MIKROBIOLOGICKÉ LABORATORNÍ METODY

Transkript

1 VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE Ústav hygieny a technologie mléka MIKROBIOLOGICKÉ LABORATORNÍ METODY MVDr. Šárka Bursová, Ph.D. Mgr. Marta Dušková, Ph.D. MVDr. Lenka Necidová, Ph.D. doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D. Mgr. Petra Myšková BRNO 2014

2

3 Tato skripta jsou spolufinancována z Operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost: Inovace bakalářského a navazujícího magisterského studijního programu v oboru Bezpečnost a kvalita potravin (reg. č. CZ.1.07/2.2.00/ ) 1

4 Obsah OBSAH 1. KULTIVAČNÍ METODY (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) Vybrané komerční kultivační soupravy Systém TEMPO Základní principy Provedení a vyhodnocení testu Výhody, nevýhody a využití metody TEMPO v praxi AUTOMATIZOVANÉ SYSTÉMY VYUŽÍVANÉ PŘI IDENTIFIKACI MIKROORGANISMŮ (Mgr. Marta Dušková, Ph.D.) Systém VITEK (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) Základní principy Výhody, nevýhody a využití systému VITEK v praxi Systém Biolog Základní principy Výhody, nevýhody a využití systému Biolog v praxi Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF Základní principy Příprava izolátů Výhody a nevýhody metody MALDI-TOF MS Využití metody MALDI-TOF MS v praxi Biosenzory Základní principy Biorekogniční část Fyzikálně-chemický převodník Výhody a nevýhody biosenzorů Využití biosenzorů v praxi MIKROSKOPICKÉ METODY (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) Fluorochromy a sondy používané v mikroskopii Fluorochromy Využití fluorochromů při vitálním barvení Molekulární sondy Základní druhy mikroskopie Světelná (optická) mikroskopie Fluorescenční mikroskopie Epifluorescenční mikroskopie Elektronová mikroskopie Přímá epifluorescenční filtrační technika DEFT Základní principy Stanovení celkového počtu mikroorganismů v syrovém mléce Modifikace metody DEFT Automatizace metody DEFT systém BactoScan Výhody, nevýhody a využití metody DEFT v praxi Průtoková cytometrie Základní principy, složení průtokového cytometru Výhody a nevýhody průtokové cytometrie Využití průtokové cytometrie v praxi Využití průtokové cytometrie při hodnocení kvality syrového mléka

5 Obsah 4. IMUNOLOGICKÉ METODY (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) Aglutinační testy Imunochromatografická metoda Základní principy Výhody, nevýhody a využití imunochromatografie v praxi Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA Základní principy Konfigurace ELISA metod používaných v mikrobiologii potravin Sendvičová ELISA Nepřímá sendvičová ELISA Kompetitivní ELISA Komerčně dostupné ELISA soupravy Výhody, nevýhody a využití ELISA metod v praxi Enzyme-Linked Fluorescent Assay ELFA (MVDr. Lenka Necidová, Ph.D.) Základní principy Provedení metody a vyhodnocení výsledků Výhody, nevýhody a využití metody ELFA v praxi METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE (Mgr. Marta Dušková, Ph.D.) Způsoby izolace nukleových kyselin Izolace nukleové kyseliny prokaryot Izolace nukleové kyseliny virů Polymerázová řetězová reakce (PCR) Základní principy Detekce PCR produktů Modifikace PCR Real-time PCR (qpcr) Inhibitory polymerázové řetězové reakce Výhody, nevýhody a využití metody PCR v praxi Hybridizační techniky Základní principy Hybridizace na pevném podkladu Mikročipy ( microarrays ) Výhody, nevýhody a využití hybridizačních technik v praxi NEPŘÍMÉ METODY (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) Elektrické metody Teorie impedance Základní principy Přímá metoda měření impedance Nepřímá metoda měření impedance Faktory ovlivňující impedanční stanovení Měřicí systémy Výhody a nevýhody elektrických metod Využití elektrických metod v praxi Radiometrické stanovení 14 CO Limulus Amebocyte Lysate test LAL test Detekce pozitivní reakce Zkumavkový LAL test Využití LAL testu v praxi

6 Obsah 6.4. ATP bioluminiscenční test Základní principy Stanovení počtu mikroorganismů v potravinách Využití v praxi Výhody a nevýhody Monitoring hygieny a sanitace v potravinářských provozech Výhody a nevýhody Využití ATP bioluminiscence při detekci vybraných patogenů Měřicí přístroje STANOVENÍ CITLIVOSTI MIKROORGANISMŮ K AML (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) Rezistence mikroorganismů k AML Antimikrobiální látky a jejich účinek na mikroorganismy Rezistence mikroorganismů k antimikrobiálním látkám Mechanismy rezistence mikroorganismů k AML Vznik a šíření rezistence mikroorganismů k AML Semikvantitativní metody Disková difúzní metoda Kvantitativní diluční metody Agarová diluční metoda Provedení a vyhodnocení testu Výhody a nevýhody agarové diluční metody Diluční mikrometoda (mikrodiluční metoda) Provedení a vyhodnocení testu Výhody a nevýhody diluční mikrometody Etest Provedení a vyhodnocení testu Výhody, nevýhody a využití Etestu v praxi Genotypové metody stanovení rezistence Odhalování mutací spojených s rezistencí k AML Výhody a nevýhody použití genotypových metod STANOVENÍ BAKTERIÁLNÍCH TOXINŮ (MVDr. Lenka Necidová, Ph.D.) Toxiny Staphylococcus aureus Stafylokokové enterotoxiny Přímé metody detekce stafylokokových enterotoxinů Imunologické metody Fyzikálně-chemické metody Nepřímé metody detekce stafylokokových enterotoxinů Využití v praxi Toxiny Bacillus cereus Emetický toxin a diarhogenní enterotoxiny Přímé metody detekce toxinů B. cereus Imunologické metody Fyzikálně-chemické metody Další přímé metody Nepřímé metody detekce toxinů B. cereus Využití v praxi

7 Obsah 8.3. Toxiny Clostridium botulinum Botulotoxiny Metody detekce toxinů C. botulinum Průkaz botulotoxinu Identifikace typu botulotoxinu Další metody Využití v praxi TYPIZAČNÍ METODY A JEJICH VYUŽITÍ PŘI EPIDEMIOLOGICKÉM ŠETŘENÍ ALIMENTÁRNÍCH ONEMOCNĚNÍ (doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D., Mgr. Petra Myšková) Alimentární onemocnění Typizační metody Sérotypizace Antigenní struktura Fágová typizace Rezistence k antimikrobiálním látkám Makrorestrikční analýza a pulsní gelová elektroforéza (PFGE) Sekvenční metody Případové studie Případová studie Případová studie Případová studie Případová studie Použitá literatura

8 PŘEDMLUVA Mikrobiologická analýza má při výrobě potravin zcela nezastupitelnou roli. Význam mikroorganismů nespočívá pouze v otázce bezpečnosti potravin a ochrany konzumentů před možným vznikem alimentárního onemocnění, významná je také jejich úloha při výrobě a zpracování potravin, zejména fermentovaných výrobků, či naopak podíl na jejich kažení. Spolu se zvyšujícím se tlakem na produkci bezpečných a kvalitních potravin, vzrůstá i potřeba jednoduchých, rychlých a co nejvíce specifických metod detekce mikroorganismů, určených jako vhodná alternativa ke klasickému kultivačnímu vyšetření. Učební text je určen studentům navazujícího magisterského studijního programu Bezpečnost a kvalita potravin realizovaného na Fakultě veterinární hygieny a ekologie Veterinární a farmaceutické univerzity Brno. Cílem učebního textu bylo komplexním způsobem obsáhnout problematiku laboratorních metod používaných při mikrobiologickém vyšetření potravin a potravinových surovin. Jsou zde uvedeny všechny základní skupiny mikrobiologických metod kultivační metody, systémy využívané při identifikaci mikroorganismů, mikroskopické metody, imunologické metody, molekulárně biologické metody a techniky používané při nepřímém stanovení mikroorganismů. V druhé části skript je zmíněna problematika rezistence mikroorganismů k antimikrobiálním látkám a metody stanovení jejich citlivosti, dále významné bakteriální toxiny a možnosti jejich stanovení v potravinách, a v neposlední řadě i typizační metody a jejich využití při epidemiologickém šetření. S některými metodami se posluchači již detailně seznámili v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody ve 2. ročníku bakalářského studijního programu Bezpečnost a kvalita potravin. Abychom předešly zbytečnému opakování, jsou tyto metody ve skriptech zmíněny pouze okrajově s odkazem na příslušné studijní materiály, ve kterých je tato problematika řešena podrobněji. Závěrem bychom rády poděkovaly recenzentkám MVDr. Marcele Faldynové, Ph.D. a RNDr. Danuši Lefnerové, Ph.D. za kritické a konstruktivní připomínky. Autorky 6

9 Kultivační metody 1. KULTIVAČNÍ METODY Zlatým standardem při hodnocení mikrobiologické kvality potravin stále zůstává, i přes velký rozvoj alternativních metod, kultivační vyšetření. Kultivační metody jsou obvykle metodami referenčními, umožňují jak kvantitativní tak kvalitativní stanovení. Cílem kvantitativních metod je stanovení počtu životaschopných buněk cílové skupiny mikroorganismů. Mezi základní techniky patří metoda zalití, metoda roztěru a metoda stanovení nejpravděpodobnějšího počtu mikroorganismů (MPN, Most Probable Number). Stanovení počtu některých mikroorganismů (zejména patogenů) může být rozšířeno o krok resuscitace, jehož cílem je zachycení i stresovaných či subletálně poškozených buněk. Jednou z možností je např. využití membránových filtrů, které se po filtraci nejdříve krátce kultivují na neselektivním médiu a teprve poté se filtr umístí na selektivní agar (stanovení počtu Escherichia coli O157 v potravinách). Další možností je homogenizace vzorku v neselektivní či částečně selektivní tekuté půdě a jeho krátká resuscitace při laboratorní teplotě, jako je tomu např. při stanovení počtu Listeria monocytogenes. Kvalitativní stanovení je zaměřeno na průkaz přítomnosti či absence cílového mikroorganismu v dané navážce vzorku. Tento typ stanovení je časově i materiálově náročnější a obvykle probíhá v několika na sobě navazujících stupních primární pomnožení (předpomnožení), sekundární pomnožení, izolace a konfirmace. Cílem předpomnožení (neselektivní tekuté médium) či primárního pomnožení (selektivní tekutá půda se sníženou koncentrací inhibičních složek) je mimo jiné resuscitace stresovaných či subletálně poškozených cílových buněk. Během sekundárního pomnožení se výrazně zvyšuje počet cílových mikroorganismů. Při stanovení některých mikroorganismů se využívá pouze jeden pomnožovací krok (např. stanovení termotolerantních druhů rodu Campylobacter). Pomnožený vzorek se izoluje na pevných selektivních či selektivně diagnostických agarech. Růst cílového mikroorganismu se projeví vznikem kolonií s typickou morfologií, příp. doplněnou o charakteristické změny živného média. Protože jenom velmi málo používaných diferenciálních živných médií je zcela specifických, je nejen při kvalitativním stanovení nezbytné provést vhodnými metodami konfirmaci suspektních kolonií cílových mikroorganismů. Problematika kultivačních metod a jejich využití v mikrobiologii potravin je detailně studována v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie a skripta Mikrobiologie potravin praktická cvičení II. Metody stanovení mikroorganismů v potravinách). Konvenční kultivační metody používané pro detekci mikroorganismů v potravinách jsou dobře zavedené, jednoduché, levné a mohou být použity pro kvantitativní i kvalitativní analýzu. Mezi jejich nevýhody, zejména při stanovení patogenních mikroorganismů, patří nezbytnost kultivace v několika různých živných médiích, detekce růstu vizuálně a potřeba provedení konfirmačních testů (biochemických a serologických). To má za následek zvýšenou pracnost, subjektivní hodnocení výsledků a zejména dlouhou dobu stanovení. Zkrácení doby stanovení a snížení požadavků na laboratorní vybavení lze dosáhnout použitím alternativních neboli rychlých metod. Mezi tzv. rychlé metody lze zařadit celou řadu technologií založených na mikroskopii, měření ATP (adenosintrifosfátu), monitoringu metabolické aktivity elektrickým měřením, stanovení nukleových kyselin či imunologii. Protože v poslední době došlo k výraznému zvýšení kvality, výkonnosti a komerční dostupnosti těchto metod, jsou rychlé metody v praxi stále více využívány. Na druhou stranu nemohou rychlé metody kompletně nahradit kultivační vyšetření, a to zejména při stanovení patogenních mikroorganismů. Je obvyklé, že se kultivační i rychlé metody používají v kombinaci, kdy např. rychlá metoda nahradí jeden krok kultivačního stanovení. 7

10 Kultivační metody 1.1. Vybrané komerční kultivační soupravy Jednou z možností zjednodušení klasického kultivačního vyšetření je použití tenkých rehydrovatelných kultivačních filmů (např. Petrifilm, výrobce 3M), které jsou tvořeny dvěma plastickými filmy potaženými vysušeným kultivačním médiem a dehydratovaným gelovým činidlem rozpustným studenou vodou. Po odkrytí horního filmu (krycí folie) se 1 ml vzorku přidá do středu spodního filmu. Inokulum se horním filmem opatrně překryje a následně se roztlačí kruhovým tvořítkem do požadované plochy. Tím dojde k rehydrataci živného média a vytvoří se podmínky vhodné pro růst mikroorganismů. Kultivační podmínky se volí s ohledem na stanovované mikroorganismy. Kultivační rehydratovatelné filmy jsou vhodné pro stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM), různých indikátorových mikroorganismů i některých patogenů (např. S. aureus, Listeria spp.). Na trhu jsou dále dostupné různé formy otiskových nosičů či kontaktních Petriho misek. Otiskové nosiče (tzv. dipslides) nabízí celá řada firem Orion Diagnostica (Hygicult ), Merck Millipore (řada Cult Dip), Oxoid Ltd., HiMedia Laboratories (řada HiDip Slide ), Accepta, atd. Obvykle se jedná o ohebný plastový nosič, který je z obou stran potažen živným médiem a umístěn ve sterilní šroubovatelné zkumavce. Vzorkování se nejčastěji děje otiskem živného média na testovaný povrch, možné je i ponoření nosiče do vyšetřované tekutiny, případně nanesení vzorku sterilním tamponem. Díky uzavření nosiče ve sterilní zkumavce jsou dipslidy lehce použitelné přímo v potravinářském provozu. Spektrum vyšetření je obvykle omezeno na indikátorové skupiny mikroorganismů. Některé sety jsou určeny pro stanovení MPN. Jedná se např. o systém SimPlate (výrobce BioControl), což je speciálně tvarovaná kruhová plastová miska s velmi malými jamkami. Před nalitím do misky se vzorek smíchá s kultivačním médiem. V průběhu inkubace je chromogenní substrát obsažený v živném médiu hydrolyzován cílovými bakteriemi. Po ukončení inkubace se hodnotí počet jamek se změnou barvy a odhadne se hodnota MPN. Systém SimPlate umožňuje stanovení CPM, kvasinek a plísní, Enterobacteriaceae, koliformních bakterií/e. coli, Campylobacter spp. Pro stanovení koliformních bakterií, resp. E. coli ve vodě lze využít systém Colilert (výrobce IDEXX Laboratories). Systém je tvořen speciálně tvarovanou deskou s komůrkami, do kterých se nalije směs vzorku a kultivačního média. Kultivační médium obsahuje chromogeny a fluorogeny. Přítomnost sledovaných mikroorganismů je indikována změnou barvy, fluorescencí (E. coli) a tvorbou plynu. Po ukončení inkubace je spočítán počet pozitivních komůrek a odhadnuta hodnota MPN. Ke stanovení enterokoků ve vodách lze využít podobný systém Quanti-Tray (výrobce IDEXX Laboratories) Systém TEMPO Při vyšetření vzorků potravin a tekutin s očekávanou nízkou úrovní kontaminace mikroorganismy, se již více než 100 let používá metoda stanovení nejpravděpodobnějšího počtu mikroorganismů. Metoda MPN patří mezi základní techniky stanovení počtu mikroorganismů při použití tekutých půd. Je založena na pravděpodobnosti záchytu mikroorganismů ze vzorku. Hodnota MPN se odečítá v tabulkách, kde jsou statisticky vypočteny nejpravděpodobnější hodnoty odpovídající počtu záchytů, tj. počtu pozitivních zkumavek ve třech po sobě jdoucích sériích ředění vzorku, pro daný počet očkovaných zkumavek v každé sérii. Klasické provedení je tří- či pětizkumavkový test. V roce 2007 uvedla firma biomérieux na trh systém TEMPO miniaturizovaný systém stanovení MPN. TEMPO je plně automatizovaný test založený na enzymatickém principu. Je určen pro přímé stanovení počtu vybraných mikroorganismů v potravinách. 8

