Kvantitativní stanovení hemoglobinu ve stolici: nová metoda detekce okultního krvácení

Transkript

1 Masarykův onkologický ústav Lékařská fakulta Masarykovy univerzity Kvantitativní stanovení hemoglobinu ve stolici: nová metoda detekce okultního krvácení Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: RNDr. Lenka Dubská, PhD. Autor: Lucie Juránková Brno, duben 2010

2 Jméno a příjmení autora: Název bakalářské práce: Pracoviště: Vedoucí bakalářské práce: Lucie Juránková Kvantitativní stanovení hemoglobinu ve stolici: nová metoda detekce okultního krvácení Oddělení laboratorní medicíny RNDr. Lenka Dubská, PhD. Rok obhajoby bakalářské práce: 2010 Souhrn: Stanovení hemoglobinu ve stolici slouží k odhalení okultního krvácení do střeva ke screeningu kolorektálního karcinomu a střevních prekanceróz. Uvedení do této problematiky je popsáno v obecné části, kde jsou základní údaje o patogenezi kolorektálního karcinomu, laboratorní nálezy spojené s tímto onemocněním a možnosti laboratorního screeningu nádorů střeva a konečníku. Ve speciální části je pak popsána testovaná imunoanalytická metoda záchytu hemoglobinu ve stolici, analytické parametry metody a výsledky měření v kontextu klinického nálezu. Na závěr je uveden návrh algoritmu laboratorního screeningu CRC. Klíčová slova: okultní krvácení, kolorektální karcinom, screening Summary: Determination of faecal hemoglobin is used for screening occult bleeding and for colorectal carcinoma and colon premalignant lesion. The introduction to the topic is described in the general chapter of the thesis, which includes the basic data about pathogenesis of colorectal cancer, laboratory findings in colorectal carcinoma patients and laboratory screening of colorectal tumors and adenomas. The experimental chapter includes immunoanalytical metod for faecal hemoglobin detection, analytical parameters and results in the context of the clinical findings. Finally, we suggest the algorithm of laboratory screening of CRC. Keys words: occult bleeding, colorectal carcinoma, screening norem. Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných

3 Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením RNDr. Lenky Dubské, PhD. V seznamu literatury jsem uvedla všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne... (vlastnoruční podpis autora)

4 Poděkování Chtěla bych velmi poděkovat své vedoucí práce RNDr. Lence Dubské, PhD. za vedení bakalářské práce, za odborné rady, připomínky, trpělivost. Děkuji také celému kolektivu spolupracovníků z Oddělení laboratorní medicíny z Masarykova onkologického ústavu v Brně a v neposlední řadě také MUDr. Milaně Šachlové CSc. et PhD. za kritické připomínky ke klinické stránce problematiky.

5 Obsah Seznam použitých symbolů a zkratek 7 A Obecná část 8 1. Úvod 8 2. Nádory tlustého střeva Anatomie dolní části trávicí soustavy a lokalizace nádorů Nádory tlustého střeva a konečníku Benigní nádory Maligní karcinomy Patogeneze kolorektálního karcinomu Hereditární etiologie Sporadická etiologie K-ras Protein p Epidemiologie Laboratorní nálezy u karcinomu tlustého střeva Nádorové markery Nespecifické laboratorní nálezy u kolorektálního karcinomu Sideropenická anemie Reaktanty akutní fáze a nádorová aktivita Tumor lysis syndrom Jaterní metastázy Screening kolorektálního karcinomu Chemické (guajakové) testy Imunochemické testy (ifobt) Haptoglobin hemoglobinový test 21 5

6 B Speciální část Cíl práce Materiál a metody Materiál Reagencie, spotřební materiál, analyzátor Biologický materiál, preanalytická fáze Metody Analytické parametry testu a výsledky Linearita Opakovatelnost Reprodukovatelnost Specifita měření Validační studie Výsledky, zavedení testu do klinické praxe v MOÚ Souhrn výsledků za období červen únor Stanovení hemoglobinu ve stolici a kolonoskopický nález Diskuze Závěr Seznam použité literatury Přílohy 45 6

7 Seznam použitých symbolů a zkratek ALP ALT AST CEA CRC CRP DNA FAP GMT Hb H 2 O H 2 O 2 HNPCC K-ras LDH MOÚ OLM SOP TLS Alkalická fosfatáza Alaninaminotransferáza Aspartátaminotransferáza Karcinoembryonální antigen Kolorektální karcinom C-reaktivní protein Deoxyribonukleová kyselina Familiární adenomatózní polypóza Gamaglutamyltransferáza Hemoglobin Voda Peroxid vodíku Hereditary nonpolyposis colorectal cancer Kirsten-RAS, onkogen Laktátdehydrogenáza Masarykův onkologický ústav Oddělení laboratorní medicíny Standardní operační postup Tumor lysis syndrom 7

8 A Obecná část 1. Úvod Kolorektální karcinom je jedním z nejčastějších nádorových onemocnění. Pokud je toto onemocnění odhaleno včas, je dobře léčitelné, proto zde zásadní roli hraje screening. Velký význam má také záchyt prekancerózních adenomatózních polypů. Pokud dojde k jejich odstranění, sníží se výskyt maligního kolorektálního nádoru. Screeningové postupy zahrnují zpravidla vyšetření stolice na přítomnost skrytého (okultního tj. nepozorovatelného) krvácení, případně screeningovou kolonoskopii. Od testů na detekci okultního krvácení se očekává vysoká citlivost, ale také vysoká specificita, aby se předešlo zbytečným návazným vyšetřením a stresu pro vyšetřovaného v případě falešně pozitivního záchytu. 8

9 2. Nádory tlustého střeva 2.1. Anatomie dolní části trávicí soustavy a lokalizace nádorů Konečnou částí trávicí trubice je tlusté střevo, které má délku 1,5 m a šířku 5 7 cm. Typické je, že sliznice nemá klky, pouze nízké řasy. Na začátku je tvořeno slepým střevem a jeho výběžek se nazývá apendix. Dále následují další oddíly jako je tračník vzestupný, příčný a sestupný, konečnou částí je konečník. Konec trávicí trubice je tvořen řitním otvorem (Novotný, Hruška., 2003) (obr. 1). Obr. 1: Anatomie tlustého střeva (Screening kolorektárního karcinomu; Lokalizace karcinomů CRC je ve vzestupném (pravém) a sestupném (levém) tračníku, konečníku i otvoru řitním. Karcinomy z pravého tračníku mají polypózní růst a vzácně způsobují obstrukci střeva. Karcinomy z levého tračníku rostou cirkulárně ve stěně střeva a stenózují lumen. Pravostranné a levostranné karcinomy jsou mikroskopicky identické. Typické pro všechny CRC je jejich postupné prorůstání střevní stěnou do okolních struktur, odtud se odvíjí i prognóza a infiltrace do krevních a lymfatických cest. Anální karcinom se od CRC makroskopicky neliší a z mikroskopického hlediska se jedná o dlaždicobuněčný karcinom (Jablonská et al., 2000). 9

