FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra analytické chemie

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra analytické chemie Využití průtokových analytických metod pro stanovení biologicky aktivních látek Disertační práce Hradec Králové 2011 Mgr. Petra Koblová (roz. Žáková)

2 Prohlášení Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla použita k získání stejného, nebo jiného titulu. 2

3 Poděkování Ráda bych poděkovala svému školiteli prof. RNDr. Petru Solichovi, CSc. a PharmDr. Haně Sklenářové, Ph.D., školitelce specialistce, za jejich odborné vedení, motivaci ke studiu, cenné rady, péči po celou dobu mého postgraduálního studia, připomínky a inspiraci jak pro tvůrčí praktickou práci, tak při psaní odborných publikací. Dále bych ráda poděkovala PharmDr. Petru Chocholoušovi, Ph.D. a Doc. RNDr. Daliboru Šatínskému, Ph.D., kolegům z Laboratoře průtokové analýzy, kteří mi pomohli se seznámením s průtokovými metodami, hlavně s metodami SIA a SIC. Jejich zkušenosti se SIA technikou a především se softwarovým prostředím byly pro mne výborným základem pro rychlou orientaci a ovládání přístrojového vybavení. Díky patří také mým kolegyním PharmDr. Ludmile Matysové, Ph.D. a PharmDr. Lucii Havlíkové, Ph.D. za cenné rady a pomoc při řešení problémů v oblasti validací a HPLC metod. Mé poděkování patří samozřejmě i všem ostatním členům katedry za ochotnou pomoc kdykoliv jsem byla v nesnázích, za porozumění, rady, trpělivost a v neposlední řadě za příjemnou atmosféru po celou dobu mého doktorského studia. Děkuji grantové agentuře Univerzity Karlovy (GAUK) za finanční podporu mých výzkumných úkolů a za možnost prezentovat tyto výsledky na tuzemských i zahraničních konferencích. V neposlední řadě děkuji své rodině především za trpělivost a za to, že stáli při mně v dobrém i zlém a tím mi zpříjemnili dobu mého studia. Tato práce vznikla za podpory grantu SVV

4 Abstrakt Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra: Analytické chemie Kandidát: Mgr. Petra Koblová Školitel: prof. RNDr. Petr Solich, CSc. Název disertační práce: Využití průtokových analytických metod pro stanovení biologicky aktivních látek Disertační práce se zabývá vývojem HPLC a SIC metod pro stanovení účinných látek a degradačních produktů ve farmaceutických přípravcích. Vyvinuté metody byly validovány a splňují všechny požadavky kladené na vhodnost, přesnost a správnost. V první práci byla vyvinuta metoda HPLC pro stanovení účinné látky klotrimazolu a příslušných nečistot (2-chlorfenyl)difenylmethanolu a imidazolu v přípravku Clotrimazol spray 1 %. Jako vnitřní standard byl použit ibuprofen. Cílem další práce bylo porovnat separační účinnost částicové kolony a monolitických kolon různé délky. K porovnání byla použita HPLC metoda stanovení indometacinu a jeho dvou rozkladných produktů. Ketoprofen byl použit jako vnitřní standard k hodnocení dat v průběhu celé studie. Byla vyvinuta metoda SIC pro stanovení ve vodě nerozpustných vitamínů (retinol acetát, D 2, nebo D 3 a tokoferol acetát). Nová SIC metoda s použitím monolitické kolony a UV spektrofotometrické detekce byla použita pro stanovení vitamínu D 3 v léčivém přípravku Vigantol a vitamínů A, D 2 v přípravku Vitamin AD Slovakofarma kapsle. Jako vnitřní standard pro kvantifikaci byl použit tokoferol acetát. Použitelnost a separační účinnost SIC a HPLC s gradientovou elucí byla demonstrována na separaci a současném stanovení účinné látky indometacinu a jeho dvou rozkladných produktů v topickém farmaceutickém přípravku (Indobene gel 1 %). Ketoprofen byl použit jako vnitřní standard. Další práce se zabývala vývojem a validací HPLC metody pro stanovení účinné látky nonoxynolu a trimekainu v topických přípravcích - lubrikačních 4

5 gelech. Amitriptylin byl vybrán jako vnitřní standard. Vyvinutá metoda byla prakticky aplikována pro hodnocení přípravku LG non-stop. Poslední HPLC metoda, která je uvedena v této práci, popisuje stanovení kyseliny askorbové, fenylefrinu, paracetamolu a kofeinu. Byla použita monolitická kolona a UV detekce. Kyselina salicylová byla použita jako vnitřní standard. Optimalizovaná metoda byla aplikována na stanovení účinných látek ve farmaceutickém přípravku Coldrex tablety. 5

6 Abstract Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Mgr. Petra Koblová Supervisor: prof. RNDr. Petr Solich, CSc. Title of Doctoral Thesis: Using of flow analytical method for determination of biological active compounds The presented dissertation thesis is dealing with development of HPLC and SIC methods for determination of active substances and degradation products in pharmaceutical formulations. Developed methods were validated and meet all requirements for suitability, precision and reliability. In the first work, HPLC method for determination of active compound clotrimazole and its degradation products (2-chlorophenyl) diphenylmethanol and imidazole in Clotrimazol spray 1 % was developed. Ibuprofen was used as the internal standard. The aim of the next work was to compare separation efficiency particle based and monolithic columns with various lengths. HPLC method for determination of indomethacin and its two degradation products was used for comparison. Ketoprofen was used as an internal standard for data evaluation throughout the study. SIC method for determination of water-insoluble vitamins (retinol acetate, D 2, or D 3 and tocopherol acetate) was developed. The novel SIC method with the monolithic column and UV spectrophotometric detection was applied for the determinations of vitamin D 3 in the pharmaceutical formulation Vigantol and vitamins A, D 2 in the formulation Vitamin AD Slovakofarma capsules. Tocopherol acetate was used for quantification as an internal standard. Applicability and separation efficiency of SIC and HPLC with gradient elution was demonstrated on the separation a simultaneous assay of active compound indomethacin and its two degradation products in topical 6

7 pharmaceutical formulation (Indobene gel 1 %). Ketoprofen was used as internal standard. Next work dealt with development and validation of HPLC method for determination of nonoxinol and trimecaine in topical formulations lubricant gels. Amitriptyline was chosen as internal standard. The developed method was practically applied for evaluation of preparation LG non-stop. The last method that is mentioned in this work described determination of ascorbic acid, phenylephrine, paracetamol and caffeine. Monolithic column and UV detection were used. Salicylic acid was used as internal standard. Optimized method was applied for determination of active compounds in pharmaceutical formulation Coldrex tablets. 7

8 Disertační práce Obsah Obsah 1 Seznam použitých zkratek Úvod Cíl práce Teoretická část Principy chromatografie Definice, princip a rozdělení chromatografických metod Vybrané pojmy a charakteristiky chromatografického procesu Chromatogram Retenční charakteristiky a distribuční konstanta Účinnost separace v chromatografii Rozlišení Faktor symetrie Kapalinová chromatografie Definice kapalinové chromatografie Dělení HPLC Instrumentální vybavení v kapalinové chromatografii Stacionární fáze Stacionární fáze na bázi silikagelu Stacionární fáze pro normální chromatografii Stacionární fáze pro reverzní chromatografii Hybridní stacionární fáze Stacionární fáze na bázi oxidu zirkoničitého, hlinitého a titaničitého Stacionární fáze pro HILIC Polymerní stacionární fáze Monolitické stacionární fáze Makroporézní polymerní disky Makroporézní polymerní kolony Tubulární kolony s radiálním tokem Komprimované gely Monolitické kolony z anorganických materiálů Nové trendy ve stacionárních fázích Porézní částice menší než 2 mikrometry Porézní částice s neporézním jádrem Monolitické kolony High Resolution Mobilní fáze Nízkotlaké průtokové metody Definice a základní charakteristiky Princip Rozdělení průtokových metod

9 Disertační práce Obsah Průtoková injekční analýza Sekvenční injekční analýza Sekvenční injekční chromatografie Definice sekvenční injekční chromatografie Princip sekvenční injekční chromatografie Instrumentální vybavení v sekvenční injekční chromatografii SIC aplikace Porovnání HPLC a SIC Komentář k publikovaným pracím Optimalizace HPLC stanovení klotrimazolu Aplikace monolitických kolon ve farmaceutické analýze. Stanovení indometacinu a jeho degradačních produktů Separace vitamínů A acetátu, ergokalciferolu, nebo cholekalciferolu a tokoferolu acetátu pomocí sekvenční injekční chromatografie Tvorba gradientové eluce v sekvenční injekční chromatografii s využitím monolitických kolon Chromatografické stanovení účinných látek v topických přípravcích Vývoj a validace HPLC metody pro stanovení kyseliny askorbové, fenylefrinu, paracetamolu a kofeinu s využitím monolitické kolony Přehled všech publikovaných prací Přehled přednášek a posterů Přílohy I publikace Příloha Příloha Příloha Příloha Příloha Příloha Přílohy II postery Příloha Příloha Příloha Příloha Příloha Příloha Příloha Shrnutí

10 Disertační práce Obsah 11 Summary Závěr Seznam literatury

11 Disertační práce Seznam použitých zkratek 1 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK BEH Hybridní technologie silikagelu a polymeru (Bridge Ethylene Hybride) FIA Průtoková injekční analýza (Flow injection analysis) GC Plynová chromatografie (Gas Chromatography) HILIC Chromatografie hydrofilních interakcí (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High performance liquid chromatography) LC Kapalinová chromatografie (Liquid Chromatography) LC - MS Kapalinová chromatografie hmotnostní spektrometrie (Liquid Chromatography mass spectrometry) MF Mobilní fáze (Mobile phase) MS Hmotnostní spektrometrie (Mass spectrometry) MK Monolitická kolona (Monolithic column) NP Normální fáze (Normal phase) PBD Polybutadien PC Papírová chromatografie (Paper Chromatography) ph Záporný dekadický logaritmus koncentrace vodíkových iontů PS Polystyren RP Reverzní fáze (Reverse phase) RP-HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi SIA Sekvenční injekční analýza (Sequential injection analysis) SIC Sekvenční injekční chromatografie (Sequential injection chromatography) SPE Extrakce na tuhou fázi (Solid phase extraction) SST Test vhodnosti systému (System Suitability Test) TLC Tenkovrstvá chromatografie (Thin Layer Chromatography) UV-VIS Spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti (ultra-violet and visible spectrometry) 8

12 Disertační práce Úvod 2 ÚVOD Farmaceutické přípravky jsou nejčastěji směsi účinných a pomocných látek. Pro jejich stanovení se s výhodou používají chromatografické separační metody, které umožňují zároveň stanovit jak jednotlivé účinné látky, tak i látky pomocné a případně i rozkladné produkty. Mezi takové metody patří např. HPLC, GC a nově také sekvenční injekční chromatografie (SIC). Farmaceutické přípravky se mohou vyskytovat v různých lékových formách (roztoky, tablety, masti, gely,...) a ve většině případů je před vlastním stanovením nutná předúprava vzorku. Někdy postačí pouhé naředění vzorku mobilní fází (či jiným rozpouštědlem), jindy je úprava složitější - extrakce organickým rozpouštědlem, centrifugace, SPE,... HPLC a SIC jsou průtokové separační chromatografické techniky, které se používají k separaci, identifikaci a stanovení směsi látek a to vše během jedné analýzy. Chromatografické metody jsou vysoce účinné separační techniky, při kterých dochází k dělení látek mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je vysoce instrumentálně pokročilá separační technika. Je to metoda univerzální, robustní, citlivá (v závislosti na použitém detektoru) s možností automatizace. Využití automatického dávkovače umožňuje analýzy velkých sérií vzorků, což je výhodné pro rutinní využití metody. Rutinně se HPLC využívá ve všech typech analytických laboratoří zabývajících se kontrolou léčiv, kontrolou životního prostředí, klinickým hodnocením léčiv, monitorováním lékových hladin, toxikologií, biochemií, analýzou potravin, diagnostikou markerů různých onemocnění či dědičných poruch. Sekvenční injekční chromatografie je nízkotlaká separační technika, která vzniká začleněním chromatografické kolony, nejčastěji monolitické kolony, do SIA systému. Díky své porozitě kladou monolity při průtoku minimální odpor, a proto k dosažení požadovaného průtoku dostačují nízkotlaké pístové pumpy. Právě použití monolitů umožňuje začlenění SIC do širší skupiny separačních technik, i když se zatím používá jen k výzkumným účelům. 12

13 Disertační práce Cíl práce 3 CÍL PRÁCE Cílem této disertační práce byl vývoj a validace HPLC a SIC metod pro stanovení účinných látek ve farmaceutických přípravcích. Některé metody byly určeny pro sledování stability léčiv a analyzovány byly i degradační produkty. Při optimalizaci metod byla práce zaměřena na výběr vhodné chromatografické kolony, složení mobilní fáze, jejího ph, vnitřního standardu, rychlosti průtoku mobilní fáze a objem vzorku. U metod SIC byl navíc optimalizován řídící program. Po optimalizaci jednotlivých metod byly tyto vždy validovány a tím ověřena vhodnost, správnost a spolehlivost nově vyvinutých metod. Cílem práce nebyl jen vývoj nových (HPLC a SIC) metod, ale také jejich vzájemné porovnání, ověření výhod a nevýhod SIC techniky oproti HPLC. Byly studovány a kriticky zhodnoceny možnosti přenosu vyvinuté a optimalizované HPLC metody na SIC techniku. Předmětem mé práce bylo otestovat možnost zapojení monolitických kolon do HPLC a SIC systému a aplikovat tyto metody v oblasti farmaceutických analýz a také porovnat separační účinnost konvenční částicové kolony a monolitických kolon a otestovat podmínky převodu metody z částicové na monolitickou kolonu. Cílenou snahou bylo vyvinout metodu sekvenční injekční chromatografie s gradientovou elucí a prakticky ji aplikovat na stanovení vybraného léčivého přípravku. 13

