GanglioCombi. se směsí enzymů značených IgG a IgM. anti-ganglioside protilátky ELISA (GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b a GQ1b)

Transkript

1 GanglioCombi se směsí enzymů značených IgG a IgM anti-ganglioside protilátky ELISA (GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b a GQ1b) EK-GCO-GM 2 x 96 testů (12 profilů pacientů, IgG & IgM) Datum revize: / 10

2 POUŽITÍ Souprava Bühlmann GanglioCombi ELISA, EK-GCO-GM je určena pro kvantitativní stanovení klinicky nejvýznamnějších autoprotilátek IgG a IgM namířených proti gangliosidům GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b a GQ1b v lidském séru (2 profily/pacienta) (1-8 ). PRINCIP STANOVENÍ Metoda Bühlmann GanglioCombi ELISA je založena na principu enzymoimunometrického stanovení. Gangliosidy GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b a GQ1b jsou naneseny v jamkách mikrotitračních destiček. Kalibrátory, kontroly a pacientská séra se inkubují po dobu dvou hodin v jamkách mikrotitračních destiček. Během této doby se anti-gangliosidické autoprotilátky (Ab) přítomné ve vzorku váží na imobilizované gangliosidy. Po vymytí nenavázané substance se do jamek přidá směs protilátek proti lidskému IgG a/nebo IgM značených křenovou peroxidázou (HRP) a inkubuje se další dvě hodiny. Po druhém promytí, v němž jsou odstraněny protilátky, které se nenavázaly na enzym, je přidán do jamek roztok obsahující tetramethylbenzidin (TMB). Modré zbarvení se vyvíjí v závislosti na koncentraci autoprotilátek proti gangliosidům navázaných na mikrotitrační destičku v prvním kroku. Enzymová reakce působící modré zbarvení se zastaví přidáním kyselého blokovacího roztoku (zředěná kyselina sírová) a modrý roztok se zbarvý žlutě. Absorbance roztoku se měří při vlnové délce 450 nm. Naměřené absorbance je přímo úměrná titru antigangliosidických protilátek přítomných v daném vzorku. Množství antigangliosidických protilátek lze odečíst z kalibrační křivky. Bühlmann GanglioCombi ELISA je určena ke kvantifikaci protilátek izotopu IgG a IgM jedním testem. (IgG/IgM-Mix-konjugát, 1 profil / pacienta). Pro další diferenciaci izotypů IgG nebo IgM (individuální IgGand IgM-konjugát) lze využít EK-GCO-GM (2 profily / pacienta). DODÁVANÉ REAGENCIE A PŘÍPRAVA Reagencie Množství Katalog. číslo Rekonstituce Mikrotitrační destička potažená gangliosidy 2 x 12 x 8 jamek B-GCO-MP Připraveno k použití Krycí fólie 6 kusů Koncentrát promývacího pufru (10X) S konzervačními prostředky 2 lahvičky 100 ml B-GCO-WB Rozpusťte v 900 ml deionizované H 2O Inkubační pufr S konzervačními prostředky 2 lahvičky 100 ml B-GCO-IB Připraveno k použití Kalibrátor Lyofilizovaný s konzervačními prostředky Negativní, nízká a střední hladina kontroly Lyofilizované s konzervačními prostředky 1 lahvička B-GCO-CA 3 lahvičky B-GCOCONSET Přidejte 1,5 ml inkubačního pufru Přidejte 1,5 ml inkubačního pufru Enzymové markery IgG Protilátky proti lidskému IgG konjugovanému s HRP v pufru na bázi proteinu s konzervačními prostředky 1 lahvička 11 ml B-GCO-ELG Připraveno k použití Enzymové markery IgM Protilátky proti lidskému IgM konjugovanému s HRP v pufru na bázi proteinu s konzervačními prostředky 1 lahvička 11 ml B-GCO-ELM Připraveno k použití Substrát TMB TMB v roztoku H 2O 2 v citrátovém pufru 2 lahvičky 11 ml B-TMB Připraveno k použití 2 / 10

