Schválil: prof. MUDr. David Stejskal, PhD, MBA. Datum platnosti: Označení dokumentu: BLP01/LMB Verze č.: 6

Transkript

1 Laboratoř lékařské genetiky - úsek molekulární biologie Vypracoval: RNDr. Richterová Radmila Mgr. Tavandzis Spiros Ing. Cibulková Petra Ing. Bóday Arpád Mgr. Augste Eva Mgr. Radka Sítková Mgr. Magdaléna Dvořáková Mgr. Pavla Vaníčková Schválil: prof. MUDr. David Stejskal, PhD, MBA Datum platnosti: Označení dokumentu: BLP01/LMB Verze č.: 6

2 Strana: 2 Obsah 1. Úvod 3 2. Politika kvality laboratoře 3 3. Identifikační údaje 4 4. Identifikační údaje laboratoře 4 5. Seznam akreditovaných vyšetření 5 6. Žádanky (požadavkové listy) 5 7. Označení vzorků 5 8. Ústní požadavky na vyšetření 5 9. Kritéria odmítnutí vzorků Požadavky na odběr primárních vzorků Příjem vzorků Množství odebraných vzorků a jejich uchovávání Zásady práce se vzorky Odběrový materiál Opakovaná a dodatečná vyšetření Formy vydávání výsledků Hlášení výsledků telefonicky Tisk laboratorních výsledků Způsoby tisku Uvolňování a distribuce výsledků Elektronická distribuce výsledkových zpráv Výdej výsledků přijatých a označených jako STATIM Výdej výsledku pacientovi Hodnocení a vydávání výsledků Změny výsledků a nálezů Smluvní laboratoře Systém kontroly kvality v laboratoři Vyřizování stížností Seznam vyšetření prováděných v laboratoři 11 A) Hereditární trombofilie 11 B) Onkohematologie 19 C) Farmakogenetika 22 D) Onkogenetika 24 E) Geneticky podmíněné choroby 35 F) Ostatní 44

3 Strana: 3 1. Úvod Hlavním předmětem služeb společnosti v oblasti Klinických laboratoří, je provádění analýz biologického materiálu. Je to proces zahrnující preanalytickou, analytickou a postanalytickou fázi. Tento proces je zaměřený na účelnou diagnostiku klinického stavu pacientů v čase odpovídajícím klinickým potřebám. Pracovníci Klinických laboratoří společnosti jsou vázáni mlčenlivostí a prospěch pacienta je pro ně vždy na prvním místě. 2. Politika kvality laboratoře Vedení a zaměstnanci klinických laboratoří se zavazují udržovat a zlepšovat systém kvality: který odpovídá rozsahu činnosti laboratoří prováděných v souladu s platnou legislativou a je v souladu s požadavky zákazníka technickou způsobilostí, nestranností, věrohodností a dodržováním postupů dokumentovaných v Příručce kvality, která zavazuje vystupovat laboratoř, jako nezávislou Klinickou laboratoř pro provádění zkoušek osobní angažovaností v laboratoři poskytovat služby na takové úrovni, aby nebyly porušeny zásady správné laboratorní praxe prací v souladu se stanovenými postupy a veškerou pracovní činnost provádět se snahou maximálně uspokojit požadavky zákazníka za předpokladu, že nedojde k ohrožení zájmů společnosti porušením právních předpisů poskytováním služeb v souladu s normou ČSN EN ISO a ostatními externími dokumenty ZŘ spolu s MK udržují efektivní systém kvality, který je trvale zlepšován. ZŘ spolu Ř se zavazují zabezpečovat zdroje k plnění požadavků mezinárodní normy ČSN ISO Souhrnné cíle vytyčené pro realizaci politiky kvality trvale zlepšovat kvalitu a rozsah služeb zákazníkům a ostatním zainteresovaným stranám trvale zvyšovat odbornou způsobilost pracovníků

4 Strana: 4 3. Identifikační údaje společnosti Firma adresa Revoluční 2214/35, Nový Jičín hospodářsko-právní forma akciová společnost (viz příloha 2) Telefon Předseda představenstva IČO sekretariat@lag.agel.cz Ing. Luděk Cibulka, MBA ludek.cibulka@lag.agel.cz číslo bankovního účtu / 0300 web laboratore.agel.cz Společnost je součástí holdingu Agel a.s. Akreditovaný subjekt:, Klinické laboratoře Vedoucí klinických Laboratoří RNDr. Lenka Faldynová Kulíšková Zástupce vedoucího klinických laboratoří adresa Manažer kvality Adresa MUDr. Mgr. Ivo Kasperčík lenka.kuliskova@lag.agel.cz Revoluční 2214/35, Nový Jičín Marta Hýnarová Ing. Dagmar Mrocková marta.hynarova@ lag.agel.cz dagmar.mrockova@lag.agel.cz Revoluční 2214/35, Nový Jičín 4. Identifikační údaje laboratoře Vedoucí laboratoře: RNDr. Radmila Richterová radmila.richterova@lag.agel.cz Zástupce vedoucího laboratoře: Mgr. Spiros Tavandzis spiros.tavandzis@lag.agel.cz Adresa pracoviště: Revoluční 2214/35, Nový Jičín Telefon:

5 Strana: 5 Provozní doba: pondělí - pátek: 6:30-16:00 hod. 5. Seznam akreditovaných vyšetření Laboratoř je akreditovaná dle normy ČSN EN ISO :2007. Aktuální seznam akreditovaných vyšetření je uveden na platném Osvědčení o akreditaci, které je umístěno na stránkách 6. Žádanky (požadavkové listy): Všechny aktuální žádanky jsou umístěny na našich stránkách V případě potřeby je možno kontaktovat pracovníky laboratoře, kteří zajistí dodání jednotlivých žádanek. Laboratoře přijímají materiál doprovázený žádankou, která musí minimálně obsahovat: 1. jednoznačnou identifikaci pacienta (přímení a jméno, rodné číslo) 2. datum narození a pohlaví pacienta v případě, že tato nejsou jednoznačně určena číslem pojištěnce (např. u cizinců) 3. kód pojišťovny pojištěnce 4. diagnózu 5. identifikaci objednatele - jmenovku, adresu, podpis a telefonní číslo lékaře žádajícího vyšetření, IČP, IČZ, odbornost 6. druh primárního vzorku 7. datum a čas odběru vzorku 8. požadovaná vyšetření 9. medikaci - u vyšetření, jejichž výsledky jsou ovlivněny léčbou V případě nečitelných nebo chybějících údajů na žádance, pracovník na příjmu komunikuje se zadavatelem o vyšetření a zjistí chybějící informace, popřípadě požádá o vyplnění nové žádanky. Pokud zadavatele o vyšetření nelze identifikovat, je tento vzorek zpracován a v informačním systému uložen v adresáři neznámý zadavatel. Pokud je dodán materiál bez žádanky a jedná se o nenahraditelný vzorek, laboratoř tento vzorek vyšetří, ale výsledek nebude uvolněn, pokud zadavatel nedoplní identifikační údaje, tedy žádanku. 7. Označení vzorků Na odebraném materiálu musí být souhlasná identifikace pacienta/pojištěnce v následujících údajích: jméno a příjmení pacienta, rodné číslo, případně rok narození. 8. Ústní požadavky na vyšetření

6 Strana: 6 Laboratoř reaguje i na ústní požadavky zákazníků. Zadavatel si může ke vzorku dodanému do laboratoře telefonicky doobjednat další vyšetření. Požadavek je přijímán od lékaře nebo sestry, nikoli od pacientů. Možnost dodatečného vyšetření závisí na množství uchovávaného vzorku, stabilitě daného analytu a délce skladování vzorku. Humánní DNA je skladována v DNA bance minimálně po dobu 5 let. Během této doby mohou být vzorky kdykoliv dovyšetřeny. Poté jsou vzorky likvidovány v souladu s Provozním řádem společnosti Zadavatel je vždy povinen dodatečně zaslat novou žádanku řádně vyplněnou s dodatečnými parametry. Bez dodané žádanky nelze vyšetření provést. 9. Kritéria odmítnutí vzorků - nedostatečná identifikace vzorku z hlediska nezaměnitelnosti - zjevné nedodržení postupu při odběru biologického materiálu - nedodržení přepravních podmínek - nedodání informovaného souhlasu pacienta 10. Požadavky na odběr primárních vzorků Stav pacienta, vlastní odběr materiálu, jeho transport do laboratoře, uchovávání a další manipulace se vzorkem před analýzou mohou významnou měrou ovlivnit vlastní konečný výsledek analýzy. Soubor všech postupů a operací, jimiž projde vzorek od požadavku na vyšetření až do samotné analýzy, tvoří preanalytickou fázi vyšetření. Všechny faktory a vlivy je nutno brát v úvahu, jelikož tvoří nedílnou součást analýzy. Odběr venózní nesrážlivé krve Pro genetické analýzy se používá převážně plná krev (cca 2-3 ml) odebraná do zkumavky s K 3 EDTA, případně citrátem sodným. Odběr není nutno provádět nalačno. Ihned po odběru je vhodné zkumavku několikrát mírně promíchat (pomalým obracením nebo kýváním) a pečlivě označit identifikačními údaji pacienta. Vzorek je možné uchovávat při pokojové teplotě nebo v lednici při 2-8 C a poslat do laboratoře nejlépe v den odběru nebo v následující den. Při vyšetření RNA (detekce fúzního genu BCR/ABL, mutační stav genu IgVH, popř. vzorky pro Fassay analýzu genu TP53) je třeba vzorek nesrážlivé krve v K 3 EDTA poslat do laboratoře v den odběru do 14:00 hodin. Tento vzorek uchovávat vždy při teplotě 2-8 C, nemrazit. Zkumavky s heparinem nejsou pro genetická vyšetření vhodné. Odběr venózní srážlivé krve Některá vyšetření se provádí ze séra pacienta. Sérum se získává sedimentací nebo centrifugací venózní srážlivé krve. Pro sérum (příp. plazmu) je nezbytné, aby byly odstředěny a odděleny od sraženého krevního koláče nebo krvinek co nejdříve. Lze také zaslat vzorek ve formě séra separovaného centrifugací. Po oddělení séra od krevního koláče je nutno sérum opatrně slít nebo odpipetovat do sterilní zkumavky tak, aby nedošlo ke smísení oddělených složek. Sérum je nutno uchovávat při 4-8 C a poslat do laboratoře do 12 hodin nebo zamrazit na -20 C a poslat v zamraženém stavu na suchém ledu. Množství odebírané krve záleží na počtu prováděných vyšetření - přibližně 5 ml plné krve při