14 Disertační práce Teoretická část 4 TEORETICKÁ ČÁST 14

15 Disertační práce Principy chromatografie 4.1 Principy chromatografie Definice, princip a rozdělení chromatografických metod Chromatografie je separační a současně analytická fyzikálně chemická metoda, sloužící k oddělení analyzovaných složek ze směsi. Svým určením je to především metoda kvalitativní a kvantitativní analýzy vzorku [1, 2]. Při chromatografickém procesu se mnohonásobně ustavuje rovnováha součástí analyzované směsi mezi dvěma vzájemně nemísitelnými fázemi. Jedna nepohyblivá stacionární fáze má schopnost různou měrou zadržovat jednotlivé součásti analyzované směsi, druhá pohyblivá mobilní fáze pak vymývá (eluuje) jednotlivé součásti směsi z nepohyblivé fáze a odnáší je ve směru toku různou rychlostí, čímž dojde k jejich oddělení [3]. Chromatografických metod je velké množství. Vzhledem ke značné různorodosti se dělí podle několika hledisek [1]: 1) Podle skupenství mobilní fáze (LC, GC) 2) Podle uspořádání stacionární fáze Kolonová chromatografie Plošné techniky (PC, TLC) 3) Podle povahy děje, který převládá při separaci (rozdělovací, adsorpční, iontově-výměnná chromatografie, gelová a afinitní chromatografie) Vybrané pojmy a charakteristiky chromatografického procesu Chromatogram Záznam odezvy chromatografického detektoru na čase se nazývá chromatogram. Zóny separovaných látek procházející detektorem jsou zaznamenávány jako koncentrační profily (chromatografické píky). V ideálním případě je chromatografický pík symetrický a má Gaussovský tvar [4]. 15

16 Disertační práce Principy chromatografie Pokud je zkoumaná směs dobře rozdělena, pak každý pík na chromatogramu odpovídá jedné ze složek směsi. Poloha píku na ose x uváděná pomocí retenčního času (určeno podle polohy vrcholu píku) určuje, o jakou látku se jedná (kvalitativní analýza), plocha píku (nebo jeho výška) určuje koncentraci látky ve směsi (kvantitativní analýza) [2]. Obr. 1: Chromatogram [7] Retenční charakteristiky a distribuční konstanta Molekula složky stráví v koloně určitou dobu, která se nazývá retenční čas t R. Tato doba se dělí na čas, který molekula setrvává v mobilní fázi - mrtvý retenční čas t M a čas strávený ve stacionární fázi - redukovaný retenční čas t R. Tyto časy splňují retenční rovnici: t = t + t R M R U inertní látky, která se nepoutá na stacionární fázi, je její retenční čas totožný s mrtvým retenčním časem. Retenční charakteristiky se používají ke kvalitativní analýze, protože v daných podmínkách můžeme konkrétní složku charakterizovat jejím retenčním nebo redukovaným retenčním časem. Během separace dochází v koloně k neustálému vytváření a porušování fázové rovnováhy mezi mobilní a stacionární fází. Děj probíhá nepřetržitě. 16

17 Disertační práce Principy chromatografie Složka má při ustavení rovnováhy ve stacionární fázi koncentraci c s a v mobilní fázi c m. Poměr mezi těmito koncentracemi je v ideálním případě konstantní a nazývá se distribuční konstanta K D, protože charakterizuje distribuci rozdělení složky mezi obě fáze: c K D = c S M Čím je hodnota distribuční konstanty vyšší, tím je složka více vázána stacionární fází a déle zadržována v koloně. Pro oddělení dvou složek je nutné, aby se od sebe lišily svými distribučními konstantami. Distribuční konstanta závisí na teplotě. Zvolíme-li konstantní teplotu, pak se závislost koncentrace složky ve stacionární fázi na koncentraci složky v mobilní fázi nazývá izoterma [5]. Tvar izotermy má úzký vztah ke tvaru píku. V případě lineární izotermy je pík symetrický. Jinak bývá nesymetricky natažen na jednu stranu, buď v přední nebo v zadní části píku. Hovoříme o píku s rozmytou přední částí nebo píku chvostujícím (obr. 2). Obr. 2: Souvislost tvaru píku s tvarem izotermy (c s a c m koncentrace složky ve stacionární a mobilní fázi, R signál detektoru, t čas [5] 17

18 Disertační práce Principy chromatografie Účinnost separace v chromatografii Účinností kolony charakterizujeme její schopnost separovat složky směsi. Čím je kolona účinnější, tím lépe dokáže od sebe složky směsi oddělit. Mírou účinnosti kolony je počet teoretických pater kolony N. Teoretické patro je pomyslná část kolony, ve které dochází k ustavení rovnováhy mezi mobilní a stacionární fází. Délka této části kolony se nazývá výškový ekvivalent teoretického patra H. Proto kolona o délce L má výškový ekvivalent teoretického patra [5]: H = L N Kolona je tím účinnější, čím více má teoretických pater a čím menší má výškový ekvivalent teoretického patra. Počet teoretických pater N lze určit z chromatogramu z šířky píku v základně w nebo z šířky píku v polovině jeho výšky w 1/2 a retenčního času t R podle vztahů [5]: 16 t = w N R 2 5,54 t = w1/ 2 N R 2 Podle van Deemterovy teorie vedou k rozšiřování zóny v koloně a tím k růstu výškového ekvivalentu teoretického patra děje, které probíhají v koloně během separace. Sleduje se vliv lineární rychlosti mobilní fáze u na účinnost separace. Lineární rychlost mobilní fáze je v podstatě rychlost jejího pohybu v koloně a lze ji vypočítat z délky kolony L a mrtvého retenčního času t M [5]: u = L t M Turbulentní (vířivá) difúze - H A Tento příspěvek souvisí s nehomogenitou stacionární fáze. Mobilní fáze proudí v širších kanálcích rychleji než v kanálcích užších [4]. Proto se dvě porovnávané molekuly za určitou dobu dostanou do jiné vzdálenosti. Tím se zóna složky v koloně 18

19 Disertační práce Principy chromatografie rozšiřuje [5]. Příspěvek vířivé difúze k rozmytí zón je závislý pouze na rozměrech částic a pravidelnosti uspořádání náplně kolony [4]. Žádný vliv na tento děj nemá lineární rychlost mobilní fáze [5]. Příspěvek je možno vyjádřit výrazem: H = A = 2 λ A d p A konstantní člen van Deemterovy rovnice λ koeficient nerovnoměrného plnění chromatografické kolony d p velikost částic náplně kolony [6] U náplňových kolon není možné člen A van Deemterovy rovnice eliminovat, naopak u kapilárních kolon tento člen odpadá [4]. Molekulární difúze - H B Molekuly látky difundují z místa s vyšší koncentrací do místa s koncentrací nižší. Molekuly se takto pohybují ve směru toku mobilní fáze i proti toku mobilní fáze. Molekulová difúze je popsána podle Fickových zákonů [4]. Příspěvek narůstá s časem, který složka stráví v koloně, tedy se uplatňuje zejména při malých průtokových rychlostech. Proto je nepřímo úměrný lineární rychlosti mobilní fáze [4, 5]. Příspěvek molekulové difúze k rozmytí zón je dán vztahem: H B = B u 2γ D = M u γ korekční faktor charakterizující tvar kanálků v náplni kolony D m difúzní koeficient u lineární průtoková rychlost mobilní fáze [6] Při hodnotách průtoku mobilní fáze běžných v kapalinové chromatografii je příspěvek molekulové difúze zanedbatelný [4]. 19

20 Disertační práce Principy chromatografie Odpor proti převodu hmoty - H C Molekula složky proniká do různé hloubky stacionární fáze. Ta molekula, která do ní pronikne hlouběji, se v ní zdrží déle než ta, která ulpí na jejím povrchu. Zóna se tak rozšiřuje. Příspěvek H C je přímo úměrný lineární rychlosti mobilní fáze, protože rychlý pohyb mobilní fáze způsobí větší vzájemné vzdálení molekul. V kapalinové chromatografii se uplatňuje tento odpor i v mobilní fázi, která je podstatně viskóznější než plyn [5]. Příspěvek odporu proti převodu hmoty k rozmytí zón lze popsat vztahem: H c = ( c + c ) u M S c M konstanta závislá na difúzním koeficientu analytu v mobilní fázi c S konstanta závislá na difúzním koeficientu analytu ve stacionární fázi u lineární průtoková rychlost mobilní fáze [4] Výškový ekvivalent teoretického patra lze vyjádřit jako součet dílčích příspěvků: H = H + H + H A B c H výška teoretického patra H A příspěvek turbulentní difúze k výšce teoretického patra H B příspěvek molekulární difúze k výšce teoretického patra H C příspěvek odporu proti převodu hmoty k výšce teoretického patra [4] 20

21 Disertační práce Principy chromatografie Obr. 3: 1. Vířivá difúze, 2. Podélná molekulární difúze, 3. Odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi, 4. Odpor proti přenosu hmoty v mobilní fázi [7] Vzhledem ke vztahu jednotlivých příspěvků k lineární průtokové rychlosti mobilní fáze se tato rovnice používá také ve tvaru: H = A + B + Cu u kde A, B a C jsou konstanty, které charakterizují kolonu a nezávisí na lineární rychlosti u [5]. Grafickým znázorněním závislosti výškového ekvivalentu teoretického patra na lineární rychlosti mobilní fáze je křivka, v jejímž minimu najdeme optimální lineární rychlost, při které daná kolona vykazuje největší účinnost a tedy minimálně rozšiřuje zóny analytů. Pracovat budeme s takovou rychlostí mobilní fáze, při které je separace dostatečně účinná a ještě dosti rychlá. Proto volíme rychlost poněkud vyšší než odpovídá přesně minimu křivky bez výrazné ztráty na účinnosti separace [5, 7]. 21

22 Disertační práce Principy chromatografie Obr. 4: Závislost účinnosti kolony na lineární rychlosti mobilní fáze podle van Deemterovy rovnice [8] Rozlišení Hlavním cílem chromatografické metody je dosáhnout dobrého rozdělení analyzovaných látek v přijatelném čase. Rozdělení látek může být dokonalé nebo nedokonalé a je vhodné tento stupeň kvantitativně vyjádřit. Rozlišení je pak nejpoužívanější vyjádření míry kvality separace dvou sousedních elučních křivek [9]. Obecně je pak rozlišení definováno: R 1,2 2 = ( t t ) R2 R1 w + w 1 2 t R1, t R2... retenční časy složek w 1, w 2... šířka píků na základní linii [7, 9] Rozlišení se tedy udává jako rozdíl retenčních časů, dělený průměrnou hodnotu šířky elučních křivek. Rozlišení je veličina bezrozměrná a větší hodnota R znamená lepší separaci, při volbě separačních podmínek nejde však o dosažení co největšího rozlišení, ale o dosažení právě potřebného rozlišení [9]. 22

23 Disertační práce Principy chromatografie Rozlišení je ovlivněno třemi faktory selektivity (separační), kapacitní (retenční) a účinnosti [9]. Vztah mezi rozlišením, selektivitou, kapacitou a účinností je dán rovnicí: F R úč 1,2 = Fsel + Fkap + [4] 4 R = N α 1 k 4 α 1+ k N... počet teoretických pater α... separační faktor (selektivita) k... retenční faktor (kapacita) [7, 10] Separační faktor (selektivita): k = k 2 R2 D2 α [7] 1 t = t R1 K = K D1 Parametr charakterizující vzájemnou retenci dvou analytů [11]. Retenční faktor (kapacita): k ( t t ) t = R M = R [7] t M t M Udává kolikrát více času stráví analyt ve stacionární fázi než ve fázi mobilní, tj. v kolika násobku mrtvého času analyt eluuje [11]. Faktor účinnosti Kinetický faktor související s počtem teoretických pater kolony [4]. 23

24 Disertační práce Principy chromatografie Faktor symetrie se ze vzorce: Faktor symetrie píku je míra souměrnosti chromatografického píku a vypočítá w0,05 A S = 2d w 0,05... šířka píku v jedné dvacetině jeho výšky d... vzdálenost mezi kolmicí spuštěnou z vrcholu píku a vzestupnou částí píku v jedné dvacetině jeho výšky [11, 12] Hodnota faktoru symetrie 1,0 značí úplnou (ideální) symetrii píku. Hodnota vyšší než 1,0 značí asymetrické píky v sestupné části ( tailing ), naopak hodnota nižší než 1,0 značí asymetrické píky ve vzestupné části ( fronting ) [11, 12]. 24

25 Disertační práce Kapalinová chromatografie 4.2 Kapalinová chromatografie Definice kapalinové chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je nejčastěji používaná separační metoda založená na rozdílu v distribuci látek mezi dvě nemísitelné fáze, z nichž mobilní fází je kapalina, která prostupuje stacionární fází naplněnou do kolony [12]. Vyniká vysokou účinností, dobrou opakovatelností a robustností. Tato metoda je vhodná pro dělení netěkavých a polárních látek, jejichž analýza příbuznou plynovou chromatografií bývá často obtížná [13]. K účinné separaci je třeba použít dostatečně malých zrníček sorbentu, která kladou prostupující kapalině značný odpor, proto je nutné pracovat při vysokém tlaku [14] Dělení HPLC a) dle typu stacionární fáze [6, 12] o Chromatografie s normální fází (NP) Jako stacionární fáze se používají látky polární povahy, např. silikagel, oxid hlinitý nebo porézní grafit. Jako mobilní fáze se pak používají nepolární rozpouštědla (n-hexan, chloroform, tetrahydrofuran a další). o Chromatografie s reverzní fází (RP) Jako stacionární fáze se používají nepolární látky. Jsou to různé druhy chemicky modifikovaných nosičů připravených z polymerů, silikagelu nebo porézního grafitu. Běžně užívané vázané fáze jsou nejčastěji nosiče modifikované řetězci C8 nebo C18. Mobilní fáze je polární a obvykle se používají vodné mobilní fáze, jak s organickým rozpouštědlem (acetonitril, nebo metanol), tak bez něj. b) dle typu eluce [6, 12] o Izokratická eluce Používá se pouze jedna mobilní fáze s konstantním složením. Eluční síla mobilní fáze je po celou dobu separace stejná. Pokud analyzujeme velké množství látek s různou polaritou, může analýza trvat velmi dlouhou dobu. 25

