Molekulární biofyzika

Transkript

1 Molekulární biofyzika Molekuly v živých systémech - polymery Lipidy (mastné kyseliny, fosfolipidy, isoprenoidy, sfingolipidy ) proteiny (aminokyseliny) nukleové kyseliny (nukleotidy) polysacharidy (monosacharidy)

2 Proteiny - bílkoviny oprimární str. (aminokyseliny) osekundární str.(peptidová vazba, nevazebné interakce, sekundární struktury) oterciární str. (folding) okavarterní str. odruhy proteinů (struktura, funkce) oenzymy (mechanismus katalýzy, inhibice)

3 Primární struktura proteinů - AMINOKYSELINY -aminokyseliny: konfigurace (podle Fischera) COO - COO - D: H C NH 3 L: NH 3 C H R R Kódované aminokyseliny (20): -aminokyseliny (kromě prolinu NH 2 skupina zabudována do cyklu)

4 Hydrofobní aminokyseliny

5 Polární aminokyseliny

6 Kyselé aminokyseliny

7 Bazické aminokyseliny

8 Rozdělení podle chemické povahy postranních řetězců (v lit. se často liší) o Aromatic (phenylalanine, tyrosine, tryptophan) o aliphatic (leucine, isoleucine, alanine, methionine, valine) o Hydroxyl/Sulfhydryl (threonine, serine, tyrosine, cysteine) o Carboxyamide (glutamine, asparagine) o R-Acids (glutamic acid, aspartic acid) o R-Amines (lysine, histidine, arginine) o Odd (glycine, proline)

9 AA včetně označení hmotnosti v Tab jsou uváděny o 18 nižší, tedy takové jaké jsou v bílkovinném řetězci

10 Kódované aminokyseliny: Jednopísmenkové zkratky Proč jsou v tabulce vzorce s náboji? obojetné ionty = amfionty COO - H C H NH 3 celkový náboj amfiontu: součet všech nábojů (pro Gly v ph 7 = 2) volný náboj amfiontu: algebraický součet nábojů (pro Gly v ph 7 = 0)

11 kyselina: HA H A - Slabá kyselina - pufr: např. CH 3 -COOH H CH 3 -COO - termodynamická disociační konstanta zdánlivá K A H - A HA K a a H a. a HA A Henderson-Hasselbalch HAc <=> H Ac- ph = pka log ([Ac-]/[HAc]) pka = -Log Ka (stejně jako ph = -Log [H])

12 KYSELÉ DISOCIAČNÍ KONSTANTY pk A disociovatelných SKUPIN VYSKYTUJÍCÍCH SE V BÍLKOVINÁCH -COOH, -COOH imidazolium -SH -NH 3 fenol -NH 3 guanidinium 2,5 4,0 6,0 8,3 9,5 10,1 10,5 12,5

13 Hodnoty pk A disociovatelných skupin v aminokyselinách a bílkovinách (25 o C) Funkční Aminokyselin Hodnoty pk A nalezené Hodnoty pk A skupina a ve volných nalezené aminokyselinách v bílkovinách -karboxylová C-koncová 1,7-2,6 1,8-3,6, karboxylová Asp, Glu 3,86; 4,25 3,0-4,7 imidazolová His 6,0 5,6-7,0 -aminová N-koncová 8,8-10,7 7,9-10,6 -aminová Lys 10,53 9,4-11,0 sulfhydrylová Cys 8,33 8,3-8,6 fenolová Tyr 10,07 9,8-10,8 guanidylová Arg 12,48 11,6-12,6

14 Titrační křivka glycinu

15 COO - OO - H C CH 2 NH 3 CH 2 C COO - H C CH 2 NH 3 CH 2 CH 2 CH 2 NH 3 COO - NH CH H C CH 2 C NH NH 3 CH

16 ISOELEKTRICKÝ BOD DEFINICE: ph, při němž se amfiont nepohybuje ve stejnosměrném elektrickém poli (interakce s dalšími ionty, závisí na prostředí - pufr); označujeme pi

17 ISOELEKTRICKÝ BOD př.: Gly (titruji Gly.HCl) K COOH A1 COO - K A2 COO - H C H NH 3 H C H NH 3 H C H NH 2 Z = 1 (Gly 1 ) 0 (Gly ) -1 (Gly -1 ) ph pk A1 Gly ph pk Gly Gly log [ ] A2 Gly log [ ] 2 ph pk pk Gly log [ ] A1 A2 Gly Ale v ph = pi platí: [Gly 1 ] = [Gly -1 ] takže: pi ( pk pk ) / A1 A2 2