10 Zhoubné nádory (karcinomy) a jejich výskyt v procentech: - 25% cékum (apendix-slepé střevo), vzestupná část tlustého střeva - 25% rektum, dolní část sigmoidea (esovitá klička) - 25% sestupná část tlustého střeva a horní část sigmoidea (esovitá klička) - 25% ostatní úseky střeva (Mačák, Mačáková, 2004) Nádory tlustého střeva a konečníku Kolorektální nádory mohou být benigní či maligní, přičemž benigní stádium zpravidla přechází v invazivní typ tumoru a hovoří se v takovém případě o premaligním stádiu Benigní nádory Adenom je benigní nádor epitelového původu, který se může vyskytovat ve všech oblastech střeva, je považován za premaligní lézi, prekurzor intestinálního karcinomu. I když asi jen ve 3 % dochází k jeho transformaci v karcinom, jde o závažné onemocnění. Adenom se nachází ve sporadické a hereditární formě a jeho členění lze provést makroskopicky na: polypózní léze a ploché léze. Mikroskopicky se benigní nádory kolorekta rozdělují na tubulární adenomy tvořené tubulárními strukturami. U vilózních adenomů jsou jejich struktury protáhlé s prstencovitými tvary. Adenomy tubulovilózní jsou tvořeny z nádorových žlázek a papil. Mezi další benigní nádory patří ademomy serrated-pilovité a mikrotubulární (Holubec et al., 2004) Maligní karcinomy Karcinom obecně je zhoubný nádor z epiteliálních buněk typický s invazí do submukózy. Kolorektální karcinom může z makroskopického hlediska vykazovat růst intraluminární (exofytický) vyskytující se hlavně v pravé polovině tračníku, kde se velice často vytvářejí chronické krevní ztráty. Ulcerózní (endofytický) růst je většinou nacházen v levé části s projevem poruchy pasáže střeva. Jeho mikroskopické dělení karcinomu je na: a) tubulární adenokarcinom, tvořený strukturami tubulárními, b) mucinózní karcinom, který je tvořen v 50 % komponentou hlen-mucin, c) karcinom z buněk tvaru pečetního prstenu, který je v oblasti tlustého střeva vzácný, d) adenoskvamózní karcinom, kde pozorujeme žlázové a 10

11 dlaždicovité struktury, e) medulární karcinom s nemalými tumorovými buňkami a jádry, f) nediferencovaný karcinom, kde nenacházíme žlázové struktury (Holubec et al., 2004) Patogeneze kolorektálního karcinomu Etiologie kolorektálního karcinomu může být hereditární (geneticky podmíněná) a sporadická (bez rodinné zátěže). V obou případech je možné patogenezi kolorektálního karcinomu popsat několikafázovým Vogelsteinovým modelem z roku 1990 (obr. 2). Vogelstein a Fearon předložili podklady o několikafázovém modelu vývoje sporadického CRC u adenomových polypů se somatickou mutací některých onkogenů a tumor supresorových genů. U onkogenů vznikne blokace v aktivní formě a u tumor supresorových genů dojde k opačnému procesu, tedy k deaktivaci po ztrátě jedné nebo obou alel, ke které dojde po somatické mutaci. U tohoto modelu dochází k sekvenční akumulaci, což znamená, že mutace vzniknou v různé fázi transformace (Vogelstein, Fearon, 1990). Hyperproliferativní epitel Normální Ztráta nebo mutace genu APC na chromozomu 5q Overexprese cyklooxygenázy (COX1 Časný adenom Hypometylace DNA Středně pokročilý adenom Pozdní adenom Mutace genu K-ras na chromozomu 12p Mutace nebo ztráta DCC genu na chromozomu Ztráta nebo mutace genu p53 na Karcinom Obr. 2: Vývoj CRC : (Adaptováno dle: Fearonova-Vogelsteinova modelu vzniku CRC). 11

12 Hereditární etiologie Geneticky podmíněné kolorektální karcinomy představují asi 15 % CRC a jsou asociovány s těmito syndromy: familiární adenomatózní polypóza, Gardnerův, Turkottův syndrom, syndrom plochých adenomů, hereditární nepolypózní karcinom, Peutzův-Jeghersův syndrom, Lynchův syndrom, Cowdenův syndrom, familiární juvenilní polypóza (Jablonská et al., 2000) (tab. 1). Syndrom Alternovaný gen Lokalizace genu Familiární adenomatózní polypóza APC 5q21-22 Peutzův-Jeghersův syndrom STK 11 19p13.3 Cowdenův syndrom PTEN 10q23.3 Familiární juvenilní polypóza SMAD4 18q21.1 Hereditární nepolypózní kolorektální karcinom hmsh-2 2p22 hmlh-1 3p21.3 hmsh-6 2p16 Tab. 1: Některé genetické abnormality u vybraných geneticky podmíněných typů CRC (Klener et al., 2002). Některé z těchto syndromů a genetických zátěží jsou klasifikovány na základě výskytu abnormality v genu či genech hrajících úlohu v patogenezi kolorektálního karcinomu. Např. FAP je onemocnění, kde velikou roli hraje mutace v genu APC a způsobí tak autozomálně dominantně dědičný syndrom FAP, u kterého je typický rozvoj stovek až tisíců prekancerózních adenomatózních střevních polypů. Polypy se začínají objevovat již v mladším věku, další rozvoj je kolem 35. roku věku, kdy je riziko maligního zvratu (Vyzula et al., 2007). Vedle FAP je nejčastějším genetickým onemocněním hereditární nepolypózní karcinom tlustého střeva označovaný jako HNPCC, Lynchův syndrom. HNPCC má incidenci 2 3 % a vyskytuje se již ve věku 42 až 44 let. Většinou se zde nevyskytují mnohočetné polypy a jeho etiologií je MMR tzv. mismatch-repair, defekt genů, které reparují DNA, tedy opravují náhodné chyby vznikající při replikaci DNA (Klener et al., 2002). Lynchův syndrom byl poprvé popsán u 2 velkých rodin s dědičným výskytem mutací v genech pro reparaci DNA, 12

13 především DNA v MLH1, MHL2. Byla také prokázána role MYH (chromozom 1 p32.1), jehož funkcí je odstraňování chyb způsobených oxidativním působení DNA. MYH geny se podílejí nejen na vzniku CRC, ale i jiných onkologických onemocnění jako je např. rakovina prsu, endometria (Lynch et al., 2009) Sporadická etiologie Rozdíl mezi sporadickou a hereditární formu CRC: u hereditární formy kolorektálního karcinomu je typická vrozená mutace některého ze zmíněných genů např. genu APC u FAP a dojde tedy k rychlejšímu nástupu onemocnění. Sporadických forem CRC je cca 85 % a vznikají působením vnějších faktorů, nikoliv dědičné dispozice (Gryfe et al., 1990). Na vzniku kolorektálního karcinomu se podílí mimo jiné i exogenní vlivy jejichž součástí jsou karcinogenní látky, mezi které patří tuky, červené maso. Dalšími faktory, které přispívají na vzniku CRC, je sedavé zaměstnání, nadměrná konzumace alkoholu, nedostatek fyzické aktivity, který souvisí s obezitou. V potravě jsou to nedostatky vápníku, vitamínu A, C, E a selenu (Jablonská et al., 2000). Genetická změna vyvolá vysokou proliferaci buněk sliznice tlustého střeva a konečníku. Dochází k selhání funkce tumor supresorových genů, které kontrolují normální buněčnou proliferaci a diferenciaci (zde se uplatňují zejména geny APC, ale také JV 18, DPC 4, MADR 2). Dále se zde uplatňuje mutace v onkogenech např. K-ras, který aktivovaný mutací podpoří tvorbu polypů. Dalším faktorem je ztráta genu DCC, která opět iniciuje růst polypů. Posledním krokem je mutace a vyřazení funkce genu p53. Sledem těchto událostí dochází k rychlému růstu nádoru, prorůstání do okolních tkání a metastazování. Z benigního nádoru se tak stává maligní a proces trvá asi 8 let (Kathleen, Vogelstein, 1992). 13