3 Blokovací roztok 0.25 M kyselina sírová 2 lahvičky 11 ml B-STS Připravená k použití Korozivní látka Tabulka 1 SKLADOVÁNÍ A TRVANLIVOST RAGENCIÍ Neotevřené reagencie Všechny neotevřené komponenty soupravy jsou stabilní při teplotě 2-8 C do expirace uvedené na štítcích. Otevřené / rekonstituované reagencie Mikrotitrační destička Promývací pufr Kalibrátor Kontroly Inkubační pufr Enzymové markery TMB substrát Blokovací roztok Nepoužité proužky ihned vraťte do hliníkového sáčku obsahujícího sušidlo a uzavřete po celé délce. Skladujte nejvýše 4 měsíce při teplotě 2-8 C. Skladujte nejvýše 4 měsíce při teplotě 2-8 C. Skladujte nejvýše 1 měsíc při 2-8 C. Nezmrazujte! Skladujte při 2-8 do expirace uvedené na štítku. Skladujte při C. BEZPEČNOSTNÍ UPOZORNĚNÍ A OPATŘENÍ Kalibrátor (B-GCO-CA) a kontroly (B-GCO-CONSET) této sady obsahují komponenty lidského původu. Každé použité sérum bylo testováno metodami schválenými FDA na povrchový antigen HBV a na protilátky proti HCV a HIV 1/2 a shledáno negativním. I přes vysokou přesnost těchto metod nelze zaručit, že materiály nemohou přenášet hepatitidu nebo AIDS. Z těchto důvodů se se všemi pacientskými vzorky a komponenty soupravy musí nakládat, jako by byly potenciálně infekční. Se všemi výrobky obsahujícími komponenty lidského séra se musí nakládat v souladu s dobrou laboratorní praxí při dodržení příslušných bezpečnostních předpisů. POTŘEBNÉ LABORATORNÍ VYBAVENÍ A POMŮCKY Přesné pipety se špičkami na jedno použití: 20 µl, 100 µl a1 ml. Polystyrenové nebo polypropylenové zkumavky na jedno použití pro ředění vzorků. Odměrný válec 1000 ml pro rekonstituci promývacího pufru. Střička na promývací pufr nebo automatická myčka na mikrotitrační destičky. Savý papír. Rotátor na mikrotitrační destičky. Fotometr na mikrotitrační destičky pro měření absorbance při 450 nm. ODEBĚR A SKALDOVÁNÍ VZORKŮ Stanovení vyžaduje <0,1 ml krve příp. <50 µl séra. Podrobnosti o interferencích hemolyzovaných, lipemických nebo ikterických vzorků najdete na str. 6 Odeberte krev do obyčejných zkumavek (ne antikoagulačních) tak, aby nedošlo k hemolýze, nechte 1 hodinu vysrážet, proveďte centrifugaci 10 minut při přibližně 1500 x g a pokojové teplotě (18-28 C). Pak odeberte sérum. 3 / 10

4 Při dlouhodobém skladování doporučujeme zamrazení pacientských vzorků. Je však třeba zabránit opakovanému zmrazení / rozmrazení. Vzorky séra uchovávejte při teplotě 20 C max. 4 měsíce. Při teplotě 70 C jsou vzorky stabilní po dobu >1 rok. Před použitím se musí nechat zmrazené sérum důkladně rozpustit a promíchat (Vortex). POKYNY K PRACOVNÍMU POSTUPU Doporučení a varování při provádění stanovení Výsledky a výstupy testu mohou být ovlivněny mnoha faktory. Je důležité, aby striktně dodržovat protokol a preanalytické požadavky. Zejména doporučujeme věnovat pozornost následujícím krokům: Rezidua v jamkách mikrotitračních destiček z výrobního procesu. Jsou odstraněny promytím (Postup stanovení - krok 3) a nemají vliv na výsledky. Kroky 3-9: Pro všechny tyto kroky používejte chlazené (2-8 C) reagencie, je vhodné je chladne i pipetovat. Kroky 3, 6, 9: Ujistěte se, že jsou jamky kompletně prázdné po posledním promývacím cyklu Krok 9: Před použitím vytemperujte TMB substrát na pokojovou teplotu (18-28 C). Krok 11: Mikrotitrační destičky se substrátem je třeba během inkubace promíchávat. V závislosti na třepačce doporučujeme 400 až 600 ot. / min. Roztok by měl být přesouván v jamce, ale nesmí se přelít přes okraj. Používáte-li automatickou promývačku, měl by být režim promývání zvolen tak, aby bylo dávkování prováděno postupně do všech jamek před nasátím. POSTUPU STANOVENÍ 1. Nařeďte všechny pacientské vzorky inkubačním pufrem v poměru 1:50. Použijte 30 µl séra µl inkubačního pufru. Důkladně promíchejte a nechte naředěné vzorky, rekonstituované kalibrátory a kontroly před pipetováním po dobu 30 minut při teplotě 2-8 C (viz krok 4 a-c). 2. Připravte si mikrotitrační destičku s požadovaným počet testovacích proužků pro vzorky pacientů. Přebytečné proužky vyjměte z držáku a ihned je vraťte do sáčku se sušidlem a dobře uzavřete. Skladujte v chladu. Poznámka: Použijte chlazené reagencie v krocích 3 až 9 3. Promyjte jamky, každou nejméně 300 µl chlazeného promývacího pufru. Vyprázdněte jamky a důkladně vyklepejte na savý papír tak, aby se odstranila přebytečná tekutina. Poznámka: Ihned přejděte k dalšímu kroku (4a-e). Detekce izotopu IgG 4a. Kalibrátor: Napipetujte 100 µl kalibrátoru do jamky A1(viz obr. 1). 4b. Kontroly: Napipetujte 100 µl střední hladiny kontroly do jamky B1, 100 µl nízké hladiny kontroly do jamky A2 a negativní kontrolu do jamky B2 (viz obr. 1). Poznámka: Jsou-li používány více než tři proužky na běh lze testovat kalibrátory a kontroly v duplikátu (viz obr. 1). 4c. Pacientské sérum: Napipetujte 100 µl naředěného pacientského séra 1 do jamek C1 - H1 (viz obr. 1). 4d. Pacientské sérum: Napipetujte 100 µl naředěného pacientského séra 2 do jamek C2 - H2 (viz obr. 1). 4e. Napipetujte 100 µl naředěného pacientského séra 3-12 do dalších jamek (viz obr. 1). Detekce izotopu IgM 5. Zopakujte kroky 4a 4e v jamkách, které následují. 4 / 10

