WORKSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE SBORNÍK

Rozměr: px
Začít zobrazení ze stránky:

Download "WORKSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE SBORNÍK"

Transkript

1 WORKSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE SBORNÍK EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I

2

3 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 WORKSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE SBORNÍK BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I V RÁMCI PROJEKTU ROZVOJ MODERNÍCH TRENDŮ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII: VÝZNAM BIOMOLEKULÁRNÍCH INTERAKCÍ PRO FUNKCI BUNĚČNÝCH STRUKTUR OPERAČNÍ PROGRAM VZDĚLÁVÁNÍ PRO KONKURENCESCHOPNOST ČÍSLO PROJEKTU: CZ.1.07/2.3.00/

4 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 WORKSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE sborník editoval: Václav Brázda autoři: Václav Brázda, Miroslav Fojta, Michaela Vorlíčková, Ctirad Hofr, Petr Pečinka, Iva Kejnovská Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Česká republika Brno 2014 Česká Republika První vydání ISBN:

5 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Obsah Program workshopu , Brno... 6 Umístění... 8 Přednášky... 9 Elektrochemie biopolymerů... 9 Spektroskopie DNA Fluorescenční metody studia biomolekul Metody studia interakce proteinů s DNA Praktická cvičení Spektroskopie DNA - stanovení struktury a koncentrace Enzymatická syntéza značené DNA, magnetická separace a elektrochemická detekce Sledování změn struktury DNA pomocí elektrochemických metod na rtuťových elektrodách - AC voltametrie Fluorescenční značení proteinu Stanovení koncentrace DNA pomocí mikrofluorometru Imunolokalizace modifikovaných histonů H3metK4 a H3metK Izolace rostlinných buněčných jader Imunodetekce Imunodetekce 5-metylcytozinu Praktické úlohy firmy Biotech Real-time PCR (qpcr) Izolace plazmidové DNA Prezentace firem

6 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Program workshopu , Brno Neděle 31. srpna :00-19:00 Registrace a ubytování od 19:00 Slavnostní zahájení workshopu s večeří Pondělí 1. září :00-9:15 Úvodní slovo organizátorů workshopu (M. Fojta) 9:15-10:15 Elektrochemie biomolekul (M. Fojta) 10:15-10:30 Přestávka s občerstvením 10:30-11:30 Spektroskopie DNA (M. Vorlíčková) 12:00-14:00 Oběd 14:00-15:00 Interaktivní škola pipetování (Eppendorf) 15:00-15:30 Přestávka s občerstvením 15:30-17:00 Interaktivní škola pipetování (Eppendorf) 19:00 Večeře Úterý 2. září :00-10:00 Fluorescenční metody studia biomolekul (C. Hofr) 10:00-10:30 Přestávka s občerstvením 10:30-11:30 Metody studia interakce proteinů s DNA (V. Brázda) 12:00-14:00 Oběd a přesun do laboratoří 14:00-18:00 Rozdělení na skupiny, které budou řešit praktické úlohy na 2 stanovištích v UKB MU a 3 stanovištích na BFÚ AVČR 19:00 Večeře - 6 -

7 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Středa 3. září :00-10:00 Prezentace firem (Biotech) 10:00-10:15 Přestávka s občerstvením 10:15-11:00 Prezentace firem (Eppendorf) 11:00-12:00 Prezentace firem (Biotech) 12:00-14:00 Oběd a přesun do laboratoří 14:00-18:00 Rozdělení na skupiny, které budou řešit praktické úlohy na 2 stanovištích v UKB MU a 3 stanovištích na BFÚ AVČR 19:00 Večeře Čtvrtek 4. září :00-12:00 Exkurze do významných pracovišť MU 12:00-14:00 Oběd a přesun do Mendelova muzea 14:00-16:00 Prohlídka Mendelova muzea 19:00 21:00 Slavnostní večeře a zakončení workshopu Pátek 5. září :00-11:00 Závěrečná diskuze účastníků s pořadateli a evaluace workshopu - 7 -

8 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Umístění Workshop (ubytování, stravování a dopolední přednášky) probíhá v hotelu Santon, Přístavní 38, Brno Praktická cvičení probíhají na Biofyzikálním ústavu AV ČR, Královopolská 135, Brno a v kampusu Masarykovy univerzity v Brně, Kamenice 5, Brno - 8 -

9 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Přednášky Elektrochemie biopolymerů Doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc. Nukleové kyseliny a proteiny jsou elektroaktivní látky poskytující analyticky využitelné elektrochemické signály na různých typech pracovních elektrod. Tyto signály mají původ v redukci a oxidaci složek biopolymerů (nukleobází, aminokyselin), adsorpčně-desorpčních a v případě bílkovin rovněž elektrokatalytických procesech. Elektrochemické chování nukleových kyselin i bílkovin je závislé na jejich struktuře. Kromě vlastní elektrochemické aktivity biopolymerů se často využívá rovněž jejich značení různými elektroaktivními skupinami, které pomáhají zvýšit citlivost a selektivitu daného měření. V rámci této přednášky budou vysvětleny základní principy, jimiž se řídí chování přírodních a chemicky modifikovaných biopolymerů na elektrodách, a budou uvedeny příklady využití elektrochemických metod ve studiu nukleových kyselin, proteinů a v praktických bioanalytických aplikacích. Literatura: M. Fojta, Detecting DNA damage with electrodes. in: E. Palecek, F. Scheller, and J. Wang, (Eds.), Electrochemistry of nucleic acids and proteins. Towards electrochemical sensors for genomics and proteomics, Elsevier, Amsterdam, 2005, pp Hocek M, Fojta M, Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chemical Society Reviews 40, Paleček E, Bartošík M, Electrochemistry of nucleic acids. Chem. Rev E. Palecek, Electroactivity of proteins and its possibilities in biomedicine and protemics. in: E. Palecek, F. Scheller, and J. Wang, (Eds.), Electrochemistry of nucleic acids and proteins. Towards electrochemical sensors for genomics and proteomics., Elsevier, Amsterdam, 2005, pp

10 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Spektroskopie DNA prof. RNDr. Michaela Vorlíčková, DrSc. Přednáška bude věnována elektronické spektroskopii absorpční a cirkulárně dichroické (CD), jejich principům a využití pro studium DNA. Absorpční spektroskopie slouží k základní charakterizaci nukleových kyselin, tj. ke stanovení koncentrace a čistoty studovaných preparátů a stability jejich uspořádání. CD spektroskopie je užitečným, extrémně citlivým a relativně finančně nenáročným nástrojem pro stanovení globální struktury nukleových kyselin. Může být použita pro nízké i vysoké koncentrace studovaného materiálu, pro krátké i dlouhé molekuly, přičemž studované preparáty mohou být titrovány různými agens vyvolávajícími strukturní izomerizace. Průběh spektrálních změn umožňuje rozlišit konformační změny v rámci jedné struktury a kooperativní přechody mezi diskrétními strukturními stavy. CD lze použít k měření kinetiky vzniku jednotlivých konformérů a stanovení jejich termodynamických parametrů. Umožňuje zmapování strukturních vlastností vybraných nukleotidových sekvenčních motivů, které zahrnují konformační třídu B-, A- a Z- forem, triplexy, cytosinové a guaninové tetraplexy, které jsou v současné době intenzívně studovány, a další méně definované struktury DNA. Jednotlivá uspořádání poskytují charakteristická CD spektra. Díky svým četným přednostem se CD spektroskopie významně podílela na zásadních objevech uspořádání DNA, které budou v přednášce zmíněny

11 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Fluorescenční metody studia biomolekul Ctirad Hofr, Ph.D. Budou shrnuty základy jevu fluorescence, podstata fluorescenčních spekter a možnosti fluorescenčního značení proteinů a nukleových kyselin. Bude představena fluorescence jako nástroj pro analýzu struktury a interakcí biologických molekul. Výklad bude zaměřen na způsoby fluorescenčního značení biomolekul za účelem jejich vizualizace a využití fluorescence pro kvantitativní analýzu proteinů a nukleových kyselin. Navíc bude prezentováno využití fluorescenčních přístupů pro přímé sledování vzájemné vazby DNA a proteinů. Během přednášky budou posluchači seznámeni mimo jiné se souvislostí mezi sklenicí vína a objevem změny energie světla dopadajícího na roztok fluoroforu a světla následně roztokem fluoroforu emitovaného; dozví se, které oblíbené nápoje přirozeně fluoreskují a také bude objasněna záhada neomylné navigace Vikingů za sychravého počasí