11 Kultivační metody Základní principy Systém TEMPO se skládá ze tří komponent TEMPO kitu, plničky (tzv. filler) a čtečky (tzv. reader). TEMPO kit tvoří vialka s kultivačním médiem, do které se v průběhu testu přidává homogenát vyšetřované potraviny (ředění 10-1 ), a specifická karta. Vialka obsahuje lyofilizované kultivační médium, které musí být před inokulací vzorku resuspendováno v destilované vodě. Kultivační médium je po naočkování testovaným vzorkem v plničce automaticky přeneseno do specifické karty, která obsahuje 3 sady jamek po 16, vždy s jedním logaritmem rozdílu v objemu každé sady (první sadu tvoří 16 malých jamek; druhou sadu 16 větších jamek, které mají 10ti násobný objem oproti první sérii; třetí sérii 16 velkých jamek, které mají 10ti násobný objem oproti druhé sérii). Vialka i karta jsou opatřeny unikátním čárovým kódem, který slouží k přesné identifikaci jednotlivých vzorků a vylučuje jejich záměnu. Plnička je vlastně vakuová komora, ve které dochází k naplnění karet směsí ve vialce. Inkubace vzorků probíhá v běžném termostatu. K odečtu výsledků se používá čtečka. Součástí obou přístrojů (plničky i čtečky) jsou počítače vybaveny specifickým softwarem. Oba přístroje jsou vzájemně propojeny pomocí bezdrátové sítě a dochází mezi nimi k automatickému přenosu dat. Obrázek 1: TEMPO specifická karta. Při inkubaci karet dochází k růstu přítomných mikroorganismů, které metabolizují živiny z kultivačního média. K detekci přítomnosti mikroorganismů (pozitivní záchyt) v systému TEMPO může docházet dvojím způsobem. První možností je pokles ph, k němuž dochází při metabolizaci živin z kultivačního média, a současné vymizení fluorescenčního signálu vyzařovaného 4-methylumbeliferonem (4MU). Signál je snímačem TEMPO detekován díky fluorescenčnímu indikátoru ph pouze tehdy, je-li ph neutrální. Tento způsob vyhodnocení se používá např. při stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM). Druhá možnost detekce je založena na specifické enzymatické aktivitě stanovovaných bakterií. Při tomto způsobu dochází k enzymatickému odštěpení látky z vazby na 4MU, jenž se stává fluorescentní. Pozitivní jsou v tomto případě jamky vyzařující fluorescenční signál. Tento způsob vyhodnocení se používá např. při stanovení E. coli. Na základě počtu pozitivních zkumavek v každé řadě získáme stejně jako u klasické metody MPN trojciferný kód, který je přístrojem automaticky vyhodnocen. Konečný výsledek, včetně zohlednění stupně ředění vzorku, je uveden přímo v KTJ (kolonie tvořící jednotky, angl. Colony Forming Unit, CFU) na gram vyšetřované potraviny Provedení a vyhodnocení testu Počáteční příprava vzorku zahrnuje jeho homogenizaci v pufrované peptonové vodě (10 g a 90 ml, resp. 25 g a 225 ml, tj. ředění 10-1 ). Následuje resuspendace živného média ve vialce sterilní destilovanou vodou, její množství se volí podle požadovaného finálního ředění vzorku (3 ml ředění 1:40 nebo 3,9 ml ředění 1:400). Obsah vialky důkladně promícháme na vortexu. Homogenizovaný vzorek se asepticky dávkuje do vialky v množství 1 ml (finální ředění 1:40) nebo 0,1 ml (finální ředění 1:400), obsah vialky se opět důkladně promíchá. Následuje načtení čárového kódu vialky a načtení prázdné karty pomocí čtečky čárových kódů, jenž je součástí TEMPO systému. Po zanesení údajů do systému a jejich zobrazení na počítači, který je součástí plničky, lze doplnit název vzorku a jeho ředění (1:40 nebo 1:400, 9

12 Kultivační metody příp. i vyšší). Karta i vialka se vloží do speciálního stojánku tak, aby nasávací trubička karty byla ponořena do vialky. Stojánek se následně umístí do plničky, po jejím spuštění je vzorek pod tlakem automaticky rozplněn do všech 48 jamek na kartě. Po naplnění karty je nasávací trubička automaticky odříznuta a zatavena. Před umístěním stojánku do inkubátoru se provádí vizuální kontrola, zda opravdu došlo k nasátí vzorku do karty. Inkubační podmínky se volí podle požadavků stanovovaných mikroorganismů. Po ukončení inkubace se karty přenesou do readeru, který hodnotí v každé jamce vznik (příp. zánik) fluorescence a automaticky vypočítá hodnotu MPN. Během několika minut je výsledek získaný na základě zohlednění ředění zobrazen v počítači v přehledné tabulce přímo v KTJ/g potraviny. Přístroj umožňuje i přímé vytištění výsledků nebo jejich transport do uživatelského PC Výhody, nevýhody a využití metody TEMPO v praxi Metoda TEMPO je plně automatizovaná s minimem nároků na obslužný personál. Její provedení je velmi jednoduché, výrobce uvádí maximální kapacitu více než 500 vyšetření za den. Je vhodná pro laboratoře, které pravidelně vyšetřují větší počty vzorků. Stanovené výsledky mají výbornou korelaci s klasickou metodou MPN. Určitou nevýhodou mohou být investiční náklady na pořízení nezbytného přístrojového vybavení a následně i cena TEMPO kitů. Metodu lze využít pro vyšetření celé řady mikroorganismů zahrnujících jak patogenní, tak indikátorové a technologicky významné mikroorganismy. V současné době jsou dostupné kity pro stanovení CPM, koliformních bakterií, E. coli, kvasinek a plísní, bakterií mléčného kvašení a koagulasa pozitivních stafylokoků. 10

13 Systémy identifikace mikroorganismů 2. AUTOMATIZOVANÉ SYSTÉMY VYUŽÍVANÉ PŘI IDENTIFIKACI MIKROORGANISMŮ Velmi oblíbenými identifikačními nástroji v mikrobiologii jsou automatizované systémy, které velmi rychle poskytují výsledek. Doplňují ostatní mikrobiologické metody běžně používané v laboratořích Systém VITEK Systém VITEK (výrobce biomérieux) je rychlý, plně automatizovaný systém umožňující identifikaci mikroorganismů současně se stanovením jejich citlivosti k antimikrobiálním látkám. Nachází široké uplatnění v řadě oborů. VITEK byl vyvinut koncem 60-tých let minulého století pro NASA a byl určen pro přímou detekci a identifikaci patogenů ve vzorcích moči kosmonautů. Původní systém byl označován jako MLM (Microbial Load Monitor). Koncem 70-tých let byl firmou MacDonell Douglas uveden na trh automatický systém označovaný jako Auto Microbic System určený pro klinickou mikrobiologii. Byl schopen identifikovat devět nejčastějších patogenů močového ústrojů. V roce 1977 se vytvořila samostatná divize Vitek Systems, po níž získal přístroj své konečné označení. Postupně se také rozšiřovala použitelnost systému v různých odvětvích průmyslové mikrobiologie. Novou generaci představuje modernizovaný systém VITEK 2, který byl na trh uveden v roce Opět se jedná o plně automatizovaný systém umožňující současnou identifikaci mikroorganismů a stanovení jejich citlivosti k antimikrobiálním látkám. Úplnou novinkou je systém VITEK MS. Identifikace mikroorganismů je zde založena na principu hmotnostní spektrometrie (MALDI-TOF), výsledky jsou k dispozici během několika minut Základní principy Systém VITEK je integrální modulární systém skládající se z několika základních komponent. První z nich je identifikační karta (ID card) tenká plastová karta obsahující 30 malých jamek naplněných různými dehydrovanými biochemickými substráty. Zastoupení jednotlivých biochemických testů odpovídá testované skupině mikroorganismů. K plnění identifikačních karet připravenou suspenzí mikroorganismu dochází v jednotce označované jako plnička (filler), což je v podstatě vakuová komora, do které se ve speciálním stojánku umístí identifikační karta a vialka s připravenou suspenzí. Po naplnění karty, je dávkovací trubička uříznuta a zatavena, čímž dojde k úplnému uzavření identifikační karty. Další jednotku představuje inkubátor s readerem. Identifikační karty jsou inkubovány obvykle při teplotě C. Každou hodinu je spektrofotomericky hodnocena změna barvy či tvorba zákalu uvnitř jamek na kartě. Současně je posuzována i produkce plynu. Celková doba stanovení se pohybuje v rozmezí 4 až 12 hodin. Tyto informace jsou přenášeny do počítače, kde jsou zpracovány. Výsledky biochemických testů jsou porovnány s databází známých kultur a následně je provedena identifikace testovaného mikroorganismu. Součástí vybavení počítače je i tiskárna. Při identifikaci mikroorganismů jsou využívány následující databáze známých kultur: gramnegativní mikroorganismy (GNI), grampozitivní mikroorganismy (GPI), bakterie rodu Bacillus (BAC), anaerobní mikroorganismy (ANI), kvasinky (YBC), nefermentující mikroorganismy (NFC) a rody Neisseria/Haemophilus (NHI). Při stanovení citlivosti k antimikrobiálním látkám se používají speciální karty (tzv. AST cards) obsahující více než 40 látek. Výsledky jsou vyjádřeny hodnotou MIC (minimální inhibiční koncentrace). 11

14 Systémy identifikace mikroorganismů Výhody, nevýhody a využití systému VITEK v praxi Jednoznačnou výhodou systému VITEK je jednoduché a velmi rychlé provedení testu, výsledky identifikace jsou známy během několika hodin. Systém je plně automatizovaný, umožňuje současné stanovení velkých sérií vzorků. Nevýhodou jsou samozřejmě vyšší investiční náklady na pořízení nezbytného vybavení a do jisté míry i cena stanovení. Z tohoto důvodu nelze VITEK doporučit do laboratoří s velmi malým počtem vyšetřovaných vzorků. Mimo širokého využití v klinické diagnostice se systém VITEK používá také k hodnocení farmaceutických a kosmetických výrobků a potravin, kde nachází uplatnění zejména při stanovení patogenních mikroorganismů (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, atd.). Velké využití má také při identifikaci klinicky významných multirezistentních bakterií Systém Biolog Pro identifikaci a charakterizaci mikrobiologických kultur vyvinula firma Biolog, Inc. systém Biolog rychlý a levný prostředek pro získání velkého množství informací o analyzovaných mikroorganismech Základní principy Princip tohoto identifikačního systému spočívá ve schopnosti mikroorganismů metabolizovat sacharidové substráty umístěné v 96-ti jamkové mikrotitrační destičce. Pokud naočkované mikroorganismy mají enzymy schopné metabolizovat dané substráty, dochází k uvolnění elektronů ze substrátu a probíhá oxidace. Tyto elektrony přijímá barvivo trifenyltetrazoliumchlorid (TTC), čímž se redukuje a dochází ke vzniku trifenylformazanu (TPF), reakce je doprovázena změnou barvy. Dostatečné množství buněk v jamce mikrodestičky tak zajišťuje pozorovatelnou barevnou změnu. Tímto způsobem každý mikroorganismus získá specifický kód, díky kterému je identifikován. Postup analýzy je jednoduchý. Nejdříve se na agaru izoluje čistá kultura, poté se připraví inokulum o předepsané koncentraci buněk a naočkuje se vhodná mikrotitrační destička. V průběhu času dochází při inkubaci k vývoji barvy v jednotlivých jamkách podle toho, jak mikroorganismus využívá jednotlivé substráty. Po inkubaci je mikrodestička umístěna do mikrostanice pro analýzu, kde reader odečte absorbanci (k odečtům je použito dvou vlnových délek, 590 nm a 750 nm). Výsledky jsou zaznamenány a srovnány s širokou databází mikroorganismů, ve které je uloženo přes 2000 druhů. Systémy existují manuální (MicroLog), poloautomatické (MicroStation) zahrnující kromě softwaru i identifikační reader, a plně automatické systém OmniLog (software, inkubátor/reader) Výhody, nevýhody a využití systému Biolog v praxi Výhodou systému Biolog je rychlá a poměrně přesná identifikace mikroorganismů díky široké škále biochemických reakcí obsažených v mikrodestičce a komplexní databázi mikroorganismů (bakterie, kvasinky, plísně). Nevýhodou tohoto systému je možnost identifikace pouze kultivovatelných mikroorganismů, pro vhodný výběr panelu testů se musí předem nadefinovat, o jakou skupinu mikroorganismu se jedná. Dále je zde potenciální riziko křížových reakcí, u manuální verze není možné měřit absorbanci (vyhodnocení je vizuální). Původně měl systém Biolog sloužit pro snadnou identifikaci klinicky významných bakterií. Nyní jsou mikrodestičky vyvinuty pro různé skupiny mikroorganismů aerobní bakterie, anaerobní bakterie, grampozitivní bakterie, gramnegativní bakterie, kvasinky a plísně. V nejnovější verzi tohoto systému lze identifikovat na stejném panelu jak grampozitivní, tak gramnegativní bakterie zároveň, a tím odpadá před vlastní analýzou barvení dle Grama a další testování pro výběr vhodného panelu substrátů. 12

15 Systémy identifikace mikroorganismů Kromě identifikace mikroorganismů má systém Biolog také možnost sledovat funkční diverzitu mikrobiálních společenstev se speciálními testovacími panely pro ekologické a ekotoxikologické studie Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF Rychlou a velmi přesnou identifikaci a typizaci mikroorganismů poskytuje hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem (MALDI-TOF MS, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry). Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF patří mezi chemotaxonomické metody. Proces identifikace je založen na analýze ribosomálních a dalších proteinů v buňce. Ribosomální proteiny představují asi 20 % veškerých buněčných bílkovin a asi 3 % celkové hmoty. Tyto makromolekuly jsou specifické pro jednotlivé bakteriální druhy a díky tomu mohou být považovány za vhodné biomarkery. Hmotnostní spektrometrie je vysoce citlivá analytická technika s detekčními limity řádově až desetiny femtomolů. Obrázek 2: Schéma přístroje MALDI-TOF MS Základní principy Jedná se o šetrnou ionizační metodu, kdy biomolekuly (proteiny buněčných extraktů) nejsou po ataku laseru štěpeny, ale pouze ionizovány pomocí matrice (obrázek 3). Nejčastěji se využívají dusíkové UV lasery, v menší míře infračervené (IR) lasery. Ozáření o vlnové délce 337 nm trvá 4 ns. Matrice zajistí kontakt analyzované molekuly s laserem tak, aby biomolekula nebyla atakována přímo a štěpena nežádoucím způsobem. Matrice dále zprostředkovává přenos energie, kdy excitované molekuly matrice za vysokého tlaku ionizují molekuly analytu (biomolekuly) přenosem protonu. Ionty, které přešly do plynné fáze, postupují přes silné elektrické pole, ve kterém jsou urychleny a zaostřeny. Vstoupí do vakuové trubice hmotnostního analyzátoru doby letu (TOF, Time of Flight), kde se pohybují Obrázek 3: Schéma ionizace. 13

