Analýza genů ovlivňující zbarvení srsti psů

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Analýza genů ovlivňující zbarvení srsti psů Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: Prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Vypracovala: Bc. Krčmová Kristýna Brno 2010

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Analýza genů ovlivňující zbarvení srsti psů, vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF Modelu v Brně. dne:... podpis studentky:...

3 PODĚKOVÁNÍ: Ráda bych poděkovala profesorovi RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za vedení mé diplomové práce. Dále bych ráda poděkovala Ing. Pavle Chalupové a Ing. Michaele Nesvadbové za odborné připomínky při psaní této práce a za praktické rady při práci v laboratoři. Chtěla bych také poděkovat své rodině za trpělivost a podporu. Mé největší díky ovšem patří všem chovatelů německého boxera, kteří mi poskytli vzorky a dovolili mi vyfotografovat psy nebo mi snímky svých psů dali.

4 ABSTRAKT Německý boxer se vyskytuje ve třech barevných variantách, ale uznané FCI jsou pouze varianty zlatá a žíhaná. Bílá varianta je označená jako nestandard a neměl by být používán v chovu. Podle přítomnosti skvrn je zlatý a žíhaný boxer buďto celoplášťově zbarvený nebo s odznaky. Bílé odznaky se mohou objevovat na hlavě, hrudi, šíji a nohách. Gen pro tyto bílé skvrny ještě nebyl objeven. Kandidátním genem je MITF, který se nachází u psa na 20. chromozomu. Byla osekvenována část tohoto genu, ve které byl již dříve nalezen polymorfismus. Byly nalezeny další dva polymorfismy, z nichž jeden je v korelaci se dříve nalezeným. Klíčová slova: německý boxer, bílé skvrny, MITF, polymorfismus ABSTRACT Deutscher boxer exists in three variants of coat color, but FCI accepts only fawn or brindle. A white coat color is described as nonstandard a these dogs shouldn t be used in breeding. The presence of spotting can be either spotty or appear in smudges with or without marks. A white pattern can by arise on the head, chest, neck and feet. The gene for white spotting is not discovered yet. The candidate gene is MITF, which was obtained on canine chromosome 20. Part of this gene, in which was found one polymorfismus, was sequencied. Two others polymorfisms was found. One of them is in the correlation with this one founded before. Key worlds: Deutscher boxer, white spotting, MITF, polymorphism

5 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Německý boxer Historie plemene Početní stavy boxerů v ČR Plemenný standard boxera Zbarvení boxera Dědičnost zbarvení boxera Tvorba pigmentu srsti Geny a alely ovlivňující zbarvení A (Agouti) E (Extension) B (Brown) K (Black) S (white spotting) M (Merle) C (Albinismus) G (Greying) D (Dilutes eumelanin)...31

6 T (Ticking, tečkování) L (délka srsti) Testy DNA pro barvu srsti Nemoci spojené s barvou srsti Hluchota Zbarvení duhovky Color dilution alopecia Použité metody molekulární genetiky Elektroforéza Polymerázová řetězová reakce (PCR) Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) Sekvenování MATERIÁLY A METODY ZPRACOVÁNÍ Odběr vzorků Izolace DNA Postup izolace PCR Optimalizovaná reakční směs Teplotní profil RFLP Reakční směs Sekvenování...41

7 4.5.1 Přečištění Kvantifikace PCR produktu Vlastní sekvenování Vyhodnocení sekvenování VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE Vyhodnocení izolace DNA a vzorků Zbarvení boxera Vyhodnocení sekvenování Hluchota boxera a ostatních plemen ZÁVĚR SEZNAM LITERATURY SEZNAM TABULEK SEZNAM OBRÁZKŮ...59