5 6. Přikryjte mikrotitračná destičku fólií a nechejte inkubovat 2 hodiny ± 5 minut při teplotě 2-8 C (nepromíchávat). 7. Odstraňte krycí fólii. Vyprázdněte jamky a promyjte je třikrát každou nejméně 300 µl chlazeného promávacího pufru. Jamky vyprázdněte a důkladně vyklepejte na savý papír. 8. Do všech jamek přidejte 100 µl enzymového roztoku. 9. Přikryjte mikrotitrační destičku fólií a nechejte inkubovat 2 hodiny ± 5 minut při teplotě 2-8 C. (nepromíchávat). 10. Odstraňte krycí fólii. Vyprázdněte jamky a promyjte je třikrát každou nejméně 300 µl chlazeného promávacího pufru. Jamky vyprázdněte a důkladně vyklepejte na savý papír. Důležité upozornění: Nechejte substrát TMB vytemperovat na C. 11. Do každé jamky přidejte 100 µl substrátu TMB. 12. Přikryjte destičku fólií, umístěte ji na rotátor nastavený na rpm a nechejte inkubovat 30 minut ± 2 minuty při C. Chraňte ji před přímým světlem. 13. Do každé jamky přidejte 100 µl blokovacího roztoku. Do 30 minut proveďte krok Ve fotometru na mikrotitrační destičky změřte absorbanci při 450 nm. VÝSLEDKY A VÝPOČET Standardizace Kalibrátor, který je součástí tohoto kitu, byl kalibrován pomocí Výsledek byl upraven na 200% podíl. interního referenčního materiálu. Výpočet výsledků: 1. Pro každou jamku změřte abrorbanci při 450 nm (vzorky kontrol, kalibrátoru a pacientů). 2. Vypočítejte průměr z duplikovaných hodnot kontrol a kalibrátoru (pokud jsou). 3. Výsledky jsou vyjádřeny jako poměr absorbance vzorků a (průměrné) absorbance kalibrátoru % výsledek = absorbance vzorků a kontrol / absorbance kalibrátoru x 200 Programy pro výpočet výsledků v % jsou dostupné na většině readerů. Poznámka: Výsledky uvedené v Tebulce 11 slouží pouze jako příklad. Hodnoty absorbancí kontrol a kalibrátoru je nutné stanovit pro každou sadu měřených vzorků samostatně. 5 / 10 KONTROLA KVALITY Pro správné použití výrobku je nezbytné prostudování tohoto příbalového letáku. Spolehlivé výsledky získáte pouze při dodržení přesných laboratorních postupů (běžné směrnice GLP - dobrá laboratorní praxe) a tohoto návodu. Protože na trhu není běžně dostupné kontrolní sérum pro protilátky proti gangliosidu, doporučujeme pro interní kontrolu kvality použít pozitivní a negativní směsné sérum. Výsledky všech naměřených kontrol musí být v předepsaných rozmezích. Limity spolehlivosti kontrol jsou specifické pro šarži a jsou vyznačeny na příbalovém letáku kontroly. Reprodukovatelnost parametrů kalibrační křivky a výsledků kontrol musí být v rámci stanovených limitů