14 K-ras Na patogenezi kolorektálního karcinomu se často podílí onkogen K-ras. Jeho proteinový produkt se účastní regulace buněčného dělení a to tak, že přenáší signál z vnějšku buňky do buněčného jádra. Pokud dojde k mutaci proteinu K-ras, zůstává tento protein aktivní bez ohledu na přítomnost aktivačních signálů, které přicházejí z membránových receptorů (Normanno et al., 2009) (obr. 3). Vyšetření mutací tohoto genu hraje velkou roli v léčbě metastatického CRC, protože pokud je prokázána mutace, je pacient rezistentní vůči léčbě anti-egfr (cetuximab a panitumumab), není tedy vhodný pro tuto léčbu (Bardelli, Siena, 2010). Obr. 3: Mechanismus stimulace EGFR a léčby anti-egfr protilátkami (Siddigui, Piperdi, 2010). 14

15 Protein p53 Klíčovou úlohu v patogenezi CRC má také nádorový supresor p53. Protein p53 označovaný jako strážce genomu reguluje expresi některých genů (obr. 4), které kontrolují růst a stárnutí buněk, opravu DNA a růst nových cév. Jeho inaktivace přispívá k transformaci v karcinom. Za normálních okolností se vyskytuje v neaktivní formě a jeho koncentrace je velmi nízká, aktivuje se na základě působení stresových podmínek a tím pádem dojde tedy i ke zvýšení jeho hladiny (Smith et al., 2005, Vojtěšek et al., 1992). 2000). Obr. 4: Mechanismus působení nádorového supresoru p53 (Pospíšilová, Vojtěšek, 15

16 2.4. Epidemiologie CRC je spolu s nádory kůže, plic a prsu třetí nejčastější malignitou, které se v dnešní době vyskytují v ČR. Každý rok je v České republice diagnostikováno pacientů a na něj zemře. Jeho výskyt stále narůstá (obr. 5) (Dušek et al., 2009). Obr. 5: Incidence a mortalita CRC od roku 1977 do roku 2007 (Mužík et al., 2007). V celosvětovém srovnání ve výskytu kolorektálního karcinomu je česká populace mužů na prvním místě a ženy jsou na místě osmém (obr. 6). Obr. 6: Srovnání incidence nádorů tlustého střeva a konečníku u žen a mužů v ČR s ostatními zeměmi světa (Mužík et al., 2007). 16

17 3. Laboratorní nálezy u karcinomu tlustého střeva V této kapitole jsou popsány nejvýznamnější laboratorní odchylky, které nacházíme u pacientů s kolorektálním karcinomem. První podkapitola je věnována tzv. nádorovým markerům a druhá podkapitola se zabývá laboratorními nálezy, které nejsou specifické pro toto onemocnění, nicméně jsou často spojeny a mohou v některých případech upozornit na možnost výskytu nádoru střeva Nádorové markery Nádorové markery se obecně využívají pro sledování onemocnění při léčbě, v remisi, mohou být prognostickým ukazatelem, informovat o původu nádorového onemocnění a v některých případech je také využíváme ke screeningu (např. CA 125 u nádorů ovárií). Markery jsou látky přítomné v nádoru, produkované nádorem a nebo je produkuje hostitel na přítomnost nádoru a toho využíváme v diagnostice. CEA je onkofetální glykoprotein s jedním polypetidovým řetězcem, molekulová hmotnost je kda a je produkován během embryonálního vývoje, kde je syntetizován v epiteliálních buňkách a to zejména na jejich membránách. Za fyziologických podmínek je v dospělosti syntetizován v minimální koncentraci v epiteliálních buňkách střevní sliznice, žaludku a bronchu, je orgánově nespecifický. Zvýšená hladina je pozorována u benigního onemocnění a to zejména u pacientů s jaterní cirhózou, Crohnovou chorobou, ulcerózní kolitidou, hepatitidou, zánětů pankreatu, ale i u kuřáků. Během maligního procesu, hlavně u karcinomů tlustého střeva a konečníku, je produkován nádorovou tkání a jeho koncentrace se zvyšuje ke vztahu k celkové hmotě nádorů. Používá se obvykle hodnota cut-off 5 µg/l. CA 19-9 je onkofetální glykolipid, syntetizovaný během vývoje plodu ve žlučových cestách, pankreatu a žaludku, v nízkých koncentrací ho nacházíme v dospělosti v pankreatu, žlučníku, bronchu. Zvýšenou koncentraci tohoto markeru pozorujeme u nádorových onemocnění, jako je karcinom pankreatu a kolorektální karcinom, kde má vysokou senzitivitu. Exponenciální nárůst hladiny v séru je obvykle známkou vzdálených metastáz. Nízká hodnota CEA a CA 19-9 nemůže vyloučit nádorové onemocnění, protože nejsou orgánově specifické a jejich zvýšená hodnota nemusí nasvědčovat onkologickému onemocnění. Nelze je tedy použít pro screening nádorového onemocnění (Valík et al., 2009). 17