7 Strana: 7 požadavcích na 5 vyšetření. 11. Příjem vzorků Přijímající pracovníci kontrolují u přebíraných vzorků: množství neporušenost obalu vzorku identifikovatelnost (označení) požadavky na vyšetření (žádanka) Informovaný souhlas pacienta V případě, že některý z výše uvedených atributů není splněn, je tato okolnost přenesena do výsledkové zprávy, např. v případě nedostatečného množství vzorku je ve výsledkové zprávě poznámka málo mat., v případě rozbité zkumavky je ve výsledkové zprávě v poznámce rozbito, v případě chybného odběru je uvedeno špatný odběr, v případě nedodaného informovaného souhlasu je uvedeno, že vyšetření nelze provést. V případě nedodržení preanalytických podmínek nemusí laboratoř nutně vzorek odmítnout, může jej zpracovat, ale výsledek uvolní až tehdy, kdy požadující lékař převezme odpovědnost za kvalitu dodávky vzorku. 12. Množství odebraných vzorků a jejich uchovávání Množství vzorku krve úzce souvisí s počtem naordinovaných vyšetření. Doporučené množství vzorku ve zkumavce: Vyšetření Množství vzorku Trombofilní markery ml nesrážlivé krve (K 3 EDTA, příp. citrát sodný) Farmakogenetika ml nesrážlivé krve (K 3 EDTA, příp. citrát sodný) Onkohematologie ml nesrážlivé krve (K 3 EDTA, příp. citrát sodný) - při vyšetření BCR/ABl, IgVH je nutné vzorek uchovávat v lednici 2 8 C a poslat v den odběru do 14:00 hodin Onkogenetika ml nesrážlivé krve (K 3 EDTA, příp. citrát sodný) nebo DNA vyizolovanou z periférní krve - parafinový bloček, nativní tkáň, sklíčka - v případě konfirmačního vyšetření zaslat nový odběr nebo se použije DNA z druhé nezávislé izolace Marfanův syndrom ml nesrážlivé krve (K 3 EDTA, příp. citrát sodný) nebo DNA vyizolovanou z periférní krve (DNA - minimální objem 200 l, koncentrace 100 g/ml) - v případě konfirmačního vyšetření zaslat nový odběr nebo se použije DNA z druhé nezávislé izolace Ostatní geneticky ml nesrážlivé krve (K 3 EDTA, příp. citrát sodný) podmíněné choroby - Na genetické vyšetření není nutno provádět odběr nalačno.

8 Strana: 8 - Nevhodné je odebírat krev do zkumavky s lithium heparinem. - Odběrové soupravy s biologickým materiálem je vhodné zaslat do laboratoře co nejdříve po odběru. U některých vyšetření může docházet ke zkreslení výsledků. Již vyšetřené vzorky jsou v laboratoři skladovány, pokud je to možné v rámci jejich stability, po dobu 7 dnů. Pro případné delší skladování jsou vzorky zamrazovány. Vyizolovaná humánní DNA je skladována v DNA bance po dobu minimálně 5 let. Poté jsou vzorky likvidovány v souladu s Provozním řádem společnosti Vzorky uložené v DNA bance mohou být na vyžádání dovyšetřeny. 13. Zásady práce se vzorky Každý vzorek biologického materiálu je považován za potencionálně infekční. Je třeba zamezit možnému kontaktu pacientů i veřejnosti s biologickým materiálem po odběru. Svoz vzorků je zajišťován v uzavřených přepravních boxech tak, aby během transportu nedošlo ke kontaminaci osob nebo dopravních prostředků použitých k přepravě. V případě kontaminace je třeba se řídit platnými zásadami dezinfekce a dekontaminace. 14. Odběrový materiál Pro své zákazníky - lékaře poskytují Klinické laboratoře společnosti odběrový materiál a žádanky na základě telefonického požadavku. Materiál je na ordinující pracoviště dodáván pracovníky svozové služby. 15. Opakovaná a dodatečná vyšetření Dojde-li ke znehodnocení vzorku během transportu nebo během jeho zpracování, laboratoř informuje zadávajícího lékaře, popř. s ním telefonicky domluví nový odběr. Pokud se během vyšetření vzorku naskytnou nějaké okolnosti, které by mohly zkreslit výsledek vyšetření nebo pokud by samotný stav vzorku mohl vést ke zkreslení výsledku, je o tomto informován lékař buď telefonicky nebo formou komentáře k výsledku vyšetření. Analýzy, které je nutno opakovat, jsou zopakovány a zkontrolovány pověřeným pracovníkem. 16. Formy vydávání výsledků Klinické laboratoře společnosti v současné době využívají 3 způsoby vydávání výsledků a to: Tisk laboratorních výsledků (běžný je jeho kumulativní tisk) a jejich distribuce Zasílání nálezů elektronicky - zabezpečenou formou, vlastním softwarem Datová pumpa Hlášení telefonicky. Poté je vždy výsledek dodán v elektronické nebo tištěné podobě. V případě telefonického nahlášení výsledku je pracovník lékařem informován o svém IČZ, jménem a rodném čísle pacienta, teprve na základě těchto údajů pracovník laboratoře smí nahlásit výsledek. Nahlášený výsledek musí být lékařem zopakován. Pracovník poté do OpenLIMSu zapíše jméno a IČZ lékaře, kterému byl výsledek nahlášen.