12 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Metody studia interakce proteinů s DNA Václav Brázda, Ph.D. Interakce proteinů s DNA hrají klíčovou úlohu v základních biologických procesech a jsou esenciální pro všechny živé organismy. Vazba proteinů s DNA je nutnou podmínkou při expresi genů, transportu a translaci RNA, při organizaci chromatinu, genetické rekombinaci, replikaci, při opravách DNA atd. Proteiny interagují s DNA pomocí elektrostatické interakce, dipolární interakce, hydrofobických interakcí a disperzních sil. Interakci proteinů s DNA můžeme rozdělit podle specifity na sekvenčně specifickou, strukturně specifickou a nespecifickou vazbu. Ke studiu interakcí proteinů s DNA lze využít celou řada experimentálních metodik jako jsou chromatinová immunoprecipitace, elektroforetická retardační analýza, reportérové metody, DNA footprinting, fluorescenční annisotropie, atomová silová mikroskopie aj. Elektroforéza patří k separačním metodám, které pro rozdělení látek ve směsi využívají elektrické pole. V oblasti molekulární biologie se elektroforéza využívá především pro rozdělení elektricky nabitých biomakromolekul nukleových kyselin a proteinů. Elektroforéza nukleových kyselin je umožněna tím, že nukleové kyseliny ve svých molekulách obsahují pravidelně se opakující zbytek kyseliny fosforečné, která je v slabě kyselém, neutrálním a zásaditém protředí plně disociována je nositelkou záporného náboje. Protože počet zbytků kyseliny fosforečné v nukleových kyselinách roste přímo úměrně molekulové hmotnosti (počtu nukleotidů), je hustota náboje konstantní a při použití stejnosměrného elektrického pole dochází ve vhodném nosiči k dělení molekul nukleových kyselin podle jejich velikosti, případně topologického tvaru. Jako nosiče při elektroforetickém dělení nukleových kyselin se používají agarosové nebo polyakrylamidové gely. Polyakrylamidové gely se obecně používají pro kratší fragmenty DNA (velmi efektivně separují fragmenty v rozmezí bp). Nespornou výhodou polyakrylamidových gelů ve srovnání s agarosovými je jejich separační schopnost: dokážou rozdělit fragmenty DNA, které se liší o 0.2 % hmotnosti (tj. fragment dlouhý 500 bp od fragmentu dlouhého 501 bp). Agarosové gely nemají takovou rozlišovací schopnost jako gely polyakrylamidové, zato mají větší rozmezí separace. Při použití stejnosměrného napětí můžeme v agarosových gelech účinně dělit fragmenty DNA v rozmezí 50 bp až bp. Větší molekuly DNA (až několik Mbp) lze

13 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 v agarosovém gelu separovat pomocí pulsní elektroforézy, při které je periodicky měněn směr elektrického pole. Větší molekuly, které při stejnosměrném napětí migrují stejnou rychlostí, jsou pulsní elektroforézou děleny na základě rozdílného času potřebného k reorientaci. Čím větší molekula, tím delší čas vyžaduje k zaujetí orientace potřebné pro putování gelem. V rámci přednášky budou diskutovány různé metody studia interakcí DNA a proteinů s prezentací výsledků získaných na oddělení Biofyzikální chemie a molekulární onkologie Biofyzikálního ústavu Akademie Věd České republiky. Literatura: Coufal, J., Jagelska, E.B., Liao, J.C., and Brazda, V. (2013). Preferential binding of p53 tumor suppressor to p21 promoter sites that contain inverted repeats capable of forming cruciform structure. Biochem Bioph Res Co 441, Brazda, V., Coufal, J., Liao, J.C., and Arrowsmith, C.H. (2012). Preferential binding of IFI16 protein to cruciform structure and superhelical DNA. Biochem Bioph Res Co 422, Brazda, V., Cechova, J., Coufal, J., Rumpel, S., and Jagelska, E.B. (2012). Superhelical DNA as a preferential binding target of gamma protein. J Biomol Struct Dyn 30, Brazda, V., Laister, R.C., Jagelska, E.B., and Arrowsmith, C. (2011). Cruciform structures are a common DNA feature important for regulating biological processes. BMC Mol Biol 12, 33. Brazda, V., Jagelska, E.B., Liao, J.C., and Arrowsmith, C.H. (2009). The Central Region of BRCA1 Binds Preferentially to Supercoiled DNA. J Biomol Struct Dyn 27,

14 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Praktická cvičení Spektroskopie DNA - stanovení struktury a koncentrace Princip metody Ke stanovení struktury DNA v roztoku se s výhodou používá spektroskopická metoda cirkulárního dichroismu (CD). Je velmi citlivá ke vzájemné orientaci bazí ležících nad sebou ve šroubovici nukleových kyselin. Jednotlivé struktury poskytují charakteristická spektra CD. V poslední době jsou studovány kvadruplexy, tedy čtyřřetězcová uspořádání DNA, která mohou vznikat v oblastech bohatých na guanin. Základní jednotku tvoří guaninová tetráda (viz. obr 1). Podle vzájemné orientace řetězců rozdělujeme kvadruplexy na paralelní a antiparalelní. CD spektrum paralelního kvadruplexu je charakterizováno pozitivním pásem při 260 nm, antiparalelního pak pozitivním pásem při 295 nm a negativním pásem při 260 nm (obr. 2). Koncentrace nukleových kyselin se stanovuje na základě absorpce záření v ultrafialové oblasti spektra bázemi; maximum se nachází okolo 260 nm. Pomocí Lambert-Beerova zákona se z naměřené absorbance (A) vypočítá koncentrace (c): A = c..l, kde je absorpční koeficient, charakterizující danou sekvenci bazí, a l je tloušťka absorbující vrstvy. Absorpční spektrofotometrie se dále používá ke sledování termálních denaturací, ze kterých na základě teploty tání lze usuzovat na pevnost vazeb mezi řetězci DNA. Pro guaninové kvadruplexy je typické, že během denaturace dochází k výraznému poklesu absorpce okolo 295 nm, kdežto zvýšení okolo 260 nm odpovídá denaturaci jakékoliv uspořádané struktury

15 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Cíl úlohy Indukce guaninového kvadruplexu přidáním sodných nebo draselných iontů k neuspořádanému jednořetězci a následná termální denaturace kvadruplexů. Pracovní postup: 1. do 1 cm kyvety napipetujeme 1,3 ml 1 mm Na-fosfátového pufru, ph 7 a změříme na dichrografu baselinu kyvety 2. přidáme 10 l zásobního roztoku oligonukleotidu G 3 AG 3 AG 3 AG 3 pro závislost v draselných iontech a G 4 T 4 G 4 pro závislost v sodných iontech (objem je 1,310 ml), změříme orientačně UV absorpční spektrum při pokojové teplotě, aby optimální absorbance v maximu byla cca 0,8 a změříme CD spectrum před denaturací 3. kyvety omotáme kolem špuntů parafilmem, aby se roztok neodpařil, zahřejeme v absorpčním spektrofotometru na 90 C a změříme UV absorpční spektrum. Odečtenou absorbanci při 260 nm denaturovaného vzorku použijeme pro výpočet koncentrace DNA podle vztahu c = A/ l. je molární extinkční koeficient - veličina charakteristická pro danou sekvenci bazí: = M -1 cm -1 pro G 3 AG 3 AG 3 AG 3 a = M -1 cm -1 pro G 4 T 4 G 4 4. změříme CD spektrum vychladlého oligonukleotidu po denaturaci 5. zvýšíme iontovou sílu přidáním soli ze zásobního roztoku: pro draselnou závislost na 10 mm K-fosfátový pufr přidáním 35 l ze zásobního roztoku 0,4 M K-fosf. pufru ph 7 (objem je 1,345 ml, koncentraci vypočítáme podle V 1 c 1 = V 2 c 2 ); pro sodnou závislost na 150 mm NaCl přidáním 45 l ze zásobního roztoku 3M NaCl (objem je 1,345 ml) 6. změříme CD spektrum ve vyšší iontové síle 7. vzorky přepitujeme do zúžených kyvet 1 cm a spustíme teplotní závislost na UV absorpčním spektrofotometru 8. navržení struktury kvadruplexu

16 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Seznam potřebného vybavení a chemikálií: oligonukleotidy křemenné kyvety s 1 cm optickou dráhou pufr 1 mm Na-fosfát, ph 7 roztoky K-fosfátový pufr, ph 7; NaCl pipety a špičky H H N N H N N N N N H... N N... H... O O... N H H N O O... H... N N... H N N... H N N N H N N H Obrázek 1. Schéma guaninové tetrády

17 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 T T T T 20 [M -1 cm -1 ] T T T T wavelength [nm] Obrázek 2. Spektra cirkulárního dichroismu při vzniku guaninového kvadruplexu: paralelního a antiparalelního