18 3.2. Nespecifické laboratorní nálezy u kolorektálního karcinomu Mezi laboratorní odchylky, které nacházíme u CRC patří sideropenická anémie v důsledku krvácení do střeva, v důsledku růstu nádoru např. reaktanty akutní fáze, zvýšenou laktátdehydrogenázu. Při tvorbě jaterních metastáz vlivem nádoru dochází k aktivaci jaterních enzymů a vlivem cytostatické léčby vzniká tzv. tumor lysis fenomén Sideropenická anémie Anémie (chudokrevnost) je chorobný stav, kde je typické snížení hemoglobinu pod fyziologickou mez. Sideropenická anémie vzniká z nedostatku železa v organismu, tento nedostatek je vyvolán zvýšenou ztrátou železa (Fe), nedostatečným přívodem nebo zvýšeným nárokem organismu. K nadměrným ztrátám Fe dochází u déletrvajícího krvácení, v případě CRC do zažívacího traktu. Nedostatečný přívod železa je způsoben poruchou vstřebávání a nedostatkem Fe v potravě. Mezi laboratorní projevy sideropenické anémie patří mikrocytóza a hypochromie (Hoffman et al., 2005 ). K odlišení sideropenické anémie od anémie chronických chorob se používá biochemické vyšetření železa, feritinu, transferinu, saturace transferinu, celková vazebná kapacita železa. U sideropenické anémie jsou snížené hodnoty železa, feritinu, saturace transferinu a naopak zvýšené jsou hladiny transferinu a celkové vazebné kapacity (Brejcha, Gumulec, 2003) Reaktanty akutní fáze a nádorová aktivita Sedimentace erytrocytů je nespecifické vyšetření, které slouží k diagnostice akutních a chronických zánětů, infekcí, nádorů, ale také k monitorování aktivity právě probíhajících zánětlivých stavů. U koloretálního karcinomu mohou být zvýšené hodnoty sedimentace vlivem změny fyzikálních vlastností bílkovin, tzn. dochází ke změnám koncentrace pozitivně nabitých sérových proteinů, jako je fibrinogen a imunoglobuliny. Dalším reaktantem akutní fáze je bílkovina C-reaktivní protein, která se tvoří v játrech. CRP je citlivý marker zánětu, používá se k odlišení virové a bakteriální infekce, zhodnocení těžkého poškození tkání a monitorování antibiotické léčby. Je zvýšen u infekcí jakéhokoliv původu včetně nádorů a k jeho zvýšení dochází na rozdíl od sedimentace již po několika hodinách (Murray et al., 2002). 18

19 Laktátdehydrogenáza je cytoplazmatický orgánově nespecifický enzym, který katalyzuje reakci anaerobní glykolýzy, což je redukce pyruvátu na laktát. Takový metabolismus (anaerobní) je typický u nádorů a proto jsou nacházeny její zvýšené koncentrace v plazmě onkologických pacientů. Laktátdehydrogenáza je indikátorový jaterní enzym reagující na poškození jaterních buněk. LDH patří mezi rizikové faktory při vzniku syndromu nádorového rozpadu (tumor lysis syndrom), který bude vysvětlen v následující kapitole a její hladina koreluje s objemem tumoru. (Masopust, 1998, Klener et al., 2002) Tumor lysis syndrom Při terapii nádorového onemocnění může vzniknout tzv. syndrom nádorového rozpadu (TLS - tumor lysis syndrom). TLS můžeme definovat jako rozvrat vnitřního prostředí, který vznikl spontánně nebo léčbou vyvolanou nekrózou či rychlou apoptózou. Na patogenezi TLS se podílí: a) zvýšená hladina kyseliny močové (látka, která vzniká odbouráváním nukleových kyselin). U nádorů dochází k vysokému obratu nukleových kyselin, z tohoto důvodu se zvyšuje koncentrace kyseliny močové v séru. Následuje její ukládání v ledvinách ve formě krystalů a k akutnímu selhání ledvin. b) zvýšená hladina fosfátů (hlavní intracelulární anionty), která je způsobená zvýšeným rozpadem buněk, tím dojde k vylití do extracelulární tekutiny (plazma). c) zvýšená hladina draslíku (K + je hlavní intraceluární kationt, u kterého je koncentrační gradient mezi nitrem buňky a extracelulární tekutinou udržován pomocí sodíkodraslíkové pumpy), způsobená zvýšeným rozpadem buněk, kde dojde k vycestování draslíku z nitra buňky. Dojde tedy k jeho nárůstu v plazmě a vznikne nebezpečí kardiotoxicity. d) laktátová acidóza (zvýšená hladina laktátu) vzniklá na základě zvýšeného rozpadu buněk (Rampello et al., 2006). e) zvýšená koncentrace se nachází také u močoviny (urea). Močovina je látka vznikající jako konečný produkt metabolismu bílkovin. U CRC vysoké hodnoty svědčí o vyšším katabolismu nebo postrenálním selhání (Vorlíček et al., 1995). 19

20 Jaterní metastázy Při růstu nádoru do jaterního parenchymu dojde k poškození buňky (velice často u karcinomů trávící soustavy a slinivky břišní), které způsobí lokální cholestázu a zvýšení aktivity ALP a GMT Mezi další enzymy, které zvyšují svoji aktivitu, patří AST, ALT, které svědčí o zániku jaterních buněk. V důsledku metastatického CRC se také zvyšuje LDH, která reaguje na poškození jaterních buněk. Při poškození jaterního transportu aniontů jsou nacházeny i zvýšené hladiny nekonjugovaného bilirubinu (Racek et al., 2006). 4. Screening kolorektálního karcinomu Na diagnostiku okultního krvácení ve stolici lze použít více typů testů, které pracují na různých principech a mají různou specifitu a senzitivitu. V případě pozitivního výsledku na okultní krvácení následuje zpravidla endoskopické vyšetření (Mitchell et al., 2004) Chemické (guajakové) testy Princip guajakového testu (obr. 7) je založen na detekci pseudoperoxidázové aktivity hemoglobinu, který v přítomnosti peroxidu vodíku zbarví indikátor do modra. Pokud není hemoglobin přítomen ve stolici, nedojde k vytvoření zbarvení. Mezi tyto testy patří např. Haemoccult II a Haemoccult II SENSA, které jsou levné, nenáročné a dostupné. Aby nedošlo k ovlivnění výsledku testu, nesmí pacient 72 hodin přijímat červené maso, zeleninu a ovoce. Týden před vyšetřením musí pacient vysadit kyselinu acetylsalicylovou a nesteroidní antiflogistika. Falešná negativita může být také způsobena vitamínem C, ale jako prospěšná se naopak jeví konzumace vlákniny (Mitchell et al., 2004). Princip metody: chromogen bezbarvý + H 2 O2 chromogen modro zelený + H 2O Hb 20

21 Pozitivní test Modré zabarvení do 30 sekund Negativní test Bez modrého zabarvení Obr. 7: Příklad pozitivního a negativního guajakového testu (Haemoccult; Imunochemické testy (ifobt) Imunochemické testy jsou založeny na detekci lidského hemoglobinu pomocí monoklonální protilátky (detekce globinu), mezi které patří: hemaglutinační (Heme Select), latexová imunoprecipitace (Hemolex), imunoafinitní chromatografie (ImmoCare, Hexagon OBTI). U těchto testů je vyloučena možnost interference chemických látek, jiného zdroje hemoglobinu a není zde nutná dieta. Metody jsou citlivější než guajakové testy s 4 7 % falešnou pozitivitou, jsou tedy příznivější ke stanovení krvácení i u asymptomatických jedinců. Senzitivita i pozitivní průkaz jsou vysoce ovlivněny odlišnou degradací obou složek hemoglobinu. Degradace globinu je rychlá a pozitivita těchto testů zpravidla neodráží krvácení v horním oddílu trávicí trubice (Dubská, Nechvátal, 2009) Haptoglobin hemoglobinový test Tato imunochemiluminometrická metoda je založena na detekci komplexu hemoglobinhaptoglobin (Hb/Hp) pomocí dvou specifických protilátek proti hemoglobinu a haptoglobinu. Výsledkem této dvojí detekce je specifita pro detekci komplexu Hb/Hp a je vyloučena zkřížená reaktivita s hemoglobinem. Tato metoda vykazuje vysokou stabilitu proti rozpadu hemoglobinu, ke kterému dochází při jeho cestě trávícím traktem. Optimální mezní bod pro hemoglobin-haptoglobin komplex je 2 µg/g stolice. Tento test má citlivost srovnatelnou 21