16 Systémy identifikace mikroorganismů rychlostí úměrnou jejich hmotnosti a náboji (obrázek 2). Měří se doba letu částice, lehčí či více nabité ionty dorazí k detektoru dříve než těžší nebo méně nabité. Detektor je propojen s počítačem a pomocí softwaru jsou data zpracována. Obrázek 4: Dendrogram vytvořený na základě MALDI-TOF MS profilů. (autor O. Šedo) Pro každý kmen je vytvořeno hmotnostní spektrum, neboli profil jeho proteomu. Toto hmotnostní spektrum je zobrazením četnosti ionizovaných částic buněčného proteomu. Profily proteinů jsou pro daný druh mikroorganismu vysoce charakteristické. Vlastní identifikace mikroorganismů následně spočívá ve srovnávání proteinového spektra izolátu se spektry referenčních kmenů v databázi MALDI Biotyper. Z matice podobnosti spekter se provádí klastrová (shluková) analýza. Shluky podobnosti se zobrazují jako dendrogram (obrázek 4). Na základě získaného dendrogramu je založena klasifikace v rámci rodu, druhu, a v některých případech i poddruhu či typizace kmene. Míra spolehlivosti identifikace (podobnost izolátu s referenčním kmenem v databázi) se vyjadřuje jako log(score). Pokud je log(score) vyšší než hodnota 2,3, jedná se o vysoce pravděpodobnou identifikaci na úrovni druhu. Log(score) v rozmezí 2,3 2,0 potvrzuje vysoce pravděpodobnou identifikaci na úrovni rodu a pravděpodobnou identifikaci na úrovni druhu. Pravděpodobnou identifikaci na úrovni rodu mají kmeny s log(score) 2,0 1,7. Výsledky s hodnotami pod 1,7 nejsou signifikantní. Samotná analýza je velmi rychlá a výsledky jsou možné získat během několika minut Příprava izolátů Příprava izolátů pro analýzu MALDI-TOF MS je velmi jednoduchá. Analyzovat se mohou celé buňky nebo jejich extrakty. Nejrychlejším způsobem je nanesení mikroorganismů vykultivovaných na agaru či v bujónu, promytých deionizovanou vodou a s přídavkem matrice, přímo na MALDI destičku. Buněčné proteiny je doporučeno extrahovat zejména u grampozitivních bakterií vzhledem ke struktuře jejich buněčné stěny (silná vrstva peptidoglykanu) např. působením enzymů lysozymu či lysostaphinu, chemických rozpouštědel (ethanolu, acetonitrilu, směsi chloroform-methanol), ultrazvukové sonikace či tepelného záhřevu. Čisté 24 hodinové bakteriální kultury jsou resuspendovány a inaktivovány v 75% ethanolu. Po centrifugaci a důkladném odstranění supernatantu je k buňkám přidána matrice v poměru 1:10 4. Matrice musí absorbovat vlnovou délku použitého laseru, musí být fotostabilní a tvořit malé krystaly. Nejčastěji se používají deriváty kyseliny benzoové či skořicové. Výběr vhodné matrice je zcela zásadní pro kvalitu analýzy. Jako rozpouštědlo se používá acetonitril, aceton či organická kyselina ve směsi s vodou a pro zvýšení Obrázek 5: MALDI destička. (autor O. Šedo) 14

17 Systémy identifikace mikroorganismů kvality signálu je přidávána kyselina trifluoroctová (TFA) či mravenčí (FA). Směs je nanášena na speciální destičku z nerezové oceli či hliníku, která je inertní vůči matrici a rozpouštědlům. Na této kovové destičce se může analyzovat až 384 izolátů. Po vysušení vzorků při pokojové teplotě je destička umístěna do hlubokého vakua (10-4 Pa) v iontovém zdroji hmotnostního spektrometru a proběhne analýza MALDI-TOF MS. Po analýze se MALDI destička důkladně vyčistí a tím je připravena k dalšímu použití Výhody a nevýhody metody MALDI-TOF MS Tato metoda má velké přednosti díky levnému provozu, snadnosti a rychlosti provedení, vysoké rozlišovací schopnosti, snadné reprodukovatelnosti a možnosti analyzovat velký počet izolátů najednou. Pro analýzu je potřeba velmi malé množství vzorku. Je aplikovatelná pro široké spektrum mikroorganismů a obejde se bez předchozí charakteristiky izolátu a jeho zařazení do určité skupiny. Limitujícím faktorem této metody je identifikace druhů mikroorganismů, které nejsou obsaženy v databázi. Avšak hmotnostní spektra nových referenčních kmenů se neustále do databáze doplňují. Mezi další nevýhody patří vysoké pořizovací náklady přístrojového vybavení a komplikovaná identifikace některých fylogeneticky příbuzných druhů bakterií či směsných kultur Využití metody MALDI-TOF MS v praxi Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF byla v nedávné době zavedena do rutinní mikrobiologické diagnostiky. MALDI-TOF MS se začíná úspěšně využívat v různých oblastech mikrobiologie, nejen v klinické praxi. Metodou lze identifikovat bakterie, kvasinky a plísně izolované z různých biologických materiálů, potravin i vzorků prostředí. Stává se klíčovým nástrojem v rámci kontroly bezpečnosti potravin. Mikroorganismy lze identifikovat nejen do rodu, ale také na druhové úrovni a v některých případech i na úrovni poddruhů. MALDI-TOF MS lze snadno a rychle identifikovat nejen patogenní bakterie izolované z potravin, jako jsou E. coli O157:H7, Yersinia spp., Salmonella spp., Campylobacter spp., jednotlivé druhy listerií včetně L. monocytogenes, Clostridium spp., Bacillus cereus, Staphylococcus aureus (včetně rozlišení meticilin rezistentních MRSA, od meticilin senzitivních kmenů S. aureus), Enterococcus spp., ale také technologicky významnou avšak na identifikaci komplikovanou skupinu bakterií mléčného kvašení a další mikroorganismy. Hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF se mohou analyzovat také rekombinantní proteiny, proteiny faktorů virulence, proteiny sporových stěn a S-vrstvy, enzymy, metabolity, bakteriociny, atd Biosenzory Biosenzor je analytický přístroj s velmi širokým využitím. Uplatňuje se v humánní i veterinární medicíně, farmaceutickém a potravinářském průmyslu, zemědělství, životním prostředí, atd. Pomocí biosenzorů jsou zkoumány interakce protilátka-antigen, DNA-DNA, DNA-protein, receptor-ligand, protein-ligand a mnoho dalších interagujících dvojic. Studium biosenzorů spadá do několika vědních oborů biochemie, biotechnologie, analytická a fyzikální chemie, elektronika, informatika, nauky o materiálech a biologie Základní principy Biosenzor má dvě hlavní části (obrázek 6). Biorekogniční část citlivý prvek biologického původu, který má za úkol styk s testovaným vzorkem (analytem). Biorekogniční část je buď součástí, nebo v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem. Ten převádí biologický nebo biochemický signál na měřitelný a kvantifikovatelný elektrický nebo optický 15

18 Systémy identifikace mikroorganismů signál vhodný k dalšímu zpracování. Signál je přímo úměrný koncentraci stanovovaných látek ve vzorku. Samotné měření může probíhat buď v uzavřené nádobce, v průtočném Obrázek 6: Schéma složení biosenzoru. systému nebo přímo v kontaktu s analytem. Měření v uzavřené nádobce je velmi jednoduché a nenáročné na vybavení, avšak je potřeba manuální obsluha. Průtočné systémy měření mohou být automatizovány. Vzorek může být v průtočné cele měřen neředěný či ředěný. Pokud se biosenzor nachází přímo ve sledovaném prostředí (tkáň, krevní řečiště, fermentor), neměla by jeho přítomnost ovlivnit koncentraci analytu a snížit jeho množství v důsledku měření Biorekogniční část Biorekogniční část biosenzoru může být buď biokatalytická nebo bioafinitní. Pokud je analyt přeměněn v průběhu chemické reakce, obvykle vystupuje jako substrát enzymové reakce, jedná se o biokatalytický typ (biologickým prvkem je např. enzym, organela, buňka, tkáň, orgán, mikroorganismus). V případě, že je analyt specificky vázán ve vznikajícím afinitním komplexu, biorekogniční část je bioafinitní (např. lektin, protilátka, nukleová kyselina, receptor). Nejčastěji využívanou biorekogniční složkou je enzym. Ten katalyzuje přeměnu substrátu v produkt, který se může stát zároveň markerem pro elektrochemický převodník. Další rozšířenou biorekogniční složkou je protilátka, která je pevně imobilizovaná na povrch převodníku. Tento typ biosenzoru velmi připomíná techniku ELISA s tím rozdílem, že vzniklý imunokomplex je detekován pomocí převodníku, nikoliv pomocí kolorimetrické změny. Velké využití se nabízí u kombinace protilátek s křemíkovým typem převodníků tzv. Guartz Crystal Microbalance. Mikroorganismy patří mezi velmi výhodnou biologickou složku biosenzorů. Používají se buňky bakterií (např. Bacillus subtilis, B. licheniformis), sinic, kvasinek či plísní. Mohou nahradit antigeny, enzymy, proteiny (pokud jsou exprimovány na povrchu buňky), což zjednodušuje a zvyšuje efektivitu výroby biosenzoru Fyzikálně-chemický převodník Pro sestavení biosenzorů se používá celá škála fyzikálně-chemických převodníků. Mohou být: - elektrochemické, tyto nejrozšířenější převodníky měří změnu napětí (amperometrie), odporu (konduktometrie), proudu (voltametrie) či elektromotorického napětí (potenciometrie); jsou velmi citlivé, levné a jednoduché ke konstrukci, - optické převodníky jsou založeny na detekci změn ve světelné adsorpci nebo emisi během reakce biorekogniční složky analytu, uplatňuje se fotometrie, fluorimetrie, luminometrie a nelineární optika, - kalorimetrické převodníky využívají změnu teploty v průběhu enzymatických reakcí, - akustické, - piezoelektrické převodníky, kde se využívá křemíkový krystal, který kmitá na určité frekvenci v závislosti na převedeném napětí. Pokud je změněna hmotnost krystalu (např. navázáním určitých látek), posouvá se i frekvence oscilace krystalu a z této změny lze určit nárůst hmotnosti na krystalu. Tento typ převodníků se využívá např. při detekci Salmonella Typhimurium. 16

19 Systémy identifikace mikroorganismů Výhody a nevýhody biosenzorů Přednostmi biosenzorů jsou vysoká citlivost a selektivita, měření bez speciálních reagencií, rychlost analýzy, nízké náklady a snadná obsluha. Analýzy probíhají v reálném čase. Častou výhodou biosenzorů je jejich malá velikost a přenositelnost, tudíž stačí relativně malé množství vzorku a potřebných chemikálií pro analýzu. Velkým problémem je sterilizace biosenzorů. Některé typy pracují jen v úzkém rozsahu koncentrace analytu, mají pomalou odezvu, jsou citlivé na elektrický šum a jejich miniaturizace může mít vliv na velikost signálu. Při použití enzymů se obvykle liší optimální provozní ph enzymu od ph prostředí Využití biosenzorů v praxi V dnešní době nacházejí biosenzory uplatnění zejména v medicíně. V klinické diagnostice se používají pro detekci různých metabolických produktů, složek krve, ale i k identifikaci patogenních mikroorganismů. Snad úplně nejrozšířenějším biosenzorem je glukosový biosenzor pro kontrolu hladiny glukosy v krvi diabetiků. Velký potenciál využití biosenzorů je i v potravinářství při kontrole kvality potravin. Pomocí biosenzorů lze stanovit např. sacharidy, lipidy, vitaminy, ale také alergeny, rezidua inhibičních látek, antibiotika, růstové stimulátory, pesticidy či methanol. Mezi důležité aplikace patří detekce alimentárních patogenů jako Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157:H7, S. aureus, dále bakteriálních toxinů (např. stafylokokové enterotoxiny typ A a B), mykotoxinů (např. aflatoxin) a biogenních aminů (např. histamin, putrescin). Navzdory velkému rozvoji biosenzorů, jen málo systémů je komerčně vyráběných právě pro oblast analýzy potravin. Na trhu jsou k dispozici následující biosenzory určené pro detekci bakterií: Midas Pro (výrobce Biosensori SpA), Malthus 2000 (výrobce Malthus Instruments) Unilite (výrobce Biotrace) a BIACORE (výrobce Swedish BIACORE AB). V oblasti ochrany životního prostředí jsou biosenzory využívány zejména ke sledování znečištění zdrojů pitné vody a vodních toků (např. polyaromatickými uhlovodíky). Dále k monitorování půdní mikroflóry a metabolické aktivity těchto mikroorganismů. V biotechnologiích nacházejí biosenzory uplatnění při řízení procesů a při kontrole jakosti produktů (např. nežádoucí kontaminace). V neposlední řadě se biosenzory uplatňují také v armádě. Pokud má být biosenzor vhodný k použití v praxi, musí splnit následující kritéra: dostatečná selektivita pro účely dané analýzy, dostatečná stabilita v průběhu analýzy, reakce probíhající v biosenzoru by měla být nezávislá na fyzikálních parametrech (ph, teplota, atd.) což umožňuje provádět analýzu bez předchozí úpravy vzorku. Odpověď senzoru by měla být přesná, reprodukovatelná a lineární v co nejširším rozsahu koncentrací, aby nebylo nutné vzorek ředit. Biosenzor použitelný v biotechnologiích by měl být sterilizovatený (např. v autoklávu). 17

20 Mikroskopické metody 3. MIKROSKOPICKÉ METODY Mikroskopické hodnocení je jedním ze základních postupů při analýze mikrobiální populace a hraje důležitou roli i v mikrobiologii potravin. Mimo klasických mikroskopických metod využívajících světelnou mikroskopii, nachází stále větší uplatnění i metody moderní fluorescenční či elektronová mikroskopie. V uvedeném textu se zaměřujeme na metody nejvíce využívané při mikrobiologickém vyšetření potravin a potravinových surovin přímou epifluorescenční filtrační techniku (Direct Epifluorescent Filter Technique, DEFT) a průtokovou cytometrii (Flow Cytometry, FC). Obě techniky využívají spojení optické metody v kombinaci se specifickým či nespecifickým barvením mikroorganismů fluorescenčními barvivy. DEFT se opírá o přímé mikroskopické pozorování mikroorganismů, oproti tomu průtoková cytometrie kombinuje optické, fluidní a elektronické technologie při detekci a charakterizaci jednotlivých buněk či dalších malých částic. Některé průtokové cytometry jsou schopné třídit či fyzicky izolovat buňky či částice s definovanými vlastnostmi. Komerčně se tato technologie využívá od 70. let minulého století. Lze však diskutovat o tom, zda je průtoková cytometrie pravou mikroskopickou technikou, protože při ní nemusí docházet ke zdánlivému zvětšení organismů a jejich pozorování pouhým okem Fluorochromy a sondy používané v mikroskopii Fluorochromy Některé mikroskopické techniky využívají pro odlišení vybraných buněk fluorescenční barviva. Fluorochromy mohou být použity dvojím způsobem: buď díky svým chemickým vlastnostem přímo reagují s cílovými molekulami (DNA, RNA, bílkoviny, lipidy) nebo se používají ke značení molekulárních sond, jako jsou protilátky či oligonukleotidy. Základní vlastností všech fluorochromů je schopnost absorbovat a emitovat světlo o specifické vlnové délce. Po absorpci světelné energie se fluorochromy dostávají do nestabilního excitovaného stavu, kdy jsou elektrony posunuty do vyšší energetické hladiny. Při návratu elektronů do stabilního neexcitovaného stavu dochází k uvolnění energie ve formě emitovaného světla. Vlnová délka použitá k excitaci fluorochromu je vždy kratší (vyšší energie) než vlnová délka světla emitovaného (nižší energie). Vlastnosti jednotlivých fluorochromů jsou určující pro konfiguraci měřicích přístrojů. V případě průtokové cytometrie se obvykle k excitaci používá laser, ve fluorescenční mikroskopii rtuťové či xenonové lampy Využití fluorochromů při vitálním barvení Vhodné fluorochromy můžeme využít i k hodnocení vitality mikrobiálních buněk. Jedním z nich je např. akridinová oranž fluorescenční barvivo s afinitou k nukleovým kyselinám. Při vazbě na jednořetězcovou RNA vzniká červenooranžová fluorescence (mrtvé buňky), při vazbě na dvouřetězcovou DNA fluorescence zelená (živé buňky). Vzniklá barva však může být ovlivněna složením média, ve kterém došlo k resuspendaci buněk, či úrovní zpracování vzorku. Další kategorii indikátorů životaschopnosti tvoří redoxní sondy, které jsou založeny na přítomnosti fungujícího elektronového transportního systému. Redoxní sondy přijímají elektrony ze složek elektronového transportního systému respirujících buněk a hromadí se uvnitř buňky jako nerozpustné chromogeny či fluorescenční deriváty. 18