26 Disertační práce Kapalinová chromatografie o Gradientová eluce Složení a tedy i eluční síla mobilní fáze se mění podle předem daného programu. Využívá se k separaci látek rozdílné afinity ke stacionární fázi, kdy je potřeba zachovat přiměřeně krátkou dobu analýzy. c) dle typu separačního mechanismu [1] o Rozdělovací chromatografie o Adsorpční chromatografie o Iontově-výměnná chromatografie o Gelová chromatografie o Afinitní chromatografie Instrumentální vybavení v kapalinové chromatografii Přístroj pro kapalinovou chromatografii se skládá z čerpacího systému (vysokotlaká pumpa), dávkovacího zařízení, chromatografické kolony (může být použit i regulátor teploty kolony), detektoru a zařízení na zpracování dat (počítač). Mobilní fáze je do systému přiváděna z jednoho nebo více zásobníků a protéká obvykle konstantní rychlostí kolonou a poté detektorem [12]. Aparaturou protéká mobilní fáze, která je ze zásobních lahví vedena přes vysokotlakou pumpu do kolony, z ní do detektoru a dále pak do odpadu. Dávkovačem je do proudu mobilní fáze nadávkován vzorek (řádově jednotky či desítky µl). Vzorek je unášen mobilní fází do kolony, kde dochází k separaci jednotlivých složek. Výstup z kolony vede do detektoru, kde jsou jednotlivé složky detekovány. Signál z detektoru je zaznamenáván pomocí počítače [2]. 26

27 Disertační práce Kapalinová chromatografie Obr. 5: Schéma kapalinového chromatografu [7] Jednotlivé součásti HPLC systému: Vysokotlaká pumpa Vysokotlaká bezpulzní pumpa je velmi důležitou součástí HPLC aparatury. Kolony pro HPLC jsou plněny mikročásticemi, které při průchodu mobilní fáze kladou značný odpor. Z toho důvodu musí být mobilní fáze pod vysokým tlakem (až desítky MPa), aby mohla projít přes kolonu [2]. Průtok musí být konstantní, reprodukovatelný a bezpulzní. Jeho hodnoty se pohybují kolem 1 ml min -1 pro běžné částicové kolony [10]. Dávkovací zařízení Vzorek je dávkován do proudu mobilní fáze pomocí dávkovací smyčky nebo pomocí automatického dávkovače (autosampleru) [2]. Kapalné vzorky lze aplikovat přímo. Pevné vzorky musí být rozpuštěny ve vhodném rozpouštědle. Je vhodné před nadávkováním vzorku do systému z něj odstranit případné částice. K odstranění se používá filtrace nebo odstřeďování [6]. Chromatografické kolony Jedná se o skleněné či nerezové trubice o délce cm a vnitřním průměru 3-4,6 mm naplněné sorbentem o průměru zrn 3-10 µm, který je držen v koloně 27

28 Disertační práce Stacionární fáze pomocí frit. O schopnosti kolony separovat určité složky směsi rozhoduje zejména typ stacionární fáze [2, 7]. Detektory V HPLC je dostupná řada různých detektorů, které se liší principem funkce, konstrukcí, selektivitou, citlivostí, mezí detekce a lineárním dynamickým rozsahem. Metoda HPLC využívá tyto typy detektorů: spektrofotometrický detektor (UV-VIS), fluorescenční detektor, hmotnostní spektrometr, refraktometrický detektor a další. Volba detektoru opět závisí na konkrétní aplikaci. Často používanými detektory jsou detektor spektrofotometrický (UV-VIS) a fluorescenční. Podmínkou použití těchto detektorů je, aby daný analyt absorboval záření určité vlnové délky (UV-VIS detekce) anebo emitoval fluorescenční záření (fluorescenční detekce). Pokud analyt sám o sobě neabsorbuje záření v oblasti UV-VIS nebo neemituje fluorescenční záření, je použití těchto detektorů podmíněno derivatizací vzorku (vzorek je chemickou reakcí převeden na sloučeniny, které mají potřebné vlastnosti - absorpce UV-VIS, fluorescence) [2] Stacionární fáze Stacionární fáze je v chromatografickém systému ta fáze, která je nepohyblivá, může to být pevná látka nebo film kapaliny zakotvený na pevné látce [2]. Konvenční stacionární fáze jsou stacionární fáze částicové. Částice mohou mít různý tvar, velikost i strukturu. Tyto vlastnosti, spolu s délkou a vnitřním průměrem kolony, ovlivňují separační vlastnosti. V dnešní době se používají výhradně sférické částice, které vykazují proti starším částicím s nepravidelným tvarem vyšší účinnost. Velikost původně vyráběných částic byla několik desítek mikrometrů. Při plnění kolon vznikal velký prostor mezi částicemi, a tím docházelo ke snížení účinnosti separace vlivem zvýšené turbulentní difúze a zvýšeného odporu proti převodu hmoty. Vývoj nových technologií umožnil přípravu částic s průměrem pouhých několika mikrometrů. Tyto částice mají vyšší účinnost a kapacitu, ale také způsobují vyšší tlak na koloně. Nejčastěji používaný průměr částic je dnes 3 10 µm. Částice mohou být neporézní, mohou mít porézní povrchovou vrstvu, nebo být porézní [15]. 28

29 Disertační práce Stacionární fáze Jednotlivé druhy stacionárních fází: Stacionární fáze na bázi silikagelu Silikagel je obecně nejrozšířenější polární sorbent [16]. Pro účely kapalinové chromatografie má nejčastěji porézní amorfní formu o složení SiO 2. x H 2 O. Voda je chemicky vázána v nestechiometrickém množství za vzniku silanolových skupin Si-OH. Nejčastější velikost částeček náplně je 3-5 µm. Silanolové skupiny udělují povrchu silikagelu polární charakter a jsou pro svoji reaktivitu využívány k přípravě kovalentně vázaných fází. Silanolové skupiny a jejich typ mají velký vliv na chromatografické chování silikagelu [17]. Povrch silikagelu je slabě kyselý, takže více zadržuje bazické látky než látky kyselé a neutrální a může tak působit chvostování jejich píků. Tomu lze zabránit přídavkem slabé organické báze (většinou aminového typu triethylamin) do mobilní fáze, ale je nutné dbát, aby ph mobilní fáze nepřesáhlo ph 8, kdy dochází k rozpouštění silikagelu. Protože povrch silikagelu je kyselý, může vystupovat jako iontoměnič [16] Stacionární fáze pro normální chromatografii V kapalinové chromatografii s normálními fázemi se využívá jako stacionární fáze nemodifikovaný silikagel nebo polárními skupinami chemicky modifikovaný silikagel, např. se skupinami aminopropylovými, kyanopropylovými, diolovými nebo pentafluorfenylpropylovými v kombinaci s nepolární mobilní fází [12, 16]. Retence látek kyselé povahy na aminopropylu je daleko větší než na silikagelu. Nevýhodou aminopropylu je jeho vysoká reaktivita a může reagovat s aldehydy nebo ketony za vzniku iminů, nebo může být funkční skupina NH 2 oxidována např. peroxidy. V přítomnosti vody dochází k částečné hydrolýze NH 2 skupiny a výsledkem je vysoce alkalické prostředí v pórech, které se může pohybovat až kolem hodnoty ph 10 a vyšší a dochází k rozpouštění silikagelu. Proto je nutné se vyhnout promývání aminopropylové fáze vodou [16]. Separace na pentafluorfenylpropylové fázi je obdobná jako na oktadecylové fázi, pouze je nutné používat mobilní fáze o silnější eluční síle. Stacionární fáze 29

30 Disertační práce Stacionární fáze vykazuje vyšší selektivitu vůči aromatickým látkám. Na těchto fázích je možné používat 100 % vodné mobilní fáze bez zhroucení stacionární fáze v rozmezí ph 2,0-8,0 do teplot až 70 C [16] Stacionární fáze pro reverzní chromatografii Reverzní fáze na bázi silikagelu jsou dnes nejběžněji připravovány reakcí vhodného monofunkčního organosilanu (např. ethoxydi(methyl)oktadecylsilanu) se silikagelem. Kovalentně vázaný alifatický řetězec, kterým je nejčastěji oktadecylová nebo oktylová skupina (dále také fenylová či alkylfenylová skupina), uděluje vzniklé stacionární fázi hydrofobní charakter. Je ovšem prokázáno, že silanizace vede ke zreagování jen asi poloviny všech přítomných silanolových skupin na povrchu silikagelu. Za jistých okolností se zbytkové silanoly mohou spolupodílet na retenci analytů. Tato obvykle nežádoucí interakce je často doprovázena snížením separační účinnosti a chvostováním píků. Uvedený efekt se projevuje především při dělení bazických látek, které mohou být protonizovány, což vede k jejich zadržování na deprotonizovaných silanolech elektrostatickou interakcí. Jednoduché řešení tohoto problému, tj. snížení protonizace báze zvýšením ph pufru, totiž není možné vzhledem k rozpustnosti silikagelu při vyšším ph [16, 17]. Jednou z velkých slabin reverzních fází na bázi silikagelu je jejich omezená stabilita v bazickém a silně kyselém prostředí. Typická C18 fáze je stabilní jen v úzkém rozsahu ph, asi 3 9. Jakmile je ph mobilní fáze nižší než 3, dochází ke kysele katalyzované hydrolýze siloxanové vazby mezi silikagelem a organosilanem. Tento proces vede ke kontinuální ztrátě vázané fáze a ve svém důsledku ke ztrátě chromatografické retence pro hydrofobní analyty. Při hodnotě ph nad 9 nastává naopak rozpouštění silikagelové matrice. Rozpouštění silikagelu je doprovázeno poklesem účinnosti, vznikem volného prostoru v koloně, nakonec dojde k úplné destrukci stacionární fáze. Dalším důležitým faktorem ovlivňujícím stabilitu stacionární fáze je teplota. Teplotní stabilita reverzních fází na bázi silikagelu bývá uváděna v rozmezí 5 C C. Obecně ovšem platí, že zvyšování teploty vždy vede k rychlejší degradaci sorbentu, což se zejména projeví při extrémních hodnotách ph. Nejjednodušším řešením problému omezené stability sorbentu je striktní udržování 30

31 Disertační práce Stacionární fáze ph mobilních fází v rozmezí od 3 do 7-9, což však zásadně omezuje možnost optimalizace složení mobilní fáze. Eliminace sekundárních interakcí vede ke zvýšení separační účinnosti a zlepšení symetrie píků bazických látek. Zlepšení stability v kyselém prostředí bylo docíleno zvětšením velikosti a hydrofobicity organosilanu vázaného na silikagel. C18 fáze je tedy z tohoto pohledu stabilnější než C8. Předpokládá se, že objemný alkyl lépe chrání siloxanovou vazbu před hydrolýzou. Jiné přístupy vedoucí ke zvýšené odolnosti sorbentu vůči silně kyselému prostředí jsou založeny na vzniku většího počtu kovalentních vazeb mezi silikagelem a modifikujícím silanem. Komerčně nejúspěšnější je zatím použití tzv. stericky chráněných silanů. Stericky chráněné silany jsou tvořeny jedním alkylem (C8, C18) nebo fenylem, dvěma objemnými isopropylovými nebo isobutylovými skupinami a jednou reaktivní funkční skupinou (Cl), vázanými na křemíkový atom. Vzniklé fáze jsou stabilní i v agresivních podmínkách. Pouhé prodloužení alkylových modifikujících řetězců vede ke zlepšené odolnosti v alkalickém prostředí pravděpodobně v důsledku zlepšeného stínění silikagelové matrice. Jinou možností jsou dodatečné modifikující reakce ( endcapping ). Technika je založena na modifikaci povrchu organosilanem s příslušně dlouhou hydrofobní skupinou a následné dodatečné modifikaci povrchu reakcí např. s trimethylchlorsilanem nebo hexamethyldisilazanem. Malé rozměry endkapujících činidel jim umožní lépe proniknout k povrchu silikagelu. Proces vede k dramatickému zlepšení odolnosti fáze vůči alkalickému prostředí [17] Hybridní stacionární fáze Hybridní anorganicko-organické stacionární fáze kombinují nejlepší vlastnosti silikagelu, tj. vysokou účinnost a vynikající mechanickou stabilitu, s nejlepšími vlastnostmi polymerních sorbentů, tj. mimořádnou ph stabilitou a sníženým efektem reziduálních silanolů. V roce 1999 byla na trh uvedena první generace hybridních fází pod názvem XTerra firmou Waters. Syntéza je založena na reakci dvou organosilanů, jeden z nich tvoří silikagelovou matrici a druhý do vznikající matrice vnáší methylsiloxanové jednotky [17]. 31