22 s imunochemickými metodami pro záchyt kolorektálního karcinomu, má výrazně vyšší citlivost pro adenomatózní polypy, ale výrazně nižší specifitu (Sieg et al., 1999). 22

23 B Speciální část 5. Cíl práce Cílem této bakalářské práce je: 1. v obecné části shrnout poznatky z literatury se zaměřením na kolorektální karcinom a laboratorní problematiku 2. shrnout a zhodnotit informaci o imunochemické metodě stanovení hemoglobinu ve stolici Stanovení hemoglobinu ve stolici slouží ke screeningu skrytého krvácení do střeva v důsledku kolorektálního nádoru u asymptomatických jedinců. V případě pozitivního testu na okultní krvácení do stolice následuje cílené kolonoskopické vyšetření k objasnění příčiny pozitivity testu. V poslední době se objevují nové způsoby detekce okultního krvácení do střeva např. na principu imunologické detekce lidského hemoglobinu ve vzorku stolice. Takový přístup testujeme jak z hlediska laboratorních parametrů (přesnost, linearita, specificita), tak z hlediska klinických parametrů v kontextu endoskopického nálezu. 6. Materiál a metody 6.1. Materiál Reagencie, spotřební materiál, analyzátor - analyzátor OC Senzor (EIKEN CHEMICAL CO., LTD.) - odběrové zkumavky na stolici (EIKEN CHEMICAL CO., LTD.) - kyvety do analyzátoru OC Senzor (EIKEN CHEMICAL CO., LTD.) - reagencie OC Auto Latex Reagent (EIKEN CHEMICAL CO., LTD.) - reagencie OC Auto 3 Buffer (EIKEN CHEMICAL CO., LTD.) - kalibrátor OC Standard (EIKEN CHEMICAL CO., LTD.) - kontrolní materiál OC Control High a OC Control Low (EIKEN CHEMICAL CO., LTD.) Katalogová čísla reagencií a spotřebního materiálu jsou uvedena v příloze 1: SOP - Stanovení hemoglobinu ve stolici. 23

24 Biologický materiál, preanalytická fáze Pacienti při návštěvě MOÚ obdrželi od svého ošetřujícího lékaře 3 odběrové zkumavky s příslušným návodem popisujícím odběr vzorku stolice (obr. 8). Pacienti byli instruováni, že mají odebrat 3 vzorky ve 3 dnech. Po odběru vzorků stolice odeslali nebo osobně doručili označené odběrové zkumavky na OLM MOÚ. Obr. 8: Postup při provedení odběru (Dialab; Pracovník OLM provádějící příjem biologického materiálu ihned po doručení vzorků provedl zaevidování do NIS GreyFox (nemocniční informační systém) a vzorky označil štítkem (obr. 9), který obsahoval příjmení, jméno, rodné číslo pacienta a čárový kód s číslem záznamu. Vzorek označený čárovým kódem byl vložen do analyzátoru (je on-line napojen na NIS GreyFox ) a změřen. 24

25 Obr. 9: Místo nalepení čárového kódu pro analyzátor Metody Princip metody: stanovení lidského hemoglobinu ve stolici je založeno na reakci A0 lidského hemoglobinu (antigen) s protilátkou proti lidskému hemoglobinu, na kterém je navázaná latexová částice. Hemoglobin A0 ve stolici reaguje specificky s polyklonální protilátkou Hb A0 IgG a vytváří komplex, který se detekuje turbidimetricky při 600 nm. Tato metoda je kvantitativní a umožňuje definovat optimální cut-off hodnotu. Vzorky se po označení čárovým kódem vloží do stojánku, který je vložen do analyzátoru. Současně se musí také vložit reagencie a kyvety (obr. 10) (podrobně popsáno v příloze 1: SOP - Stanovení hemoglobinu ve stolici). vzorky kyvety reagencie Obr. 10: Analyzátor OC senzor 25

26 Postup měření analyzátoru: - vzorek je na odběrovém kartáčku po zasunutí do kazety protlačen přesně definovaným septem - v analyzátoru je mechanickým tlakem kazeta stisknuta a dochází k protlačení extraktu stolice - 25 µl extraktu je aplikováno do měřící kyvety - hemoglobin přítomný v extraktu je detekován po reakci s protilátkou turbidimetricky Obr. 11: Postup měření analyzátoru (Dialab; 26

27 7. Analytické parametry testu a výsledky V této kapitole je popsáno jakým způsobem byly stanoveny jednotlivé analytické parametry testu a zároveň jsou uvedeny zjištěné parametry stanovení. Dále jsou zde shrnuty výsledky validační studie a výsledky testu po zavedení do screeningu kolorektálního karcinomu v rámci programu preventivní onkologie Linearita Linearita je rozsah hodnot obsahu, množství či koncentrací, ve kterém je analytický signál lineární funkcí hodnot obsahu, množství či koncentrace (Friedecký et al., 2006). Ověřovali jsme linearitu, kterou udává výrobce reagencie. Lineární rozsah měření udávaný výrobcem je ng/ml. Linearitu metody jsme ověřili na vzorcích o předem známé koncentraci Hb (tab. 2). Do odběrové kazety bylo napipetováno 10 µl připraveného roztoku hemoglobinu. Koncentrace hemoglobinu Průměrná naměřená koncentrace (µl/l) (ng/ml) , , , , ,01 0 0, , , , , Tab. 2: V prvním sloupci jsou uvedeny koncentrace hemoglobinu ve vzorku vloženém do odběrové nádobky. Roztok hemoglobinu byl připraven ředěním plné krve o známé koncentraci hemoglobinu fyziologickým roztokem. Ve druhém sloupci jsou uvedeny průměrné naměřené hodnoty analyzátorem OC senzor ve třech měřeních. 27

28 1800 Linearita stanovení hemoglobinu y = 1456,8x + 6,0814 R 2 = 0,9635 Průměrná naměřená koncentrace (ng/ml) ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Koncentrace hemoglobinu (ul/l) Graf 1: Linearita metody, kde do grafu byly vneseny průměrné hodnoty ze třech měření. Metoda je lineární v rozsahu naměřené koncentrace od meze stanovitelnosti do 1536 ng/ml Opakovatelnost Opakovatelnost je přesnost za podmínek opakovatelnosti; podmínky opakovatelnosti jsou podmínky, při nichž tentýž pracovník získá nezávislé výsledky zkoušky (měření) toutéž metodou na téže položce v téže laboratoři v krátkém časovém intervalu a při použití téhož laboratorního vybavení (Friedecký et al., 2006). Ověření opakovatelnosti jsme provedli měřením 3 opakovaní na 15 pacientských vzorcích. Výsledky byly v rozmezí od 0 do 1135 ng/ml (tab. 3, graf 2). 28