21 Mikroskopické metody Řada vitálních barviv je založena na integritě buněčné membrány. Vyloučení určitých barviv intaktní membránou je ukazatelem životaschopnosti, zatímco pronikání barviva je známkou poškození a omezené vitality buňky. Jedná se např. o fluorescenční barviva propidium jodid či fluorescein diacetát Molekulární sondy Fluorochromy jsou používány ke značení protilátek nebo oligonukleotidů. Umožňují specifickou identifikaci mikroorganismů při mikroskopování či průtokové cytometrii. V závislosti na použité sondě lze provádět identifikaci mikroorganismů na různých taxonomických úrovních (rod, druh, kmen). Fluorochromem značené protilátky se váží na antigenní determinanty bakteriálních buněk. Jejich použití je velmi jednoduché, po přidání ke vzorku dojde k vazbě protilátek na cílové bakterie, následuje promytí a pozorování v mikroskopu. Protože se protilátky váží na povrchové struktury, není třeba buňky před jejich aplikací nijak ošetřit. Oligonukleotidy (syntetické polymery) jsou schopné vazby na specifické úseky nukleových kyselin (na základě komplementarity bazí). Podobně jako protilátky mohou být značené fluorochromy a mohou fungovat jako fluorescenční sondy pro specifické sekvence nukleových kyselin. Protože jsou syntetizovány chemicky, je produkce oligonukleotidů levnější a jednodušší. Využití nachází například v metodě FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) nebo v průtokové cytometrii (detekce patogenů v potravinách). Na rozdíl od značených protilátek, vyžaduje použití značených oligonukleotidů obvykle určitý typ úpravy buněk tak, aby sonda mohla projít skrz buněčnou stěnu a interagovat s nukleovou kyselinou (např. záhřev nebo chemická úprava) Základní druhy mikroskopie Již bylo zmíněno, že mikroskopie je základním nástrojem při analýze mikrobiální populace. Mikroskopie má dvě základní charakteristiky, a to zvětšení a rozlišovací schopnost (tj. oddělení dvou blízkých objektů tak, aby mohly být hodnoceny individuálně). Mikroskopie je univerzální technologie umožňující rychlou detekci i stanovení počtu mikroorganismů v potravinách. Pokud je využita při identifikaci mikroorganismů, zkracuje dobu analýzy. Řada postupů mikrobiologické analýzy potravin zahrnuje mikroskopii v různých formách Světelná (optická) mikroskopie Světelná mikroskopie je základním a historicky nejstarším druhem mikroskopie. Je přímo využitelná při testování potravin v laboratořích, při identifikaci mikroorganismů (Gramovo barvení, barvení endospor, morfologie plísní) či jako kvantitativní metoda stanovení mikrobiální populace (vyšetření čistých mlékařských kultur, stanovení počtu mikroorganismů v mléce, stanovení fragmentů plísní). Obvyklé provedení zahrnuje nanesení a fixaci vzorku na podložní sklíčko a jeho barvení, aby bylo dosaženo dostatečného kontrastu nebo zviditelnění mikrobiálních buněk proti pozadí. Problematika světelné mikroskopie a jejího využití v mikrobiologii potravin je detailně studována v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie a skripta Mikrobiologie potravin praktická cvičení II. Metody stanovení mikroorganismů v potravinách). 19

22 Mikroskopické metody Fluorescenční mikroskopie Podstatou fluorescenční mikroskopie je excitace fluorochromu po expozici světlem o krátké vlnové délce a následná emise světla o delší vlnové délce z fluorochromu. Emisní spektrum je vůči excitačnímu posunuto do vyšších vlnových délek, protože během vzniku fluorescence je část energie ztracena. Excitační a emisní vlnové délky jsou kontrolovány a odděleny vhodnými filtry umístěnými v mikroskopu. Základní součásti fluorescenčního mikroskopu jsou: zdroj světla, systém filtrů a zrcadel, objektiv a detektor (okulár či CCD kamera). Konstrukce fluorescenčního mikroskopu je založena na jednom ze dvou typů osvětlení a) světlo vzorkem prochází, nebo b) světlo na vzorek dopadá. Obrázek 7: Epifluorescenční mikroskop Epifluorescenční mikroskopie V mikrobiologii potravin má nepraktičtější využití epifluorescenční mikroskopie, při které silný zdroj světla (rtuťová, halogenová či xenonová lampa) osvicuje vzorek a výsledná fluorescence je následně optickou cestou poslána na detektor. Světlo ze zdroje prochází skrz excitační filtr, který usměrňuje vybrané vlnové délky na dichroické zrcadlo. Dichroické zrcadlo odráží kratší excitační záření a propouští delší emisní záření. Současně odstraňuje nežádoucí excitační záření o vysoké intenzitě, které je škodlivé pro oko. Každé zrcadlo je vždy kombinováno s vhodným excitačním a emisním filtrem (obvykle se jedná o set zrcadla a filtrů pro daný fluorochrom). Zrcadlo je umístěno pod úhlem 45 k vertikální ose mikroskopu. Záření odražené zrcadlem prochází čočkou objektivu a dopadá na vzorek (preparát) shora. Ve vzorku vyvolá excitaci elektronů a následné vyzáření světla. Emitované záření má větší vlnovou délku a šíří se všemi směry. Díky imerznímu oleji prochází přes imerzní objektiv jen část záření, která dopadá na dichroické zrcadlo. Zrcadlem emitované záření prochází na excitační (bariérový) filtr, který propouští jen záření vlnové délky odpovídající použitému fluorochromu, záření o kratší vlnové délce filtr zastaví. Vybrané fluorescenční záření můžeme pozorovat okulárem nebo snímat CCD kamerou. Epifluorescenční mikroskopie má dvě základní výhody: a) vyšší výkon při velkých zvětšeních potřebných pro mikrobiální buňky; b) světlo přichází na vzorek shora a osvětluje povrch vzorku, proto můžeme analyzovat i silné či neprůhledné vzorky Elektronová mikroskopie Elektronová mikroskopie není využitelná pro rutinní analýzu potravin. Rozlišujeme dva typy elektronových mikroskopů transmisní a skenovací. Transmisní elektronový mikroskop má obrovské zvětšení a rozlišovací schopnost (detekční limity jsou v rozmezí nanometrů) a umožňuje podrobné zobrazení jednotlivých vnitrobuněčných struktur mikroorganismů. Při skenovací elektronové mikroskopii je vzorek potažen tenkým filmem těžkého kovu a je skenován paprskem elektronů skrz. Technika umožňuje trojdimenzionální zobrazení povrchu vzorku a může být využitelná při studiu mikroorganismů v jejich přirozeném prostředí. 20

23 Mikroskopické metody 3.3. Přímá epifluorescenční filtrační technika DEFT Základní principy Oproti běžnému mikroskopickému stanovení kombinuje metoda DEFT membránovou filtraci, fluorescenční barvení a mikroskopii. Membránová filtrace vzorku umožňuje koncentraci mikroorganismů a tím výrazně zvyšuje citlivost metody. U homogenizovaných pevných potravin se někdy zařazuje krok předfiltrace přes hrubý filtr pro usnadnění pasáže vzorku membránovým filtrem. Při průchodu vzorku skrz membránový filtr jsou mikroorganismy koncentrovány na jeho povrchu. K hodnocení povrchu filtru je použita epifluorescenční mikroskopie. K barvení se používá akridinová oranž (afinita k nukleovým kyselinám). Původně se ke koncentraci vzorků používaly černé membrány, které tvořily kontrastní pozadí pro fluorescenci. Dnes se používají polykarbonátové membrány s jednotnou velikostí pórů, které umožňují dobré stanovení počtu mikroorganismů. Při hodnocení počtu bakterií se používá nefluorescenční imerzní olej a imerzní objektiv 100 (objektiv s nejmenším zorným polem). Při detekci kvasinek nebo protozoí lze použít méně výkonné objektivy s větším zorným polem. K vyhodnocení se obvykle používá digitální fotoaparát, napojený na mikroskop, s vazbou na systém analýzy obrazu (semi-automatická metoda). Detekční limit metody DEFT je běžně řádově 10 3 buněk v 1 ml Stanovení celkového počtu mikroorganismů v syrovém mléce Původně byla metoda DEFT používána při stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM) v syrovém mléce. Nejdříve se pomocí proteolytických enzymů a povrchově aktivních látek provede lýza somatických buněk a tukových kuliček pro usnadnění filtrace vzorku. Vzorek (2 ml) je přefiltrován přes polykarbonátový membránový filtr. Bakterie soustředěné na jeho povrchu jsou obarveny akridinovou oranží, po opláchnutí barviva se filtr nechá osušit na vzduchu. Poté se umístí na podložní sklíčko, zakápne imerzním olejem a překryje krycím sklíčkem, hodnocení probíhá v epifluorescenčním mikroskopu. Metabolicky aktivní buňky fluoreskují oranžovočerveně, neaktivní zeleně. Stanovení trvá 25 minut. Před vlastním hodnocením se provede hrubý odhad počtu buněk v zorném poli, je-li větší než 100, je nutné provést naředění vzorku. Následně se počítají fluoreskující buňky v náhodně vybraných zorných polích na membránovém filtru. Počet hodnocených zorných polí je závislý na množství mikrobiálních buněk. Stanovení počtu buněk v 1 ml mléka se provede výpočtem z průměrného počtu buněk v zorném poli, faktoru mikroskopu, množství filtrovaného vzorku a jeho ředění Modifikace metody DEFT Pro hodnocení životaschopných buněk se filtr po filtraci vzorku několik hodin inkubuje na vhodném živném médiu, dojde k vytvoření mikrokolonií, které po obarvení fluoreskují. Technika mikrokolonií byla dále modifikována použitím fluorescenčně značených protilátek jako barvicího činidla. Metodu lze využít např. k rychlé detekci životaschopných buněk salmonel a L. monocytogenes v syrovém mase. Jako alternativa k barvení akridinovou oranží se dají použít fluorescenční protilátky i bez tvorby mikrokolonií, a to pro rychlou a především specifickou detekci a počítání mikroorganismů. Během jedné hodiny lze detekovat např. E. coli O157:H7 v mléce, ovocných šťávách a hovězím mase nebo L. monocytogenes v zelenině. Ke konfirmaci pozitivních vzorků lze využít imunomagnetickou separaci. Další variantou je využití fluorescenčně značených oligonukleotidů (vazba na r-rna) např. při detekci E. coli ve vodě, odpadech či zeleninových klíčcích. 21

24 Mikroskopické metody Automatizace metody DEFT systém BactoScan 8000 BactoScan 8000 (výrobce Foss Electric) je plně automatizovaný přístroj pro přímé mikroskopické počítání mikroorganismů v syrovém mléce. Mikroorganismy jsou ze syrového mléka odstředěny a odděleny, barveny fluorescenčním barvivem a elektronicky počítány jako světelné impulsy ve fluorescenčním mikroskopu s kontinuálním prouděním. Somatické buňky, tukové kuličky a kaseinové micely jsou chemicky degradovány a poté separovány od bakteriálních buněk odstředěním v sacharoso-glycerolovém gradientu. Současně dochází k rozpuštění bakteriálních shluků, což vede k přesnější kvantifikaci mikroorganismů. Bakteriální buňky jsou po obarvení akridinovou oranží usměrněny pod objektiv epifluorescenčního mikroskopu. Při průchodu pod objektivem jsou bakterie ozářeny filtrovaným modrým světlem, které způsobí červený světelný impuls emitovaný živými bakteriemi. Fotodetektor připevněný k objektivu zachytí tyto impulsy, které jsou počítány jako individuální bakteriální buňky (IBC). Průběžně se provádí kalibrace BactoScanu za použití referenčních standardů IBC, které jsou převedeny na hodnoty KTJ.ml -1. Krok kalibrace umožňuje srovnání výsledků s dalšími technikami stanovení celkového počtu mikroorganismů. Přístroj BactoScan 8000 nachází široké využití v analýze syrového mléka, je vhodnou alternativou ke klasickému kultivačnímu stanovení CPM v syrovém mléce, a to zejména pokud CPM je v rozsahu přístroje (tj až KTJ.ml -1 ). Jeho hlavní výhodou je rychlost stanovení (cca 80 vzorků za hodinu). Novější verzí je BactoScan FC+ pracující na principu průtokové cytometrie (viz kapitola ) Výhody, nevýhody a využití metody DEFT v praxi Metoda DEFT je velmi náročná a pracná technika, která neumožňuje zpracovat velký počet vzorků a je aplikovatelná pouze při vyšších počtech mikroorganismů v potravině (10 3 až 10 4 KTJ.g -1 ). Pro vlastní hodnocení výsledků je zapotřebí kvalifikovaný pozorovatel. Na druhou stranu jen málo automatizovaných metod se může rovnat diskriminační síle cvičeného oka. Nespornou výhodou je rychlost stanovení. Technika DEFT je obecně použitelná pouze pro syrové potraviny a obvykle pro stanovení celkového počtu mikroorganismů. Může však být využita i pro detekci a stanovení počtu patogenních bakterií (salmonely, E. coli O157:H7, L. monocytogenes), a to např. v kombinaci s fluorescenčně značenými specifickými protilátkami či imunomagnetickou separací. Rutinní využití našla automatizovaná metoda DEFT při stanovení celkového počtu mikroorganismů v syrovém mléce (systém Bactoscan), dále při mikrobiologickém vyšetření masa, drůbeže, ryb, zeleniny či koření Průtoková cytometrie Základní principy, složení průtokového cytometru Průtokový cytometr je přístroj, který analyzuje částice (buňky, bakterie, jádra) pohybující se v proudu kapaliny, který protíná soustředěný, stabilní a vysoce intenzivní paprsek světla, obvykle tvořený laserem. Přístroj zaznamenává charakteristiky každé buňky unášené proudem a je schopný analyzovat tisíce buněk ve vzorku během sekundy. Mezi vlastnosti (charakteristiky) částic lze zařadit velikost, tvar, obsah nukleových kyselin, přítomnost povrchových antigenů, schopnost odrážet či rozptylovat světlo a fluorescenci. V nejjednodušším typu průtokového cytometru prochází tekutý vzorek přes průtokovou štěrbinu a je osvětlen laserem. Částice jsou automaticky detekovány mikroskopem 22

25 Mikroskopické metody zaostřeným na průtokovou štěrbinu. Moderní průtokový cytometr se skládá ze tří hlavních částí: fluidiky, optiky a elektroniky. Pro analýzu je nezbytné, aby se buňky nacházely ve formě suspenze, protože musí přístrojem procházet jedna za druhou konstantní rychlostí. Suspenze buněk se dávkuje do zkumavky, ze které vychází na dolním konci kapilára. Zkumavka je uložena v nádobce s tzv. plášťovou tekutinou, která odtéká laminárním prouděním a strhává s sebou z kapiláry jednotlivé buňky. To, aby prošla měřícím bodem právě jedna částice, je zajištěno tzv. hydrodynamickou fokusací. Ideální je, aby rozdíl tlaku mezi vzorkem a unášející tekutinou byl malý, v tomto případě je proud vzorku úzký a v plošném průřezu projde právě jedna buňka (lepší rozlišení). Proudění vzorku musí být laminární nikoli turbulentní. Analyzované buňky nebo detekovaná látka uvnitř buněk se vhodnou metodou označí tak, aby ji mohl rozpoznat detekční systém přístroje. Nejčastěji se tak děje pomocí specifických fluorochromů. Je vhodné, aby se absorpční maximum fluorochromu co nejvíce blížilo vlnovým délkám běžně používaných laserů. Vzorek procházející kapilárou je ozářen monochromatickým zářením laseru. Průtokové cytometry bývají dvoulaserové nebo třílaserové. Nejčastěji používaným laserem je vzduchem chlazený argonový laser, který emituje záření s vlnovou délkou 488 nm (modrá oblast spektra). Sběrnou optiku tvoří soustava filtrů, zrcadel a čoček. Filtry a zrcadla rozdělují emitované fotony podle vlnové délky na příslušné detektory. V případě bočního rozptylu (SSC) a fluorescence je intenzita signálu nízká, a proto je potřeba signál zesilovat fotonásobičem. Při bočním rozptylu je světlo emitováno v úhlu přibližně 90 k dráze paprsku laseru. U přímého rozptylu (FSC) je intenzita signálu dostatečná, světlo je emitováno v malém úhlu ke směru dráhy laserového paprsku. Intenzita paprsků FSC je přímo úměrná velikosti buňky, intenzita poprsků SSC odráží vnitřní komplexitu buněk a je úměrná granularitě buňky (stav cytosolu, buněčné inkluze, granula, atd.). Podle intenzity paprsků FSC je možné rozlišit živé a mrtvé buňky, podle SSC buňky granulózní a agranulózní. Signály z optiky jsou v detektorech převedeny na elektrické impulsy, které jsou zpracovány počítačovým programem. Pro jednotlivé buňky jsou generována multiparametrická data, která se ukládají do počítače. Výsledek je vyjádřen graficky v podobě jednoparametrového histogramu (osa x intenzita signálu, osa y četnost) nebo dvouparametrově pomocí dot plotů. V jednom grafu je tedy možno pozorovat přímý rozptyl, boční rozptyl a fluorescenci (u částic s navázanou fluorochromem značenou protilátkou). Z grafu se tzv. gatováním vybere populace buněk, která bude předmětem další analýzy a vytvoří se pro ni dot plot histogram Výhody a nevýhody průtokové cytometrie Průtoková cytometrie umožňuje kvalitativní i kvantitativní analýzu. Jako automatizovaná metoda nabízí zejména následující výhody: rychlost analýzy (minuty), jednoduchá příprava a vyšetření velkého počtu vzorků. V rámci jednoho vzorku analyzuje průtokový cytometr mnoho tisíc jednotlivých částic, což není manuálně možné. Zřejmou výhodou je také schopnost shromažďovat data o jednotlivých buňkách. Problémy mohou vzniknout při detekci zřídka se vyskytujících buněk (např. patogenů) na pozadí velkého množství buněk či částic. Pokud jsou k dispozici specifická fluorescenční barviva pro selektivní značení vybraných druhů mikroorganismů, je metoda potenciálně velmi specifická. Jednoznačnou nevýhodou je finanční náročnost, zejména investiční náklady na pořízení průtokového cytometru. Vzorky nelze dlouhodobě uchovávat, pevné vzorky musí být nejprve upraveny tak, aby došlo k separaci buněk od sebe. K obsluze cytometru je zapotřebí školený personál. Jednou z nevýhod použití v mikrobiologii potravin je nedostatečná diskriminace mezi živými a mrtvými buňkami a rušení stanovení potravinovou matricí. 23