18 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Enzymatická syntéza značené DNA, magnetická separace a elektrochemická detekce Přirozená DNA je elektrochemicky aktivní především díky tomu, že některé z nukleobází jsou redukovatelné na rtuťových elektrodách a oxidovatelné na uhlíkových elektrodách. Avšak tzv. label-free detekce DNA má svá omezení, např. při snaze analyzovat malé změny struktury v dlouhé sekvenci DNA, nebo rozlišit dva řetězce DNA mezi sebou (při hybridizaci DNA), apod. Proto je často DNA modifikována různými molekulami, které umožňují zviditelnění hledaného jevu. Detekována pak není vlastní DNA, ale tato molekula-značka, která je volena společně s podmínkami stanovení tak, aby bylo dosaženo co nejvyšší citlivosti a specificity měření. Jednou z možností značení DNA je inkorporace značených nukleotidů pomocí DNA polymeráz. Elektrochemické stanovení DNA značené antrachinonem DNA s inkorporovanými chemicky modifikovanými nukleotidy je možné připravit metodou prodlužování primeru (primer extension, PEX). Při této metodě je pomocí různých DNA polymeráz prodlužován řetězec DNA od 5 konce ke 3 konci. Syntéza probíhá podle templátu komplementárního řetězce DNA. DNA polymerázy dokáží inkorporovat jak přirozené, tak i některé chemicky modifikované nukleotidy. Pro elektrochemické stanovení se nukleotidy modifikují navázáním funkčních skupin, které je možné elektrochemicky snadno redukovat nebo oxidovat, jako jsou například antrachinon, aromatické nitroderiváty, benzofurazan a další. V této práci bude připraven oligonukleotid značený antrachinonem. Oligonukleotid bude připravený metodou PEX s využitím templátu modifikovaného biotinem a výsledný produkt bude separovaný pomocí magnetických mikročástic pokrytých streptavidinem. Připravený oligonukleotid bude elektrochemicky detekován pomocí cyklické voltametrie (CV) na visící rtuťové kapková elektrodě (HMDE). Postup: - připravit 4 vzorky o celkovém objemu 30 μl podle tabulky (A-AQ a C-AQ jsou vzorky značené antrachinonem, neznačený je přirozený oligonukleotid a bez E je kontrola bez enzymu):

19 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 neznačený A-AQ C-AQ bez E voda 10, thermo buffer basII-bio (100 g/ml) Primer (100 g/ml) datp (1 mm) dctp (1 mm) dgtp (1 mm) dttp (1 mm) da AQ TP (1 mm) dc AQ TP (1 mm) 1.4 vent(exo)dna polymeráza vzorky nechat reagovat 40 minut při 60 C a 300 rpm - promýt 15 μl DBStr (Dynabeads M-280 Streptavidin) pomocí magnetického koncentrátoru 3x 100 μl 0,3 M NaCl / 10 mm TRIS, roztok odebrat - k DBStr přidat vzorky - DBStr se vzorky třepat 20 min při 20 C a 1200 rpm, pak pomocí magnetického koncentrátoru vzorky od DBStr odebrat - DBStr promýt 3x 100 μl PBST (fosfátový pufr s 0,05% Tween), pak ještě 3x 100 μl 0,3M NaCl / 10mM TRIS, roztok odebrat - k DBStr dát 30 μl H 2 O (Sigma), třepat při 75 C, 2 min a 900 rpm - roztok od DBStr přenést do čisté eppendorfky, přidat 3 μl 2 M NaCl - změřit Měření: - metoda CV (cyclic voltammetry) (E i = 0 V, E sw = -1,85 V nebo -0,8 V, scan rate 1 V/s) - základní elektrolyt: mf (0,3 M mravenčan amonný, 50 mm fosforečnan sodný) - pracovní elektroda: HMDE

20 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září měření pomocí adsorpční přenosové techniky: Do 5 μl vzorku připraveného pomocí DBStr ponořit HMDE, nechat 1 min adsorbovat, opláchnout v dest. H 2 O, vložit do zákl. elektrolytu, změřit primer 5 3 template DNA polymerase dn AQ TP (+dntp) biotin DB stv washing heat or NaOH measurement

21 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Sledování změn struktury DNA pomocí elektrochemických metod na rtuťových elektrodách - AC voltametrie Princip metody AC voltametrie (ACV) patří mezi voltametrické metody se střídavou složkou potenciálu. U této metody se na elektrodu vkládá lineárně se měnící potenciál. Na tento potenciál je superponováno střídavé napětím sinusového průběhu o malé amplitudě (10 mv) a nízké frekvenci (desítky až stovky Hz). Měří se závislost střídavého proudu procházejícího elektrodou na jejím potenciálu. DNA dává v ACV řadu signálů. Některé z nich jsou citlivé ke změnám struktury DNA. Dvouřetězcová (ds) a jednořetězcová (ss) DNA poskytují pík 1, který je způsoben adsorpcí/desorpcí cukrfosfátové kostry. Ds DNA dále poskytuje pík 2 v důsledku adsorpce/desorpce zdeformovaných ds úseků. Ss DNA poskytuje pík 3, který je způsoben adsorpcí/desorpcí zbytků bází v jednořetězcových úsecích. Kovalentně uzavřená (superhelikální) DNA (scdna) poskytuje pouze pík ssb 0.6 I [ A] sc DNA oc DNA ss DNA E [V] e ACV záznamy scdna, otevřené kružnicové DNA (ocdna) a ssdna na visící rtuťové kapkové elektrodě. Pracovní postup - Připravíme tří vzorky scdna o výsledné koncentraci 30 g/ml

22 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září Vzorek 1 přímo naředíme 0,2M NaCl, ostatní vzorky (2,3) inkubujeme s DNasou I (30min. 37 o C), vzorek 3 po naštěpení tepelně denaturujeme (6 minut na 99 o C) - Do vzorků 2 a 3 pro elektrochemické měření přidáme NaCl tak, aby jeho výsledná koncentrace byla 0,2M. - Měření AC voltametrie do měřící nádobky nalijeme 3 5 ml základního elektrolytu (roztok 0,3 M NaCl a 50 mm Na 2 HPO 4 ). Provedeme voltametrické měření v potenciálovám rozsahu -0,6 až -1,6 V. Jako pracovní elektrodu používáme visící rtuťovou kapkovou elektrodu. Měříme nejdříve základní elektrolyt a potom postupně vzorky DNA. Měření DNA probíhá pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí voltametrie (AdTSV). Materiál a pomůcky - potenciostat (Autolab) - elektrodový systém (663 VA-stand) - tlaková láhev s argonem - DNasa I - pufr 0,3 M NaCl, 50 mm Na 2 HPO 4 - roztok 0,2 M NaCl - DNA

23 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Fluorescenční značení proteinu Materiál Fluorescenční barvička Mikrozkumavka s magnetickým míchadlem Roztok proteinu ve fosfátovém pufru (TRF2, MW = , extinkční koeficient ε = M-1cm-1, zásobní koncentrace 4 mg/ml) 1M roztok hydrogenuhličitanu sodného (NaHCO3, MW = 84), 1ml Fosfátový pufr (50 mm NaCl, 50 mm fosfát sodný) Kolona s náplní Sephadex G-25 (GE Healthcare) Kyvety Spektrofotometr (Beckmann) Příprava proteinu Pro optimální efektivitu značení by měl být protein ve fosfátovém pufru bez amonných inontů a primárních aminů. V případě, že protein je v jiném pufru (Trisový, glycinový), je možno dialýzou pufr změnit. Výsledná koncentrace roztoku proteinu na značení by neměla být menší než 2 mg/ml. Značení proteinu 1. Do mikrokyvety napipetujte roztok proteinu (roztok nařeďte přidáním fosfátového pufru na výslednou koncentraci 2 mg/ml). 2. Zkumavky s fluorescenční značkou nechte zahřát na laboratorní teplotu. Do této zkumavky přidejte 1M NaHCO 3 a to v množství 1/10 objemu roztoku naředěného proteinu a promíchejte pipetováním nahoru a dolů. Odpipetujte do mikrozkumavky s proteinem a promíchejte pipetováním nahoru a dolů. 3. Vše nechte míchat v mikrozkumavce s magnetickým míchadlem po dobu 30 minut při laboratorní teplotě minut před koncem inkubace připravte kolonu pro separaci proteinu a nenavázané fluorescenční značky

24 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Purifikace proteinu Náplň kolony Sephadex G-25 umožňuje gelovou filtrací oddělit nenavázanou fluorescenční značku od proteinu podle rozdílné velikosti a molekulové hmotnosti. 1. Kolonu umístěte do stojánku, odstraňte víčko a zátku a nechte obsah kolony vykapat. 2. Promyjte kolonu 5 ml fofátového pufru. 3. Opatrně naneste reakční směs proteinu a značky pipetou do středu kolony. Použijte 100 µl fosfátového pufru k vypláchnutí mikrozkumavky s reakční směsí a opět naneste na kolonu. Roztok nechte zaputovat do kolony. ml. 4. Po 1 ml přidávejte fosfátový pufr. Postupně jímejte frakce vytékající z kolony do mikrozkumavek po 1 Po cca 2-3 ml začíná vytékat značený protein. Zachyťte značený protein do jedné frakce. 5. Vzorek (frakci se zachyceným značeným proteinem) proměřte na spektrofotometru. Vzorek po změření nevylijte, přeměřte objem frakce. Zároveň proměřte frakci se samotnou značkou. Na základě absorpčního spektra odečtěte a dopočítejte odpovědi na soutěžní otázky. Nastavení spektrofotometru: Functions Wave scan interval vlnových délek ( nm) vložte kyvetu s blankem Blank vložte kyvetu se vzorkem Sample Options Graph scale upravit rozsah osy y, aby byly píky viditelné Určení koncentrace protein v mg/ ml A protein = A 280 A max *CF CF = A 280 volné značky A max volné značky ; CF je korekční factor udávající příspěvek značky k absorpčnímu spektru