9 Strana: 9 Za hotovou oficiální Výsledkovou zprávu nebo Protokol o zkoušce se považuje elektronická případně tištěná forma výsledku zkontrolována oprávněným středoškolským pracovníkem a uvolněna pověřeným vysokoškolským pracovníkem. 17. Hlášení výsledků telefonicky - používá se hlavně pro hlášení vysoce patologických výsledků lékařům - výsledky ohrožující zdraví pacienta nahlásí vždy příslušný vysokoškolský pracovník - V případě telefonického nahlášení výsledku je pracovník lékařem informován o svém IČZ, jménem a rodném čísle pacienta, teprve na základě těchto údajů pracovník laboratoře smí nahlásit výsledek. Nahlášený výsledek musí být lékařem zopakován. Pracovník poté do OpenLIMSu zapíše jméno a IČZ lékaře, kterému byl výsledek nahlášen. 18. Tisk laboratorních výsledků Zapsání výsledků probíhá přes laboratorní informační systém fy STAPRO. Před vydáním jsou výsledky v laboratorním informačním systému kontrolovány, odsouhlaseny a uvolněny kvalifikovaným vysokoškolským zdravotnickým. 19. Způsoby tisku - ukončené a úplné výsledkové zprávy - tisk výsledkových zpráv z archívu - stejný formát jako u konečných výsledkových zpráv 20. Uvolňování a distribuce výsledků Uvolňování a tisk výsledků je prováděn průběžně v době od 7.00 hod hod. Vytištěné výsledky jsou distribuovány lékaři v zalepených umělohmotných obálkách svozovou službou. Výsledky jsou lékaři také zasílány poštou v zalepených obálkách a to v případě, že k lékaři nezajíždí svozová služba. 21. Elektronická distribuce výsledkových zpráv Nemocnicím, lékařům a zařízením v terénu se výsledky odesílají automaticky prostřednictvím vlastního SW Datová pumpa. 22. Výdej výsledků přijatých a označených jako STATIM Vyšetření označené STATIM se provádějí přednostně. 23. Výdej výsledku pacientovi Výdej výsledků pacientovi (zákonnému zástupci rodinnému příslušníkovi) je možný na požádání pouze s předložením průkazu totožnosti: občanský průkaz, cestovní pas, nebo sdělení

10 Strana: 10 na základě objednávajícího lékaře na žádance (zde musí být uvedeno, že výsledková zpráva bude předána do rukou pacienta). Výsledek je vytištěn z laboratorního informačního systému, vložen do obálky, zalepen, označen razítkem přes lepení a předán pacientovi. Pacientovi a nezdravotnickým pracovníkům se výsledky nesdělují! 24. Hodnocení a vydávání výsledků Za technické provedení a výsledky genetického testování je zodpovědný vedoucí laboratoře. Za interpretaci výsledků je zodpovědný výhradně lékař. Výsledková zpráva z OpenLIMS obsahuje: 1) Identifikaci zdravotnického zařízení a laboratoře 2) Druh primárního vzorku, pokud je tato informace pro interpretaci významná 3) Datum a čas přijetí vzorku laboratoří 4) Datum a čas odběru 5) Identifikaci pacienta (jméno, příjmení, rodné číslo, pohlaví u cizinců, zdravotní pojišťovnu) 6) Identifikaci odesílajícího (IČP, odbornost) 7) Diagnózu pacienta 8) Název vyšetření, výsledek, jednotky, referenční interval, hodnocení 9) Identifikaci pracovníka uvolňujícího výsledek 10) Údaj o tom, kdy byl výsledek vytištěn, datum, hodina 11) Slovní komentář, příp. doporučení 25. Změny výsledků a nálezů Lze provádět opravu: Identifikační části Výsledkové části Oprava identifikační části výsledků z laboratorního informačního systému fa STAPRO Opravou identifikační části pacienta se rozumí oprava rodného čísla, změna pojišťovny a změna nebo významná oprava příjmení pacienta po odeslání výsledků. Oprava identifikace (rodného čísla, příjmení pacienta) je provedena přepsáním původního zadání. Nová opravená výsledková zpráva a chybná výsledková zpráva se vytiskne a založí do speciální složky v laboratoři. Barevně se označí změna a pracovník, který změnu provedl, ten se identifikuje na obou zprávách. Oprava pojišťovny se provádí po odmítnutí vyúčtování původně uvedenou zdravotní pojišťovnou. Oprava výsledkové části z laboratorního informačního systému fa STAPRO