26 Mikroskopické metody Využití průtokové cytometrie v praxi Základní principy průtokové cytometrie se dají aplikovat i na mikroorganismy, přesto je její využití v mikrobiologii potravin poměrně malé. V případě bakterií narážíme na několik specifických problémů, jedním z nich je relativně malá velikost bakteriálních buněk. Většina komerčně dostupných průtokových cytometrů je vytvořena pro analýzu částic o velikosti eukaryotních buněk (např. lymfocytů), které jsou několikanásobně větší než bakterie. Při stanovení počtu mikroorganismů v potravinách, musí být zařazen krok filtrace, který je nezbytný pro odstranění částic potraviny (hrozí ucpání cytometru). Ke stanovení počtu bakterií, kvasinek, plísní a spor lze využít např. technologii CHEMUNEX (automatizované přístroje D-Count, BactiFlow ASL, semi-automatický přístroj BactiFlow, výrobce biomérieux), která umožňuje mikrobiologickou analýzu potravin (např. syrového mléka, mléčných výrobků, nápojů), vody, výživových doplňků, léčiv a kosmetických přípravků. Technologie kombinuje fluorescenční značení životaschopných buněk s digitální průtokovou cytometrií. Průtoková cytometrie může být využita i k multiparametrické analýze startovacích kultur a probiotických produktů, kdy se hodnotí přítomnost a) kultivovatelných (životaschopných), b) metabolicky aktivních, ale nekultivovatelných a c) neživotaschopných bakterií mléčného kvašení. Při stanovení patogenů se průtoková cytometrie kombinuje s imunofluorescencí. Barvení buněk musí být provedeno před vlastní analýzou na průtokovém cytometru. Po přídavku optimálního množství fluorescenčně značených protilátek následuje krátká inkubace vzorku a poté promytí k odstranění nenavázaných protilátek. Pokud je stanovení patogenů kvantitativní, musí být zjištěn objem vzorku, který prošel detekčním bodem přístroje. K tomu lze použít např. mikrosyrinky s kontrolovaným průtokem. Tímto způsobem lze detekovat např. L. monocytogenes, salmonely či E. coli O157:H7. Asi největší využití nachází průtoková cytometrie v lékařství, konkrétně v klinické imunologii, hematoonkologii, nádorové biologii a v oblasti molekulární biologie Využití průtokové cytometrie při hodnocení kvality syrového mléka Širší využití nachází průtoková cytometrie při rutinní analýze kvality syrového mléka, konkrétně se jedná o stanovení počtu somatických buněk a celkového počtu mikroorganismů. Pro stanovení počtu somatických buněk se v naší republice často používají průtokové cytometry Fossomatic FC (výrobce Foss) či přístroje řady Somacount (dodavatel BentleyCzech). V obou případech je fluorochrom navázán na DNA somatických buněk. Při průchodu buněk kapilárou a po osvitu laserem dojde k emisi záření, které je přístrojem detekováno. Ke stanovení celkového počtu mikroorganismů v syrovém mléce lze použít BactoCount IBC (dodavatel BentleyCzech). Vzorek mléka je natažen do karuselu temperovaného na 50 C, kde na něj působí směs pufru, proteolytického enzymu a fluorescenčního barviva. Tento roztok způsobí rozklad somatických buněk, rozpuštění tukových globulí a bílkovin, současně podpoří propustnost bakterií k obarvení jejich DNA. Během inkubace je vzorek ošetřen speciálním ultrazvukovým způsobem. Po inkubační periodě je část vzorku přemístěna do průtokového cytometru, kde jsou jednotlivé bakterie vystaveny laseru a fluoreskují. Fluorescenční signál je zaostřen optikou, filtrován, a detekován fotonásobičem. Intenzita a šířka pulsů je zaznamenána a použita jako vstupní parametr. Po kalibraci jsou vytříděné pulsy přepočítány na individuální počty bakterií. Výsledky i cytogramy jsou archivovány. Různé modely zpracují 50 až 150 vzorků za hodinu. Na podobném principu pracuje i BactoScan FC+ (výrobce Foss), kterým lze během jedné hodiny vyšetřit až 200 vzorků syrového mléka. 24

27 Imunologické metody 4. IMUNOLOGICKÉ METODY Imunologické metody jsou obecně založeny na vysoce specifické reakci mezi protilátkou a antigenem. Tvoří základ celé řady testů, které mohou být v mikrobiologii potravin použity k detekci a konfirmaci specifických mikroorganismů, zejména alimentárních patogenů, a některých toxinů. Antigen je molekula schopná vyvolat v živých organismech produkci specifických protilátek. Jako antigen mohou sloužit specifické části cílového mikroorganismu (např. lipopolysacharidy v buněčné stěně gramnegativních bakterií, bičíkové proteiny), nebo toxin či jiný produkt vznikající při růstu mikroorganismu. Protilátky jsou proteiny produkované bílými krvinkami (aktivované B-lymfocyty) živočichů po jejich infekci cizí molekulou nebo mikroorganismem. V mikrobiologii potravin se používají v testech určených k detekci specifických mikroorganismů, proteinů či toxinů. Uvádí se, že u některých mikroorganismů může docházet ke zkříženým reakcím jejich somatických antigenů, a proto, i když jsou imunologické metody relativně specifické, nelze je k potvrzení přítomnosti určitého mikroorganismu použít samostatně. Z tohoto důvodu jsou výsledky imunologických testů označovány jako presumptivní a musí být potvrzeny konvenční kultivací s následnou konfirmací sledovaného mikroorganismu. Některé imunologické metody, jako aglutinační testy, se staly nedílnou součástí řady konfirmačních postupů (stanovení Salmonella spp., E. coli O157, atd.). Pravděpodobně nejrozšířenější metodou detekce specifických mikroorganismů v potravinách je technika ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Využití nachází také metoda imunomagnetické separace, která umožňuje oddělení cílových mikroorganismů z homogenátů potravin či pomnožených vzorků a tím snižuje negativní vliv potravinové matrice a doprovodné mikroflóry. Běžně se používá při stanovení E. coli O157, kde je nejen součástí referenční kultivační metody, ale i dalších alternativních metod. Technika imunomagnetické separace je detailně studována v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody, proto není v této kapitole dále uvedena. Využití imunologických metod při vyšetření potravin má některá úskalí. Jedním z nich je doprovodná mikroflóra, která může inhibovat růst sledovaného mikroorganismu nebo zkříženě reagovat s použitými protilátkami (falešně pozitivní výsledky). Řada technologických postupů při výrobě potravin může způsobit subletální poškození mikroorganismů, které potom nejsou schopny růstu v selektivních médiích. Z tohoto důvodu je nezbytné zařazení kroku neselektivního pomnožení vzorku před vlastní imunologickou detekci. Na trhu je v současné době řada testovacích souprav umožňujících detekci běžně se vyskytujících alimentárních patogenů a jejich toxinů Aglutinační testy Aglutinační testy se řadí do skupiny serologických metod, asi největší využití nachází při serologické konfirmaci bakterií. Aglutinace je in vitro reakce antigenu se specifickou protilátkou, která se makroskopicky projevuje viditelným shlukováním. Reakce je obvykle rychlá, vykazuje vysokou afinitu, vzniklý aglutinát se nerozpadá. Již řadu let se aglutinační testy využívají v klinické diagnostice infekcí či při serologické klasifikaci bakterií (např. identifikace Salmonella spp. Kauffmann-White Antigenic Scheme). V potravinářské mikrobiologii je důraz kladen především na rychlou konfirmaci suspektních izolátů. Standardně je aglutinace součástí stanovení Salmonella spp. a E. coli O157. Trend při vývoji aglutinačních testů je použití nosičů (např. latexových částic), které umožňují jednodušší odečítání pozitivních reakcí než klasická antiséra. Při vyšetřování potravin lze úspěšně používat i testovací soupravy určené pro klinickou diagnostiku. 25

28 Imunologické metody Asi nejběžnějším alimentárním patogenem, při jehož identifikaci se používá aglutinační test, je Staphylococcus aureus. Komerční aglutinační testy umožňují identifikaci S. aureus detekcí vázané koagulasy (clumping faktor) a proteinu A, a to samostatně nebo v kombinaci. K průkazu proteinu A se obvykle používají latexové částice s navázanými specifickými monoklonálními protilátkami, pro detekci vázané koagulasy potom ovčí erytrocyty senzitivované fibrinogenem při pozitivní reakci dochází k hemaglutinaci. Rutinní využití má aglutinace i při identifikaci Escherichia coli O 157:H7 či bakterií rodu Salmonella. Při konfirmaci salmonel využívají běžné laboratoře obvykle pouze polyvalentní antiséra, bližší typizaci jednotlivých izolátů provádí specializované laboratoře. Některé komerční latex-aglutinační soupravy umožňují nejen screening, ale i presumptivní identifikaci suspektních izolátů, např. Wellcolex Colour Salmonella Test (výrobce Oxoid Ltd.). Při detekci bakteriálních toxinů se využívá metoda pasivní reverzní latexové aglutinace (RPLA). Test se provádí v mikrotitračních destičkách, výsledky jsou k dispozici za cca 24 hodin. Mezi komerčně dostupné testy patří např. SET-RPLA pro stanovení stafylokokových enterotoxinů A až D, BCET-RPLA pro stanovení diarhogenních enterotoxinů B. cereus či VTEC-RPLA pro detekci Shigatoxinů ST1 a ST2 (výrobce Oxoid Ltd.). Problematika serologických metod a jejich využití v mikrobiologii potravin je detailně studována v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie) Imunochromatografická metoda Praktické využití v mikrobiologii potravin nachází také imunochromatografické metody, označované též jako LFIA (Lateral Flow Immuno Assay) Základní principy Nejběžnějším formátem je plošná imunochromatografie. Na trhu je celá řada různých provedení testu, jeho základní formát zůstává však stejný. Typicky se test skládá z porózní nitrocelulózové membrány, na které jsou imobilizovány vazebné proteiny pro cílovou detekovanou molekulu. Ve většině případů se jedná o specifické protilátky schopné navázat antigeny přítomné ve vzorku. Obrázek 8: Schéma imunochromatografického testu. (McMeekin, 2003 upraveno) 26

29 Imunologické metody Určené množství pomnoženého vzorku se otvorem v krytu testu napipetuje do tzv. okna pro vzorek, kde je obvykle papírová vrstva umožňující absorpci vzorku. Pod touto vrstvou je vrstva skleněných vláken obsahující vysušený konjugát částice s navázanými specifickými protilátkami proti cílovému antigenu (mohou to být např. částice zlata nebo barevné latexové částice). Vrstva s konjugátem je připojena k nitrocelulózové membráně. Po aplikaci vzorku proniká tekutina kapilární difúzí do vrstvy konjugátu a rehydratuje jej. Současně dochází ke specifické reakci mezi konjugátem a cílovými antigeny. Vytvořený komplex antigen-konjugát projde až na membránu a putuje směrem k linii vazebných proteinů (tzv. vazebná nebo testovací linie). Vazebné proteiny jsou specifické protilátky proti cílovému antigenu, které migrující komplex zachytí a imobilizují. V testovacím okně dojde v místě vazebné linie k vytvoření zřetelného pruhu či linky, což indikuje pozitivní výsledek. V závislosti na rychlosti průniku kapaliny porózní membránou, trvá tento proces obvykle minut. Obrázek 9: Výsledek testu. Přebytečný (nenavázaný) konjugát vzlíná dál membránou a je zachycen na dalším místě membrány, tzv. kontrolní linii, kde jsou navázány specifické protilátky proti konjugátu. Jejich hromadění opět vyvolá vznik barevného proužku. Tato linie slouží ke kontrole funkčnosti testu. Pokud nedojde k jejímu zvýraznění, je test neplatný i když vznikne proužek na testovací linii. Vyhodnocení testu: pozitivní výsledek zřetelný barevný pruh v místě vazebné i kontrolní linie (2 proužky) negativní výsledek pruh je vytvořen pouze v místě kontrolní linie (1 proužek) Výhody, nevýhody a využití imunochromatografie v praxi Jedná se o velmi rychlou, jednoduše proveditelnou metodu, která nevyžaduje zvláštní přístrojové vybavení či školený personál a je proveditelná v provozních podmínkách. Určitým omezením je požadavek na pomnožení vzorku před vlastním stanovením, což samozřejmě prodlužuje dobu stanovení. Podobně jako u dalších imunologických technik, je nezbytné potvrdit pozitivní výsledky konvenční metodou. V klinické diagnostice jsou imunochromatografické metody rutinně používány. Využívají se při detekci specifických složek moči, krve a ostatních tělních tekutin, dále hormonů, léčiv, virů či dalších infekčních agens. V potravinářské mikrobiologii nachází své uplatnění při detekci reziduí antibiotik, hormonů a alimentárních patogenů. Nečastěji se imunochromatografická metoda používá k detekci Salmonella spp., E. coli O157 a Shigatoxinů ST1 a ST2, L. monocytogenes či Campylobacter spp., a to v různých potravinách či environmentálních vzorcích. Komerční soupravy dodává na trh řada firem, např. Merck KGaA (řada Singlepath či Duopath), Oxoid Ltd, BioControl Inc. (řada VIP), Neogen Corp (řada Reveal) či Celsis Ltd (řada Path-Stick). Některé testy byly validovány organizací AOAC (Association of Official Chemists). 27