18 Více disociovatelných skupin: rozhodují ty, které "sousedí" s pi (nutno načrtnout titrační křivku) Pro polyionty (např. bílkoviny) tuto rovnici nelze použít (příliš mnoho pk A v okolí pi) Isoelektrické body kódovaných aminokyselin AK pi AK pi AK pi AK pi Gly 6,0 Ser 5,7 Phe 5,5 His 7,6 Ala 6,0 Thr 5,6 Tyr 5,7 Lys 9,6 Val 6,0 Cys 5,0 Trp 5,9 Arg 10,8 Leu 6,0 Met 5,7 Asn 5,4 Asp 3,0 Ile 6,0 Pro 6,4 Gln 5,6 Glu 3,2

19 absorbance OPTICKÉ VLASTNOSTI Absorpce UV záření: aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm Absorpční spektra 1: hovězího sérového albuminu (1 mg/ml), 2: lidského imunoglobulinu (1 mg/ml) a 3: DNA (0,1 mg/ml), optická délka kyvety 1 cm. Optická aktivita: konfigurace (nesouvisí přímo se smyslem rotace) 1,6 1,4 1, ,8 0,6 0,4 1 0, vlnová délka [nm]

20 Peptidová vazba

21 >gi ref ZP_ putative Cerebroside-sulfatase [Escherichia coli TA143] MQKTLMASLIGLAVCTGNAFNPVVAAETKQPNLVIIMADDLGYGDLATYGHQIVKTPNIDRLAQEGVKFTDYYAPAPLSSPSRAGLLTGRMPF RTGIRSWIPTGKDVALGRNELTIANLLKAQGYDTAMMGKLHLNAGGDRTDQPQAKDMGFDYSLVNTAGFVTDATLDNAKERPRFGMVYPT GWLRNGQPTPRSDKMSGEYVSSEVVNWLDNKKDSKPFFLYVAFTEVHSPLASPKKYLDMYSQYMSDYQKQHPDLFYGDWADKPWRGTG EYYANISYLDAQVGKVLDKIKAMGEEDNTIVIFTSDNGPVTREARKVYELNLAGETDGLRGRKDNLWEGGIRVPAIIKYGKHLPKGMVSDTP VYGLDWMPTLANMMNFKLPTDRTFDGESLVPVLENKALKREKPLIFGIDMPFQDDPTDEWAIRDGDWKMIIDRNNKPKYLYNLKTDRFETI NQIGKNPDIEKQMYGKFLKYKADIDNDSLMKARGDK PEAVTWG Mutace!

22 Prim. Struktura - ZÁKONITOSTI: Primární struktura je zapsána v DNA (gen). Bílkoviny jeví druhovou specifitu (sekvenční homologie). Zákon isopolárních záměn. Polymorfismus bílkovin ("isobílkoviny").

23 Kovalentní struktura bílkovin (primární struktura posttranslační modifikace) 1. Propojení řetězců kovalentními vazbami 2. Odštěpení částí řetězců 3. Úpravy postranních řetězců aminokyselin 4. Připojení mastných kyselin 5. Glykosylace 6. Fosforylace (dočasné či trvalé) 7. Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory enzymů...) 8. Metaloproteiny (koordinační kovalentní vazby různé síly) 1-3: jednoduché bílkoviny 4-8: složené bílkoviny

24 Konformace peptidového řetězce OBECNÉ ZNAKY PROSTOROVÉHO USPOŘÁDÁNÍ "ORGANISOVANÝCH" BIOPOLYMERŮ: o Nativní struktuře odpovídá minimum Gibbsovy energie, dané výhodností nekovalentních interakcí. o Nativní struktura je zakódována v kovalentní struktuře. o Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích s okolím. o Prostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické. o Nativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformační dynamické systémy). o Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).

25 Typy nekovalentních interakcí uplatňujících se v živých systémech * Střední hodnota energie vazby C - H v molekule methanu je 416 kj.mol -1. ** Pro prostředí s hodnotou relativní permitivity 4, přibližně odpovídající nepolárnímu prostředí uvnitř bílkovinné globule.