11 Strana: 11 Tuto opravu laboratoř neprovádí. Doplňuje nebo upřesňuje původní komentář. Chyba ve výsledkové části výsledkové zprávy po odeslání je řešena laboratoří jako neshoda. O chybném výsledku musí být vždy informován zadávající lékař. Je okamžitě domluven systém nápravy např. opakovaná analýza, opravit chybný výsledek. Odpovědnost za nápravu má pouze vedoucí Klinických laboratoří a vedoucí jednotlivých laboratoří. Tato změna musí být vždy evidovaná a dohledatelná. 26. Smluvní laboratoře Úsek molekulární biologie nevyužívá služeb smluvní laboratoře. 27. Systém kontroly kvality v laboratoři V laboratoři jsou uplatňovány zásady správné laboratorní práce včetně systému vnitřní kontroly kvality. Úsek molekulární biologie se pravidelně účastní cyklů externí kontroly kvality, které v ČR organizuje Státní zdravotní ústav Praha a ÚHKT Praha. Laboratoř je dále zapojena do mezinárodního systému kontroly kvality INSTAND e.v. - Düsseldorf, DGKL - Bonn, EMQN - Manchester. V případě potřeby je provedeno srovnání s jinou externí laboratoří. 28. Vyřizování stížností Stížnosti ze strany zákazníka na délku zpracování výsledků, vyšetření nesprávných parametrů atd. jsou řešeny s vedoucím laboratoře, popř. manažerem kvality. Pokud je stížnost řešena okamžitou nápravou, tak je toto zapsáno do Knihy stížností. Do knihy stížností se zapisuje datum příjmu stížnosti, popis stížnosti, identifikace stěžovatele, příjemce stížnosti, způsob řešení stížnosti a datum vyřešení stížnosti. Závažná stížnost se eviduje v knize stížností, která je uložena u vedoucího klinických laboratoří. 29. Seznam vyšetření prováděných v laboratoři A) Hereditární trombofilie Název vyšetření: Faktor V Leiden (R506Q) Zkrácený název: FV Leiden R506Q

12 Strana: 12 Leidenská mutace koagulačního faktoru V je nejčastěji se vyskytující vrozený hemostatický rizikový faktor pro vznik žilní trombózy. Normální koagulační faktor V (FV) slouží jako substrát pro aktivovaný protein C (APC) a je inaktivován proteolytickým štěpením v místě tří různých argininových zbytků. Leidenská mutace (R506Q) je jednonukleotidová záměna G za A na pozici 1691 v nukleotidovém řetězci, která způsobuje záměnu aminokyseliny arginin za glutamin v jednom z inaktivačních míst na pozici 506 v polypeptidovém řetězci. V místě 506 je za normálních podmínek aktivovaný FVa štěpen aktivovaným proteinem C a tím je inaktivován. Mutovaný FVa je proti tomuto enzymatickému štěpení odolnější. Přítomnost FV Leidenské mutace je spojena s vyšším rizikem žilní trombózy a plicní embolie. Riziko žilní trombózy se velmi liší v závislosti na homozygotním nebo heterozygotním nosičství mutace. Pro heterozygoty je riziko zvýšeno 7x, pro homozygoty až 80x. - nesrážlivá periferní krev, zkumavka s protisrážlivou látkou K 3 EDTA nebo citrátem sodným wild type = nemutovaný homozygot (negativní) Heteroz. - heterozygot Homozg. - mutovaný homozygot Metoda: PCR Provádí se: 1 x týdně Doba odezvy: do 15 pracovních dnů Název vyšetření: Prothrombin (G20210A) Zkrácený název: Prothrombin G20210A, FII Prothrombinová mutace (G20210A) je záměna nukleotidu G za A na pozici v genu prothrombinu. Mutace se nachází v nekódující 3 oblasti genu, která se již nepřepisuje do proteinu a proto neexistuje specifické funkční koagulační vyšetření. Mutace ne zcela jasným způsobem zvyšuje hladinu prothrombinu v plasmě, patofyziolgie působení mutace není dosud