29 pacient číslo chyba měření v % (100x (rozdíl minmax/prostřední hodnota) nejmenší hodnota prostřední hodnota nejvyšší hodnota rozdíl (minmax) Tab. 3: Výsledky opakovatelnosti u 15 pacientských vzorků. Každý vzorek byl měřen 3x. Opakovatelnost metody. naměřená koncentrace (ng/ml) nejmenší hodnota prostřední hodnota největší hodnota pacienti Graf 2: Opakovatelnost u 15 pacientů, každý z patnácti sloupců je rozdělen na 3 části, které ukazují jednotlivá měření. Z grafu vyplývá, že výsledky opakování měření jsou porovnatelné. Stanovení opakovatelnosti jsme mohli provést pouze 3x z jednoho odběru a z toho důvodu jsme nebyli schopni provést základní statistické vyhodnocení např. výpočet směrodatné odchylky a 29

30 variačního koeficientu. Vypočítali jsme pouze rozdíl mezi nejmenším a nejvyšším výsledkem měření a dále chybu měření v %. Chyba měření v žádném ze vzorků nepřesáhla 22 % Reprodukovatelnost Reprodukovatelnost je stanovení analytu, které se provádí postupně, například jednou denně, na témže zařízení, případně i s různými pracovníky. Tím zjistíme stabilitu metody a analytu v kontrolním vzorku po celou dobu měření (Racek et al., 2006).). Pro výpočet směrodatné odchylky a variačního koeficientu jsme použili výsledky interní kontroly kvality v období od do Interní kontrola kvality je měřená pro dvě koncentrace hemoglobinu ve stolici vždy před měřením pacientských vzorků. Cílová hodnota kontrolních materiálů je u nižší kontroly 150 ng/ml a u vyšší 600 ng/ml. U každé série měření jsme vypočítali směrodatnou odchylku a variační koeficient. F_Hb_low F_Hb_high Počet měření Průměr 0,96 0,99 Medián 0,97 0,99 SD 0,1133 0,1073 CV % 11,8 10,8 Tab. 4: Statistické ukazatele interní kontroly kvality za období od do Pro kontinuitu v čase (nezávisle na změně šarže a tedy cílové hodnoty kontroly) je kalkulováno s poměrem (naměřená/cílová hodnota). 30

31 Interní kontroly kvality hemoglobinu ve stolici od 1/ /2009 poměr (naměřená hodnota/cílová hodnota) 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 F_Hb_low F_Hb_high 0, datum měření Graf 3: Průběh interní kontroly kvality za období od do Pro kontinuitu v čase (nezávisle na změně šarže a tedy cílové hodnoty kontroly) je uveden poměr (naměřená/cílová hodnota). Výsledky reprodukovatelnosti ukazují, že metoda je dlouhodobě stabilní a hodnoty variačního koeficientu u obou kontrolních materiálů se pohybují kolem 11 respektive 12 procent Specifita měření Specifičnost je schopnost měřícího postupu stanovovat pouze tu měřenou veličinu, která má být stanovena (Friedecký et al., 2006). Specifičnost měření jsme ověřili na vzorcích animální krve ze skotu, koně a prasete. Krev jsme aplikovali přímo do odběrového systému určeného k měření této metody. 31

32 Vzorek/typ vzorku Koncentrace hemoglobinu ve stolici (ng/ml) prase kůň skot Tab. 5: Naměřená koncentrace hemoglobinu ve stolici u vybraných druhů zvířat. Při ověření specifity měření pro různé druhy krve respektive hemoglobinu zvířat jsme zjistili, že metoda je vysoce specifická pro lidský hemoglobin Validační studie Validační studie měla za cíl zhodnotit výsledky testu u pilotního stanovení v %. Dvacet jedna pacientů kolonoskopicky vyšetřovaných v MOÚ obdrželo odběrové zkumavky s návodem na odběr (je uvedeno v předcházející kapitole) pro provedení odběru před kolonoskopií. Výsledky stanovení hemoglobinu imunochemickou metodou jsme srovnali s výsledky kolonoskopie. Výsledky validační studie: stanovení u pacientů s kolonoskopickým vyšetřením: - U 9 z 10 s endoskopicky negativním nálezem stran polypu či nádorové infiltrace byly zachyceny negativní hodnoty - U 3 pacientů s histologicky ověřeným karcinomem byly ve všech třech odběrech vysoké hodnoty s průměrem 1473,1043 a 937 ng/ml - Polypy/adenomy: - Drobný plochý polyp ng/ml - Plochý široce nasedlý polyp ng/ml - Drobný polyp ng/ml - Vilotubulární adenom ng/ml - Adenom s low-grade high grade dysplázií: ng/ml - Tubulární adenom: ng/ml - U 3 pacientů s histologicky ověřeným karcinomem byly ve všech třech odběrech vysoké hodnoty s průměrem 1473, 1043 a 937 ng/ml. 32

33 Z výsledků validační studie vyplynulo především, že kvantitativní stanovení je orientačním ukazatelem rozsahu patologického nálezu a vyšetření ze třech různých odběrů je informativní také z hlediska prekanceróz. Vztah kvantity a nálezu kolonoskopie souvisí s rozsahem onemocnění, proto byl tento test zařazen do ambulance preventivní onkologie Výsledky, zavedení testu do klinické praxe v MOÚ Masarykův onkologický ústav poskytuje program preventivní onkologie. Součástí tohoto preventivního programu je i screening CRC. Na základě literatury a výše zmíněných výsledků byl dříve používaný chemický (guajak) test nahrazen novou imunochemickou metodou na stanovení hemoglobinu ve stolici. Pacienti obdrželi tři odběrové zkumavky, letáček na postup odběru stolice (příloha 3) a obálku k zaslání odběrů na OLM Souhrn výsledků za období červen únor 2010 Na OLM MOÚ bylo od června 2009 do února 2010 provedeno testů celkem 3675 testů od 1225 pacientů. Za pozitivní jsme považovali výsledky stanovení hemoglobinu ve stolici na analyzátoru OC Senzor s hodnotou vyšší než 75 ng/ml. Výsledky pacientů Počet pacientů % Negativní ve třech ,72 1 pozitivní + 2 negativní 89 7,09 2 pozitivní + 1 negativní 26 2,07 3 pozitivní 14 1,12 celkem Tab. 6: Souhrn výsledků testu na okultní krvácení za 9 měsíců ve screeningovém programu Stanovení hemoglobinu ve stolici a kolonoskopický nález U pacientů, kteří měli test na stanovení hemoglobinu ve stolici pozitivní a podstoupili indikované vyšetření kolonoskopie v MOÚ, jsme vyhledali v NIS GreyFox nálezy kolonoskopického vyšetření, případně hodnocení patologem (tab. 7). Polyp/adenom byl nalezen u 32,6 % pacientů, kteří podstoupili endoskopické vyšetření na základě pozitivního 33

34 testu na okultní krvácení. U několika případů byly zachyceny také divertikulóza sigmatu a zánětlivé změny trávící soustavy (kolitida, gastritida). 34