25 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Výpočet stupně značení stupeň značení = A max x MW protein C protein x ε max st. značení = molární množství značky molární množství proteinu = koncentrace značky koncentrace proteinu = A max ε max C protein MW protein kde ε max je molární extinkční koeficient značky v excitačním maximu, C koncentrace proteinu v mg/ml a MW je molekulová hmotnost proteinu Alexa Fluor dye Abso rptio n max. Emissi on max (nm) Emission color Extinction coefficient (cm -1 M -1 )

26 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 (nm) Alexa Fluor Blue 19,000 Alexa Fluor Blue 34,000 Alexa Fluor Green/Yellow 16,000 Alexa Fluor Green 71,000 Alexa Fluor Yellow 81,000 Alexa Fluor Orange 104,000 Alexa Fluor Orange 150,000 Alexa Fluor Orange/Red 91,000 Alexa Fluor Red 73,000 Alexa Fluor Red 138,

27 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Stanovení koncentrace DNA pomocí mikrofluorometru Materiál Mikrofluorometr Qubit (Invitrogen) Quant-iT dsdna BR Assay Kit Standardy dsdna Vzorek DNA o neznámé koncentraci Qubit assay tubes Postup Připravit cca 1 ml Quant it working solution smícháním Quant-iT dsdna BR reagent a Quant-iT dsdna BR buffer v poměru 1:200 Standardy: 190 µl Quant-iT working solution + 10 µl dsdna standardu #1 #2 Vzorek o neznámé koncentraci 2x : 195 µl Quant-iT working solution + 5 µl vzorku Standardy i vzorky krátce promíchat na vortexu (2-3 sec), pozn.: ve vzorku nesmí být bublinky!! Inkubace 5-10 minut při laboratorní teplotě Zapnout Qbit fluorometr, vybrat příslušnou metodu, nová kalibrace (standardy), poté změřit neznámý vzorek (2 x 2 měření) Pozn.: Měření by mělo probíhat za laboratorní teploty (22-28 C). Intenzita fluorescence je závislá na teplotě. Teplota vzorků by proto měla být stejná. Nedržte zkumavku se vzorkem před měřením dlouho v rukou, po každém měření zkumavku ihned vyjměte z přístroje a mezi jednotlivými měřeními ji ponechte inkubovat alespoň 30 sec při laboratorní teplotě. Soutěžní otázka Jaká je koncentrace neznámého vzorku DNA?

28 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Imunolokalizace modifikovaných histonů H3metK4 a H3metK9 Cílem tohoto experimentu je naučit se připravovat preparáty z buněčných jader vhodných pro imunodetekci poznat dobré preparáty interpretovat fluorescenční signály Izolace rostlinných buněčných jader Buněčná jádra určená pro detekci chromatinových proteinů musejí být okamžitě po izolaci fixována ve formaldehydu, čímž se zabrání poškození epitopů nezbytných pro navázání protilátek. Materiál Metoda jaderný izolační pufr (NIB), čerstvě připravený a uchovávaný na ledu (10 mm Tris-HCl ph 9.5, 10 mm EDTA, 100 mm KCl, 0.5 M sacharóza, 4 mm spermidin, 1.0 mm spermin, 0.1% (v/v) 2-merkaptoethanol) 4% paraformaldehyd v PBS (10 mm fosfát sodný ph 7.0, 143 mm NaCl) nylonové filtry (50 a 20µm) žiletka 1 µg/ml DAPI ve Vectashieldu 1. Odebrat g mladých listů do Petriho misky umístěné na ledu. 2. Přidat ~0.5 ml pufru NIB a žiletkou sekat listovou tkáň, dokud nevznikne jemná suspenze (obvykle po 5 10 min). 3. Přepipetovat suspenzi pipetou s uřízlou špičkou do zkumavky. 4. Přidat stejný objem 4% paraformaldehydu a fixovat 20 min na ledu. 5. Přefiltrovat suspenzi přes 50 µm nylonový filtr do nové zkumavky. 6. Přefiltrovat suspenzi přes 20 µm nylonový filtr do nové zkumavky. 7. Centrifugovat 3 min, 2500 rpm, 4 C. 8. Odstranit supernatant a rozpustit pelet s jádry v ~40 µl pufru NIB. 9. Připipetovat 2 µl jaderné suspenze k 5 µl DAPI ve Vectashieldu a zkontrolovat kvalitu a hustohu jader pomocí fluorescenčního mikroskopu. 10. Zbylou suspenzi uchovávat na ledu. 11. Napipetovat 2 µl suspenze jader na podložní sklo a nechat zaschnout při 4 C (obvykle 1h)

29 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Imunodetekce Materiál pufr PBS (10 mm fosfát sodný ph 7.0, 143 mm NaCl) protilátka proti H3metK4 (rabbit anti-trimethylated histone H3 at lysine 4) protilátka proti H3metK9 (mouse anti-trimethylated histone H3 at lysine 9) 1% hovězí sérový albumin (BSA) pufr 4T (4 SSC ph 7.0, 0.05% (v/v) Tween-20) pufr TNT (100 mm Tris-HCl ph 7.5, 150 mm NaCl, with 0.05% (v/v) Tween-20) pufr TNB (100 mm Tris-HCl ph 7.5, 150 mm NaCl, 0.5% Boehringer blokovací činidlo) sekundární protilátky (Alexa 488-conjugated goat-anti-mouse, Alexa 594- conjugated donkey-anti-rabbit) 1 µg/ml DAPI ve Vectashieldu Metoda 1. Postfixovat preparáty ve 4% formaldehydu v PBS, 30 min při pokojové teplotě. 2. Inkubovat preparáty 30min v 1% BSA v PBS (100 µl na podložní sklo, přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 24x50 mm) ve vlhké komůrce při 37 C. 3. Opláchnout preparáty v PBS 1x5 min. 4. Detekce H3metK4: Připipetovat 1 µl protilátka proti H3metK4 do 100 µl 1% BSA. Inkubovat preparáty 2h ve vlhké komůrce při 37 C. 5. Detekce H3metK9: Připipetovat 1 µl protilátka proti H3metK9 do 50 µl 1% BSA. Inkubovat preparáty přes noc ve vlhké komůrce při pokojové teplotě. 6. Opláchnout preparáty v PBS 3x10 min. 7. Opláchnout preparáty v TNT 1x5 min. 8. Připipetovat 5 µl od každé sekundární protilátky do 1000 µl TNB. 9. Inkubovat 30 min při 37 C 10. Opláchnout preparáty v TNT 3x5 min. 11. Napipetovat na podložní skla 15 µl 1 µg/ml DAPI a přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 24x24 mm. Nenechat preparáty vyschnout!

30 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Imunodetekce 5-metylcytozinu Cílem tohoto experimentu je naučit se poznat dobré preparáty porozumět výhodám a limitům této metody interpretovat fluorescenční signály Materiál Imunolokalizace metylovaného cytozinu zahrnuje denaturaci templátu, která zvyšuje přístupnost modifikovaných bazí k protitátkám. Předmětem detekce je v tomto případě báze DNA, a proto je možné použít běžné preparáty připravené z rostlinné tkáně fixované v ethanolu/kyselině octové (3:1). běžné chromozomové preparáty připravené z rostlinné tkáně fixované v ethanolu/kyselině octové (3:1, Carnoy fixáž) nebo preparáty buněčných jader fixované v (para)formaldehydu 1% formaldehyd v PBS pufr HB50 (2xSSC, 50% formamid, 50 mm fosfát sodný ph 7.0) pufr PBS 1% BSA v PBS pufr TNT pufr TNB protilátka proti metylcytozinu (mouse-antibody against 5- methylcytosine) sekundární protilátka (rabbit-anti-mouse conjugated with Alexa 488) 1 µg/ml DAPI ve Vectashieldu Ethanol (70%, 90% a 100%) Metoda 1. Opláchnout preparáty v PBS 2 x 5 min. 2. Fixovat preparáty v 1% formaldehydu 10 min. 3. Opláchnout preparáty v PBS 2 x 5 min 4. Dehydratovat v 70, 90, 100% ethanolu (každý krok 1-2 min), nechat uschnout. 5. Na podložní sklo napipetovat 20 µl HB50, přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 22x22 mm a denaturovat 2 min při 80 C. 6. Opláchnout preparáty ve 2xSSC 2x5 min a šetrně odstranit krycí sklíčko

31 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září Inkubovat preparáty 30 min v 1% BSA v PBS (100 µl na podložní sklo, přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 24x50 mm) ve vlhké komůrce při 37 C. 8. Opláchnout preparáty v PBS 3x5 min. 9. Opláchnout preparáty v TNT 1x5 min. 10. Připipetovat 1 µl protilátky proti metylcytozinu do 40 µl TNB. Pufr s protilátkou napipetovat na podložní sklo a přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 22x32 mm. Inkubovat preparáty 30 min ve vlhké komůrce při 37 C. 11. Opláchnout preparáty v TNT 3x5 min. 12. Připipetevat 1 µl sekundární protilátky do 500 µl TNB. Pufr s protilátkou napipetovat na podložní sklo a přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 22x32 mm. Inkubovat preparáty 30 min ve vlhké komůrce při 37 C. 13. Opláchnout preparáty v TNT 3x5 min. 14. Napipetovat na podložní skla 15 µl 1 µg/ml DAPI a přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 24x24 mm. Nenechat preparáty vyschnout!