32 Disertační práce Stacionární fáze Pro potřeby RP-HPLC je povrch následně kovalentně modifikován buď trifunkčními silany za vzniku fází, optimalizovaných pro maximální chemickou stabilitu a určených pro LC-MS, a nebo monofunkčními silany za vzniku fází RP8 a RP18, s vloženými karbamáty, optimalizovaných pro minimální chvostování bazických látek. Vzhledem k tomu, že na povrchu hybridu je ve srovnání s klasickými silikagelovými materiály asi jen třetina silanolových skupin, chvostování bazických látek je na hybridních fázích výrazně omezeno a symetrie píků je daleko lepší. Hybridy vykazují velkou odolnost vůči vysoké hodnotě ph mobilní fáze. Hybridní reverzní fáze byly úspěšně testovány v rozmezí ph 1,2 až 11,5. Další důležitou vlastností hybridních sorbentů je jejich zlepšená odolnost vůči zvýšené teplotě mobilní fáze. Možnost chromatografie při teplotách kolem 60 C přináší řadu výhod: snížení viskozity mobilní fáze, a tím tlaku na koloně, zlepšení separační účinnosti a zmenšení závislosti účinnosti kolony na rychlosti průtoku [17]. V roce 2006 byl úspěšně dokončen vývoj druhé generace hybridních sorbentů a byl uveden na trh firmou Waters pod označením XBridge. Tyto kolony jsou připravovány pomocí tzv. BEH technologie (Bridge Ethylene Hybride) a obsahují ve své struktuře ethylénové můstky, kterými je část siloxanů přemostěná. Ve srovnání se sorbenty XTerra byla dále podstatně zvýšena chemická odolnost v silně bazickém prostředí a separační účinnost [17, 18]. Do skupiny hybridních kolon patří také kolony Gemini od firmy Phenomenex (USA). Jsou vyrobené pomocí Twin technologie kombinující ty nejlepší vlastnosti silikagelu a polymerních nosičů, nabízející vysokou životnost a účinnost dělení v rozsahu ph od 1 do 12. Při produkci kolon Gemini projde v posledním stádiu výroby částice silikagelu speciální chemickou procedurou, jejímž výsledkem je unikátní povrchová organokřemičitá vrstva vytvářející novou kompozitní částici. Částice si však zachovává svoji vnitřní, celým procesem nedotčenou, strukturu čistého silikagelu a tím i mechanickou pevnost, rigiditu a především i vynikající dělící účinnost [19, 20] Stacionární fáze na bázi oxidu zirkoničitého, hlinitého a titaničitého Omezená chemická odolnost silikagelu v alkalickém prostředí vedla k vývoji alternativních HPLC kolon na bázi oxidů kovů (oxidu titaničitého, oxidu hlinitého a zejména oxidu zirkoničitého) [16, 17]. Ukázalo se, že tyto oxidy jsou podstatně 32

33 Disertační práce Stacionární fáze stabilnější v silně alkalickém prostředí než silikagel. Navíc jsou tyto nové materiály v bazickém prostředí stabilní i při zvýšené teplotě, což neplatí pro silikagelové fáze. Zvýšená stabilita a pracovní rozsah ph přináší řadu výhod. Mechanická odolnost vůči vysokému tlaku je u všech zmíněných oxidů velmi dobrá, plně srovnatelná nebo lepší než v případě silikagelu [17]. Nejčastěji jsou oxidy kovů modifikovány polybutadienem (PBD), který má pro neionizovatelné látky podobnou separační selektivitu jako silikagelové C8 a C18 fáze, nebo polystyrenem (PS), který je svou selektivitou spíše blízký fenylové modifikaci silikagelu. PBD sorbenty vykazují velmi dobrou ph stabilitu, pro oxid hliníku v rozmezí ph 3 12, pro oxid zirkonia v rozmezí ph Kromě toho také tepelná odolnost zvláště zirkoniových PBD fází je mimořádná (až do 200 C). Velmi dobrou ph a tepelnou stabilitu mají i kovové oxidy pokryté vrstvou polystyrenu, které mohou být provozovány v rozmezí ph nejméně 1 13 a při teplotách až do 160 C. Kompatibilita sorbentů s vysokými teplotami nabízí mnoho zajímavých aplikačních výhod. Řada z nich již byla výše zmíněna, zde lze navíc připomenout možné využití samotné vody jako mobilní fáze. Je totiž známo, že při teplotě 200 C má voda podobnou polaritu jako methanol při laboratorní teplotě. Tímto způsobem lze dosáhnout snížení spotřeby organických rozpouštědel [17]. Oxid zirkoničitý lze připravit ve formě monodisperzních porézních kulových částeček. Takto připravené kolony vykazují srovnatelnou účinnost s kolonami silikagelovými. Nemodifikovaný oxid zirkoničitý se používá v systému s normálními fázemi (ZirChrom -PHASE). Častější je použití oxidu zirkoničitého v reverzním módu. Povrch oxidu zirkoničitého se modifikuje tenkou vrstvou polybutadienu (ZirChrom - PBD, Discovery Zr-PBD), polystyrenu (ZirChrom -PS, Discovery Zr-PS) nebo pyrolyticky vyloučeného uhlíku (ZirChrom -CARB, Discovery Zr-Carbon), které lze případně modifikovat ligandem C18 (Discovery Zr-CarbonC18) [16, 21, 22] Stacionární fáze pro HILIC HILIC může být chápána jako rozšířená chromatografie na normální fázi s vodnými mobilními fázemi. HILIC je separační technika vhodná pro polární a hydrofilní látky. Retence se zvyšuje s polaritou analytu a snižuje se zvýšením polarity mobilní fáze (klesá s rostoucím podílem vody nebo pufru) [16]. 33

34 Disertační práce Stacionární fáze Mobilní fáze je naopak obdobná mobilním fázím používaných v reverzní chromatografii a používá se voda nebo pufr s organickým rozpouštědlem [16]. Typické HILIC aplikace používají acetonitril, který má malou viskozitu a tím dostáváme vysokou účinnost separace a nízký tlak na chromatografické koloně. Obvyklá koncentrace acetonitrilu se pohybuje v rozmezí 50-90% [16, 23]. Stacionární fáze je velmi hydrofilní: silikagel, polární vázané fáze, polární polymerní fáze a iontoměniče. Hydrofilnější stacionární fáze více poutá vodu z mobilní fáze a retence analytu se zvyšuje. Retenční mechanismus se může vysvětlit jako rozdělování analytů mezi na vodu bohatší stacionární fází a na vodu chudší mobilní fází. Jako druhý mechanismus, který se uplatňuje, je mechanismus iontové výměny, neboť uvedené stacionární fáze mají vlastnosti iontoměniče. Klasickým příkladem separace technikou HILIC je separace sacharidů, aminokyselin, peptidů a polárních organických kyselin a zásad [16]. Unikátní technologie společnosti Merck ZIC -HILIC používá jako stacionární fázi porézní silikagel s kovalentně navázanou vysoce polární zwitterionickou funkční skupinou, která zaručuje vyšší stabilitu a robustnější HILIC separaci. Kolony ZIC -philic jsou založeny na polymerních částicích o velikosti 5 µm, navázaných na stejnou zwitterionickou funkční skupinu a tudíž nabízejí srovnatelnou selektivitu [24] Polymerní stacionární fáze Hlavní a podstatnou nevýhodou chemicky modifikovaného silikagelu je jeho rozpustnost v alkalické oblasti ph, ale mnoho chromatografických systémů využívá alkalickou oblast ph zejména pro separaci bazických látek. Tomuto požadavku vyhovují polymerní stacionární fáze, které jsou většinou použitelné v celém rozsahu ph. Nevýhodou polymerních fází je, že částečky obsahují mikropóry o velikosti asi 1 nm, což zabraňuje přenosu hmoty zejména pro malé molekuly. Polymerní stacionární fáze jsou dále omezeny maximálním pracovním tlakem na koloně a to 20 MPa, i když 10 MPa je pro většinu aplikací HPLC dostačující. Stabilita polymerních stacionárních fází je omezena stabilitou funkčních skupin polymeru pro methylakrylát je limitující stabilita esterové skupiny, pro akrylamid je limitující stabilita amidové skupiny. I když současně připravované polymerní fáze jsou 34

35 Disertační práce Monolitické stacionární fáze dostatečně mechanicky i chemicky stálé, pro jejich nižší účinnost dosud nevytlačily z použití chemicky vázané nepolární stacionární fáze [16] Monolitické stacionární fáze Na rozdíl od konvenčních stacionárních fází, které se skládají z jednotlivých částic sorbentu o definované velikosti, monolitické HPLC kolony tvoří jediný kus pórovitého materiálu, který zcela zaplňuje vnitřek separační kolony. Proti typickým kolonám plněným drobnými částicemi, monolity neobsahují mezičásticové prostory, kterými se v klasických kolonách uskutečňuje valná část průtoku. Proto musí veškerá mobilní fáze nutně protékat póry monolitu [16, 25, 26]. Monolitické kolony mají dva typy pórů: a) velké póry (makropóry) zajišťují rychlý konvektivní tok mobilní fáze skrz monolit a významně zrychlují přenos hmoty mezi mobilní a stacionární fází, b) středně velké póry (mesopóry) poskytují monolitu dostatečně veliký povrch, a tím vysokou separační kapacitu. Tato struktura umožňuje provozování monolitů při značně vysokých rychlostech mobilních fází bez přílišného zvýšení tlaku a zároveň bez ztráty separační účinnosti, a to i pro separované makromolekuly (bílkoviny, syntetické polymery) [16, 26]. Během minulého desetiletí byla zveřejněna celá řada originálních přístupů zahrnujících jak přípravu systémů vyznačujících se pouze některými prvky charakteristickými pro monolity (jako je snížený objem mezičásticových prostorů), tak i technologie skutečně monolitické. Do první skupiny patří např. kazety naplněné vrstvenými listy modifikované celulosy či srolované tkaniny. Monolity druhého typu jsou reprezentovány stlačenými hydrofilními gely, polymerními makroporézními disky, kolonami a trubicemi, jakož i monolity na bázi siliky, což je dnes již vžitý termín pro materiály na bázi oxidu křemičitého. Některé z těchto materiálů již doznaly i praktického uplatnění [25] Makroporézní polymerní disky Jedním z prvních chromatograficky využitelných formátů monolitických médií byly monolitické disky (monolitické membrány). Tyto materiály různého chemického složení a v mnoha geometriích byly poprvé úspěšně připraveny až v polovině 80. let, především za účelem rychlých separací bílkovin. Brzy se potvrdilo, že pro dosažení 35

36 Disertační práce Monolitické stacionární fáze dobrého dělení stačí jen poměrně tenká membrána, a tím se vytvořil široký prostor pro další vývoj konceptu monolitických médií ve formě disku [17]. Příprava monolitů je jednoduchá. Získávají se radikálovou polymerizací směsi, jež obsahuje monovinylový monomer s funkční či reaktivní skupinou jako je butyl- či glycidyl-methakrylát, síťovadlo, typický monomer se dvěma či více dvojnými vazbami např. divinylbenzen a ethylendimethakrylát, iniciátor, a porogenní rozpouštědlo. Tato směs se naplní do formy, kde po zahřátí polymerizuje [25]. Nelze-li získat disk s požadovanými funkčními skupinami přímou polymerizací odpovídajícího monomeru, mohou se v následujícím stupni funkční skupiny vzniklého polymeru modifikovat [27, 28]. V současnosti jsou již monolitické disky komerčně dostupné, konkrétně např. od firmy CIM (BIA Separations). Disky o tloušťce do 3 mm jsou při vlastní separaci umístěny ve speciálním držáku, kam může být vloženo i několik různých membrán lišících se chemickou modifikací, a tak lze provádět vícerozměrné separace [17] Makroporézní polymerní kolony Začátkem devadesátých let připravili Švec a spol. první rigidní makroporézní monolitické kolony [28]. Jejich syntéza se provádí velmi jednoduchým způsobem, a to in situ polymerizací vhodných monomerů přímo v chromatografické koloně či v kapiláře [17, 25]. Příprava spočívá v naplnění trubice směsí monomerů, radikálového iniciátoru a porogenů. Následně je trubice uzavřena, utěsněna a provedena polymerizace za pečlivě kontrolované teploty [17]. Při přímé výrobě v koloně odpadá manipulace, avšak pouhá výměna monolitu za jiný v téže trubici je prakticky nemožná. Polymerační směs používaná pro přípravu těchto monolitů je do značné míry obdobná té, která se používá k přípravě disků. Mimořádně nízký odpor vůči proudění kapalin póry je předpokladem vysokých průtokových rychlostí vhodných k velmi rychlým separacím. Funkční skupiny monolitických kolon připravených přímou polymerizací jsou dány použitými monomery. Další možností kontroly funkčních skupin je příprava monolitu s reaktivními skupinami a modifikace vzniklého polymeru [25]. V neposlední řadě je třeba upozornit i na možnost roubování monolitů s využitím UV záření, které umožňuje přípravu stacionárních fází s vysokou separační kapacitou [17]. 36

37 Disertační práce Monolitické stacionární fáze Tubulární kolony s radiálním tokem Principiálně by vše nasvědčovalo tomu, že monolitické kolony by mohly být velmi zajímavé také pro preparativní separace. Problém je ovšem v tom, že radikálová polymerizace v koloně je exotermní proces, při kterém se uvolňuje velké množství tepla. Polymerizace probíhá bez míchání a odvod tepla je obtížný [17]. Tato obtíž byla do značné míry elegantně vyřešena konceptem tubulárních monolitů s radiálním tokem [30]. Jedná se o trubice s definovanou tloušťkou monolitem tvořených stěn, mobilní fáze a analyty procházejí přes stěnu v radiálním směru [17]. Teplota při polymerizaci je snáze udržována v požadované toleranci. Kromě toho lze snadno měnit jak průměr tak i tloušťku této monolitické trubice [25] Komprimované gely Koncem 80.tých let prováděl prof. Hjertén experimenty s částicemi neporézní agarózy a zjistil, že při stlačení sloupce sorbentu hydrostatickým tlakem proudící kapaliny překvapivě došlo ke zvýšení permeability stacionární fáze a současně i ke zlepšení separace [31]. Na základě těchto experimentů připravil monolit polymerizací vodného roztoku N,N -methylenbis-akrylamidu a kyseliny akrylové v přítomnosti anorganické soli (síran amonný), který následně v koloně silně stlačil (až na 10 % původního objemu) a získal velmi dobré separace bílkovin. Tato technologie po určitém vylepšení byla přejata firmou BioRad [16] Monolitické kolony z anorganických materiálů První monolitické stacionární fáze na bázi silikagelu připravili a popsali profesoři Nakanashi, Soga a Tanaka [32, 33]. V současné době jsou komerčně dostupné pod značkou Chromolith od firmy Merck nebo v licenci Merck od firmy Phenomenex, kolony Onyx. Připravují se hydrolytickou polymerizací tetramethoxysilanu nebo tetraethoxysilanu ve vodném roztoku kyseliny octové v přítomnosti polyethylenglykolu. Technologie výroby umožňuje přípravu monolitů s přesně definovanou strukturou, kdy vznikají výhradně mesopóry (13 nm) a makropóry (2 µm) vhodných a nastavitelných rozměrů [16]. 37