26 Hydrofobní interakce

27 Sekundární struktura

28 Ramachandran Plot

29 Pravotočivá šroubovice, stabilizovaná vodíkovými vazbami. 3,6 aminokyselinových zbytků na jednu otáčku, R aminokyselin jsou orientovány ven. Všechny C=O a N-H skupiny peptidových vazeb jsou uloženy rovnoběžně s podélnou osou a-helixu. Každá karbonylová (C=O) skupina peptidové vazby je vázána vodíkovou vazbou ke čtvrté N- H skupině. -helix Helikální strukturu mají převážně vláknité proteiny (keratiny), svalové proteiny aj. Výjimečný a-helix má kolagen. Tři levotočivé a- helixy se uspořádávají do pravotočivé trojité šroubovice superhelixu (dáno specifickým aminokyselinovým složením kolagenu 33% glycinu, 13% Pro a Hypro)

30

31 β struktura (struktura skládaného listu) Segmenty natažených polypeptidových řetězců. Dva segmenty (polypeptidové řetězce) jsou stabilizovány vodíkovými vazbami mezi C=O a N-H skupinami dvou sousedních peptidových vazeb. Sousední polypeptidové řetězce jsou uloženy antiparalelně nebo paralelně. Velký počet vodíkových vazeb udržuje strukturu v nataženém stavu

32

33 β - ohyb o Umožňuje otočení směru peptidového řetězce o Kyslík karbonylové skupiny jednoho residua je vázán H-vazbou na amidový proton o 3 residua dále o V těchto strukturách převažují prolin a glycin

34 Terciární struktura

35 hemoglobin

36

37

38 Stabilizace terciálrní str.

39

40 Kvarterní struktura

41 přílohy

42 Příklady bílkovin s kvarterní strukturou

43 Svinování (folding) - neprobíhá náhodným způsobem - probíhá postupně a) malé dočasné periodické struktury b) supersekundární struktury c) strukturní domény a "roztavená" glubule d) závěrečné úpravy za účasti enzymů (peptidylprolin-cis-trans-isomerasa, proteindisulfid-isomerasa) - Potřebují bílkoviny ke svinování pomocníky?

44 Svinování (folding)

45 Dělení bílkovin podle jejich funkce stavební a podpůrné kolageny, elastin, keratiny (fibrilární) bílkoviny cytoskeletu (tubulin, vimentin, též pohyb) nukleoproteiny (histony, ribosomální bílkoviny) transportní a skladovací hemoglobin a myoglobin (O 2 ) transferrin a ferritin (Fe) sérový albumin (mast. kyseliny, bilirubin, hem...) apolipoproteiny (lipidy, cholesterol) cytochrom c (elektrony) bílkoviny zajišťující membránový transport pohyb aktin a myosin (další) ochranné a obranné imunoglobuliny fibrinogen regulační hormony receptory (membránové a intracelulární) regulační bílkoviny proteosynthesy katalytická enzymy

46

47

48 přílohy

49 Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Glycin COO - Gly H C H N N Alanin NH 3 COO - Ala N N H C CH 3 NH 3 OO Valin C - CH 3 Val H C H C N E CH NH 3 3 Leucin COO - CH H 3 Leu H C CH 2 C N E CH 3 NH 3

50 Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Isoleucin Ile Prolin Pro Fenylalanin Phe H H COO - C HC NH 3 CH 3 COO - CH C 2 CH 2 CH 3 CH H 2 N 2 CH 2 COO - H C CH 2 NH 3 N N N E N E Tyrosin Tyr C COO- H CH 2 OH NH 3 P N Tryptofan Trp COO - H C CH 2 NH 3 N H N E

51 Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Histidin His Z N Serin COO - NH CH H C CH 2 C NH NH 3 CH COO - Ser H C CH 2 OH P N NH 3 Threonin CH 3 H C CH Thr P E COO - NH 3 COO - NH 3 COO - OH Cystein Cys H C CH 2 SH P N Methionin H C CH 2 CH S CH Met 2 3 N E NH 3

52 Kódované aminokyseliny: Polarita: N (nepolární), P (neutrální polární), K (kyselá) a Z (zásaditá). Esenciální: pro člověka Název / zkratka Vzorec Polarita Esenciální Lysin H C CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH Lys 3 Z E COO - NH 3 COO - NH 3 Arginin NH 2 H C CH 2 CH 2 CH 2 HN C Arg Z N Asparagová kyselina Asp Glutamová kyselina Glu C NH 2 COO- H CH OO - 2 C NH 3 COO - H C CH 2 CH 2 COO - NH 3 Asparagin H C CH 2 CONH 2 Asn P N COO - NH 3 COO - NH 3 Glutamin H C CH 2 CH 2 CONH 2 Gln P N K K N N