8 1 ÚVOD Zbarvení je u všech zvířat velice důležité, zejména v přírodě, kdy se zvířata potřebují maskovat - vlci mají zbarvení šedé, aby splynuli s lesem, kdežto polární liška zase bílé, aby splynula se sněhem. Nebo naopak mají velice pestré zbarvení, které například u hadů signalizuje jedovatost. Při domestikaci psů si lidé vybírali různé barvy, a jejich použitím v chovu vyšlechtili různé odstíny a vzory barev srsti, které jsou dnes odlišujícími znaky plemen u domestikovaných psů. Naopak u některých plemen křížili psy podle pracovních schopností, ale barva nevyhovovala, proto se křížilo s dalším plemenem. Jako tomu bylo u německého boxera, kdy se křížil americký buldok, který dal boxerovi bílou barvu s bullbeinserem, který mu dal barvu zlatou. Jenže bílá štěňata se stále vyskytovala. To bylo nevhodné, protože by byli v noci vidět. Proto začala krutá selekce, kdy byla všechna bílá štěňata ihned po narození zabíjena. Gen je v podobě recesivní alely v genotypu u barevných boxerů s náprsenkou přenášen stále a při spojení těchto jedinců může docházet k narození bílých štěňat, která jsou recesivními homozygoty. Genetický základ bílých vzorů u boxerů zatím není znám. Byly pouze vyloučeny dva geny EDNRB a KIT (van Hagen et al., 2004). V roce 2007 byl nalezen a zveřejněn první gen, který způsobuje alespoň některé skvrnité vzory u psů. Tímto genem je MITF (Microphthalmia associated transcription factor), který zásadním způsobem ovlivňuje pigmentace. Byly v něm zjištěny potenciální mutace asociované s některými formami skvrnitosti. Žádná příčinná mutace, ale zatím nalezena nebyla (Schmutz, 2009). Analýza vazeb je typicky prováděna sadou mikrosatelitních markerů, které jsou používány k mapování dědičnosti kompletních genomů. V současnosti je mnoho SNP (single nucleotide polymorphism) k získání genotypu v jednotlivém experimentu. Tato technika usnadňuje genetické studie složitých genetických cest v populaci. Bílé skvrny u boxerů jsou monogenetické a semidominatní cesty. Proto byla vybrána sada z 3000 SNP, která je vysoce efektivní v mapování lokusu bílých skvrn u boxerů (Leegwater et al. 2007). Dnes existují různé DNA testy (Vetgen, Vetdnacenter, atd.), pomocí kterých lze určit genotyp barvy psa. Tyto testy využívají zejména chovatelé labradorských retrívrů, 8

9 za účelem vhodného spojení rodičů a následného narození hnědých štěňat, která jsou vzácná. Bylo by možné tyto testy používat i u německých boxerů, kdy si chovatelé nepřejí bílá štěňata. Stačilo by použít v chovu alespoň jednoho dominantního homozygota. Naopak, pokud by chtěl někdo použít bílého boxera do chovu, mohl by použít jako partnera dominantního homozygota. Všechna štěňata by byla barevná s náprsenkou a pravděpodobně bez nemocí, které jsou spojené s bílou barvou a jsou problémem při páření dvou bílých jedinců. 9

10 2 CÍL PRÁCE Cílem mé práce je zjistit, jaké geny ovlivňují zbarvení psů a vypracovat vhodnou metodiku testování. Do sledování zahrnout zvířata plemene německý boxer, - minimálně 30 jedinců. Zpracovat literaturu ke genům ovlivňujícím zbarvení srsti u psů. Provést výběr konkrétního genu pro testování zbarvení. Testování genotypů pomocí základních metod molekulární genetiky. 10