38 Disertační práce Monolitické stacionární fáze Mesopóry: 13 nm Makropóry: 2 µm Celková porozita > 80% Obr. 6: Mesopóry a makropóry monolitické stacionární fáze [16] Porézní struktura silikových monolitů je odlišná od organických monolitů. Zatímco struktura organických polymerů se skládá z pospojovaných skupin málo uspořádaných mikroglobulí s makropóry mezi nimi (obr. 7a), silikové monolity se skládají z dobře uspořádaných přibližně stejně velikých skeletů prostoupených téměř monodisperzními póry (obr. 7b). Skelety samy jsou též porézní a propůjčují těmto monolitům specifický povrch, tedy vlastnost, jež je ceněna právě při separacích malých molekul. Nízký odpor k toku, typický pro všechna monolitická média, umožňuje použití kolony o vnitřním průměru 4,6 mm při průtokové rychlosti až 9 ml min -1, aniž by tlak přesáhl hodnotu 8 MPa, což jsou podmínky zcela nepředstavitelné pro stejnou kolonu naplněnou 5 µm částicemi [25]. Obr. 7: Morfologie polymerního (a) a silikonového (b) monolitu [25] 38

39 Disertační práce Nové trendy ve stacionárních fázích Na rozdíl od rigidních makroporézních polymerních médií, silikagelové monolity analytických rozměrů nemohou být připraveny přímo v chromatografické koloně, neboť při tuhnutí během hydrolyticky iniciované polykondenzace dochází k výraznému zmenšování objemu. Nejprve je tedy připraven monolit, ten je pak zatěsněn do kolony odpovídajících rozměrů, a nakonec obvykle následuje chemická modifikace povrchu podle účelu použití monolitu. Vzhledem ke srážení monolitu při jeho syntéze je obtížné připravit média s délkou nad ~ 15 cm [17]. Platí, že příprava silikagelových monolitů v kapilárním měřítku je snazší a reprodukovatelnější než výroba kolon větších rozměrů, a to proto, že kapiláry s úspěchem polymerizují podobně jako rigidní polymerní monolity, tedy přímým in situ procesem [17]. Na rozdíl od organických monolitických kolon, které se mimořádně osvědčily při separacích velkých molekul, většina zatím popsaných separací používajících silikové monolity se týká malých molekul. To činí tyto kolony unikátními v celé rodině monolitů určených pro HPLC [25] Nové trendy ve stacionárních fázích V posledních letech je patrná silná tendence ke zmenšování rozměrů zrn/částic sorbentů. Stále běžněji jsou komerčně dostupné i sorbenty s velikostí částic pod 2 µm. Zmenšování sorbentu jde ruku v ruce se zkracováním chromatografických kolon. Výsledkem je podstatné zkrácení dob analýz bez ztráty účinnosti ve srovnání se separacemi provedenými na kolonách tradiční délky (250 mm) plněných 5 µm sorbentem. Doby analýz na krátkých kolonách (50 mm, 20 mm i menších) určených pro tzv. rychlou chromatografii bývají kolem 1 až 2 minut. Vedle zkracování kolon dochází postupně také ke zmenšování jejich vnitřního průměru. Tradiční průměr analytických kolon 4,6 mm je postupně opouštěn a nahrazován dnes již běžnějšími průměry kolem 3-4 mm. S nástupem techniky LC-MS vzrostla popularita kolon o průměru 2 mm a menším. Tento trend souvisí nejen se snahou o zrychlení analýz, ale také s úsilím o zlepšení ekonomiky provozu chromatografických laboratoří a v neposlední řadě i s hledisky ekologickými. Spotřeba mobilních fází, obvykle obsahujících organická rozpouštědla, a množství vznikajících odpadů může být tímto způsobem řádově sníženo. 39

40 Disertační práce Nové trendy ve stacionárních fázích Pokud se jedná o separační možnosti HPLC, je možno konstatovat, že dělení na reverzních fázích (RP) je stále nejrozšířenější technikou, přitom dominantní postavení mají již tradičně částicové fáze na bázi silikagelu. Ze silikagelových RP fází jsou dlouhodobě nejpopulárnější C18 modifikace. Vedle silikagelových částicových sorbentů se v moderní RP-HPLC stále více prosazují materiály nové, jako např. anorganicko-organické hybridy a modifikované oxidy kovů. Velmi perspektivní jsou také monolitické kolony [17] Porézní částice menší než 2 mikrometry Jedním z cílů při vývoji nových chromatografických sorbentů vždy bylo dosažení vysoké separační účinnosti, která úzce souvisí s morfologií porézních částic. Většina povrchu typických porézních sorbentů je tvořena difuzivními póry. Zmenšení velikosti částic sorbentu zlepšuje inter i intra partikulární přenos hmoty. V porézní částici putuje analyt z pohybující se mobilní fáze do nepohyblivé mobilní fáze, a pak do stacionární fáze uvnitř pórů, kde dochází k jeho interakci. Následně se analyt uvolní ze stacionární fáze a musí difundovat zpět do pohybující se mobilní fáze. Tímto mnohonásobně se opakujícím procesem analyt postupuje kolonou. V případě použití malých zrn sorbentu je difuzní proces rychlejší. Pomalý přenos hmoty ve stacionární fázi bývá hlavní příčinou malé separační účinnosti spojené s rozšiřováním píků a následně nedostatečným chromatografickým rozlišením [17]. Řešení našla firma Waters (USA) ve vývoji nových stacionárních fází s velikostí 1,7 µm podporovaných novou přístrojovou technikou, která na rozdíl od předešlé generace umožňuje bezpečně a reprodukovatelně pracovat s tlaky přes 80 MPa, tedy více než dvojnásobnými ve srovnání s předchozími přístroji. Obdobné produkty dalších významných producentů chromatografických zařízení pak na sebe nedaly dlouho čekat. Samozřejmě, že každá firma ke svým přístrojům dodává i odpovídající kolony. Jejich společným jmenovatelem je náplň s velikostí částic 2 µm či menší, jakož i celková porozita ( Å). Póry těmto fázím dodávají požadovaný povrch potřebný pro dosažení potřebné selektivity [34]. 40

41 Disertační práce Nové trendy ve stacionárních fázích Porézní částice s neporézním jádrem Technologie s pevným jádrem a porézním povrchem se nazývá fused core technologie. V současné době je několik firem, které se touto technologií zabývají: Advanced Materials Technology (USA, kolony Halo); Sigma-Aldrich (USA, kolony Ascentis Express) a Phenomenex (USA, kolony Kinetex) [35, 36]. Obr. 8: Model částice s neporézním jádrem [35] Částice s porézní povrchovou vrstvou se skládají ze dvou vrstev. Vnitřní vrstvu tvoří kompaktní kulovité jádro z anorganického materiálu, často velmi čistého pevného silikagelu. Neporézní jádro je překryté slabší vrstvou porézního materiálu. Čím tenčí je porézní vrstva, tím snazší je převod hmoty a roste účinnost separace. To je výhodou zejména pro makromolekuly, které difundují do a z pórů pomaleji než malé molekuly. Zároveň se ovšem s klesající tloušťkou porézní vrstvy snižuje specifický povrch stacionární fáze, a klesá sorpční kapacita kolony [15]. Jako první začala tyto částice vyrábět firma Advanced Materials Technology (USA), pod obchodním názvem Halo. Neporézní silikové jádro (core) s velikostí 1,7 µm je obaleno 0,5 µm silnou vrstvou slinutých (fused) silikových nanočástic. Konečná velikost stacionární fáze je tedy 2,7 µm. Kolony plněné částicemi této velikosti mohou být použity ve standardních přístrojích, neboť nevyžadují zvýšený tlak k dosažení požadovaných průtokových rychlostí. Přitažlivost fused-core technologie spočívá v tom, že vzdálenost, jež musí být překonána difuzí v nepohyblivé mobilní fázi uvnitř pórů, není nikdy delší než 0,5 µm. To znamená, že rozmývání chromatografických zón je omezené, což se promítá do účinnosti separace [34]. 41

42 Disertační práce Mobilní fáze Monolitické kolony High Resolution Na podzim roku 2011 uvedla na trh firma Merck (Německo) nový typ monolitických kolon nazývaný Chromolith HighResolution (Chromolith HR). Tento nový typ nabízí vyšší účinnost, symetrický tvar píků a delší životnost v porovnání s částicovými kolonami. Nový typ kolony generuje zpětný tlak o polovinu nižší než částicové kolony stejných parametrů. Pro dosažení vyššího rozlišení je možné spojit dvě kolony Chromolith HighResolution k sobě. V porovnání s klasickými monolitickými kolonami (Chromolith ) vykazují nové kolony větší separační účinnost, která je dána větší separační plochou, tedy velikostí mesopórů. Klasické monolitické kolony mají velikost mesopórů nm, kdežto materiál Chromolith HR obsahuje mesopóry velikosti nm. Na druhou stranu vykazují nové kolony vyšší zpětný tlak oproti klasickým monolitickým kolonám, což je dáno velkostí makropórů. Kolony Chromolith obsahují makropóry o velikosti 1,9-2 µm a Chromolith HR o velikosti 1,1-1,2 µm [24] Mobilní fáze V chromatografii s normálními fázemi se používají méně polární mobilní fáze. Aby se dosáhlo reprodukovatelných výsledků, je nutné přísně kontrolovat přítomnost vody v mobilní fázi. V chromatografii s obrácenými fázemi se používají vodné mobilní fáze jak s organickým rozpouštědlem, tak bez něj. Složky mobilní fáze se obvykle filtrují, aby z nich byly odstraněny částice větší než 0,45 µm. Vícesložkové mobilní fáze se připravují odměřením požadovaných objemů (pokud nejsou předepsány hmotnosti) jednotlivých složek a jejich smísením. Jinou možností je přivádět rozpouštědla pomocí jednotlivých čerpadel ovládaných ventily, které umožňují mísení složek v požadovaném poměru. Rozpouštědla jsou před čerpáním do systému obyčejně odplyňována probubláváním heliem, v ultrazvukové lázni nebo se používají membránová či vakuová zařízení zařazená přímo do systému, která zabraňují vstupu vzduchových bublin do HPLC systému. Používaná rozpouštědla a jiné složky mobilní fáze mají mít vhodnou kvalitu. Pokud je nutné nastavení ph, provádí se pouze s vodnou částí mobilní fáze, nikoli s celou směsí. Jestliže se používají tlumivé roztoky, systém se po dokončení 42

43 Disertační práce Mobilní fáze chromatografických analýz patřičně promyje směsí vody a organického rozpouštědla použitého v mobilní fázi (5 % (V/V)), aby se zabránilo krystalizaci solí [12]. Na rozdíl od plynové chromatografie zde mobilní fáze vstupuje do interakce se složkami analyzované směsi a konkrétní složení mobilní fáze může významným způsobem ovlivňovat celou analýzu (kvalitu separace) [2]. 43

44 Disertační práce Nízkotlaké průtokové metody 4.3 Nízkotlaké průtokové metody Definice a základní charakteristiky Nízkotlaké průtokové metody jsou analytické metody založené na měření vzorku v proudu kapaliny (nosném proudu), jsou charakterizovány nízkým tlakem nosného proudu v systému (2,5 3,0 MPa). Základní charakteristiky metod průtokové analýzy [37]: Odstraňují fázi odměřování objemu vzorku, pipetování Vyšší rychlost analytického procesu Možnost automatizace - sériové analýzy Miniaturizace aparatury - hospodárnost analytického stanovení Eliminace kontaktu pracovníků s toxickými látkami a organickými rozpouštědly Omezení kontaktu používaných chemikálií s atmosférou Nevýhodou tradičních průtokových metod bývá malá flexibilita Princip Základním principem všech průtokových analytických metod je sledování závislosti odezvy na impulzu. Impulz je transformován na odpověď pomocí modulátoru. Modulátorem může být mísící cívka (FIA, SIA), nebo analytická kolona (HPLC, SIC) [38]. Impuls Odezva Modulátor Vzorek Pumpa Ventil Modulátor Detektor Obrázek 9: Základní princip průtokových metod [38] 44

45 Disertační práce Průtoková injekční analýza Uplatňují se zde dva procesy: Fyzikální disperze zóny vzorku uvnitř nosného proudu Chemická reakce složky vzorku s činidlem Rozdělení průtokových metod A) Metody kontinuálního toku Chromatografie HPLC (vysokotlaká průtoková metoda) FIA - Flow injection analysis (nízkotlaká průtoková metoda) B) Metody programovatelného toku SIA - Sequential injection analysis SIC - Sequential injection chromatography [38] Průtoková injekční analýza Průtoková injekční analýza (FIA) [39, 40] je technika založená na vstřikování kapalných vzorků do pohyblivého nesegmentovaného nosného proudu vhodné kapaliny. Nadávkovaný vzorek vytváří zónu, která je pak transportována k detektoru, který zaznamenává změny v požadovaném fyzikálním parametru. FIA využívá kontinuálního průtoku pro transport zóny vzorku, smísení s činidlem a přenos produktu do průtokové cely detektoru [38]. Pumpa Vzorek Mísící cívka UV-VIS detektor Nosný proud Odpad Obr. 10: Základní schéma FIA systému se skládá ze čtyř částí: peristaltická pumpa, injekční systém dávkovací nízkotlaký ventil, reakční zóna mísící cívka a detektor [38]. 45