30 Imunologické metody 4.3. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), známá také jako EIA (Enzyme Immunoassay), je široce používaná imunologická technika nejen pro detekci patogenních mikroorganismů. Je alternativou ke kroku detekce či izolace mikroorganismů na živném agaru. Je relativně jednoduchá, může být i semi-automatická, výsledky poskytuje dostatečně rychle. Podle zaměření umožňuje detekovat konkrétní rod, druh či serotyp. Na druhou stranu je to stále metoda screeningová, pozitivní výsledky musí být potvrzeny klasickým způsobem Základní principy Jako všechny imunologické metody, je i ELISA založena na principu specifické vazebné reakce mezi antigenem a protilátkou. V ELISA testech se používají monoklonální nebo polyklonální protilátky. Polyklonální protilátky jsou produkovány při imunitní odpovědi hostitele na infekci organismu relativně velkou molekulou (protein, mikroorganismus), jsou produktem mnoha aktivovaných klonů B lymfocytů, a proto jsou namířeny proti více epitopům určitého antigenu. Monoklonální protilátky jsou produkované jedním klonem B- lymfocytů po styku s jedním konkrétním antigenním epitopem, připravují se na tkáňových kulturách. Ke značení protilátek se v ELISA metodě používá enzym, obvykle schopný katalyzovat přeměnu bezbarvého substrátu na barevný produkt (případně může dojít i ke změně barvy substrátu). Díky tomu je hodnocení testu vizuální nebo spektrofotometrické. Nejčastěji se využívá enzym alkalická fosfatasa reagující s para-nitrofenyl fosfátem nebo křenová peroxidasa reagující s tetramethylbenzidinem. V obou případech vzniká barvený produkt. Reakce probíhající v průběhu ELISA testu vždy vyžadují nějaký pevný nosič, na který jsou kovalentně vázány či adsorbovány protilátky, příp. antigen. Nejčastěji se jedná o mikrotitrační destičky či mikrozkumavky, lze použít i papírové membrány nebo polystyrenové tyčinky Konfigurace ELISA metod používaných v mikrobiologii potravin V mikrobiologii potravin je detekce obvykle zaměřena na průkaz antigenu (bakterie, toxin) pomocí známých protilátek. Tomu odpovídají i typy ELISA metod, které se používají. Prvním krokem je vždy pokrytí pevného nosiče specifickými protilátkami nebo antigeny. V případě, že test používá statický nosič (např. mikrotitrační destičku),jsou vzorek a další reagencie v několika fázích postupně přidávány do jamek. Při použití polystyrenových tyčinek (tzv. dipstick) je pevný nosič navržen tak, aby byl přenosný. Antigeny navázané na pevném nosiči (tyčince) mohou být přenášeny do různých živných médií (podpora růstu a namnožení cílových buněk), po přenesení do roztoku substrátu dojde k barevné reakci Sendvičová ELISA Nejjednodušším a nejčastěji používaným formátem v komerčních testech používaných při vyšetření potravin je sendvičová (angl. sandwich) ELISA. Sendvič v tomto případě znamená, že je cílový antigen obalen dvěma protilátkami. V průběhu testu je antigen nejprve zachycen a poté detekován. Prvním krokem každého sendvičového ELISA testu je pomnožení vyšetřované potraviny. Vazebné (imobilizované) protilátky, specifické pro cílový antigen, jsou navázány na povrch pevného nosiče, např. jamky mikrotitrační destičky. Po přídavku pomnoženého vzorku potraviny dojde, v případě přítomnosti cílových antigenů, k jejich vazbě na protilátky. Po promytí, kterým se odstraní zbytky vzorku, následuje přídavek detekčních, enzymaticky značených protilátek. Detekční protilátky se váží na cílové antigeny a vytvoří se sendvič. Několikanásobným promytím se odstraní nenavázané protilátky. Po přídavku substrátu 28

31 Imunologické metody katalyzuje enzym jeho přeměnu na barevný produkt. Na závěr lze přidat tzv. stop roztok, který ukončí enzymovou aktivitu. Vzniklá barevná reakce je hodnocena vizuálně nebo spektrofotometricky. Celková doba trvání testu je asi 2 až 3 hodiny. Metodu lze využít nejen ke kvalitativnímu, ale i semikvantitativnímu či kvantitativnímu stanovení (kalibrací koncentrace antigenu proti intenzitě barvy). Obrázek 10: Hlavní kroky sandwich-elisa testu Nepřímá sendvičová ELISA V tomto typu ELISA metody nejsou detekční protilátky značené enzymem, ale nesou marker molekulu se specifickou vazebnou kapacitou pro jinou molekulu, např. protein. Nejčastěji je jako marker používán biotin, který má vazebné proteinové místo pro avidin. Po přídavku komplexu avidinu a enzymu (např. streptavidin-křenová peroxidasa), dojde k jeho navázání na biotin. Tímto způsobem vznikne enzymaticky značená protilátka. Přítomný enzym opět katalyzuje přeměnu substrátu na barevný produkt. Obrázek 11: Nepřímá sendvičová ELISA schéma Kompetitivní ELISA V tomto případě jsou na dno testovací jamky (pevný nosič) navázány antigeny. Vzorek a enzymaticky značené protilátky jsou do jamky přidány současně. Jsou-li ve vzorku přítomny cílové antigeny, nastává kompetice (soutěžení) o vazebná místa. Značené protilátky se přednostně váží na cílové antigeny ve vzorku, část protilátek se může vázat i na antigeny imobilizované na dně jamky (čím více je cílových antigenů, tím méně protilátek se naváže na imobilizované antigeny). Během následného promývání je komplex cílový antigen-protilátka z jamky odstraněn. Už bylo zmíněno, že změna barvy na konci testu je způsobena výhradně přítomností komplexu protilátka-imobilizovaný antigen na dně jamky. Při pozitivním průkazu cílových antigenů ve vzorku je tedy výsledné zbarvení velmi slabé nebo zcela bezbarvé. Což je zcela naopak oproti sendvičové ELISA metodě (pozitivní výsledek intenzivní barva, negativní výsledek bezbarvé nebo velmi slabě zbarvené). 29

32 Imunologické metody Obrázek 12: Kompetitivní ELISA pozitivní průkaz cílového antigenu. Naopak nejsou-li ve vzorku přítomny cílové antigeny, značené protilátky se váží na imobilizovaný antigen na dně jamek. Po přídavku substrátu katalyzuje enzym jeho přeměnu na barevný produkt. Negativním výsledkem je tedy změna barvy. Obrázek 13: Kompetitivní ELISA negativní průkaz cílového antigenu. Podobně jako sendvičová ELISA, může být kompetitivní ELISA přímá či nepřímá a může sloužit nejen ke kvalitativnímu, ale i kvantitativnímu stanovení. Tento typ se nejčastěji používá pro detekci malých molekul Komerčně dostupné ELISA soupravy V mikrobiologii potravin se nejčastěji využívají ELISA sety určené pro detekci alimentárních patogenů či jejich toxinů zejména se jedná o Salmonella spp., Listeria spp., E. coli O157:H7, Campylobacter spp., stafylokokové enterotoxiny, diarhogenní enterotoxiny B. cereus, Shigatoxiny a neurotoxiny C. botulinum. Nejčastěji jsou to soupravy na bázi sandwich ELISA využívající jako pevný nosič mikrotitrační destičky. Jamky jsou obvykle samostatné, před testem se vždy potřebný počet zasune do rámu destičky. Typická souprava mimo jamek s navázanými protilátkami, zahrnuje koncentrovaný promývací roztok, lyofilizované enzymaticky značené protilátky (konjugát), lyofilizovaný substrát, ředicí roztoky a pozitivní a negativní kontrolu. K vizuálnímu hodnocení je k dispozici barevná šablona, případně lze použít reader mikrotitračních destiček. Promývací kroky lze provádět ručně nebo automaticky. Na trhu jsou dostupné i zcela automatizované systémy vyžadující minimum ruční práce. Nově jsou vyvíjeny formáty, do kterých jsou začleněny kroky využívající další imunologické techniky, např. separace bakterií za použití imunomagnetických částic (IMS). Takto koncentrované antigeny jsou následně využity jako vzorek pro ELISA test. 30

33 Imunologické metody Produkcí ELISA testů se zabývá řada výrobců TECRA (řada TECRA-VIA se provádí v mikrotitračních destičkách, v řadě UNIQUE je pevným nosičem přenosná polystyrenová tyčinka), biomérieux (řada TEK, pevnou fází je mikrotitrační destička, uvedený systém je kombinovatelný také s imunomagnetickými částicemi), Merck, BioControl a další. Plně automatizovaným systémem je EiaFoss (výrobce FossElectric) se zařazenou fází imunokoncentrace pomocí Obrázek 14: ELISA souprava. magnetických částic. Dostupné jsou soupravy pro detekci Salmonella spp., Listeria spp., E. coli O157 a Campylobacter spp Výhody, nevýhody a využití ELISA metod v praxi Citlivost většiny ELISA testů je přibližně 10 5 buněk v ml, což je jednou z hlavních nevýhod této metody. Při stanovení patogenních mikroorganismů v potravinách je obecně požadavkem detekce 1 buňky ve 25 g (ml) potraviny, z tohoto důvodu je nezbytné před vlastním ELISA testem provést pomnožení vzorku ve vhodném živném médiu. Současně krok pomnožení umožňuje resuscitaci subletálně poškozených buněk (účinek tepelného ošetření, mrazení, nízkého ph či chemických konzervantů). To je významné zejména při stanovení patogenů s nízkou infekční dávkou, jako je E. coli O157:H7 nebo C. jejuni. Další možností zvýšení citlivosti metody je již zmíněné využití imunomagnetické separace. ELISA metody mají dostatečnou specifitu, a to díky používaným protilátkám, které mají vysokou afinitu k cílovým antigenům a vykazují nízkou úroveň zkřížených reakcí s jinými mikroorganismy. Více specifické jsou soupravy obsahující monoklonální protilátky. U některých typů potravin může docházet k nespecifickým reakcím, tomu se lze vyhnout jejich vhodnou úpravou před vlastním stanovením. Provedení ELISA metody je jednoduché a rychlé, u většiny testů trvá asi 2 až 3 hodiny. Největší výhodou je využití ELISA metody při negativním screeningu vzorků, její zařazení umožní zvýšení počtu vyšetřených vzorků a podstatné zkrácení doby vyšetření (negativní výsledky jsou k dispozici cca za hodin). Na druhou stranu se jedná o screeningovou metodu, takže pozitivní výsledky musí být vždy potvrzeny klasickou metodou. Náklady na provedení ELISA metody jsou nepochybně vyšší než u ekvivalentního konvenčního testu, na druhou stranu je ale vyvažují poskytované výhody (např. nižší požadavky na pracovní sílu či rychlejší uvolňování výrobků s negativním průkazem sledovaného mikroorganismu či toxinu). Určité problémy mohou nastat při stanovení stafylokokových enterotoxinů, kdy součástí soupravy je i pozitivní kontrola čistý toxin. Stafylokokové enterotoxiny patří mezi vysoce rizikové toxiny a pro jejich použití platí v České republice přísné legislativní předpisy, které musí každá laboratoř pracující s touto látkou respektovat (více kapitola ). Jak již bylo zmíněno výše, hlavní využití ELISA metod v potravinářské mikrobiologii je detekce vybraných alimentárních patogenů či jejich toxinů. Stanovení může být prováděno v různých druzích potravin. Příslušné ELISA soupravy jsou na trhu běžně dostupné. 31

34 Imunologické metody 4.4. Enzyme-Linked Fluorescent Assay ELFA Plně automatický systém založený na fluorescenční imunologické metodě ELFA (Enzyme- Linked Immunofluorescent Assay) využívá přístroj VIDAS (Vitek Immuno Diagnostic Assay System) vyvinutý francouzskou firmou biomérieux Základní principy ELFA je založena na specifické reakci antigen-protilátka a princip reakce je podobný jako u ELISA metody. Rozdíl spočívá v použitém substrátu, který je enzymem štěpen na fluorescenční produkt. Vzniklé chemické změny detekuje fotodiodový fluorimetr. Obrázek 15: VIDAS souprava (reagenční strip, SPR a kontroly) a přístroj minividas. Testy využívané přístrojem VIDAS se skládají ze dvou částí. První částí jsou tzv. pipety, označované jako komůrka s pevnou fází (SPR ), jejichž vnitřní část je potažena protilátkou specifickou k hledanému antigenu. Druhou částí je reagenční strip složený z deseti jamek. První z nich je prázdná, do ní se pipetuje upravený vzorek zpravidla o objemu 500 µl. Dalších osm jamek obsahuje promývací roztoky nebo reagenční roztoky, konjugát z části tvořený alkalickou fosfatasou a substrát 4-methyl-umbeliferyl fosfát. Hledaný antigen (bakterie nebo např. stafylokokový enterotoxin SEA SEE) se naváže na protilátku uvnitř SPR a v průběhu promývacích kroků se odstraní nenavázané složky vzorku. Fluorogenní substrát 4-methyl-umbeliferyl fosfát, používaný v testu, je enzymem alkalickou fosfatasou navázanou na komplex antigen-protilátka konvertován na fluorescenční produkt 4- methyl-umbeliferon. Poslední jamka stripu je optická kyveta, ve které je změřena intenzita fluorescence při 450 nm pomocí fotodiodového fluorimetru. Na konci analýzy je pro každý vzorek stanovena relativní fluorescenční hodnota (RFV) a přístroj tyto výsledky automaticky analyzuje. Stanovená hodnota se porovná s interními referenčními hodnotami a provede se interpretace jednotlivých výsledků (pozitivní/ negativní), které jsou následně přístrojem vytištěny. Novinkou a významnou inovační technologií firmy biomérieux je využití rekombinantních fágových proteinů v systému VIDAS. V současnosti se tato technologie používá při detekci salmonel, listerií a E. coli O157:H7 v potravinách. U takto inovovaných testů není vnitřek SPR komůrky potažen protilátkou proti detekovaným bakteriím, ale specifickými fágovými proteiny. Rekombinantní fágové proteiny jsou části bakteriofágů (používá se tzv. tail fiber protein ), které mají schopnost se specificky navázat na receptory bakterií. Nová technologie je jedinečná díky své citlivosti. Další postup enzymové metody zůstává zachován jako v případě použití protilátek. 32

35 Imunologické metody Provedení metody a vyhodnocení výsledků Soupravy se skládají z reagenčních stripů (zpravidla ks) a příslušného počtu SPR komůrek, standardů a pozitivní i negativní kontroly. K dispozici je také ředicí roztok. Nezbytnou součástí každé soupravy je MLE karta (Master Lot Entry) s čárovými kódy, která je před vlastním využitím soupravy vkládána do přístroje. Karta umožní načtení dat potřebných pro kalibraci testu a závěrečné vyhodnocení analýzy a současně dohlíží na to, aby v testu nebyly použity stripy po uplynutí doby exspirace. Kalibrace přístroje pomocí karty, standardů, pozitivních a negativních kontrol je nutná u každé nové soupravy. Vlastní analýze na přístroji VIDAS předchází vždy zpracování vzorků. V případě průkazu stafylokokových enterotoxinů se vzorky nejprve homogenizují s destilovanou vodou, upravuje se ph na hodnotu v rozmezí 3,5 4,0 pomocí 5 M HCl, po odstředění se upravuje ph čirého supernatantu 1M NaOH na hodnotu v rozmezí 7,5 8,0 a znovu se vzorek odstřeďuje. Pro analýzu se použije získaný supernatant. V případě detekce patogenních bakterií spočívá příprava vzorků v jejich homogenizaci v pufrované peptonové vodě s přídavkem suplementů a inkubaci. Může následovat pomnožení v dalších pomnožovacích půdách. Takto zpracované vzorky se pipetují vždy v množství 500 µl do první jamky stripu. Obrázek 16: Schéma reagenčního stripu s pevnou fází (SPR ). (McMeekin, 2003 upraveno) Reagenční stripy s aplikovanými vzorky se vloží do přístroje VIDAS. Vložení každého stripu musí být doplněno zasunutím špičky (SPR fáze) na příslušnou pozici shodnou s dráhou proužku (obrázek 15). Každý vyšetřovací set má své barevné označení. Je nutné, aby si barevné štítky s kódem testu na SPR fázi a stripu odpovídaly a bylo zřejmé, že pochází z jednoho typu testu. Poté se přístroj spustí a na displeji se označí názvy vzorků v jednotlivých drahách. V průběhu testu se SPR postupně zasunuje do jamek s reagenciemi. Ty jsou vždy nasáty do špičky a po ukončení daného kroku opět vypuštěny do příslušné jamky stripu (obrázek 16). V závěru analýzy je SPR, obsahující v případě pozitivního výsledku komplex imobilizovaná protilátka-antigen-konjugát, naplněna fluorogenním substrátem z poslední jamky. Proběhne enzymatická reakce a obsah je uvolněn zpět do optické kyvety, kde je změřena hladina fluorescence. Výsledky jsou k dispozici za minut, podle typu testu. Výsledky pro jednotlivé vzorky (pozitivní/negativní) přístroj vytiskne. Obrázek 17: Vyhodnocení. 33