35 Koncentrace Hb ve stolici (ng/ml) pohlaví nález m masivní divertikulóza sigmatu m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m tubulární adenom m vilózní polyp f sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace f sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m tubulární adenom m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m divertikulóza sigmatu, bez pat změn m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace f sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace f sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m suspektní atrofická sliznice antra m tubulární adenom s low grade epiteliální dysplázií m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace f sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace f sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m smíšený polyp sigmytu se střední dysplázií f tubulární adenom s low grade dysplázií m tubulovilózní adenom m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m tubulární adenom se střední dysplázií m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace f tubulární adenom s low grade epiteliální dysplázií m divertikulosa sigmatu, bez jiných pat. změn m dysplastický adenomový polyp m tubulární adenom f sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m smíšený polyp tlustého střeva f sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace f tubulovilózní adenom se střední dysplazií f submukosní lipom střeva m indeterminová kolitida m polypózní adenom, tubulární adenom s lehkou dysplázií m tubulární adenom f vícečetné fragmenty kolické sliznice m sliznice hladká, klidná, bez přítomnosti polypů nebo infiltrace m abn.vys mírná neaktivní chronická antrální gastritis s intestinální metaplazií Tab. 7: Souhrn výsledků v případě pozitivního hodnocení krvácení do stolice výsledku kolonoskopického vyšetření. Výsledky jsou uvedeny ve stoupajícím pořadí dle koncentrace, neodráží chronologii odběru. Nález bez jakékoli patologie je vyznačen barevně. 35

36 8. Diskuze Ve své práci jsem se zaměřila na novou metodu stanovení hemoglobinu ve stolici, který slouží k odhalení okultního krvácení do střeva a slouží pro odhalení kolorektálních karcinomů a střevních prekanceróz. Přestože diagnóza tohoto onemocnění v nižších stádiích umožňuje nejefektivnější léčbu s nejdelším přežitím nemocných, není v posledních letech významný posun v diagnostice časných stádií (obr. 12). Nutnost screeningu vyplývá tedy z dobré prognózy záchytu časných stádií nebo ještě lépe ve stádiu prekancerózních lézí. Z věkové struktury diagnostikovaných pacientů s tímto onemocněním (obr. 13) vyplývá nutnost screeningu po roce života. Obr. 12: Zastoupení klinických stádií zhoubných nádorů konečníku a tlustého střeva v čase diagnózy (Mužík et al., 2007). Obr. 13: Věková struktura pacientů od roku 1977 do roku 2007 (Mužík et al., 2007). 36

37 Reputabilní světové organizace zabývající se problematikou screeningu CRC historicky doporučují screening CRC u průměrně rizikových osob nad 50 let věku. Mezi nejčastější testy patří chemický (guajak test) a nově imunochemické stanovení hemoglobinu ve stolici kvantitativní metodou. V Nizozemí byla provedena v roce velká studie, která porovnávala obě tyto metody. Do programu bylo zahrnuto jedinců ve věku let. Polovina těchto jedinců byla testována na okultní krvácení metodou Haemoccult II a druhá polovina kvantitativní imunochemickou metodou, která je také předmětem této práce. Holandská studie porovnala výsledky okultního krvácení s kolonoskopií a z výsledků vyplynulo, že imunochemický test je podstatně efektivnější než Haemoccult II. Tato studie pracovala s cutoff hodnotou 75 ng/ml s výsledkem dvakrát vyššího záchytu pokročilých neoplasií než v případě pozitivního guajakovova testu srovnatelném počtu endoskopií provedených z důvodu pozitivního testu (Hol et al., 2009). Přestože výrobce testu doporučuje hodnotu cut-off 100 ng/ml, hodnotu cut-off 75 ng/ml jsme se rozhodli použít na pracovišti MOÚ na základě této holandské studie a naší validační studie. Chemický (guajak) test je založen na detekci pseudoperoxidázové aktivity hemoglobinu, který v přítomnosti peroxidu vodíku zbarví indikátor do modra. Tento test má své výhody i nevýhody. Výhodou je možnost provedení testu bez analyzátoru. Mezi jeho nevýhody patří nízká senzitivita, ale především velkou roli hraje ovlivnění výsledků některými látkami, bylo již vysvětleno v kapitole chemických testů (Konrad, 2010). Imunochemický test detekuje kvantitativně hemoglobin přítomný ve stolici respektive globin. Než byl tento test zaveden do preventivního programu v MOÚ, byly ověřeny analytické parametry a byla provedena validační studie. Mezi výhody patří určitě komfortní práce v laboratoři, kde personál nepřichází do styku díky uzavřenému systému s biologickým materiálem. Výhodou z pohledu laboratoře je možnost využití čárových kódů a přenos výsledků do nemocničního informačního systému, tím zamezení záměny vzorků a výsledků. Práce s tímto analyzátorem je velice snadná a metoda je rychlá. Neopomenutelnou výhodou oproti chemické metodě je objektivní měření místo hodnocení pozitivně nebo negativně do jisté míry závislé na odečítateli. Při verifikaci metody jsme ověřovali analytické parametry deklarované výrobcem. Chyba měření stanovení opakovatelnosti nepřesáhla 22 %. Výsledky reprodukovatelnosti 37

38 ukazují, že metoda je stabilní a hodnoty variačního koeficientu kontrolního materiálu nepřesahují 12% a vzhledem k tomu, že se jedná o imunochemickou metodu a měření nehomogenního materiálu jakým je stolice, je reprodukovatelnost přijatelná. U ověřování specifity jsme potvrdili specifitu pouze pro lidský hemoglobin a tak jednoznačně odpadá dietetické omezení ve smyslu zákazu konzumace syrového masa. Při ověření linearity bylo potvrzeno, že test je lineární minimálně v rozsahu stanoveném výrobcem tj ng/ml. Již z výsledků validační studie vyplývá, že stanovení hemoglobinu imunochemickou metodou umožňuje odhalení okultního krvácení a navíc kvantitativní stanovení spolu s informací ze tří nezávislých odběrů poskytuje informaci o možném rozsahu onemocnění. Na základě validační studie byl test zařazen do rutinního užívání v MOÚ a to především pro screening CRC v rámci preventivního onkologického programu. V této chvíli považujeme za pozitivní okultní krvácení alespoň v jednom odběru hodnotu přes 75 ng/ml. Pozitivních nálezů bylo tedy 10,28 % z 1225 testovaných pacientů. Pacientů, kteří měli takto pozitivní výsledek na okultní krvácení a podstoupili indikované kolonoskopické vyšetření bylo vyhodnoceno 46. Ostatní pacienti s pozitivním výsledkem testu buď vyšetření kolonoskopie odmítli nebo vyšetření podstoupili v místě svého bydliště a neznáme endoskopický nález. Již z pilotní studie vyplynul význam testování ve třech nezávislých odběrech, který umožní např. záchyt prekancerózních polypů, které nekrvácejí pravidelně tj. každý den. Jak se dá předpokládat, hemoglobin byl ve stolici zachycen také u zánětlivých střevních procesů. Mírně zvýšené hodnoty (obvykle jen v jednom odběru) byly zachyceny také u pacientů s rozšířenými žilami rekta a u divertikulózy sigmatu. Pro minimalizaci této falešné pozitivity bude pacient upozorněn, aby vynechal odběr stolice v případě podráždění rekta/anu např. při zácpě nebo komplikovaném vyprazdňování. V tomto smyslu bude upraven informační letáček pro pacienty (viz příloha č. 3.). Na druhé straně i nízké hodnoty nepřesahující cut-off zachycené ve všech třech odběrech mohou ukazovat na přítomnost polypu přisedlé morfologie. V tomto smyslu byl připraven algoritmus vyhodnocení výsledků zavedeného testu, od kterého očekáváme, že bude méně zatěžující pro pacienta z hlediska kolonoskopického vyšetření a zároveň nebude snížena senzitivita vyšetření a možnost záchytu CRC a prekancerózních adenomů (obr. 14). 38