46 Disertační práce Průtoková injekční analýza Vlastní pohyb vzorku a činidel, jejich mísení a chemická reakce probíhá v teflonových nebo polyethylenových trubicích o vnitřním průměru 0,5 1 mm. Výsledkem analýzy jsou za sebou jdoucí píky závislosti signálu (např. absorbance) na čase, jejich výška h je mírou koncentrace analytu [41]. Vzorek je při průchodu systémem rozmýván v nosném proudu, který může zároveň obsahovat činidlo a vytváří se koncentrační gradient. Kontrolovaná disperze je základní charakteristikou metody FIA. K disperzi vzorku může dojít přímo v rozpouštědle, kdy nedochází k chemické reakci, a nebo i při chemické reakci v proudu činidla. K popisu koncentračního gradientu se užívá disperzní koeficient D, který je dán poměrem počáteční koncentrace a aktuální koncentrace v daném bodě (čase): D = c 0 /c kde c 0 je počáteční koncentrace a c je aktuální koncentrace. Hodnota D je vždy větší než jedna a nejčastěji se odečítá v bodě maximální koncentrace (c max ), které pak odpovídá hodnota D max [41]. Fáze 1 Nosný proud Vzorek Dávkování Fáze 2 Fáze 3 Nosný proud Nosný proud Disperze Detekce Fáze 4 Vymytí Nosný proud Obr. 11: Princip FIA [38] Velikost rozptýlení zóny, a tedy i tvar a výška zaznamenaného signálu, závisí na objemu vzorku, délce reakčních cívek (délce celého vedení) a na parametrech průtokového systému. Pro kvalitní záznam signálu v metodě FIA musí být na jedné straně dosaženo malé disperze vzorku a zároveň musí být poskytnut čas 46

47 Disertační práce Sekvenční injekční analýza pro dostatečný průběh reakce (při měření ale nenastává rovnovážný stav, nestacionární metoda). Oba tyto požadavky jsou však protichůdné, proto je velmi důležité nalézt optimální podmínky pro provedení dané analýzy. Ve FIA metodě je obecně nutné zajistit bezpulsní tok všech chemikálií a přísně reprodukovatelný objem vzorku. Pro detekci ve FIA systému je možné použít jakýkoliv detektor vhodný pro daný reakční produkt v kombinaci s průtokovou celou (vnitřní objem několik desítek µl). Mezi detektory využívající optické vlastnosti látek patří: fotometrické, citlivější fluorimetrické, detektory využívající chemiluminiscenci, a detektory refraktometrické. Z elektrochemických detektorů lze použít iontově selektivní elektrody a vodivostní nebo coulometrické detektory [41] Sekvenční injekční analýza Sekvenční injekční analýza (SIA) je průtoková analytická metoda, řešící některé nedostatky průtokové injekční analýzy (FIA), ze které byla vyvinuta v roce 1990 [42]. Sekvenční injekční analýza umožňuje snadnou automatizaci složitých postupů sériových analýz velkého počtu vzorků. Významnými rozdíly technik SIA a FIA je odlišnost v geometrii nosného toku, kdy FIA využívá přímý konstantní tok, zatímco SIA využívá změnu přímého a zpětného toku. Tím je dosaženo vyššího stupně konverze analytu na výsledný produkt [43]. Technika SIA používá odlišný princip, jehož charakteristickým rysem jsou oddělené měřící cykly. Nejprve jsou zóny nosného média, vzorku a činidla postupně (jednorázově) aspirovány do jednokanálového systému s využitím selekčního vícecestného ventilu (nejčastěji 6, 8 či 10 cestného) a pístového čerpadla. Pomocí selekčního ventilu jsou řazeny zóny činidel a vzorku v mísící cívce. Pohyb toku je dále pomocí čerpadla obrácen a tím dojde k dokonalejšímu promísení zón za vzniku reakčního produktu, který je dále detekován. Někdy se využívá uzavření zóny vzorku mezi dvě zóny činidla, což zvyšuje výtěžek chemické reakce [43, 44]. 47

48 Disertační práce Sekvenční injekční analýza Vzorek Produkt Činidlo Detektor Nosný proud Nosný proud Obr. 12: Princip SIA [38] Typická základní konfigurace příslušného SIA systému je schematicky znázorněna na obr. 13. Systém je tvořen jednokanálovým dvousměrným pístovým čerpadlem, vícecestným selekčním ventilem, vhodným detektorem, mísící cívkou, která slouží zároveň jako pojistka proti vniknutí vzorku a činidel do čerpadla, a spojovacím materiálem [44]. Pístová pumpa Mísící cívka Odpad Detektor Odpad Nosný proud Vzorek Pumpa Odpad Činidlo 1 Činidlo 2 Obr. 13: Základní schéma SIA systému [38] 48

49 Disertační práce Sekvenční injekční chromatografie V podstatě se dá říci, že SIA systém pracuje v cyklu naprogramovaných pohybů pístu čerpadla, synchronizovaných s přepínáním pozic selekčního ventilu. Přesná synchronizace a opakovatelnost těchto kroků je nutnou podmínkou k dosažení reprodukovatelné disperze jednotlivých zón v SIA systému a tím i k získání reprodukovatelného koncentračního gradientu reakčního produktu, resp. odpovědi detektoru. Z toho vyplývá, že nezbytnou součástí SIA systému musí být i vhodný počítač s příslušným programovým vybavením, který řídí kroky měřícího cyklu a současně sbírá, uchovává a vyhodnocuje výstupní data [43, 44]. Průtokové rychlosti v SIA se prakticky neliší od FIA a pohybují se obvykle okolo 1 ml min -1 a doba trvání jednoho měřicího cyklu v SIA většinou nepřesahuje 30 s, což je v mnoha případech srovnatelné s frekvencí dávkování vzorku ve FIA. Zatímco ve FIA je v rámci jedné série měření dávkovaný objem vzorku fixní, což je dáno konstantní délkou dávkovací smyčky, u SIA je možno v jednotlivých cyklech objem vzorku cíleně měnit v rozsahu jednotek až stovek µl programováním doby otevření příslušného kanálu selekčního ventilu; tímto postupem lze optimalizovat disperzi zóny vzorku (a tedy citlivost stanovení) podle koncentrace analytu [44]. Protože SIA využívá zastavení a změnu směru toku, jsou spotřeby vzorku a hlavně činidel podstatně nižší než u FIA, kde je čerpání kontinuální. Velkou výhodou je i její flexibilita, daná snadnou změnou parametrů měření pomocí změny příkazů ovládacího programu beze změn konfigurace SIA systému. Nevýhodou SIA proti FIA je nižší frekvence dávkování vzorků [43] Sekvenční injekční chromatografie Definice sekvenční injekční chromatografie Sekvenční injekční chromatografie (SIC) je originální separační analytická technika vyvinutá v roce 2003 na Katedře analytické chemie, FaF UK, která umožňuje užití speciálních chromatografických materiálů pro separaci látek v nízkotlakém SIA systému. Tato technika vzniká zapojením monolitických kolon do SIA systému s cílem aplikace metody pro analýzu farmaceuticky významných látek. Farmaceutické přípravky mohou obsahovat v matrici více účinných látek nebo degradačních produktů, které mohou mezi sebou při stanovení výrazně interferovat. V těchto případech je nutné před vlastní analýzou přítomné analyty separovat. 49

50 Disertační práce Sekvenční injekční chromatografie Většina dříve vyvinutých SIA a FIA metod se zabývala stanovením léčiv ve farmaceutických přípravcích s jednou účinnou látkou, kde nejsou ve většině případů požadavky na odstranění jednoduché matrice a na separaci. Pro udržení tempa s moderními separačními technikami při vývoji analýz multikomponentních přípravků, je však nutné do SIA systémů začlenit separační prvek, který umožní zvýšit selektivitu a citlivost analýzy. Použití chromatografických kolon je zde ale omezeno kvůli nízkotlakému systému, který nesnese příliš vysoký zpětný tlak. Tento problém je vyřešen použitím monolitických kolon, které díky své porozitě kladou při průtoku mobilní fáze minimální odpor, a proto k dosažení požadovaného průtoku postačují i nízkotlaké pístové SIA pumpy při zachování dostatečné separační účinnosti. Při porovnání s HPLC čerpadly, schopny čerpat mobilní fázi pod tlakem až 40 MPa, je pístová pumpa SIA analyzátoru schopna vyvinout tlak pouze přibližně 2,5 3,0 MPa v závislosti na průměru použitého pístu. Písty menšího průměru jsou schopné vyvinout větší tlak, avšak jejich nevýhodou je poměrně malý objem. SIC systém dává nový prostor pro on-line chromatografickou separaci vícesložkových vzorků v nízkotlakém průtokovém systému, což má výhodu v programovatelnosti toku a v možnosti manipulace se vzorkem. SIC je metoda, která je vhodná pro rychlou analýzu jednoduchých směsí (2-5 složkových) a pro možnost on-line provedení úpravy vzorku a následnou separaci a stanovení analytů v jednom systému. Mezi výhody průtokových metod patří automatizace, miniaturizace a nízká spotřeba vzorků a mobilní fáze [38, 45, 46] Princip sekvenční injekční chromatografie SIC je založena na programovatelném toku mobilní fáze, umožňuje pohodlný výběr objemu vzorku a dokonce i umožňuje jednoduše vytvořit gradient dvou mobilních fází. 50

51 Disertační práce Sekvenční injekční chromatografie A B C D E Obr. 14: Princip SIC [38]: A) Aspirace vzorku pomocí selekčního ventilu do mísící cívky B) Selekční ventil je přepnut, obrátí se tok mobilní fáze a vzorek prochází na kolonu, kde dochází k separaci C) Aspirace mobilní fáze pomocí selekčního ventilu D) Tok mobilní fáze je obrácen a mobilní fáze vstupuje přes selekční ventil do kolony, odkud je analyt eluován E) Separované analyty jsou unášeny do detektoru Instrumentální vybavení v sekvenční injekční chromatografii Typická základní konfigurace příslušného SIC systému je schematicky znázorněna na obr. 15. Systém je tvořen jednokanálovým dvousměrným pístovým čerpadlem, mísící cívkou, vícecestným selekčním ventilem, separační kolonou a detektorem [38]. Vývoj SIC techniky vyústil ve výrobu komerčního systému SIChrom TM (FIAlab, USA). Přístroj je vybaven 8-cestným selekčním ventilem a pístovou pumpou, která má maximální pracovní tlak do 700 psi (4,8 MPa), což umožňuje analýzy při vyšších průtokových rychlostech mobilní fáze, či analýzy na delších monolitních, nebo krátkých částicových kolonách [45, 47]. 51

52 Disertační práce Sekvenční injekční chromatografie Pístová pumpa Mísící cívka Odpad Separační kolona Nosný proud Odpad Mobilní Mobilní fáze 1 fáze 2 Vzorek Pumpa Odpad UV-VIS detektor Obr. 15: Základní schéma SIC systému [38] Jednotlivé součásti SIC systému: Čerpadlo Jednotkou generující tok nosného proudu v SIA systému je nejčastěji pístová pumpa, která je poháněna vysoce přesným krokovým motorem. Ten umožňuje aspiraci velmi malých objemů roztoků od jednotek do tisíců mikrolitrů. Pístová pumpa zajišťuje jednoduchou změnu směru toku nosného proudu při plnění nebo vyprazdňování objemu rezervoáru pístové pumpy. Součástí pístové pumpy je trojcestný ventil, který je rovněž ovládán počítačem a který spojuje rezervoár pumpy se zásobníkem nosného proudu a v opačné poloze se SIA systémem [48]. Mísící cívka Mísící cívky mohou být buď přímé, nebo stočené a slouží k dostatečnému promísení vzorku a činidla či několika činidel. Delší průtok těmito cívkami má v podstatě stejnou funkci jako několikanásobná změna směru toku nosného proudu a pro běžná měření stačí hlavní mísící cívka zapojená mezi pístovou pumpu a selekční ventil [48]. Toto umístění je výhodné hlavně proto, že také zabraňuje vniknutí vzorku nebo činidel do rezervoáru pístové pumpy. 52

53 Disertační práce SIC aplikace Selekční ventil Další součástí systému je vícecestný selekční ventil. Nejčastěji se jedná o 6, 8 a 10-cestné ventily. Selekční ventil představuje jednotku, která řídí seřazení jednotlivých zón v mísící cívce, zajišťuje připojení všech požadovaných roztoků k systému, jejich aspiraci a po obrácení toku i transport zón na kolonu a dále do detektoru. Časování poloh selekčního ventilu a jejich synchronizaci s pohybem čerpadla řídí a kontroluje počítač [44]. Separační kolona Jako chromatografické kolony v SIC systému jsou nejčastěji používané monolitické kolony. Ty jsou tvořeny z jednoho kusu vysoce porézního polymerního silikagelu s dvojí porézní strukturou (makropóry a mezopóry). Makropóry (průměrná velikost 2 µm) tvoří hustou síť pórů velmi dobře prostupných pro mobilní fázi, což dramaticky snižuje zpětný tlak a umožňuje použití vyššího průtoku mobilní fáze. Mezopóry (průměrná velikost 13 nm) tvoří porézní jemnou strukturu a vytváří velkou plochu povrchu, na které může docházet k adsorpci molekul analyzované látky. Díky vysoké porozitě mohou být použity velmi vysoké průtokové rychlosti s velmi nízkým zpětným tlakem. Mezi další výhody patří vynikající mechanická stabilita [45, 46]. Detektor Detektory v SIA nejsou systémově omezeny, jejich volba záleží na druhu použité analytické reakce. Využívají se zejména spektrofotometrické, fluorescenční a elektrochemické detektory s příslušnými průtokovými celami. U spektrofotometrických detektorů se nejčastěji vyskytuje Z-cela s optickou délkou 10 mm a vnitřním průměrem 1,5 mm [44] SIC aplikace Analýzy v sekvenční injekční chromatografii jsou zaměřeny na relativně jednoduché vícesložkové vzorky farmaceutických přípravků. Mohou to být např. roztoky, kapky, sirupy, které mohou být stanoveny přímo jen naředěním vzorku mobilní fází. Ostatní matrice (krémy, tablety, kapsle, apod.) musí být před vlastním stanovením předupraveny (např. extrakcí organickým rozpouštědlem). 53