13 Strana: 13 úplně vysvětlena. Není prokázáno, že by homozygotní nosiči mutace měli hladinu prothrombinu vyšší než heterozygotní. Mutace G20210A je geneticky podmíněný hemostatický rizikový faktor pro spontánní aborty zvláště v prvním trimestru gravidity a pro vznik žilní trombózy. Riziko se výrazně zvyšuje u žen v graviditě a po porodu a při dalších zátěžových situacích (operace, úrazy a imobilizace, hormonální antikoncepce). Byl prokázán také vztah mutace a ischemické choroby srdeční. - nesrážlivá periferní krev, zkumavka s protisrážlivou látkou K3K3EDTA nebo citrátem sodným wild type = nemutovaný homozygot (negativní) Heteroz. - heterozygot Homozg. - mutovaný homozygot Metoda: PCR Provádí se: 1 x týdně Doba odezvy: do 15 pracovních dnů Název vyšetření: Methylentetrahydrofolát reduktáza Zkrácený název: MTHFR C677T MTHFR A1298C Enzym 5,10-methylentetrahydrofolát reduktáza (MTHFR) katalyzuje konverzi 5,10- - methylentetrahydrofolátu na 5-methyl-tetrahydrofolát, který je hlavní formou folátů v lidském organismu. Foláty slouží především jako dárci monokarbonů pro mnohé metabolické reakce včetně methylace homocysteinu a syntézy nukleotidů, neurotransmiterů proteinů a fosfolipidů. Bylo popsáno několik polymorfismů v MTHFR genu snižující aktivitu enzymu MTHFR. Mezi dvě nejčastější mutace patří substituce nukleotidu C za nukleotid T v pozici 677 nukleotidového řetězce (resp. ala222val) a záměna nukleotidu A za nukleotid C v pozici 1298 nukleotidového řetězce (glu429ala). Důsledkem je modifikace molekuly enzymu a vznik její termolabilní varianty se sníženou aktivitou, která má za následek defekt remethylace s následnou vyšší hladinou aminokyseliny homocysteinu v séru. Zvýšená koncentrace homocysteinu v séru o 20% a více je klasifikována jako mírná, střední nebo těžká forma hyperhomocysteinémie (HHCY). HHCY může být rizikovým faktorem pro žilní tromboembolismus, trombotické onemocnění tepenného systému či předčasnou

14 Strana: 14 generalizovanou aterosklerózou, projevující se mozkovou mrtvicí, infarktem myokardu, embolizací do plicnice nebo sklerotickým a trombotickým onemocněním periferních cév. Vysoká hladina homocysteinu je také rizikovým faktorem vzniku defektů neurální trubice během prenatálního vývoje a nadále se diskutuje i jeho možný vliv na kancerogenezi. wild type = nemutovaný homozygot (negativní) Heteroz. - heterozygot Homozg. - mutovaný homozygot Metoda: PCR Provádí se: 1 x týdně Doba odezvy: do 15 pracovních dnů Název vyšetření: Destičkový glykoprotein Ia (C807T) Zkrácený název: GPIa C807T Destičkový glykoproteinový komplex GPIa/IIa je primárním receptorem pro adhezi destiček ke kolagenu a hraje tedy významnou roli v počáteční fázi adheze. GPIa/IIa zodpovídá za zadržení a stabilizaci destiček na povrchu kolagenu a díky tomu může dojít k interakci kolagenu s dalším receptorem (GPVI), který aktivuje trombocyty. V genu kódujícím podjednotku GPIa komplexu GPIa/IIa bylo popsáno několik polymorfismů, z nichž nejznámější je bodová záměna C807T. Destičky homozygotů nebo heterozygotů alely GPIa 807T se vyznačují 2krát vyšší expresí GPIa/IIa na povrchu destiček než je tomu u wild type homozygotů GPIa C807. Přítomnost alely GPIa 807T je úzce spojena s výskytem infarktu myokardu a ischemické cévní mozkové příhody u mladých pacientů. Polymorfismus GPIa je mírným rizikovým faktorem arteriálních trombóz především v koincidenci s ostatními faktory.