39 3 odběry 2x nad 75 ng/ml * 3x nad 50 ng/ml * 1x nad 75 ng/ml + 2x 0 ng/ml 3x pod 50 ng/ml Kolonoskopie 3 odběry za 3 měsíce Opakovaný screening s odstupem, dle věku pacienta a doporučení lékaře * Urgence endoskopického vyšetření dle hodnot hemoglobinu ve stolici a klinického stavu (anamnéza, další vyšetření) pacienta. Obr. 14: Návrh algoritmu vyhodnocení screeningového testu. 39

40 9. Závěr Z výsledků vyplývá, že imunochemické stanovení hemoglobinu ve stolici na analyzátoru OC Senzor splňuje námi požadované analytické parametry a s hodnotou cut-off 75 ng/ml je vhodné ke screeningu okultního krvácení. Metoda je komfortní jak z hlediska pacienta i z hlediska laboratorního personálu a je časově nenáročná. Pro tuto metodu jsme vytvořili SOP (je součástí této bakalářské práce) a její stanovení zavedli v MOÚ do preventivního programu. Test byl dále zhodnocen z hlediska kolonoskopického nálezu a byl vypracován algoritmus hodnocení výsledků pro zvýšení specifity i senzitivity vyšetření vzhledem k prekancerózám a CRC. 40

41 10. Seznam použité literatury Bardelli, A., Siena, S., Molecular mechanisms of resistance to cetuximab and panitumumab in colorectal cancer. Clinical Oncology, 2010, 1, Brejcha, M., Gumulec, J., Anemie u kolorektálního karcinomu, Sborník abstrakt a přednášek IX. Pařízkův den(kolorektální karcinom v komplexní péči regionálního charakteru), Nový Jičín, 2003, 18 Dubská, L., Nechvátal, J., Kvantitativní stanovení hemoglobinu ve stolici, Laboratorní technologie, 2009, Dušek, L., Abrahámová, J., Mužík, J., Májek, O., Pavlík, T., Kostíková, J., Vyzula, R., Fínek, J., Populační odhady počtu nemocných s kolorektálním karcinomem v ČR jeden z nástrojů hodnocení včasné diagnostiky časných stádií a rekurence onemocnění, Farmakoterapie-kolorektální karcinom, 2009, 1, Friedecký, B., Kratochvíla, J., Kubíček, Z., Metrologie chemických měření v laboratorní medicíně, Česká společnost klinické biochemie, 2004, 64-79, ISBN Gryfe, R., Swallow, C., Bapat, B., Redston, M., Gallinger, S., Couture, J., Molecular biology of colorectal cancor, Curr Probl Cancor, 1997, 21, Hoffman, R., Benz, E., J., Shattil, S., J., Furie, B., Cohen, H., J., Silberstein, L., E., McGlave., P., Hematology Basic Principles and Practice, Elsevier Churchill Livingstone, 2005, , ISBN Hol, L., Wilschut J.,A., Ballegooijen van M., Vurren, van A., J., Valk, van der H., Reijerink, J., C,.I., Y., Togt van der A.,C., M., Kuipers, E.,J., Leerdam, van M., E., Screening for colorectal cancer: random comparison of guaiac and immunochemical faecal occult blood testing at different cut-off levels, British Journal of Cancer, 2009, 100, Holubec sen., L, Fínek, J., Holubec, L., Chudáček, Z., Koželuhová, J., Kreuzberg, B., Ludvíková, M., Pecen, L., Pešta, M., Pikner, R., Topolčan, O., Třeška, V., Kolorektální karcinom současné možnosti diagnostiky a léčby, Praha: Grada Publishing, a.s., 2004, 41-45, ISBN

42 Jablonská, M., Andrýsek, O., Beňo, I., Frič, P., Hejnar, J., Hoffmanová, J., Hořejší, J., Chlumská, A., Jirásek, V., Kohoutová, M., Kortík, J., Kozubík, A., Křepelová, A., Lukáš, M., Pešková, M., Petrželka, P., Štěpánková, R., Zavoral, M., Žaloudík, J., Židovská, J., Kolorektální karcinom časná diagnóza a prevence, Praha: Grada Publishing s.r.o., 2000, 30, 45-47, , ISBN X Kathleen, R., Cho., Vogelstein, B., Genetic Alterations in the Adenoma-Carcinoma Sequence, Cancer Supplement, 1992, Klener, P., Abrahámová, J., Fait, V., Mališ, J., Matějovský, Z., Petruželka, L., Žaloudík, J., Klinická onkologie, Galén, 2002, 87, , ISBN Konrad, G., M., D., Dietary interventions for facel occult blood test screening, Canadian Family Physician, 2010, 3, 56, Lynch, H., Lynch, F., Attard, T., Diagnostic and management of hereditary colorectal cancor syndromes: Lynch syndrome as a model, Canadian Medical Association or its licensors, 2009, 10,1, Mačák, J., Mačáková, J., Patologie, Praha: Grada Publishing, a.s., 2004, 244, ISBN Masopust, J., Klinická biochemie a hodnocení biochemických vyšetření I,. Karolinum, 1998, , ISNB Mitchell, S., Schefer, D., Dubagunta, S., Frič, P., Nové pohledy na problematiku okultního krvácení do trávícího ústrojí- komentář, Medicína po promoci, 2004, 4, Murray, R., K., Granner, D., K., Mayes, P., A., Rodwell, V., W., Harperova Biochemie, H+H, 2002, , ISBN Mužík, J., Dušek, L., Kubánek, M., Kostíková, J., Schwarz, D., Pavlík, T., Zemánek, P., Žaloudík, J., Vyzula, R., Epidemiologie zhoubných nádorů ČR on-line na webovém portálu projektu SVOD, Klinická onkologie, 2007, 20, Normanno, N., Rejpat, S., Morgillo, F., De Luca, A., Cutsem, van E., Ciardiello, F., Implications for KRAS status and EGFR-targeted therapies in metastatic CRC. Clinical Oncology,. 2009, 6, Novotný, I., Hruška, M., Biologie člověka, Praha: Fortuna, 2003, 87-88, ISBN