36 Imunologické metody Výhody, nevýhody a využití metody ELFA v praxi Významnou výhodou této automatizované metody je velká časová úspora v případě detekce patogenních bakterií, což platí pro všechny vyšetřovací soupravy z oblasti mikrobiologie potravin. Nejlépe to lze demonstrovat na průkazu salmonel a listerií. Běžná detekce salmonel nebo L. monocytogenes pomocí časově náročných kultivačních metod trvá zpravidla až 5 dní. ELFA metoda jejich průkaz zjednodušuje a zrychluje, což uvítají zvláště výrobci potravin, pro něž je negativní výsledek testů podmínkou pro expedování potravin do tržní sítě. Nejnovější testy, které využívají rekombinantní fágový protein, umožní obdržet výsledek průkazu salmonel dokonce do 27 hodin. Výjimku tvoří mléčné výrobky, kde je součástí standardního postupu vyžadován krok pomnožení vzorku v selektivním bujonu a tím se celá analýza prodlouží o 6 8 hodin. I přesto je však doba získání výsledků zkrácena o polovinu. Vyhodnocování mikrobiologických analýz při použití kultivačních metod včetně provedení konfirmačních testů vyžaduje vždy velké zkušenosti pracovníků mikrobiologické laboratoře. U VIDAS testů pracovníci obdrží jednoznačný výsledek v podobě automaticky vytištěného zápisu s pozitivním nebo negativním výsledkem. Odpadá tak riziko subjektivního hodnocení výsledků. Příprava vzorků určených pro analýzy ve VIDAS přístroji je jednoduchá. I v případě detekce stafylokokových enterotoxinů (SEs) je za výhodu považována rychlost získání výsledků (do 3 hodin) a jednoduchá příprava vzorků. Nevýhodou je, že SEs (SEA SEE) přítomné ve vzorku jsou detekovány jako suma a z výsledků nelze vyvodit, který typ enterotoxinu je v potravině přítomen. Legislativou požadovaná citlivost pro průkaz SEs ve vzorcích potravin umožňuje metodu ELFA k těmto analýzám použít (viz kapitola ). Citlivost metody ELFA se v případě detekce SEs pohybuje od 0,5 ng.g -1 (ml -1 ) (pro SEA a SEB) do 1,0 ng.g -1 (ml -1 ) (pro SEC, SED a SEE). Pro srovnání lze uvést citlivost ELISA testů, které detekují 0,1 1,0 ng enterotoxinu na 1 g (ml) potraviny. Možnost využití všech výhod, které automatizovaný systém VIDAS nabízí, je spojena s finanční investicí mikrobiologických laboratoří do nákupu přístroje. Časová úspora oproti kultivačním metodám bývá taktéž spojena s vyšší cenou vyšetření z důvodu nákupu vyšetřovacích souprav. Automatizovaný přístroj VIDAS má široké uplatnění v klinické medicíně při diagnostice virové hepatitidy, viru EBV (Epstein-Barrová virus známý také jako lidský herpesvirus 4 způsobující infekční mononukleózu) a HIV (původce nemoci AIDS), dále při stanovení Clostridium difficile, biochemických markerů (onkologická onemocnění, nemoci kardiovaskulárního systému) a dalších. V mikrobiologii potravin je přístroj VIDAS využíván při detekci Listeria spp., Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7, Campylobacter spp. a stafylokokových enterotoxinů typu A E. 34

37 Metody molekulární biologie 5. METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Ke konci 20. století se začaly velmi rychle rozvíjet genotypové metody. Ty se zaměřují na studium polymorfizmu molekul DNA nebo RNA (rozdílností v primární struktuře nukleových kyselin). Poskytují velmi přesné, objektivní a reprodukovatelné výsledky a umožňují také identifikovat nekultivovatelné mikroorganismy. Dále eliminují speciální růstové požadavky a zkracují čas potřebný ke správné identifikaci. Tyto metody významně zvýšily kvalitu identifikace mikroorganismů. Genotypové metody jsou zaměřeny buď na celkovou DNA, na určitý úsek DNA či RNA nebo na analýzu plazmidové DNA. V dnešní době je pro rodovou a druhovou identifikaci bakterií k dispozici celá řada molekulárně biologických metod. U některých je potřeba velkého množství DNA či RNA ve vzorku, neboť nedochází k amplifikaci (namnožení) cílových nukleových kyselin. Mezi tyto klasické metody řadíme např. Southern blot a nothern blot. Oproti tomu amplifikační metody (založené na polymerázové řetězové reakci) se vyznačují vysokou sensitivitou a specifitou a jsou dobře funkční i při nízkém množství cílových nukleových kyselin v analyzovaném vzorku Způsoby izolace nukleových kyselin Prvním krokem v provedení genotypových metod je extrakce nukleové kyseliny a její oddělení od ostatních složek buňky. Může se izolovat chromosomální DNA, plasmidová DNA a virová DNA či RNA, a to přímo ze vzorku, pomnožovacího média nebo z kolonií mikroorganismu na agarové půdě. Existuje celá řada metod extrakce a purifikace nukleových kyselin. Při výběru izolační techniky se zohledňuje požadavek na kvalitu a množství nukleové kyseliny, neboť ve velké míře rozhoduje o úspěšnosti navazujících molekulárně biologických metod. Také je brána v potaz časová náročnost, finanční nákladnost metody a zdroj nukleové kyseliny (typ vzorku či druh mikroorganismu) Izolace nukleové kyseliny prokaryot Obecný postup získání nukleových kyselin zahrnuje narušení buněčných membrán a uvolnění buněčného obsahu, separaci nukleové kyseliny a v případě izolace DNA také odstranění RNA. K ruptuře buňky se využívají detergenty iontové povahy (např. soli žlučových kyselin či dodecylsulfát sodný SDS), neionogenní detergenty (např. Triton X100), nebo fyzikálněchemické postupy (např. ultrazvuk). K oddělení nukleové kyseliny z roztoku buněčného obsahu se používá teplotní denaturace (záhřev), srážení organickými rozpouštědly, vysolování, fenol-chloroformová extrakce, chelatační iontoměničové pryskyřice, silikátové kolonky nebo paramagnetické nosiče. Molekuly RNA je možné degradovat enzymem ribonukleasou (RNasou), proteiny např. enzymem proteinasou. Problematika izolace nukleové kyseliny prokaryot je podrobně studována v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie) Izolace nukleové kyseliny virů Viry představují zvláštní kategorii živých soustav. Vyznačují se nebuněčnou strukturou a závislostí na hostitelské buňce. V laboratoři se mohou kultivovat na tkáňových kulturách, avšak u většiny alimentárních virů (např. noroviry, viry hepatitidy A a E) je tato kultivace velmi obtížná nebo dokonce nemožná. Proto je detekce v potravinách založena na molekulárně biologických metodách (PCR u DNA virů, reverzně transkripční PCR u RNA virů). Tyto metody však neumožní jednoznačně rozlišit infekční virové částice od neinfekčních. Zatím jen velmi málo mikrobiologických laboratoří analyzujících potraviny je 35

38 Metody molekulární biologie vhodně vybaveno pro rutinní práci s viry a také je velmi málo standardizovaných postupů izolace a detekce virů. Nukleová kyselina se může z potravinové matrice izolovat buď přímo, nebo až po izolaci a zakoncentrování virových částic. Existuje celá řada postupů, u kterých se jednotlivé kroky dají kombinovat, avšak ne všechny jsou vhodné pro použití na všechny typy potravin a všechny viry, které způsobují alimentární onemocnění. Technika izolace virových částic se vybírá podle typu matrice (liší se pro potraviny s vysokým obsahem sacharidů, nebo tuků a bílkovin, mořské živočichy s exoskeletem, vzorky vody, prostředí nebo fekálií). Používá se elučních technik (pomocí pufrů) s následným zakoncentrováním virových částic (pomocí polyethylenglykolu PEG, imunomagnetické separace, ultracentrifugace nebo filtrace elektricky nabitými filtry) a ošetření proteinasou K. Po zakoncentrování virových částic je potřeba uvolnit nukleovou kyselinu z virových obalů, odstranit nežádoucí zbytky hrubých lyzátů a nukleové kyseliny zakoncentrovat. Pro narušení virových obalů lze použít specifické enzymy či detergenty (SDS, laurylsulfát sodný), sonifikaci ultrazvukem nebo speciální přístroj bead beater, který protřepává biologický materiál se skleněnými či zirkonovými kuličkami, které mechanicky narušují virový obal. Pro alimentární viry, které nejsou obalené a mají pouze proteinovou kapsidu, stačí působení fenolu (případně ve směsi s chloroformem). Nežádoucí proteiny z hrubého lyzátu se odstraňují proteinasami, RNA (v případě izolace DNA) RNasami a DNA (v případě izolace RNA) DNasami. Manipulaci s RNA je nutno provádět v ledové lázni, používat ochranné rukavice a pracovat za aseptických podmínek. Pro přímou extrakci nukleové kyseliny z potravinové matrice lze použít guanidin isothiokyanát (GITC), který má destruktivní účinek na všechny komponenty vzorku kromě nukleových kyselin. V potravinách živočišného původu se pro uvolnění nukleové kyseliny z tkáně dá použít také přístroj bead beater. Poté následuje extrakce fenolem nebo ultracentrifugace v chloridu cesném a precipitace nukleové kyseliny ethanolem či izopropylalkoholem (u RNA v přítomnosti LiCl). Existují komerční soupravy (silikátové kolonky, chromatografické systémy, atd.), které mají výhodu snadného provedení, avšak jsou finančně nákladnější a hlavně nejsou vhodné pro každou izolaci virové DNA či RNA Polymerázová řetězová reakce (PCR) Základem pro mnohé molekulárně biologické metody je polymerázová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction). Pomocí této techniky může být za podmínek in vitro rychle a vysoce selektivně namnožena konkrétní nukleotidová sekvence obsažená v DNA. Problematika polymerázové řetězové reakce, včetně detekce PCR produktů, je podrobně studována v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie) Základní principy Principem PCR je opakované kopírování (amplifikace) templátové (vzorové) molekuly DNA pomocí enzymu DNA-polymerasy. Syntéza DNA je řízena dvěma krátkými oligonukleotidy (primery), které se komplementárně párují s templátovou DNA na počátku a na konci amplifikovaného fragmentu, každý s jiným vláknem původní dvouřetězcové molekuly DNA. V průběhu polymerázové řetězové reakce se opakovaně střídají 3 kroky. Prvním krokem je denaturace, kdy obvykle při 95 C dojde k uvolnění vodíkových můstků a z dvouřetězcové DNA (dsdna) vzniknou dvě jednořetězcové DNA (ssdna). Následuje annealing připojení (hybridizace) primerů k templátové ssdna. Tím dojde k ohraničení cílové 36

39 Metody molekulární biologie sekvence, která bude amplifikována. Tento krok probíhá při teplotě 50 až 65 C. Ta závisí na bodu tání primerů (Tm), jejich délce a nukleotidové sekvenci. U tohoto kroku je nutné provést optimalizaci. Poté následuje poslední krok, syntéza nového vlákna DNA (vznik dsdna), tzv. elongace. Probíhá obvykle při teplotě 72 C a kromě DNA-polymerasy jsou nutné všechny čtyři 2 -deoxyribonukleosid-5 -trifosfáty (dntps adenin, guanin, cytosin a thymin). Přesné hodnoty teploty a dobu trvání jednotlivých kroků je třeba optimalizovat. Tyto kroky se 25 až 35 cyklicky opakují. Optimální počet cyklů je závislý na výchozí koncentraci templátové DNA. Nově vytvořená DNA se v dalším cyklu stává matricí (templátovou DNA). Celý proces amplifikace probíhá v přístroji termocykler, v němž se teplota mění automaticky v naprogramovaných časových intervalech. Aby byl zabezpečen správný průběh PCR, je potřeba připravit reakční směs (master mix) obsahující templátovou DNA, primery, dntps, reakční pufr, hořečnaté kationty, PCR H2O a DNA-polymerasu (nejčastěji se používá termostabilní Taq polymerasa izolovaná z termofilní bakterie Thermus aquaticus). Výsledným produktem polymerázové řetězové reakce jsou amplikony, úseky DNA s definovanou délkou, o velikosti obvykle desítky až tisíce párů bazí (bp). Koncentrace a množství jednotlivých komponent reakční směsi hraje rozhodující roli při tvorbě PCR produktu a stanovuje se empiricky. Správný průběh reakce se sleduje systémem kontrol. Ty nám mohou indikovat např. kontaminaci PCR komponent (negativní kontrola) nebo funkčnost všech složek reakce (pozitivní kontrola). Aby nedocházelo ke křížovým kontaminacím, je potřeba mít od sebe oddělené prostory pro izolaci DNA, přípravu reakční směsi (nejlépe laminární box) a manipulaci s PCR produkty, včetně samostatných pomůcek pro každou z těchto činností. Tyto místnosti by se měly pravidelně dekontaminovat UV světlem. Pro rutinní provádění polymerázové řetězové reakce jsou dostupné komerčně předpřipravené PCR master mixy (např. od firmy Top-Bio, s.r.o. či Qiagen, GmbH) obsahující DNApolymerasu, reakční pufr, MgCl2, barvivo a aditiva potřebná pro detekci amplikonů agarózovou gelovou elektroforézou Detekce PCR produktů K analýze produktů polymerázové řetězové reakce mohou být použity různé metody. Např. hybridizace, ELISA nebo sekvenční analýza. Avšak snadná, levná a asi nejužívanější je separace amplikonů pomocí agarózové gelové elektroforézy (ELFO). PCR produkty migrují agarózovým gelem na základě jejich záporného náboje od katody ke kladně nabité anodě, rychlost pohybu molekul DNA je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Amplikony jsou obarveny např. ethidium bromidem (barvivo interkalující se mezi vlákna dsdna). V ultrafialovém světle obarvený fragment DNA oranžově fluoreskuje. Bezpečnější alternativou ke karcinogenní, mutagenní a teratogenní látce ethidium bromid je barvení PCR produktů pomocí látky Midori Green, která emituje zelenou fluorescenci. Podle velikosti amplifikovaného fragmentu, určené porovnáním s markerem, tj. velikostním standardem obsahujícím různě dlouhé fragmenty DNA, usuzujeme na přítomnost specifického genu ve vzorku Modifikace PCR Polymerázová řetězová reakce je používána v široké škále variant, které jsou upraveny podle účelu analýzy. U mnohonásobné multiplex PCR je možná detekce více genů v jedné reakci současně. Podle počtu požadovaných amplikonů, obsahuje master mix počet párů primerů. Primery musí být navrženy tak, aby se výsledné PCR produkty daly odlišit svou velikostí nebo byly značeny různými fluorofory (u real-time PCR). Tato varianta PCR je výhodnější 37

40 Metody molekulární biologie než provedení samostatných amplifikací, zejména z hlediska časového i ekonomického (ušetření komponent reakční směsi). Avšak optimalizace metody je náročnější než s jednou sadou primerů. Obecně platí, že jsou amplifikovány maximálně 4 různé cílové sekvence pro zajištění adekvátní citlivosti, specifičnosti a snadné interpretace dat. Využívá se často pro stanovení několika bakteriálních druhů současně (např. Campylobacter jejuni a C. coli) nebo při detekci genů kódujících stafylokokové enterotoxiny či genů rezistence. Odstupňovaná PCR (nested PCR) neboli PCR využívající vnějších a vnitřních primerů. Tento typ PCR probíhá ve dvou krocích a vyznačuje se vysokou citlivostí. V prvním kroku dochází k amplifikaci za účasti prvního, vnějšího páru primerů, poté se PCR produkt stává matricí další polymerázové řetězové reakce a amplifikuje s druhým, vnitřním párem primerů. Zpětná neboli reverzní PCR (RT-PCR) je metoda určená k amplifikaci molekul RNA. RNA je nejprve přepsána na cdna (komplementární DNA) enzymem zpětná transkriptasa. Tento enzym je termolabilní (již nad 40 C ztrácí svoji funkčnost), stringence (podmínky ovlivňující sílu a specifitu hybridizace) reakce je poměrně nízká (dochází k nekomplementárnímu párování bazí a transkripce tak není dokonalá). Proto se nyní využívá enzym Tth DNApolymerasa (RNA-dependentní DNA-polymerasa), která umožňuje nejen přepis RNA do DNA při teplotě 72 C, ale i vlastní amplifikaci a tvorbu PCR produktu. Speciálním typem polymerázové řetězové reakce je in situ-pcr. Při této metodě probíhá amplifikace specifické sekvence nukleové kyseliny přímo v buňce či tkáni. Postup zahrnuje šetrnou fixaci buněk k podložnímu sklu a nastavení podmínek pro permeabilitu nezbytných PCR reagencií do buňky. Detekce probíhá pomocí in situ hybridizace nebo imunochemicky. Jak prokaryotické, tak eukaryotické genomy obsahují repetitivní (opakující se) sekvence. Mezi těmito dlouhými repetitivními elementy se v genomu prokaryot nacházejí také relativně krátké nekódující sekvence. Při interrepetitivní (repetitivní) PCR (REP-PCR) dochází právě k amplifikaci těchto sekvencí oddělujících v genomu různé typy repeticí. Tímto typem PCR se získá soubor různě dlouhých amplikonů charakteristický pro daný mikroorganismus (obrázek 18). Profil genomu konkrétního mikroorganismu zobrazený spektrem PCR produktů (případně restrikčních fragmentů) se nazývá fingerprint. Pomocí počítačového softwaru se amplikony jednotlivých izolátů porovnávají s typovými kmeny, vytvoří se dendrogram a izoláty se identifikují. Touto metodou za použití různých primerů (např. (GTG)5) lze rozlišit některé druhy bakterií mléčného kvašení, např. při studiu diversity startovacích a doplňkových kultur. Velké využití má tato metoda jako typizační technika při genotypizaci izolátů mikroorganismů. Obrázek 18: Agarózová gelová elektroforéza amplikonů vzniklých pomocí rep-pcr. (U izolátů v běhu č. 3, 5 a 6 se vytvořily stejné amplikony, jedná se o stejný bakteriální druh). Další fingerprintovou metodou založenou na PCR, pomocí níž lze zobrazit profil DNA konkrétního organismu, je náhodná PCR (RAPD). Tato rychlá a jednoduchá metoda se používá k identifikaci a typizaci některých druhů bakterií. U RAPD se krátký oligonukleotidový primer náhodně váže k templátové DNA a vzniká soubor amplikonů charakteristický pro daný mikroorganismus (podobně jako u rep-pcr). Pomocí agarózové gelové elektroforézy jsou detekovány amplifikované fragmenty různé velikosti a tím se vytvoří specifický fingerprint pro testovaný mikroorganismus. 38