54 Disertační práce SIC aplikace Délka kolony byla vybírána v závislosti na chromatografických vlastnostech sloučenin obsažených ve vzorku. Mobilní fází byl většinou methanol, nebo acetonitril v objemu dostačujícím pro eluci všech látek z chromatografické kolony. Průtok mobilní fáze byl optimalizován podle délky kolony a tvaru píku (obvykle méně než 1 ml min -1 ). UV-VIS detektor byl používán ve spojení s Z-průtokovou celou. Dvě nebo tři vlnové délky byly často použity pro detekci současně, hlavně pokud bylo potřeba zvýšit citlivost detekce. Objem vzorku pro jednu analýzu se pohyboval v rozmezí µl v závislosti na délce kolony. Celý systém byl kontrolován softwarem FIAlab. SIC slouží jako automatická metoda pro rychlá chromatografická stanovení jednoduchých směsí s možností jednoduché on-line manipulace a předúpravy vzorku [45]. Tab. 1 shrnuje vybrané SIC aplikace pro stanovení účinných látek ve farmaceutických přípravcích: 54

55 Disertační práce SIC aplikace Analyty Farmaceutické přípravky Rozměry kolony (mm) Průtok (ml min -1 ) Mobilní fáze Detekce UV (nm) Ref. Triamcinolon acetonid, kyselina salicylová, propylparaben (IS) Topický roztok MK x 4,6 0,9 ACN/H 2 O (35:65, v/v) ph 3,3 (upraveno kys. octovou) Lidokain, prilokain, trimekain (IS) Kyselina salicylová, methylsalicylát, propylparaben (IS) Topický krém Topická pasta MK 25 x 4,6 MK 50 x 4,6 0,6 0,6 ACN/fosforečnanový pufr (40:80, v/v) ph 7,1 (upraveno triethylaminem a H 3 PO 4 ) ACN/H 2 O (35:60, v/v) ph 2,5 (upraveno 98% H 3 PO 4 ) Ambroxol hydrochlorid, methylparaben, kyselina benzoová, kyselina salicylová (IS) Farmaceutické sirupy a kapky MK x 4,6 0,48 ACN/tetrahydrofuran/ kyselina octová (10:10:90, v/v/v) ph 3,75 (upraveno triethylaminem) Nafazolin nitrát, methylparaben, ethylparaben (IS) Nosní kapky MK x 4,6 0,9 methanol/h 2 O (40:65, v/v) ph 5.2 (upraveno triethylaminem a kyselinou octovou) 220, Methylparaben, propylparaben, diklofenak sodný, buthylparaben (IS) Topický krém MK 25 x 4,6 0,48; 0,9; 1,2 ACN/ H 2 O (40:70 (v/v) ph 2,5 (upraveno triethylaminem a H 3 PO 4 ) Methylparaben, propylparaben, triamcinolon acetonid, ketoprofen (IS) Topický krém MK x 4,6 0,6 ACN/MeOH/ H 2 O (35:5:65) ph 2,5 (upraveno nonylaminem a H 3 PO 4 ) Ambroxol hydrochlorid, doxycyklin, ethylparaben (IS) Kapsle a tablety MK 25 x 4,6 0,48 ACN/ H 2 O (20:90, v/v) ph 2,5 (upraveno 98% H 3 PO 4 ) Paracetamol, kofein, kyselina acetylsalicylová, kyselina benzoová (IS) Tablety MK 25 x 4,6 0,6 ACN/fosforečnanový pufr (10:90, v/v) ph 4,05 (upraveno 8,5% H 3 PO 4 ) 210,

56 Disertační práce SIC aplikace Fenoxycarb, permethrin Veterinární kožní sprej MK 10 x 4,6 0,6; 1,2 ACN/ H 2 O (60:40, v/v) Indometacin, 2 degradační produkty, ketoprofen (IS) Topický gel MK 25 x 4,6 1,2 Gradient: ACN/ H 3 PO 4 (0,2%) 30:70 50:50 224, 237, Vitamín A-acetát, D 2, nebo D 3, E-acetát Roztok, kapsle MK 25 x 4,6 0,9 ACN/MeOH/H 2 O (20:20:1, v/v/v) 265, 290, Paracetamol, kofein, propyfenazon, kyselina salicylová (IS) Tablety MK x 4,6 10 x 4,6 0,9 1,2 ACN/ H2O (10:90, v/v) ph 3.5 (upraveno kyselinou octovou) ACN/ H 2 O (30:70, v/v) MK 100 x 3 α-estradiol, β-estradiol, ethinyl-estradiol, estron, ethylparaben (IS) roztok standardů Ascentis Express C18 0,48 ACN/ H 2 O (40:60, v/v) x 4.6 (2,7 µm) MK monolitická kolona 56

57 Disertační práce Porovnání HPLC a SIC 4.4 Porovnání HPLC a SIC Metoda SIC vykazuje srovnatelnou účinnost separace ve srovnání s tradiční HPLC technikou. Mezi výhody SIC patří: krátká doba analýzy, možnost on-line použití činidel ve všech krocích stanovení, produkce odpadů a spotřeba rozpouštědel je nižší než u HPLC (vzhledem k diskontinuálnímu toku u SIC), což umožní snížit náklady na analýzu. SIC přináší možnosti on-line úpravy vzorku v systému díky jednoduché manipulaci s roztoky v systému s obousměrným tokem. Rozměry systému a možnost měření v terénu jsou dalšími výhodami SIC systému. Na druhé straně, je metoda SIC omezena použitím kolon a maximálním množstvím mobilní fáze, která je k dispozici pro jednu analýzu (dáno velikostí rezervoáru pístové pumpy). Robustnost použitého SIC systému není tak vysoká jako u klasické HPLC, hlavně kvůli limitaci objemu pístové pumpy a zpětnému tlaku produkovanému při vyšších průtokových rychlostech mobilní fáze. Další nevýhodou je fakt, že komerční program pro zpracování dat využívá pro kvantifikaci pouze výšky píků [45]. Porovnání výhod a nevýhod SIC a HPLC systému je shrnuto v tab. 2 [45]: Charakteristika HPLC SIC Separace Ano Ano jednoduché směsi Průtok mobilní fáze Kontinuální Diskontinuální Směr toku mobilní fáze Jednosměrný tok Obousměrný tok Rychlost průtoku mobilní fáze Konstantní Variabilní Spotřeba mobilní fáze Vysoká Nízká (diskontinuální tok) Použití činidel Limitované Ano Předúprava vzorku Ano (omezená) Ano Vyhodnocení dat Sofistikované Jednoduché Cena zařízení Vysoká Nízká Přenosnost Ne Ano 57

58 Disertační práce Experimentální část 5 KOMENTÁŘ K PUBLIKOVANÝM PRACÍM 58

59 Disertační práce Experimentální část 5.1 Optimalizace HPLC stanovení klotrimazolu Byla vypracována HPLC metoda pro stanovení obsahu účinné látky klotrimazolu a příslušných nečistot (2-chlorfenyl)difenylmethanolu a imidazolu v přípravku Clotrimazol spray 1 %. Předložená práce byla zaměřena na výběr vhodné chromatografické kolony, složení mobilní fáze, jejího ph a vnitřního standardu pro analýzu léčivého přípravku obsahujícího lokálně užívané antimykotikum klotrimazol. Celkem bylo testováno 7 chromatografických kolon: Discovery HS F5 (150 x 4,6 mm, 5 µm); Chromolith Performance, RP-18e (100 x 3 mm); ZIC HILIC (50 x 2,1 mm; 3,5 µm); XTerra RP 18 (100 x 3 mm, 5 µm); Discovery RP Amide C 16 (250 x 3 mm, 5 µm); Zorbax Extend-C18 (75 x 4,6 mm; 3,5 µm); Discovery ZR-PBD (150 x 4,6 mm, 5 µm). Jako optimální kolona byla zvolena Discovery ZR-PBD. Tato kolona je vyrobena z materiálu na bázi oxidu zirkoničitého, který je potažený vrstvou polybutadienu. Největší výhodou oxidu zirkoničitého je jeho chemická a tepelná stabilita: je stálý v celém rozsahu ph při vysokém tlaku a teplotě až do 200 C. Byla použita spektrofotometrická detekce při 210 nm. Jako optimální mobilní fáze byla vybrána směs acetonitrilu a vody (ph 9,7) v poměru 50:50. Jako optimální množství nastřikovaného vzorku byl zvolen objem 3 µl a průtok mobilní fáze byl 1 ml min -1. Jako vnitřní standard byl použit ibuprofen. Celkový čas analýzy byl kratší než 4,5 min. Robustnost byla testována pro roztok standardů s vnitřním standardem ibuprofenem. Byl sledován vliv změny ph mobilní fáze v oblasti 9,2 11,0 a vliv zvýšené pracovní teploty v rozmezí C. Výsledky ukazují pouze malou změnu retenčních časů a ploch píků a tím prokazují vysokou robustnost prezentované metody, která je požadována při rutinním využití pro stanovení klotrimazolu v uvedeném přípravku. Detaily viz. příloha 1. 59

60 Disertační práce Experimentální část 5.2 Aplikace monolitických kolon ve farmaceutické analýze. Stanovení indometacinu a jeho degradačních produktů Cílem této práce bylo porovnat separační účinnost konvenční částicové kolony a monolitických kolon různé délky. K porovnání byla použita HPLC metoda stanovení indometacinu a jeho dvou rozkladných produktů. Ketoprofen byl použit jako vnitřní standard k hodnocení dat v průběhu celé studie. Konvenční separace byla provedena s využitím částicové kolony Zorbax SB-Phenyl (75 x 4,6 mm; velikost částic 3,5 µm), mobilní fáze složené z acetonitrilu a 0,2 % fosforečné kyseliny v poměru 50:50 (v/v) a průtoku mobilní fáze 0,6 ml min -1. Byly testovány monolitické kolony různé délky: Chromolith Flash RP-18e (25 x 4,6 mm); Chromolith SpeedRod RP-18e (50 x 4,6 mm) a Chromolith Performance RP-18e (100 x 3 mm). Protože složení mobilní fáze používané v původní metodě nebylo optimální pro monolitické kolony, bylo nutné upravit složení mobilní fáze (pouze zvýšením poměru vodné složky) a její průtok pro jednotlivé kolony tak, aby byly parametry SST zachovány v přijatelných mezích. Vyvinuté metody byly použity pro stanovení všech uvedených látek ve farmaceutickém přípravku Indobene gel. Chromatografické parametry byly porovnány s parametry získanými z analýzy na konvenční částicové stacionární fázi. Touto prací bylo prokázáno, že monolitické kolony lze použít pro analýzu účinných látek ve farmaceutických přípravcích jen s nepatrnou změnou původních chromatografických podmínek (použitých v HPLC separaci na částicové koloně). Výhodou monolitických kolon je jejich nízký zpětný tlak, který umožňuje využití vyšších průtoků mobilní fáze a tím i zkrácení celkové doby analýzy. V případě stanovení indometacinu a jeho dvou rozkladných produktů byl čas analýzy za využití monolitických kolon zkrácen o polovinu proti částicové koloně. Detaily viz. Příloha 2. 60

61 Disertační práce Experimentální část 5.3 Separace vitamínů A acetátu, ergokalciferolu, nebo cholekalciferolu a tokoferolu acetátu pomocí sekvenční injekční chromatografie SIC technika vzniká zapojením monolitických kolon do SIA systému s cílem aplikace metody pro analýzu farmaceuticky významných látek. Mezi výhody průtokových metod patří automatizace, miniaturizace a nízká spotřeba vzorků a mobilní fáze. Cílem této práce bylo vyvinout a validovat novou nízkotlakou metodu sekvenční injekční chromatografie pro separaci a současné stanovení ve vodě nerozpustných vitamínů (retinolu acetátu, ergokalciferolu, nebo cholekalciferolu a tokoferolu acetátu). Vitamíny D 2 a D 3 nebyly stanoveny současně, ale bylo prokázáno, že vyvinutá metoda je použitelná pro analýzu farmaceutických přípravků obsahujících jeden z těchto dvou forem vitamínu D bez potřeby změny separačních podmínek. Různé separační podmínky (délka kolony, složení mobilní fáze, průtok mobilní fáze a aspirovaný objem vzorku) byly testovány. SIC analýzy byly provedeny na komerčně vyráběném přístroji FIAlab 3000 (FIAlab Inc., Bellevue, USA), který obsahoval pístovou pumpu o objemu 5 ml, 6-cestný selekční ventil a 10 mm optickou Z-průtokovou celu. Monolitická kolona byla umístěna mezi selekčním ventilem a průtokovou celou. Pro úspěšnou separaci byla použita monolitická kolona Onyx TM Monolithic C18 (25 x 4,6 mm, Phenomenex, USA) s 10 mm předkolonou, mobilní fáze acetonitril:methanol:voda v poměru 20:20:1 (v/v/v), při průtoku mobilní fáze 0,9 ml min -1 (odpovídající 15 µl s -1 ), detekce při 265 nm (vitamín D), 290 nm (vitamín E) a 325 nm (vitamín A). Celkový čas analýzy byl 5,5 min. Nová SIC metoda s použitím monolitické kolony a UV spektrofotometrické detekce byla použita pro stanovení vitamínu D 3 ve farmaceutickém přípravku Vigantol (Merck KGaA, Německo) a vitamínů A, D 2 ve farmaceutickém přípravku Vitamin AD Slovakofarma kapsle (Zentiva a.s., Slovensko). Jako vnitřní standard pro kvantifikaci byl použit tokoferol acetát. Detaily viz. Příloha 3. 61

