách. Buněčná linie SK-N-AS byla kultivována v normoxii a hypoxii (1 % kyslíku). Při optimalizaci Western blotingu jsme zjistili, že nejlepších výsledků bylo dosaženo, pokud bylo použito méně než 30 µg proteinu/jamku a inkubace s primární protilátkou probíhala přes noc při 4 C. Obr. 10 Dynamika hypoxické exprese HIF-1α. Buňky byly sbírány po 2, 4, 8, 16, 48, 72, 96 a 120hodinové kultivaci v hypoxii (H). Jako kontrola byly použity buňky kultivované 2 hod v normoxii (N 2). Bylo použito 15 µg proteinu/jamku a krátká doba expozice. Na Obr. 10 je patrná zvýšená exprese HIF-1α v hypoxii. Nejvyšší expresi transkripčního faktoru HIF-1α jsme pozorovali po 8 16hodinové kultivaci v hypoxii. V delších časových intervalech (72 hod) je patrné snížení exprese a následně opět její zvýšení. Krátkodobý vzestup HIF-1α po expozici hypoxii potvrzují i údaje o experimentech na jiných buněčných liniích. Ke zvýšení exprese proteinu HIF-1α dochází zejména v akutní fázi 39

47 ph hypoxie, následně jeho exprese klesá 122. Na opětovném zvýšení hladiny HIF-1α v buňkách v kultivačních časech 96 a 120 hod se může podílet řada faktorů. Bylo popsáno zvýšení exprese HIF-1α v souvislosti se snížením ph, které lze očekávat při delší kultivaci buněk v hypoxii v důsledku produkce laktátu. IMDM médium obsahuje fenolovou červeň, která indikuje přechodovou oblast mezi ph 6,8 8, V dlouhodobých kultivacích, zvláště v hypoxických podmínkách, odpovídala žlutá barva média silnému snížení ph. Změnu ph media jsme ověřili pomocí ph metru (Graf 1). Protože ideální ph pro růst buněk se pohybuje v rozmezí 7,3 7,6, snížení ph pod hodnotu 7 se může podílet na opětovném zvýšení exprese HIF-1α při dlouhodobých kultivacích v hypoxii. Kromě hromadění laktátu v médiu však mohou mít vliv na opětovné zvýšení exprese i jiné metabolity produkované kultivovanými buňkami. Zda se na změně exprese HIF-1α podílí ph media a/nebo metabolity látkové přeměny nebo látky uvolňované buňkami do media je nutné ověřit dalšími experimenty. V dalších experimentech budeme sledovat vliv ph media v časných fázích kultivace a vliv frakcí kondicionovaného media z různých fází kultivace na expresi HIF-1α. 8 7,5 7 Počet buněk/cm ,5 24 hod 48 hod 72 hod 96 hod 120 hod Graf 1 Závislost ph média na době kultivace a počtu buněk na kultivační ploše. Počet buněk/cm 2 udává množství buněk nasazených na kultivační misky. Vzhledem k nízkému signálu HIF-1α po normoxické kultivaci (Obr. 10, N 2) byl Western blot déle exponován takže byla patrná i exprese HIF-1α v normoxii. (Obr. 11) Obr. 11 Dynamika hypoxické exprese HIF-1α. Buňky byly sbírány po 2, 4, 8, 16, 48, 72, 96 a 120hodinové kultivaci v hypoxii (H). Jako kontrola byly použity buňky kultivované 2 hod v normoxii (N 2). Bylo použito 15 µg proteinu/jamku a dlouhá doba expozice vzhledem k nízké expresi v normoxii. 40