15 Strana: 15 wild type = nemutovaný homozygot (negativní) Heteroz. - heterozygot Homozg. - mutovaný homozygot Metoda: PCR Provádí se: 1 x za 14 dnů Doba odezvy: do 15 pracovních dnů Název vyšetření: Destičkový glykoprotein GPIIIa (L33P) Zkrácený název: GPIIIa L33P Destičkový glykoproteinový komplex IIb/IIIa je součástí integrinové rodiny adhezivních membránových receptorů, které se podílejí na buněčné interakci. Komplex tvoří na vápníku závislé heterodimery a je hlavní komponentou destičkové membrány. Interakce GPIIb/IIIa s fibrinogenem umožňuje agregaci destiček, tedy adhezi jedné aktivované destičky k druhé a adhezi destiček k povrchům. Gen pro GPIIIa se nachází na 17. chromozomu a skládá se z 15 exonů. Za dvě nejběžnější a klinicky nejdůležitější alely genu jsou považovány alely P1A1 (HPA-1a) a P1A2 (HPA-1b). Varianta P1A2 je charakterizována jednonukleotidovou substitucí T za C v pozici 1565 v exonu 2, která způsobuje záměnu leucinu (Leu) za prolin (Pro) v pozici 33 aminokyselinového řetězce. Polymorfismus P1A1 / P1A2 způsobuje četné rozdíly ve funkci komplexu GPIIb/IIIa. Varianta GPIIIa P1A2 významně zvyšuje agregabilitu trombocytů, je významným rizikovým faktorem při vývoji koronární trombózy a infarktu myokardu, a to především u mladších jedinců bez jiných rizikových faktorů, vede k aspirinové rezistenci. Změna antigenních vlastností molekuly může vést také ke vzniku krvácivých onemocnění, jako je např. posttransfúzní purpura, život ohrožující trombocytopenie, neonatální trombocytopenická purpura či Glazmannova trombastenie. wild type = nemutovaný homozygot = P1A1/P1A1 (negativní)

16 Strana: 16 Heteroz. - heterozygot = P1A1/P1A2 Homozg. - mutovaný homozygot = P1A2/P1A2 Metoda: PCR Provádí se: 1 x za 14 dnů Doba odezvy: do 15 pracovních dnů Název vyšetření: Angiotenzin-konvertující enzym Zkrácený název: ACE ins/del Angiotenzin konvertující enzym (ACE) je karboxyl-terminální dipeptidyl-exopeptidáza obsahující Zn, která hraje důležitou roli v regulaci krevního tlaku jako součást reninangiotenzinového systému (RAS). Umožňuje konverzi angiotenzinu I na vazokonstrikční aldosteron stimulující peptid angiotenzin II (ATII). ACE odstraňuje z dekapeptidu angiotensinu I dvě karboxy-terminální aminokyseliny a tvoří oktapeptid AT II, který bývá označovaný jako prozánětlivý, protože zvyšuje hladinu prozánětlivých cytokinů. Angiotenzin II se podílí na vazokonstrikci a působí při vzniku a rozvoji aterosklerózy, chronického srdečního selhání, cévní mozkové příhody, schizofrenie, demence, Alzheimerovy choroby a dalších akutních nebo chronických zánětlivých onemocnění. ACE je přítomný na endoteliálních buňkách v mnoha tkáních (například děloha, placenta, srdce, mozek, ledviny, leukocyty, alveolární makrofágy, periferní monocyty, neurony). Gen tvoří 26 exonů, je lokalizovaný na chromozomu 17q23, a obsahuje inzerčně(i)/deleční(d) polymorfismus v intronu 16 charakterizovaný přítomností nebo absencí 287 dp dlouhé Alurepetitivní sekvence. Mechanismus účinku inzerčně delečního polymorfismu není přesně znám. Přítomnost alely D je spojována se zvýšenou aktivitou enzymu a vyššími hladinami ACE v plazmě. D/I - delece/inzerce (heteroygot) D/D - delece I/I - inzerce Metoda: PCR Provádí se: 1 x za 14 dnů Doba odezvy: do 15 pracovních dnů

17 Strana: 17 Název vyšetření: Plazminogen aktivátor inhibitor-1 Zkrácený název: PAI-1 4G/5G Plazminogen aktivátor inhibitor typ 1 (PAI-1) je serinová proteáza, která hraje významnou roli v regulaci fibrinolytického systému. Je hlavním inhibitorem tkáňového a urokinázového aktivátoru plazminogenu a brání přeměně plasminogenu na plasmin, čímž blokuje fibrinolýzu v jejím samém počátku. PAI-1 je glykoprotein, jehož gen je lokalizován na chromosomu 7. V promotorové oblasti genu se vyskytuje inzerčně/deleční polymorfismus. Jedná se o jednonukleotidovou inzerci/deleci guanosinu v pozici Varianta 4G vede ke zvýšené transkripci genu a tím dochází ke zvýšení PAI-1 proteinu v plasmě. Vyšší hladina plazmatického PAI-1 a tím snížená fibrinolytická aktivita je spojována s progresí koronárního syndromu a s až dvojnásobně vyšším rizikem rozvojem infarktu myokardu. Přítomnost 4G varianty v promotoru genu PAI-1 zvyšuje také riziko vzniku trombóz v případě, že jsou přítomny další rizikové faktory, je spojována s vyšším rizikem úmrtí po chirurgickém výkonu a s výskytem komplikací během těhotenství a porodu. 5G/5G - negativní = wild type = nemutovaný homozygot 4G/5G - heterozygot 4G/4G - mutovaný homozygot Metoda: PCR Provádí se: 1 x za 14 dnů Doba odezvy: do 15 pracovních dnů Název vyšetření: Faktor XIII (Val34Leu) Zkrácený název: FXIII (Val34Leu) Koagulační faktor FXIIIa je specifická transglutaminasa, která se účastní tvorby fibrinu z fibrinových monomerů. Katalyzuje vznik peptidových vazeb mezi -CONH2 skupinou