32 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Praktické úlohy firmy Biotech Real-time PCR (qpcr) na přístroji TOptical Thermocycler od firmy Biometra - Nechte všechny reagencie řádně rozmrznout - Před samotným použitím každou reagencie opatrně promíchejte 2-3x pomocí pipety - Mastermix připravte do připravené mikrozkumavky (200 µl) - Při přípravě reakce postupujte podle následujícího rozpisu: Reagencie Objem pro 1 reakci Objem pro 8 reakcí Mastermix 10 µl 80 µl Primer F (10µM) 0,8 µl 6,4 µl Primer R (10µM) 0,8 µl 6,4 µl DNA 2 µl(až do každého vzorku zvlášť) 2 µl(až do každého vzorku zvlášť) Voda 6,4 µl 51,2 µl - Připravte si strip ve kterém bude probíhat reakce - Do 7 jamek napipetujte 18 µl směsi, kterou jste si připravili - Do jamek 1 a 2 napipetujte 2 µl plazmidu naředěného 10x - Do jamek 3 a 4 napipetujte 2 µl plazmidu naředěného 100x - Do jamek 5 a 6 napipetujte 2 µl plazmidu naředěného 1 000x - Do jamky 7 napipetujte 2 µl vody (negativní kontrola bez templátu) - Strip uzavřete a stočte na centrifuze po dobu 10s. Poté strip vložte do cycleru a na stavte na přístroji následující program:

33 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září Cykly Teplota Čas Poznámky 1 95 C 2 min Aktivace polymerázy 2 min pro cdna a 3 min pro gdna 95 C 5 s Denaturace C 30 s Anealing/extension - nepřekročte 30 s a nepoužívejte teploty pod 60 C Analýza tání Podle technické specifikace přístroje C s krokem 1 C Vzorek Plazmid 10x vzorek 1 Plazmid 10x vzorek 2 Plazmid 100x vzorek 1 Plazmid 100x vzorek 2 Plazmid 1 000x vzorek 1 Plazmid 1 000x vzorek 2 Hodnota změřené Cq Efektivita PCR reakce Slope reakce

34 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Izolace plazmidové DNA kitem NucleoBond Xtra Midi Plus od firmy Macherey Nagel - V předstihu jsme provedli tyto přípravné kroky: o Bakteriální kultura byla zaočkována do média rostla přes noc o Bakteriální kultura byla stočena na centrifuze za těchto podmínek: 6000 x g 10 min při 4 C. Ze vzorku bylo vylito veškeré růstové medium (supernatant) a zbyla jen peleta (usazené buňky) - Rozpusťte lyofilizovanou RNázuA v 1 ml RES pufru. Zcela rozpuštěnou RNázu A nalijte zpět do RES pufru a pufr dobře promíchejte zatřepáním - Peletu kompletně resuspendujte v 8ml RES pufru - Ke vzniklé suspenzi přidejte 8ml LYS pufru. Po přidání LYS pufru směs 5x promíchejte otočením nevortexujte - Směs inkubujte 5min při pokojové teplotě - Připravte si kolonku pro izolaci do stojánku a naneste na ni celkem 12 ml EQU pufru, který pipetujte pouze na horní okraj kolonky - Po 5 minutách inkubace přidejte k bakteriální směsi 8ml pufru NEU a suspenzi promíchejte otáčením (10-15x). Po promíchání ihned pokračuji následujícím krokem - Falkonu se suspenzí 3x otočte, aby byl roztok důkladně homogenizován. Směs naneste na filtr - Na filtr naneste 5ml EQU pufru a po promytí filtr odstraňte - Kolonku bez filtru promyjte 8ml WASH pufru - Eluce plasmidové DNA proveďte pomocí 5ml pufru ELU. Eluát zachycujte do falkony - Přidejte 3,5ml isopropanolu o pokojové teplotě. Směs zvortexuju (10-15s na max. rychlost.)a poté nechte směs 2 min odstát a poté směs přečistěte přes filtr - Propláchněte filtr 2ml 70% etanolu, vysušte a poté vymyjte DNA 500 µl TRIS pufru

35 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září Změřte koncentraci a čistotu získané DNA na nanofotometru a data zapište do tabulky Koncentrace DNA A 260/280 A 260/230 Vzorek

36 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září

37 OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014 Prezentace firem

Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie

Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie IZOLACE GENOMOVÉ DNA Deoxyribonukleová kyselina (DNA) představuje základní genetický materiál většiny

Více

Tkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche

Tkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche Izolace RNA Pracovní postup Homogenizace: Pozn. Postup homogenizace platí pouze pro izolaci RNA z nativní tkáně, v případě izolace z buněčné suspenze je tento krok vynechán a začíná se přídavkem homogenizačního

Více

Izolace nukleových kyselin

Izolace nukleových kyselin Izolace nukleových kyselin Požadavky na izolaci nukleových kyselin V nativním stavu z přirozeného materiálu v dostatečném množství požadované čistotě. Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které

Více

cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2

cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2 cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2 Obsah soupravy a její skladování Tato souprava pro reverzní transkripci obsahuje reagencie potřebné k provedení reverzní transkripce (RT)

Více

Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202)

Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202) Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202) Popis Column DNA Lego Kit je základ moderní stavebnicové (Lego) soupravy pro izolaci čisté DNA různého

Více

Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii

Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 1/1 Proč biofyzikální metody? Biofyzikální metody využívají fyzikální principy ke studiu biologických systémů Poskytují kvantitativní

Více

Sure-MeDIP I. with magnetic beads and MNase. www.krd.cz

Sure-MeDIP I. with magnetic beads and MNase. www.krd.cz Sure-MeDIP I with magnetic beads and MNase www.krd.cz 1 Obsah soupravy a skladování MeDIP souprava obsahuje reagencie na provedení 25 reakcí. Souprava je rozdělen do dvou částí, jedna je distribuována

Více

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. 2. 3. 6. 3. 2015 KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální

Více

Protokoly Transformace plasmidu do elektrokompetentních buněk BL21 Pracovní postup:

Protokoly Transformace plasmidu do elektrokompetentních buněk BL21 Pracovní postup: Protokoly Pracovní potřeby, pufry a chemikálie jsou uvedeny na konci protokolu. Pracovní postupy jsou odvozeny od těchto kitů: Champion pet160 Directional TOPO Expression Kit with Lumio Technology (Invitrogen)

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální

Více

Seminář izolačních technologií

Seminář izolačních technologií Seminář izolačních technologií Zpracoval: Karel Bílek a Kateřina Svobodová Podpořeno FRVŠ 2385/2007 a 1305/2009 Úpravy a aktualizace: Pavla Chalupová ÚMFGZ MZLU v Brně 1 Lokalizace jaderné DNA 2 http://www.paternityexperts.com/basicgenetics.html

Více

α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C

α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C Popis stripů: Pracovní postup Izolace DNA Doporučujeme použít následující kit pro izolaci DNA z plné krve nebo jiných typů vzorků: Spin Micro DNA Extraction

Více

Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách

Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách Teorie Stanovení celkových proteinů Celkové množství proteinů lze stanovit pomocí několika metod; například: Hartree-Lowryho

Více

Braf V600E StripAssay

Braf V600E StripAssay Braf V600E StripAssay Kat. číslo 5-570 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci čerstvých nebo mražených biopsií použijte soupravy Qiagen QIAmp DNA Mini nebo Micro. Pro izolaci

Více

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Izolace RNA doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Metodiky izolace RNA celková buněčná RNA ( total RNA) zahrnuje řadu typů RNA, které se mohou lišit svými fyzikálněchemickými vlastnostmi a tedy i nároky na jejich