6 přijatelnosti pro laboratoř. Jestliže přesnost stanovení neodpovídá stanoveným limitům a opakované měření vyloučí technickou závadu, je nutné zkontrolovat následující: i) zda byly všechny reagencie používané v kroku 3-9 uchovávány při teplotě 2-8 C, ii) pipetování, přístroje měřící teplotu a čas, iii) kalibrace fotometru, iv) expirace reagencií, v) podmínky skladování a inkubace, vi) Substrát TMB, vii) čistota vody. ZNAKY METODY Přesnost v rámci stanovení: 3,6%. Přesnost v rámci stanovení byla vypočítána z výsledků 12 hodnot vzorků IgM a/nebo IgG stanovených při jednom měření. Výsledky v Tabulce 12 jsou vypočteny v %, jak je popsáno v části "Výsledky a výpočet". Přesnost mezi stanoveními: 13,9%. Přesnost mezi stanoveními byla zjištěna měřením různých vzorků séra se všemi 6 gangliosidy ve 20 různých měřeních. Výsledky v Tabulce 13 jsou vypočteny v %, jak je popsáno v části "Výsledky a výpočet". Analytická citlivost: 12 replikátů inkubačního pufru bylo analyzováno v jednom stanovení. Detekční limit, vyjádřený jako% podíl kalibrátoru, byl vypočítán na 5%. Funkční citlivost: Přesnost v rámci stanovení a mezi stanoveními u vzorků séra byla stanovena od 4 do 222%. Průměrné hodnoty a CV% byly vypočteny pro každý vzorek. Obrázek 2 ukazuje polynomický graf X / Y zobrazující procentuální závislost přesnosti v rámci stanovení a mezi stanoveními. Výsledná křivka byla pod horní hranicí 15% a 20% CV v rámci a mezi stanoveními, tzn. že metoda poskytuje spolehlivé výsledky. Linearita: lineární rozsah testovacího systému byl hodnocen podle pokynu CLSI EP06-A. Tento systém je lineární v diagnosticky příslušném rozmezí mezi 20 a 100%. Výsledky vyšší než 100% jsou hodnoceny jako klinicky správné a lze je ředit do lineární řady v poměru 1:05 / 1:10. Specificita: Různé vzorky pacientského séra se specifickými autoprotilátkami IgM a/nebo IgG proti gangliosidu byly inkubovány přes noc s odpovídajícím rozpuštěným antigenem a poté testovány metodou Bühlmann GanglioCombi ELISA. Inhibice autoprotilátek byla prokázána při specifické koncentraci antigenu mezi 1 a 100 µg/ml (data neuvedena). INTERFERUJÍCÍ SUBSTANCE Interference nebyla detekována u těchto látek do následujících koncentrací: Triglyceridy (Intralipid ): 3000 mg / dl, konjugovaný bilirubin: 60mg/dL; nekonjugovaný bilirubin: 40 mg / dl a hemoglobin: 400 mg / dl. OČEKÁVENÉ HODNOTY A CUT-OFF Ve spolupráci s institucemi uvedenými níže, byla stanovena cut-off hodnota 50%. Výsledky <30% byly klasifikovány jako jasně negativní. Kategorie byly stanoveny na základě analýzy 100 vzorků (n=100) od dárců krve 1 (dospělí muži a ženy mezi 18 až 70 roky) a 277 patologických vzorků (n = 277) 2. Séra byly testovány na každý ze šesti gangliosidů (GA1, GM1, GM2, GD1a, GD1b a GQ1b) dle uvedeného postupu. Výsledky dárců krve jsou uvedeny v tabulce 14. Pokyny pro používání Cut-off a jednotlivých kategorií / rozmezí (%): Kategorie Rozmezí (%) Negativní < 30% Šedá zóna 30 50% Cut-off 50% Pozitivní % Silně pozitivní 100% 1) shromážděných v dárcovském centru univerzitní nemocnice v Basileji 2) získaných od Friedrich-Baur-Institutu, univerzity Ludwiga-Maximiliana v Mnichově, Neurologické kliniky, Univerzity v Basileji a Neurologické klinika, University of Lyon. 6 / 10

7 7 / 10

8 8 / 10

9 9 / 10

10 10 / 10