41 Metody molekulární biologie Real-time PCR (qpcr) Dnes velmi využívaným typem polymerázové řetězové reakce je real-time PCR (qpcr), která umožňuje přímou detekci a kvantifikaci PCR produktu v reálném čase (v průběhu celé PCR reakce), nikoliv až po jeho skončení. Při stanovení PCR produktů se využívá sledování fluorescenčního signálu. Jeho intenzita je permanentně snímána a analyzována speciálním přístrojem, ve kterém zároveň probíhá PCR, tudíž se amplikony nemusí detekovat elektroforeticky. Tím je tato technika zjednodušena a urychlena. Stanovení množství molekul nukleových kyselin ve vzorku se využívá při studiu detekce patogenních mikroorganismů a virů a také exprese genů (zejména studium transkripce zda je a v jaké míře daný gen přepisován z DNA do mrna). Předností metody qpcr je zejména rychlost bez nutnosti detekce PCR produktu (výsledek do několika hodin), jednoduchost provedení, přesnost a citlivost. K detekci vznikajícího PCR produktu lze využít fluorescenční barviva, fluorescenčně značené hybridizační sondy nebo fluorescenčně značené primery. V prvním případě se používají barviva (např. SYBR Green I), která fluoreskují po vazbě na dsdna. Fluorescenční signál se zvyšuje se vzrůstajícím množstvím PCR produktu. Nevýhodou fluorescenčního kyaninového barviva SYBR Green I je to, že nelze rozlišit PCR produkt od nespecificky naamplifikovaných sekvencí a nedá se použít u multiplex PCR. Druhý způsob detekce amplikonů je prostřednictvím fluorescenčně značených hybridizačních sond (krátké oligonukleotidy), které se komplementárně vážou na vnitřní část amplifikované sekvence. Existuje celá řada těchto sond, které mohou obsahovat kromě různých typů fluoroforů (např. FAM), také zhášeč (např. TAMRA). U sondy TaqMan TM je možné fluorescenci snímat až po ukončení zhášení, kdy se zhášeč oddálí od fluoroforu, a to rozložením sondy pomocí enzymu Taq DNA-polymerasy při elongaci (obrázek 19). Mezi další typy sond patří tzv. molekulární majáky. Je možné také využít přenosu energie fluorescenční rezonance technologie FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Třetí způsob detekce amplionů při qpcr je pomocí fluorescenčně značených primerů, např. technologie AmpliFluor TM Obrázek 19: Technologie TaqMan TM. nebo LUX. U klasické PCR je velmi obtížná kvantifikace. Korelace mezi počátečním množstvím templátu a konečným množstvím PCR produktu (i přes známý počet cyklů) není spolehlivá. Spolehlivější je vztah mezi množstvím templátu a počtem amplifikačních cyklů nutných pro vytvoření detekovatelného PCR produktu (čím více templátu ve vzorku, tím dříve je možné PCR produkt detekovat). Cyklus, ve kterém je již PCR produkt detekovatelný se nazývá jako prahový cyklus CT (treshold cycle). A právě tato kvantifikace může být prováděna metodou qpcr, která zaznamenává vznik amplikonů v průběhu celé reakce. Existují dva způsoby kvantifikace. Relativní kvantifikace, při které dochází pouze ke srovnání dvou vzorků a získání informace, ve kterém vzorku a kolikrát je více templátu. Při absolutní kvantifikaci je množství templátu vztaženo k externímu templátu a kvantifikováno přesné množství. V tomto případě je nutné ze standardů sestrojit kalibrační křivku vyjadřující závislost CT na známém množství DNA standardního vzorku, ze které se určuje počet kopií DNA v templátu. 39

42 Metody molekulární biologie Inhibitory polymerázové řetězové reakce Teoreticky umožňuje technika PCR detekovat jednu jedinou buňku či molekulu DNA. Avšak správný průběh reakce může být narušen přítomností celé řady inhibitorů. Zejména potravinová matrice se vyznačuje jejich velkým množstvím. Za snížení citlivosti či úplné selhání reakce mohou být zodpovědné bakteriální enzymy (nukleasy, proteasy), polysacharidy, proteiny, lipidy a další složky potravin (např. ionty Ca 2+ u mléčných výrobků, myoglobin u masných výrobků), pudr z laboratorních rukavic, složky kultivačních médií, detergenty, antibiotika, aj. Již při izolaci nukleové kyseliny může dojít k selhání buněčné lýzy nebo degradaci templátové DNA či RNA. Poškozeny mohou být také primery (zejména ty s nižší teplotou tání), případně může dojít k obsazení jejich cílových míst. Termostabilní DNA-polymerasu mohou inhibitory inaktivovat. K inhibici dojde snáze, pokud je nízká koncentrace templátové nukleové kyseliny a pokud se tvoří dlouhý amplikon nebo amplikon s nižším obsahem G+C bazí. U real-time PCR může být inhibován také fluorescenční signál. Tyto nežádoucí vlivy se mohou projevit jako falešně negativní výsledek Výhody, nevýhody a využití metody PCR v praxi Polymerázová řetězová reakce je nejpoužívanější amplifikační technika. Má však i svá omezení. Její citlivost je tak vysoká (umožňující detekci jediné buňky), že u kontaminovaných vzorků se mohou vyskytnout falešně pozitivní reakce. Naopak v přítomnosti kontaminujících látek, které PCR inhibují, může dojít k falešně negativní reakci. V potravinářské mikrobiologii se polymerázová řetězová reakce využívá jednak k rychlé detekci alimentárních patogenů přímo ze vzorku, jako jsou Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Shigella spp., Campylobacter jejuni/coli, patogenní serotypy E. coli, Vibrio spp., Yersinia enterocolitica/pseudotuberculosis, Clostridium perfringens, Cronobacter sakazakii, S. aureus, Bacillus cereus, atd. Využití nachází také při rodové konfirmaci a druhové identifikaci mnoha bakterií (např. enterokoky a další bakterie mléčného kvašení) a dále při průkazu genů kódujících faktory virulence, genů rezistence k antimikrobiálním látkám a genů zodpovědných za tvorbu enterotoxinů, biogenních aminů či bakteriocinů. Ve vzorcích potravin se obvykle patogenní mikroorganismy vyskytují v nízkých počtech a při jejich průkazu standardními metodami je nutné je nejprve pomnožit, čímž se prodlužuje doba identifikace. Využití PCR tedy významně zkracuje potřebnou dobu stanovení. Na druhou stranu, stejně jako u jiných alternativních metod, musí být pozitivní výsledek (průkaz patogenního mikroorganismu přímo ve vzorku) potvrzen standardní kultivační metodou. Metoda PCR se může přímo využít k detekci mikroorganismů, avšak nestanovíme jí přítomnost toxinů a dalších metabolitů schopných ovlivnit bezpečnost potravin (např. stafylokokové enterotoxiny). Stanoví se pouze geny kódující tyto látky nebo jejich exprese. Problémem při detekci alimentárních virů je to, že mohou být detekovány i inaktivované virové částice, které již nepředstavují žádné riziko. Jejich nukleová kyselina může v potravinové matrici přetrvat i po narušení funkce kapsidy viru. V takové formě ztrácí viry schopnost vázat se na hostitelskou buňku. Molekulárně biologické metody mohou být použity i při identifikaci pomalu rostoucích či velmi obtížně kultivovatelných mikroorganismů, kde významně zvýšily kvalitu jejich identifikace. Dále se jimi mohou detekovat alergeny či geneticky modifikované organismy. Na druhou stranu, některé molekulární techniky jsou poměrně nákladné, časově náročné a pracné, a proto nejsou vždy vhodné pro rutinní identifikaci. 40

43 Metody molekulární biologie 5.3. Hybridizační techniky Hybridizace je proces vytváření dvouřetězcových (ds, angl. double stranded) molekul z jednořetězcových (ss, angl. single stranded) molekul nukleových kyselin (DNA či RNA). Hybridizovat mohou jakékoliv ssdna či ssrna za předpokladu, že se jejich sekvence vyznačují úplnou nebo částečnou komplementaritou bazí. Mezi párovými bazemi dochází k tvorbě vodíkových můstků. Podle typu molekul, které se mohou párovat, existuje DNA/DNA hybridizace, DNA/RNA hybridizace a RNA/RNA hybridizace Základní principy Před hybridizací se musí dvouřetězcové molekuly nukleových kyselin denaturovat (působením vysoké teploty, enzymaticky nebo chemicky např. NaOH). Při vlastní hybridizaci se smíchá hybridizační sonda s vyšetřovanou nukleovou kyselinou a zajistí se vhodné podmínky pro hybridizaci, a to koncentrace iontů a vhodná teplota, které lze s určitou přesností odvodit od tzv. teploty tání sondy. Poté se odmyje sonda, která se nenavázala na vyšetřovanou nukleovou kyselinu a detekuje se hybridizační produkt. Nastavení různých hybridizačních podmínek umožňuje vytvoření hybridizačních produktů obsahujících i nespárované úseky. Čím jsou tyto podmínky přísnější, tzv. vyšší stringence (vyšší teplota, blížící se teplotě tání), tím se docílí dokonalejší vazby sondy na vyšetřovanou nukleovou kyselinu a hybridy jsou stabilnější. Čím je stringence nižší (nižší teplota Obrázek 20: Hybridizace při nastavení různé stringence podmínek přísnosti. (Alberts et al., 2005 upraveno) hybridizace), tím častěji vznikají nestabilní hybridy s nedokonale spárovanými nukleotidy (obrázek 20). Kromě teploty ovlivňuje stabilitu hybridů i jejich délka a zastoupení GC a AT párů, ph a koncentrace solí v roztoku a přítomnost látek destabilizujících vodíkové můstky mezi řetězci. Záleží také na tom, které molekuly spolu hybridizují stabilita klesá v pořadí RNA-RNA, RNA-DNA, DNA-DNA. Výchozím krokem pro hybridizaci je příprava hybridizační sondy. Sondou se rozumí jednořetězcová radioaktivně nebo chemicky značená nukleotidová sekvence DNA (RNA), vázající se komplementárně k cílové sekvenci, která je takto identifikována. Aby měla sonda požadovanou sekvenci, může být uměle připravena např. polymerázovou řetězovou reakcí. Původně byly sondy pro hybridizaci značeny radioaktivně. Radioaktivní sondy mají ve své sekvenci začleněny nukleotidy obsahující radioaktivní izotop ( 32 P, 33 P, 35 S, 3 H). Signálem sondy je radioaktivní záření, které lze detekovat autoradiograficky na vrstvě fotografického filmu, papíru nebo emulze.tento způsob detekce cílové sekvence je velmi citlivý, ale kvůli bezpečnosti práce dnes převažují sondy značené chemicky. Do sekvence těchto sond jsou zabudovány chemicky modifikované nukleotidy dutp (do DNA se začleňují místo dttp) nesoucí molekulu digoxigeninu (DIG) nebo biotinu. Tyto molekuly působí jako antigen a jsou rozpoznávány protilátkami. Sonda s digoxigeninem je detekována protilátkou specifickou pro digoxigenin (Anti-DIG). U biotinu se mohou použít kromě specifické protilátky také avidin nebo streptavidin. Na protilátkách je navázán buď enzym (alkalická fosfatasa, peroxidasa, luciferasa) nebo fluorescenční barvivo (fluorescein, rhodamin). Po přidání substrátu 41

44 Metody molekulární biologie katalyzuje příslušný enzym reakci, jejímž výsledkem je změna barvy substrátu nebo jeho rozpustnosti, emise světla, případně fluorescence. Uspořádání hybridizačních experimentů je velmi variabilní. Provádí se např. hybridizace v roztoku, gelu, na filtrech, čipech, v elektronovém mikroskopu nebo in situ hybridizace (obrázek 21). Obrázek 21: Možnosti experimentálního provedení hybridizace nukleových kyselin. (Šmarda et al., 2010 upraveno) K nejcitlivějším technikám patří hybridizace v roztoku. Cílová molekula i sonda volně plavou v reakční směsi a dochází k rychlé tvorbě hybridizačního produktu. Pro tento typ hybridizace stačí velmi málo vzorku. Kombinací hybridizace v roztoku a na pevném podkladu vznikla hybridizace, kdy jsou využity kovové kuličky s imobilizovanými sondami. Hybridizace in situ umožňuje detekovat přítomnost specifických sekvencí nukleových kyselin v cytologických preparátech chromosomů, buněk nebo řezech tkání a s vysokou přesností stanovit jejich prostorovou lokalizaci. Využití má zejména k detekci genů na polytenních chromosomech hmyzu, metafázních chromosomech savců a rostlin, k detekci specifických molekul RNA uvnitř buněk a tkání nebo k detekci RNA či DNA virů. Pokud sondy obsahují fluorescenčně značené nukleotidy, technika se nazývá fluorescenční hybridizace in situ (FISH, Fluorescent In Situ Hybridisation). Vizualizace navázaných sond se provádí fluorescenční mikroskopií. Mohou se použít sondy s různou sekvenční specifičností značené látkami fluoreskujícími různými barvami, což umožňuje identifikaci polohy několika genů současně. Tuto metodu lze použít při detekci či konfirmaci bakterií Hybridizace na pevném podkladu Hybridizace na pevném podkladu je jednou z nejčastěji používaných technik. Denaturovaná DNA nebo RNA je přenesena na nitrocelulózový filtr nebo nylonovou membránu. Tato technika je méně citlivá než hybridizace v roztoku, ale její výhodou je možnost testování většího množství vzorků najednou. Pokud je potřeba zjistit, která kolonie nese hledané sekvence, provádí se hybridizace bakteriálních kolonií. Nejprve jsou kolonie přeneseny z agaru v Petriho misce na membránu (otisk je zrcadlově otočený). Potom jsou buňky lyzovány a uvolněná dsdna je denaturována na ssdna. Jednořetězcová bakteriální DNA je např. pomocí UV přichycena k membráně a po přidání ssdna sondy hybridizována. Hybridizační produkt je vizualizován a podle jeho polohy je detekována kolonie s hledanou cílovou sekvencí (obrázek 22). U dot blot (tečkové/kapkové) hybridizace je na hybridizační membránu nakápnuta a přichycena přímo denaturovaná nukleová kyselina. Pomocí hybridizace se mohou také vyhledávat a lokalizovat geny u restrikčních fragmentů, které jsou elektroforézou rozděleny na základě velikosti. Po elektroforetické separaci se tyto fragmenty přenáší z agarózových případně polyakrylamidových gelů na pevný podklad. Podle typu přenášené molekuly se rozlišuje Southernův přenos DNA (Southern blotting) a 42