Více

Hybridizace nukleových kyselin

Hybridizace nukleových kyselin Hybridizace nukleových kyselin Tvorba dvouřetězcových hybridů za dvou jednořetězcových a komplementárních molekul Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA. Denaturace DNA oddělení komplementárních

Více

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE)

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) Princip SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza slouží k separaci proteinů na základě jejich velikosti (molekulové hmotnosti). Zahřátím vzorku za

Více

ÚLOHA C Klonování PCR produktu do plasmidu

ÚLOHA C Klonování PCR produktu do plasmidu Jméno a učo: Datum: ÚLOHA C Klonování PCR produktu do plasmidu TEORETICKÝ ÚVOD Při klonování PCR produktů do plasmidů se využívá vlastnosti Taq polymerasy, a jiných non-proofreading polymeras, přidávat

Více

Praktický kurz. Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii

Praktický kurz. Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii Oddělení funkční genomiky a proteomiky Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Praktický kurz Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii Místo konání: Brno,

Více

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Více

CVD-T StripAssay. Kat. číslo 4-360. 20 testů 2-8 C

CVD-T StripAssay. Kat. číslo 4-360. 20 testů 2-8 C CVD-T StripAssay Kat. číslo 4-360 20 testů 2-8 C Popis stripu Pracovní postup Izolace DNA Použijte čerstvou nebo zmraženou krev s EDTA nebo citrátem, jako antikoagulans, vyhněte se krvi s obsahem heparinu.

Více

NRAS StripAssay. Kat. číslo 5-610. 20 testů 2-8 C

NRAS StripAssay. Kat. číslo 5-610. 20 testů 2-8 C NRAS StripAssay Kat. číslo 5-610 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci DNA musí být použita vhodná metoda vzhledem k typu tkáně vzorku. Pro doporučení vhodné metody kontaktujte

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální choroby

Více

EGFR XL StripAssay. Kat. číslo 5-630. 20 testů 2-8 C

EGFR XL StripAssay. Kat. číslo 5-630. 20 testů 2-8 C EGFR XL StripAssay Kat. číslo 5-630 20 testů 2-8 C Popis stripu Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci DNA použijte vhodný izolační kit. Doporučené kity jsou následující: Pro izolaci čerstvých nebo

Více

Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul

Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 8.11.2007 7 1 UV spektroskopie DNA a proteinů Všechny atomy absorbují v UV oblasti

Více

IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod: detekce přímo v buňkách - fluorescenční barvení

Více

1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I

1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I 1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I Vazba bromfenolové modři na sérový albumin Princip úlohy Albumin má unikátní vlastnost vázat menší molekuly mnoha typů. Díky struktuře, tvořené

Více

TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin

TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin Teoretický úvod: TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin 1 Teoretický úvod: TESTOVÁNÍ GMO Obecně na úvod Určitě jste už slyšeli pojem geneticky modifikovaný organismus (GMO). Úprava vlastností přirozeně

Více

1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru

1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru Protokol č.: F1-4 Datum: 20.12.2010 Metodika: analýza efektivity přípravy výběr z výsledků ze zkušebních provozů výroby antigenů. Vypracoval: Ing. Václav Filištein, Mgr. Tereza Chrudimská, Spolupracující

Více

Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů

Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Bioanalytické metody Prof. RNDr. Pavel Peč, CSc. Úvod Kritéria výběru metod stanovení koncentrace proteinů jsou založena na možnostech pro vlastní analýzu,

Více

2) Připravte si 3 sady po šesti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky.

2) Připravte si 3 sady po šesti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky. CVIČENÍ Z ENZYMOLOGIE 1) Stanovení Michaelisovy konstanty trypsinu pomocí chromogenního substrátu. Aktivita trypsinu se určí změřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid)

Více

Braf 600/601 StripAssay

Braf 600/601 StripAssay Braf 600/601 StripAssay Kat. číslo 5-560 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup Kit umožňuje detekci 9 mutací v genu BRAF (kodón 600 a 601) Další informace najdete v OMIM Online Mendelian Inheritance

Více

Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování

Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování Protein Gel Electrophoresis Kit obsahuje veškerý potřebný materiál provádění vertikální polyakrilamidové gelové elektroforézy. Experiment provádějí

Více

Laboratorní analytické metody. Petr Tůma

Laboratorní analytické metody. Petr Tůma Laboratorní analytické metody Petr Tůma Rozdělení analytických metod Metody separační Chromatografie kapalinová plynová Elektroforéza Metody spektrální absorpční spektrometrie v UV/VIS Metody elektrochemické

Více

Sure-MeDIP II. with agarose beads and Mse I. www.krd.cz

Sure-MeDIP II. with agarose beads and Mse I. www.krd.cz Sure-MeDIP II with agarose beads and Mse I www.krd.cz 1 Obsah soupravy a skladování MeDIP souprava obsahuje reagencie na provedení 25 reakcí. Souprava je rozdělen do dvou částí, jedna je distribuována

Více

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné:

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné: Výběrové otázky: 1. Součástí všech prokaryotických buněk je: a) DNA, plazmidy b) plazmidy, mitochondrie c) plazmidy, ribozomy d) mitochondrie, endoplazmatické retikulum 2. Z následujících tvrzení, týkajících

Více

Praktický kurz Pokročilé biofyzikální přístupy v genomice a proteomice. 12.-13. května 2010

Praktický kurz Pokročilé biofyzikální přístupy v genomice a proteomice. 12.-13. května 2010 www.modernibiofyzika.cz Oddělení funkční genomiky a proteomiky Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Praktický kurz Pokročilé biofyzikální přístupy v genomice a proteomice

Více

MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY:

MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: POKROČILÉ PRAKTICKÉ VZDĚLÁVÁNÍ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII Operační program Vzdělávání pro konkurenceschopnost Číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/09.0046 Praktický kurz pokročilých

Více

Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy,

Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy, Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy, vyhodnocení výsledků, diskuse Anotace

Více

Metoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi. Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi

Metoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi. Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi Metoda Live/Dead aneb využití fluorescenční mikroskopie v bioaugmentační praxi Juraj Grígel Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi Co je to vlastně ta fluorescence? Některé látky (fluorofory)

Více

Monitorování hladiny metalothioneinu a thiolových sloučenin u biologických organismů vystavených působení kovových prvků a sloučenin

Monitorování hladiny metalothioneinu a thiolových sloučenin u biologických organismů vystavených působení kovových prvků a sloučenin Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Monitorování hladiny metalothioneinu a thiolových sloučenin u biologických organismů vystavených působení kovových prvků a sloučenin Ing. Kateřina Tmejová, Ph. D.,

Více

Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/

Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/ Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/28.0088 Hybridizační metody v diagnostice Mgr. Gabriela Kořínková, Ph.D. Laboratoř molekulární

Více

Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření

Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření Vyučující: Ing. et Ing. David Hynek, Ph.D., Prof. Ing. René

Více

Příprava vektoru IZOLACE PLASMIDU ALKALICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLACE DNA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ. E. coli. lyze buňky.

Příprava vektoru IZOLACE PLASMIDU ALKALICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLACE DNA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ. E. coli. lyze buňky. Příprava vektoru IZOLCE PLSMIDU LKLICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLCE DN E. coli plasmidová DN proteiny proteiny + + vysrážená plasmidová lyze buňky + snížení ph chromosomální DN centrifugace DN chromosomální

Více

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH Michaela Nesvadbová Význam identifikace živočišných druhů v krmivu a potravinách povinností každého výrobce je řádně a pravdivě označit

Více

Výzkumné centrum genomiky a proteomiky. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i.

Výzkumné centrum genomiky a proteomiky. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i. Výzkumné centrum genomiky a proteomiky Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i. Systém pro sekvenování Systém pro čipovou analýzu Systém pro proteinovou analýzu Automatický sběrač buněk Systém pro sekvenování

Více

Kras XL StripAssay. Kat. číslo 5-680. 20 testů 2-8 C

Kras XL StripAssay. Kat. číslo 5-680. 20 testů 2-8 C Kras XL StripAssay Kat. číslo 5-680 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Musí být použity vhodné metody extrakce DNA, v závislosti na typu vzorku, který má být vyšetřován. Doporučení

Více

Pokročilé biofyzikální přístupy v experimentální biologii

Pokročilé biofyzikální přístupy v experimentální biologii Molekulální komplexy chromatinu CEITEC, Masarykova univerzita Praktický kurz Pokročilé biofyzikální přístupy v experimentální biologii Místo konání: Brno, Univerzitní kampus Bohunice blok A2, seminární

Více

Fluorescenční mikroskopie

Fluorescenční mikroskopie Fluorescenční mikroskopie Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 1 VYUŽITÍ FLUORESCENCE, PŘÍMÁ FLUORESCENCE, PŘÍMÁ A NEPŘÍMA IMUNOFLUORESCENCE, BIOTIN-AVIDINOVÁ METODA IMUNOFLUORESCENCE

Více

Western blotting. 10% APS 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl

Western blotting. 10% APS 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl Western blotting 1. Příprava gelu složení aparatury hustotu gelu volit podle velikosti proteinů příprava rozdělovacího gelu: 10% 12% počet gelů 1 2 4 1 2 4 objem 6 ml 12 ml 24 ml 6 ml 12 ml 24 ml 40% akrylamid

Více

SDS-PAGE elektroforéza

SDS-PAGE elektroforéza SDS-PAGE elektroforéza Příprava gelu... 1 Recept na 0.75 mm gel (1 gel/2 gely)... 2 Recept na 1.5 mm gel (1 gel/2 gely)... 2 Příprava vzorku... 3 Elektroforéza... 3 Barvení gelů Blue Silver... 4 Chemikálie

Více

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII Martina Nováková, VŠCHT Praha MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE V BIOREMEDIACÍCH enumerace FISH průtoková cytometrie klonování produktů PCR sekvenování

Více

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE. 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE. 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR) MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR) Náplň praktik 1. Izolace DNA z buněk bukální sliznice - izolační kit MACHEREY-NAGEL 2. PCR polymerázová řetězová reakce (templát gdna) 3. Restrikční

Více

Polymerázová řetězová reakce. Základní technika molekulární diagnostiky.