62 Disertační práce Experimentální část 5.4 Tvorba gradientové eluce v sekvenční injekční chromatografii s využitím monolitických kolon Tato práce se zabývala vývojem a validací gradientové eluce v sekvenční injekční chromatografii (GE - SIC). Použitelnost a separační účinnost navržené SIC metody byla demonstrována na separaci a současné stanovení účinné látky indometacinu a jeho dvou rozkladných produktů (kyseliny 5-methoxy-2- methylindoloctové a kyseliny 4-chlorobenzoové) v topickém farmaceutickém přípravku. Ketoprofen byl použit jako vnitřní standard. Byl popsán koncept jednoduché a opakovatelné tvorby gradientu mobilní fáze v SIC pomocí automatizovaného a programovatelného mísení dvou mobilních fázích s různou eluční silou přímo v systému. Optimalizace profilu gradientu GE - SIC s respektem na separační kvalitu může být relativně jednoduše dosaženo pomocí programované změny poměru jednotlivých mobilních fází a jejich rychlosti aspirace do mísící cívky. Byl testován různý profil gradientové eluce. Chromatografická separace byla provedena na monolitické koloně Onyx TM Monolithic C18 (25 mm x 4,6 mm, Phenomenex, USA). Optimální podmínky gradientové eluce využívají binární mobilní fázi o složení acetonitril a 0,2 % kyselina fosforečná v poměru 30:70 (v/v, MF 1) a 50:50 (v/v, MF 2), průtok mobilní fáze 1,2 ml min -1. Byla použita UV spektrofotometrická detekce při 224 nm (kyselina 5-methoxy-2-methylindoloctová), 237 nm (kyselina 4-chlorobenzoová, ketoprofen) a 305 nm (indometacin). Dále byla vyvinuta technika HPLC s gradientovou elucí, která sloužila jako porovnávací metoda. Obě techniky byly úspěšně použity k separaci a stanovení uvedené účinné látky a degradačních produktů v topickém přípravku Indobene gel 1 % (Ratiopharm GmbH, Ulm, Německo). Detaily viz. Příloha 4. 62

63 Disertační práce Experimentální část 5.5 Chromatografické stanovení účinných látek v topických přípravcích Cílem této práce bylo vyvinout a validovat novou HPLC metodu pro stanovení obsahu účinných látek nonoxynolu (nonoxyn-9-ol) a trimekainu (trimekainu hydrochloridu) v topických přípravcích - lubrikačních gelech. Práce byla zaměřena na výběr vhodné chromatografické kolony, složení mobilní fáze, ph její vodné složky a výběr vnitřního standardu a dále na validaci navržené HPLC metody. Během vývoje a optimalizace metody byly testovány analytické kolony s různými stacionárními fázemi: Discovery Cyano (100 x 4 mm, 5 µm), Discovery RP Amide C16 (250 x 3 mm, 5 µm), Discovery ZR-PBD (150 x 4,6 mm, 5 µm), Luna-NH 2 5µm (100 x 3 mm, 5 µm) a X Bridge TM Shield RP18 (50 x 3 mm, 2,5 µm). Separace byla úspěšně provedena na analytické koloně Discovery ZR-PBD (150 4,6 mm, velikost částic 5 µm), mobilní fáze byla směsí methanolu a 50 mm triethylaminu (78:22 v/v), ph 9 (upraveno kyselinou octovou) a jako nejvhodnější průtok mobilní fáze byl zvolen 1,0 ml min -1. Pro detekci byla vybrána vlnová délka 210 nm. Ke kvantitativnímu hodnocení byla použita metoda vnitřního standardu, kterým byl zvolen amitriptylin. Celkový čas analýzy byl 7,5 min. Po optimalizaci izolačního postupu (jednoduchá extrakce do roztoku vnitřního standardu v acetonitrilu, působení ultrazvuku a centrifugace) byla metoda úspěšně validována a prakticky aplikována pro hodnocení přípravku LG non-stop (Herbacos-Recordati, Pardubice, Česká republika). Detaily viz. Příloha 5. 63

64 Disertační práce Experimentální část 5.6 Vývoj a validace HPLC metody pro stanovení kyseliny askorbové, fenylefrinu, paracetamolu a kofeinu s využitím monolitické kolony Nová HPLC metoda s využitím monolitické kolony a UV detekce pro stanovení kyseliny askorbové, fenylefrinu, paracetamolu a kofeinu byla vyvinuta a validována. Kyselina salicylová byla použita jako vnitřní standard. V průběhu optimalizace byly testovány monolitické kolony různé délky ( mm) a různého průměru (2-4,6 mm). Směs acetonitrilu, methanolu s vodou či pufrem (2,5-7,5) byla testována jako mobilní fáze pro získání optimálních separačních podmínek. Chromatografická separace výše uvedených účinných látek byla provedena na monolitické koloně Onyx Monolithic C18 (100 x 4,6 mm), mobilní fáze je směsí acetonitrilu a fosforečnanového pufru (ph 6,50) v poměru 10:90 (v/v). Všechny experimenty byly měřeny při laboratorní teplotě. Čas analýzy byl 5 min při průtoku 1 ml min -1. Detekce byla provedena v UV oblasti spektra při vlnové délce 210 nm (pro fenylefrin, paracetamol a kyselinu salicylovou) a 235 nm (pro kyselinu askorbovou a kofein). V oblasti kontroly léčiv je novým trendem použití monolitických kolon umožňující zkrácení doby analýzy. Nově vyvinutá metoda v porovnání s dříve publikovanou HPLC metodou [63], využívající částicovou kolonu pro separaci výše zmíněných látek, zkracuje celkový čas analýzy 6 krát. Optimalizovaná metoda byla aplikována na stanovení účinných látek ve farmaceutickém přípravku Coldrex tablety (GlaxoSmithKline Dungarvan Ltd., Co. Waterford, Irsko). Je mnoho farmaceutických přípravků obsahujících stejné účinné látky jako testovaný přípravek. Navrhovaná metoda může být použita pro separaci a současné stanovení testovaných sloučenin v různých farmaceutických přípravcích po jednoduché revalidaci metody. Detaily viz. Příloha 6. 64

65 Disertační práce Přehled všech publikovaných prací 6 PŘEHLED VŠECH PUBLIKOVANÝCH PRACÍ 1) Žáková P., Sklenářová H., Havlíková L., Matysová L., Šatínský D.: Optimalizace HPLC stanovení klotrimazolu, Chemické Listy 103(3) (2009) ) Žáková P., Sklenářová H., Nováková L., Hájková R., Matysová L., Solich P.: Application of monolithic columns in pharmaceutical analysis. Determination of indomethacin and its degradation products, Journal of Separation Science 32 (15-16) (2009) , Special Issue: Monoliths 3) Sklenářová H., Koblová P., Chocholouš P., Šatínský D., Krčmová L., Kašparová M., Solichová D., Solich P.: Separation of vitamins retinol acetate, ergocalciferol or cholecalciferol and tocopherol acetate using sequential injection chromatography, Analytical Letters, 44 (1-3) (2011) ) Koblová P., Sklenářová H., Chocholouš P., Polášek M., Solich P.: Simple automated generation of gradient elution conditions in sequential injection chromatography using monolithic column, Talanta 84 (5) (2011) ) Matysová L., Koblová P., Galla L., Sklenářová H., Havlíková L., Solich P.: Chromatographic determination of active compounds in topical formulations, Analytical Methods, 2011, přijato k tisku (DOI: /C1AY05336A) 6) Koblová P., Sklenářová H., Brabcová I., Solich P.: Development and validation of a rapid HPLC method for the determination of ascorbic acid, phenylephrine, paracetamol and caffeine using monolithic column, Anal. Methods, 2011, odesláno k publikaci 65

66 Disertační práce Přehled přednášek a posterů 7 PŘEHLED PŘEDNÁŠEK A POSTERŮ 1) Žáková P., Sklenářová H., Havlíková L., Matysová L., Šatínský D.: Optimalizace HPLC stanovení klotrimazolu, 37. ročník konference Syntéza a analýza léčiv, , Brno, Česká republika 2) Matysová L., Havlíková L., Šestakova V., Žáková P., Solich P.: Application of Monolithic Columns for Determination of Estradiol, Methylparaben and Propylparaben, 5th Conference of Nordic Separation Science Society, , Tallinn, Estonsko 3) Havlíková L., Žáková P., Sklenářová H., Matysová L., Solich P.: Stanovení účinných látek v lubrikačních gelech metodou HPLC, 38. ročník konference Syntéza a analýza léčiv, , Hradec Králové, Česká republika 4) Žáková P., Sklenářová H., Chocholouš P., Brabcová I., Šatínský D., Solich P.: Determination of indomethacin and its degradation products by SIC with gradient elution using monolithic column, 11th Flow Analysis, , Pollensa, Mallorca, Španělsko 5) Žáková P., Sklenářová H., Chocholouš P., Šatínský D., Krčmová L., Solichová D., Solich P.: Separation of vitamins A, D3 and E acetate using sequential injection chromatography (SIC), 11th Flow Analysis, , Pollensa, Mallorca, Španělsko Oceněn odbornou porotou jako nejlepší poster. 6) Chocholouš P., Sklenářová H., Žáková P., Šatínský D., Krčmová L., Kašparová M., Solichová D., Solich P.: Sequential injection chromatography (SIC) for determination of fat-soluble vitamins in human blood serum, 11th Flow Analysis, , Pollensa, Mallorca, Španělsko 66

67 Disertační práce Přehled přednášek a posterů 7) Sklenářová H., Škrlíková J., Žáková P., Chocholouš P., Andruch V., Solich P.: On-line sample preparation in the sequential injection system, 16th International Conference on Flow Injection Analysis, , Pattaya, Thajsko 8) Žáková P., Sklenářová H., Chocholouš P., Solich P.: Comparison of separation quality in SIC and HPLC systems using gradient elution, 16th International Conference on Flow Injection Analysis, , Pattaya, Thajsko 9) Žáková P., Sklenářová H., Solich P.: Determination of vitamins A-acetate, D2 and E-acetate in ointment samples by HPLC using monolithic column, 28th International Symposium on Chromatography, , Valencie, Španělsko 10) Solich P., Sklenářová H., Škrlíková J., Žáková P., Chocholouš P., Andruch V., Polášek M.: On-line sample preparation in the sequential injection system, International Chemical Congress of Pacific Basin Socities, , Honolulu, USA 11) Koblová P., Sklenářová H., Chocholouš P., Solich P.: Advantages of monolithic columns for separation of pharmaceuticals, 1. fakultní PGS konference, , Hradec Králové, Česká republika 12) Koblová P., Sklenářová H., Brabcová I., Solich P.: Development and validation of a rapid HPLC method for the determination of ascorbic acid, phenylephrine, paracetamol, salicylic acid (internal standard) and caffeine using a monolithic column, 36th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, , Budapešť, Maďarsko 13) Brabcová I., Koblová P., Dvořáková P., Šatínský D., Solich P.: HPLC Determination of Lutein, Zeaxanthin and Beta-Carotene in Dietary Supplements, 36th International Symposium on High-Performance Liquid 67

68 Disertační práce Přehled přednášek a posterů Phase Separations and Related Techniques, , Budapešť, Maďarsko 14) Koblová P., Sklenářová H., Košvancová T., Brabcová I., Solich P.: Stability of active substances using different Coldrex HotRem preparation conditions, 11th International NUTRITION & DIAGNOSTICS, , Brno, Česká republika 15) Brabcová I., Koblová P., Dvořáková P., Šatínský D., Solich P.: Comparison of different extraction methods for the determination of lutein, zeaxanthin and beta-carotene in dietary supplements, International NUTRITION & DIAGNOSTICS, , Brno, Česká republika 68

69 Disertační práce Přílohy I-Publikace 8 PŘÍLOHY I PUBLIKACE 69

70 Disertační práce Příloha Příloha 1 Žáková P., Sklenářová H., Havlíková L., Matysová L., Šatínský D.: Optimalizace HPLC stanovení klotrimazolu, Chem. Listy 103(3) (2009) , IF = 0,620 70

71 Disertační práce Příloha 1 71

72 Disertační práce Příloha 1 72

73 Disertační práce Příloha 1 73

74 Disertační práce Příloha 1 74

75 Disertační práce Příloha 1 75

76 Disertační práce Příloha Příloha 2 Žáková P., Sklenářová H., Nováková L., Hájková R., Matysová L., Solich P.: Application of monolithic columns in pharmaceutical analysis. Determination of indomethacin and its degradation products, J. Sep. Sci. 32 (15-16) (2009) , Special Issue: Monoliths, IF = 2,631 76

77 Disertační práce Příloha 2 77

78 Disertační práce Příloha 2 78

79 Disertační práce Příloha 2 79

80 Disertační práce Příloha 2 80

81 Disertační práce Příloha 2 81

82 Disertační práce Příloha 2 82

83 Disertační práce Příloha 2 83

84 Disertační práce Příloha Příloha 3 Sklenářová H., Koblová P., Chocholouš P., Šatínský D., Krčmová L., Kašparová M., Solichová D., Solich P.: Separation of vitamins retinol acetate, ergocalciferol or cholecalciferol and tocopherol acetate using sequential injection chromatography, Anal. Lett., 44 (1-3) (2011) , IF = 0,920 84

85 Disertační práce Příloha 3 85

86 Disertační práce Příloha 3 86

87 Disertační práce Příloha 3 87

88 Disertační práce Příloha 3 88

89 Disertační práce Příloha 3 89

90 Disertační práce Příloha 3 90

91 Disertační práce Příloha 3 91

92 Disertační práce Příloha 3 92

93 Disertační práce Příloha 3 93

94 Disertační práce Příloha 3 94

95 Disertační práce Příloha 3 95

96 Disertační práce Příloha Příloha 4 Koblová P., Sklenářová H., Chocholouš P., Polášek M., Solich P.: Simple automated generation of gradient elution conditions in sequential injection chromatography using monolithic column, Talanta 84 (5) (2011) , IF = 3,722 96

97 Disertační práce Příloha 4 97

98 Disertační práce Příloha 4 98

99 Disertační práce Příloha 4 99