18 Strana: 18 glutaminu a -NH3 skupinou lysinu a tím stabilizuje fibrinovou sraženinu a zvyšuje její rezistenci k fibrinolýze. FXIIIa je polymorfní protein. V kódujícím genu bylo zjištěno 5 nejčastějších polymorfismů, z nichž jeden, mutace G na T v exonu 2 vede k záměně valinového zbytku za leucinový v pozici 34 aminokyselinového řetězce. Frekvence alely nesoucí variantu Leu34 v indoevropské populaci je okolo 25%. Místo polymorfismu je vzdálené 3 aminokyseliny od místa štěpení trombinu ve směru k C-konci proteinu. Bylo potvrzeno, že štěpení Leu34 varianty a následná aktivace FXIII probíhá signifikantně rychleji než u varianty Val34. Polymorfismus Val34Leu má důležitý vliv na srážení krve a pravděpodobně snižuje riziko infarktu myokardu, žilní trombózy a mozkové mrtvice. wild type = nemutovaný homozygot (negativní) Heteroz. - heterozygot Homozg. - mutovaný homozygot Metoda: PCR Provádí se: 1 x za 14 dnů Doba odezvy: do 15 pracovních dnů Název vyšetření: Faktor VII (Arg353Gln) Zkrácený název: FVII (Agr353Gln) Venózní i arteriální trombózy jsou multifaktoriální onemocnění, na jejichž vzniku se vedle získaných rizikových faktorů podílejí také vrozené abnormality. Mezi nejvýznamnější genetické faktory ovlivňující riziko trombózy patří relativně často se vyskytující mutace FV Leiden, mutace prothrombinu, deleční polymorfismus promotoru PAI-1, mutace destičkových glykoproteinů, faktoru XIII případně MTHFR. Vyšetření trombofilních stavů může být doplněno o detekci polymorfismu Arg353Gln v genu pro faktor VII. Substituce nukleotidu G za nukleotid A v exonu 8 má za následek záměnu argininového zbytku za glutaminový na pozici 353 aminokyselinového řetězce. Heterozygotní a homozygotní výskyt této mutace vede ke snížení plazmatické hladiny FVII i hladiny aktivovaného cirkulujícího faktoru VII. Paradoxně RR genotyp faktoru VII (Arg353/Arg353) je asociován s vyšším rizikem trombotických komplikací a ischemickou chorobou srdeční.

19 Strana: 19 wild type = nemutovaný homozygot (negativní) Heteroz. - heterozygot Homozg. - mutovaný homozygot Metoda: PCR Provádí se: 1 x za 14 dnů Doba odezvy: do měsíce Název vyšetření: Fibrinogen (-455G>A) Zkrácený název: Fibrinogen -455G>A Fibrinogen, koagulační faktor I, je 340 kd velký rozpustný glykoprotein, který se běžně vyskytuje v krevní plazmě a v granulích krevních destiček. Patří mezi klíčové proteiny hemokoagulace, účastní se agregace destiček a ovlivňuje viskozitu plazmy. Jednotlivé řetězce fibrinogenu α, β, a γ jsou kódovány třemi různými geny na 4. chromosomu v oblasti q28. Experimentální studie prokázaly, že substituce nukleotidů G za A v pozici -455 v promotorové oblasti -fibrinogen genu má významný efekt na jeho transkripci. Přítomnost A-alely (v populaci rozšířená přibližně ve 20 %) je spojena s výrazně zvýšenou promotorovou aktivitou genu a tím se zvýšenou hladinou fibrinogenu v plazmě. Polymorfismus -455 G>A je tedy významný ve vztahu k hladině fibrinogenu u osob s koronární nemocí i u pacientů po revaskularizaci bypasem, nebyl však prokázán přímý vztah polymorfismu ke koronární nemoci a infarktu myokardu. Je obecně přijímanou skutečností, že zvýšení koncentrace fibrinogenu je ve vztahu k tíži postižení koronárního řečiště, vztah mezi polymorfismem a nemocí však zatím prokázán nebyl. U homozygotů -455 A bylo zjištěno menší riziko srdečních infarktů případně nižší riziko žilních trombóz.

20 Strana: 20 wild type = nemutovaný homozygot (negativní) Heteroz. - heterozygot Homozg. - mutovaný homozygot Metoda: PCR Provádí se: 1 x za 14 dnů Doba odezvy: do 15 pracovních dnů B) Onkohematologie Název vyšetření: Fúzní gen BCR-ABL Zkrácený název: BCR-ABL Fúzní gen BCR/ABL je molekulárním márkerem pro chronickou myeloidní leukemii (CML). Tento gen je nalézán zhruba u 95% pacientů nemocných CML a dále u 5% dětských a 25% dospělých nemocných s akutní lymfatickou leukemií (ALL), kde přítomnost tohoto genu má