Polymerázová řetězová reakce. Základní technika molekulární diagnostiky. Polymerázová řetězová reakce Základní technika molekulární diagnostiky. Kdo za to může? Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 Princip PCR Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction PCR) umožňuje

Více

ANALÝZA MARKERŮ OXIDAČNÍHO POŠKOZENÍ DNA, PROTEINŮ A LIPIDŮ PO IN VITRO APLIKACI LÁTEK NA BUNĚČNÉ KULTURY HEL a A549

ANALÝZA MARKERŮ OXIDAČNÍHO POŠKOZENÍ DNA, PROTEINŮ A LIPIDŮ PO IN VITRO APLIKACI LÁTEK NA BUNĚČNÉ KULTURY HEL a A549 ANALÝZA MARKERŮ OXIDAČNÍHO POŠKOZENÍ DNA, PROTEINŮ A LIPIDŮ PO IN VITRO APLIKACI LÁTEK NA BUNĚČNÉ KULTURY HEL a A549 O B S A H 1. Aplikace testovaných látek na buněčné kultury 2. Oxidační poškození DNA

Více

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY ELEKTROFORÉZA K čemu to je? kritérium čistoty preparátu stanovení molekulové hmotnosti makromolekul stanovení izoelektrického

Více

FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP

FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP na gymnáziu Pierra de Coubertina v Táboře Pavla Trčková, kabinet Biologie, GPdC Tábor Co je fluorescence Fluorescence je jev spočívající v tom, že některé látky (fluorofory) po

Více

Molekulová spektroskopie 1. Chemická vazba, UV/VIS

Molekulová spektroskopie 1. Chemická vazba, UV/VIS Molekulová spektroskopie 1 Chemická vazba, UV/VIS 1 Chemická vazba Silová interakce mezi dvěma atomy. Chemické vazby jsou soudržné síly působící mezi jednotlivými atomy nebo ionty v molekulách. Chemická

Více

POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)

POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR) Polymerázová řetězová reakce (PCR, z anglického Polymerase Chain Reaction) je metoda rychlého zmnožení (amplifikace) vybraného úseku DNA. Množený (amplifikovaný) úsek

Více

IZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT NUCLEOSPIN FOOD)

IZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT NUCLEOSPIN FOOD) 1252.1 Izolace DNA pro stanovení GMO metodou Strana 1 IZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT NUCLEOSPIN FOOD) 1 Účel a rozsah Postup slouží k získání deoxyribonukleové kyseliny (DNA) ze vzorku

Více

RNA Blue REAGENS PRO RYCHLOU PŘÍPRAVU ČISTÉ A NEDEGRADOVANÉ RNA (katalogové číslo R011, R012, R013)

RNA Blue REAGENS PRO RYCHLOU PŘÍPRAVU ČISTÉ A NEDEGRADOVANÉ RNA (katalogové číslo R011, R012, R013) RNA Blue REAGENS PRO RYCHLOU PŘÍPRAVU ČISTÉ A NEDEGRADOVANÉ RNA (katalogové číslo R011, R012, R013) Upozornění: RNA Blue obsahuje fenol a další toxické komponenty. Při kontaktu s kůží je nutné omytí velkým

Více

PROTOKOL NORTHERNOVA HYBRIDIZACE

PROTOKOL NORTHERNOVA HYBRIDIZACE ! NORTHERNOVA HYBRIDIZACE Vzhledem k tomu, že se při Northern hybridizaci pracuje s RNA a RNA je extrémně citlivá na působení RNáz, je zapotřebí se vyvarovat jakékoliv kontaminace RNázami. Pro snížení

Více

Téma: Testy životaschopnosti a Počítání buněk

Téma: Testy životaschopnosti a Počítání buněk LRR/BUBV vičení z buněčné biologie Úloha č. 3 Téma: Testy životaschopnosti a Počítání Úvod: Při práci s buňkami je jedním ze základních sledovaných parametrů stanovení jejich životaschopnosti (viability).

Více

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. 4. 3. 8. 3. 2013 OPVK Praktický kurz, 2013 KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ

Více

S filtračními papíry a membránou je nutno manipulovat pinzetou s tupým koncem.

S filtračními papíry a membránou je nutno manipulovat pinzetou s tupým koncem. Western Blotting Příprava blotovacího sendviče... 1 Blotování... 2 Kontrola přenesení proteinů na membránu... 2 Blokování membrány... 2 Aplikace protilátek... 2 Vizualizace... 3 Vyvolání filmu... 4 Chemikálie

Více

Molekulárně biologické metody v mikrobiologii. Mgr. Martina Sittová Jaro 2014

Molekulárně biologické metody v mikrobiologii. Mgr. Martina Sittová Jaro 2014 Molekulárně biologické metody v mikrobiologii Mgr. Martina Sittová Jaro 2014 Harmonogram 1. den Izolace DNA 2. den Měření koncentrace DNA spektrofotometricky, real-time PCR 3. den Elektroforéza Molekulární

Více

Metody molekulární biologie

Metody molekulární biologie Metody molekulární biologie 1. Základní metody molekulární biologie A. Izolace nukleových kyselin Metody využívající různé rozpustnosti Metody adsorpční Izolace RNA B. Centrifugační techniky o Princip

Více

Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku

Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku Pavla Balínová http://vyuka.lf3.cuni.cz/ Důležité informace Kroužkový asistent: RNDr. Pavla Balínová e-mailová adresa: pavla.balinova@lf3.cuni.cz místnost: 410 studijní

Více

Praktické cvičení: Izolace a purifikace rekombinantního proteinu

Praktické cvičení: Izolace a purifikace rekombinantního proteinu Praktické cvičení: Izolace a purifikace rekombinantního proteinu Toto blokové praktické cvičení spočívá v teoretickém i praktickém seznámení s rekombinantními proteiny, jejich izolací, purifikací a využitím.

Více

HbA1c. Axis - Shield. Společnost je zapsána v obchodním rejstříku Městského soudu v Praze, odd. C vložka 1299

HbA1c. Axis - Shield. Společnost je zapsána v obchodním rejstříku Městského soudu v Praze, odd. C vložka 1299 Lékařská technika a speciální zdravotní materiál Společnost je zapsána v obchodním rejstříku Městského soudu v Praze, odd. C vložka 1299 Obchodní 110, 251 70 Praha Čestlice Tel. +420 296 328 300 Fax. +420

Více

CA15-3 IRMA Souprava CA15-3 IRMA umožňuje přímé in-vitro kvantitativní stanovení s tumorem asociovaného antigenu CA15-3 v lidském séru

CA15-3 IRMA Souprava CA15-3 IRMA umožňuje přímé in-vitro kvantitativní stanovení s tumorem asociovaného antigenu CA15-3 v lidském séru Informace o výrobku Informace o ostatních produktech jsou dostupné na www.demeditec.com Návod k použití CA15-3 IRMA Souprava CA15-3 IRMA umožňuje přímé in-vitro kvantitativní stanovení s tumorem asociovaného

Více

Chromoprobe Multiprobe - T System

Chromoprobe Multiprobe - T System Návod k použití REF: PMP 009/PMP 008/ PMP 007 Chromoprobe Multiprobe - T System Pouze pro profesionální použití Fluorescenční In Situ Hybridizace (FISH) je technika, která umožňuje detekci DNA sekvencí

Více

Vzdělávání středoškolských pedagogů a studentů středních škol jako nástroj ke zvyšování kvality výuky přírodovědných předmětů CZ.1.07/1.1.00/14.

Vzdělávání středoškolských pedagogů a studentů středních škol jako nástroj ke zvyšování kvality výuky přírodovědných předmětů CZ.1.07/1.1.00/14. Praktické cvičení z chemie 1) Stanovení lipofilních listových barviv pomocí adsorpční chromatografie. 2) Stanovení proteinů v roztoku. 3) Homogenizace rostlinného materiálu pomocí tekutého dusíku a stanovení

Více

METODY STUDIA PROTEINŮ

METODY STUDIA PROTEINŮ METODY STUDIA PROTEINŮ Mgr. Vlasta Němcová vlasta.furstova@tiscali.cz OBSAH PŘEDNÁŠKY 1) Stanovení koncentrace proteinu 2) Stanovení AMK sekvence proteinu Hmotnostní spektrometrie Edmanovo odbourávání

Více

Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE

Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE je jednoduchá, rychlá a reprodukovatelná metoda pro kvalifikovanou charakterizaci a srovnání bílkovin.tato metoda separuje

Více

ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I.

ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM / EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: 18. 4. 22. 4. 2011 II. TURNUS: 2. 5. 6. 5. 2011 MODERNÍ

Více

GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI

GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI INDUKOVANÉ PŮSOBENÍM ORGANICKÝCH LÁTEK Z PRACHOVÝCH ČÁSTIC V OVZDUŠÍ Kateřina Hanzalová Oddělení genetické ekotoxikologie Ústav experimentální medicíny AV ČR v.v.i.

Více

Moderní nástroje pro zobrazování biologicky významných molekul pro zajištění zdraví. René Kizek

Moderní nástroje pro zobrazování biologicky významných molekul pro zajištění zdraví. René Kizek Moderní nástroje pro zobrazování biologicky významných molekul pro zajištění zdraví René Kizek 12.04.2013 Fluorescence je fyzikálně chemický děj, který je typem luminiscence. Luminiscence se dále dělí

Více

AdnaTest ProstateCancerSelect

AdnaTest ProstateCancerSelect AdnaTest ProstateCancerSelect Obohacení nádorových buněk z krve pacientů s rakovinou prostaty pro analýzu genové exprese Pro diagnostiku in vitro Příručka T-1-520 Obsah Informace pro objednávky... 3 Účel...

Více

OBSAH. PP Master Mixy... 11 PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14

OBSAH. PP Master Mixy... 11 PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14 OBSAH DNA polymerázy pro PCR a pufry.................. 3 Taq DNA polymeráza 4 Taq DNA polymeráza Unis 5 TaqPurple DNA polymeráza 6 Taq DNA polymeráza 1.1 7 Combi Taq DNA polymeráza 8 LA DNA Polymerases

Více

ZÁKLADNÍ KURZ V RÁMCI UDRŽITELNOSTI PROJEKTU POŘÁDÁME ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL

ZÁKLADNÍ KURZ V RÁMCI UDRŽITELNOSTI PROJEKTU POŘÁDÁME ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL V RÁMCI UDRŽITELNOSTI PROJEKTU POŘÁDÁME ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY

Více

Fluorescenční mikroskopie

Fluorescenční mikroskopie Luminiscence jev, kdy látka vysílá do prostoru světlo chemická reakce chemiluminiscence (např. světluška) světlo fotoluminiscence fluorescence (emisní záření jen krátkou dobu po skončení exitačního záření)

Více

PROTOKOL WESTERN BLOT

PROTOKOL WESTERN BLOT WESTERN BLOT 1. PŘÍPRAVA ELEKTROFORETICKÉ APARATURY Saponátem a vodou se důkladně umyjí skla, plastové vložky a hřebínek, poté se důkladně opláchnou deionizovanou/destilovanou vodou a etanolem a nechají

Více

Cvičení ke kurzu Obecná ekotoxikologie. Úloha A - Stanovení ekotoxicity v testu klíčení rostlin

Cvičení ke kurzu Obecná ekotoxikologie. Úloha A - Stanovení ekotoxicity v testu klíčení rostlin Cvičení ke kurzu Obecná ekotoxikologie Nutné potřeby, které studenti přinesou s sebou do cvičení: - Tento návod - Poznámkový sešit, psací potřeby - Nůžky - Pravítko (s milimetrovým rozlišením) - Přezůvky

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2 Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2 1 Rozsah a účel Metoda je vhodná pro stanovení fumonisinů B 1 a B 2 v krmivech. 2 Princip Fumonisiny

Více

List protokolu QIAsymphony SP

List protokolu QIAsymphony SP List protokolu QIAsymphony SP Srpen 2015 Tissue_LC_200_V7_DSP a Tissue_HC_200_V7_DSP (uživatelem validovaný pro použití s minisadou QIAsymphony DSP DNA) Tento dokument Tissue_LC_200_V7_DSP a Tissue_HC_200_V7_DSP

Více

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů Polymorfismus délky restrikčních fragmentů Princip: Chemikálie: PCR produkt z předchozího praktického cvičení Endonukleáza KpnI 10 U μl -1 Pufr pro KpnI 10 koncentrovaný (Tris-HCl 100 mmol l -1 ph 7,5,

Více

5. BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ PŘI POUŽITÍ A MANIPULACI

5. BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ PŘI POUŽITÍ A MANIPULACI N-Histofine Simple Stain AP (M) Univerzální imuno-alkalická fosfatáza polymer, anti-myší N-Histofine imunohistochemické barvicí reagens Skladovat při 2-8 C 1. ÚVOD Firma Nichirei vyvinula jedinečný imunohistochemický

Více

ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE

ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE LABORATOŘ OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE (111) F Imobilizace na alumosilikátové materiály Vedoucí práce: Ing. Eliška Leitmannová, Ph.D. Umístění práce: laboratoř F07, F08 1 Úvod Imobilizace aktivních

Více

ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL

ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: 23. 4. 27. 4. 2012 / II. TURNUS: 14. 5. 18. 5. 2012 ZÁKLADNÍ

Více

Laboratorní úlohy z molekulární biologie

Laboratorní úlohy z molekulární biologie ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE FAKULTA TROPICKÉHO ZEMĚDĚLSTVÍ Katedra tropických a subtropických plodin a agrolesnictví Laboratoř molekulární biologie Laboratorní úlohy z molekulární biologie Plant

Více

Uživatelská příručka

Uživatelská příručka PGM Barcoding Set 1-8 Navrženo pro PGM ION-TORRENT KÓD PRODUKTU: 2001 (1-8) BALEN9: 32 testů Uživatelská příručka Rev02.2015 Str. 1 Rejstřík 1. POUŽITÍ VÝROBKU 3 2. OBSAH KITU 4 3. SKLADOVÁNÍ 4 4. STABILITA

Více

Imunochemické metody. na principu vazby antigenu a protilátky

Imunochemické metody. na principu vazby antigenu a protilátky Imunochemické metody na principu vazby antigenu a protilátky ANTIGEN (Ag) specifická látka (struktura) vyvolávající imunitní reakci a schopná vazby na protilátku PROTILÁTKA (Ab antibody) molekula bílkoviny

Více

Písemná zpráva zadavatele

Písemná zpráva zadavatele Písemná zpráva zadavatele veřejné zakázky zadávané dle zákona č. 137/2006 Sb., o veřejných zakázkách, ve znění účinném ke dni zahájení zadávacího řízení (dále jen ZVZ ). Veřejná zakázka Název: Ostatní

Více

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE I PŘÍPRAVA TKÁNĚ K IZOLACI DNA

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE I PŘÍPRAVA TKÁNĚ K IZOLACI DNA Cvičení 9,10,11: MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Jméno: Skupina: Cíl: Seznámení se se základními metodami, využívanými k analýze DNA 1. izolace DNA 2. amplifikace DNA pomocí PCR 3. restrikční štěpení PCR produktu

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS 1 Rozsah a účel Postup je určen pro stanovení obsahu melaminu a kyseliny kyanurové v krmivech. 2 Princip

Více

ANALYTICKÝ SYSTÉM PHOTOCHEM

ANALYTICKÝ SYSTÉM PHOTOCHEM ANALYTICKÝ SYSTÉM PHOTOCHEM Analytický systém Photochem (firmy Analytik Jena, Německo) je vhodný pro stanovení celkové antioxidační kapacity (tj. celkové schopnosti vzorku vychytávat volné radikály) různých

Více

Stanovení celkové kyselosti nápojů potenciometrickou titrací

Stanovení celkové kyselosti nápojů potenciometrickou titrací Stanovení celkové kyselosti nápojů potenciometrickou titrací Princip metody U acidobazických titrací se využívají dva druhy indikace bodu ekvivalence - vizuální a instrumentální. K vizuální indikaci bodu

Více

Měření koncentrace roztoku absorpčním spektrofotometrem

Měření koncentrace roztoku absorpčním spektrofotometrem Měření koncentrace roztoku absorpčním spektrofotometrem Teoretický úvod Absorpční spektrofotometrie je metoda stanovení koncentrace disperzního podílu analytické disperze, založená na měření absorpce světla.

Více