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Německý boxer Historie plemene Německý boxer patří do skupiny dogovitých plemen. Dogovití psi byli chování na obranu a lov vysoké zvěře. Velké dogy byly zkříženy s rychlejšími, snadněji zvladatelnými psy. Tyto menší dogy bojovaly s býky v soubojích, při nichž měl pes býka chytnout za mulec, a tím ho porazit. Lidé věřili, že se díky těmto soubojům zlepší chuť masa býka. V první polovině 19. století byly tyto souboje zakázány. V Německu bylo z potomků těchto starých bojových psů, gdaňského a brabantského bullbeinsera, vyšlechtěno nové moderní plemeno s širokými možnostmi využití: boxera (Nijland, 2004). Dalším z předků dnešního německého boxera byl anglický buldog. Slavný chovatel buldoků Friedrich Roberth v roce 1894 napsal článek, který vyšel v místních novinách. Chválil boxera za inteligenci a zevnějšek a stavěl toto plemeno nejvýše ze značného množství plemen, která Roberth vlastnil. Do roka od Roberthovy obhajoby byl v roce 1985 v Mnichově založen klub chovatelů boxerů (Boxerclub). Roberth a hrstka příznivců v lednu 1897 ustavila Německý klub boxerů, který měl svou pobočku také v Čechách. Roberth byl vyzván, aby sestavil plemenný standard. Tento standard byl založen na boxerovi, který byl považován za nejlepšího psa. Jeho jméno bylo Flock St. Salvator (Obr. 1) a zvítězil na první výstavě boxerů v roce 1896 (Obr. 2). Flock je jedním ze čtveřice nejdůležitějších psů použitých k zušlechtění boxerů. Dalšími byli žíhaný pes Wotan, feny rudožlutá Mirzl a skvrnitá Meta v.d.passage (Obr. 3), která je nesporně pramatkou všech dnešních boxerů (Cavanaugh, 2000). Obr. 1 Flock St. Salvator Obr. 2 První výstava boxerů Obr. 3 Meta v. d. Passage 11

12 3.1.2 Početní stavy boxerů v ČR Statistické údaje o chovu na stránkách boxerklubu nám říkají, že v roce 2006 se narodilo 727 štěňat, zapsáno jich bylo 547, z toho bylo 272 zlatých, 215 žíhaných a 56 bílých. V roce 2007 se narodilo 538 štěňat, 427 bylo zapsáno, 192 bylo zlatých, 178 žíhaných a 47 bílých. V roce 2008 bylo 713 narozených, 588 zapsaných, 322 zlatých, 212 žíhaných a 54 bílých. Poslední údaj je z roku 2009, kdy se narodilo 492 štěňat, 401 bylo zapsáno, 207 z nich bylo zlatých, 146 žíhaných a 49 bílých. Plemeno německý boxer je v České republice celkem oblíbené. Rozhodně není žádnou raritou. Z těchto dat také plyne, že se narodilo 10,5 % bílých štěňat, což se rozhodně ani neblíží 25 %, která jsou často udávána. Toto číslo by bylo možné jen za předpokladu, že by do chovu byli zařazováni jen heterozygotní jedinci. V Boxerklubu je vedených 120 chovatelských stanic z celé České republiky (Statistika chovu boxera v ČR, 2010) Plemenný standard boxera První standard z roku 1905, který připouštěl všechny barvy a uváděl výšku psa 50 cm, padl v roce 1920, kdy byla vyřazena bílá a černá barva. Jako plemeno byl boxer uznán v roce 1925 a je dodnes oblíbeným psem, a to nejen v Německu (Německý boxer 2008). Jedním z důvodu, proč se Němci pokoušeli odstranit bílou barvu z chovů boxerů, byla ve 20. letech jejich profese policejních psů. Bílá barva byla nevýhodou, protože bylo snadnější spatřit ji ve tmě. Němci je přestali v roce 1920 registrovat do chovu, protože se domnívali, že tím odstraní alelu pro bílou barvu z genotypu. (Boxer Dog.org., 2009). Boxer je středně velký pes s kvadratickou stavbou těla, má silné končetiny a mohutně vyvinuté svaly. Boxer musí působit sebevědomě, klidně a vyrovnaně. Odedávna je proslulý odolností a věrností svému pánovi i celému domu, ostražitostí a neohrožeností psa obránce. Pro svou rodinu není v žádném případě nebezpečný, vůči cizím lidem je však nedůvěřivý. Při hře bývá veselý a přátelský, ale ve vážných situacích vystupuje neohroženě (Nijland, 2004) Zbarvení boxera Německý boxer se vyskytuje ve zbarvení plavém, žíhaném a bílém (Obr. 4). Plavá barva se pohybuje od světle hnědé až po mahagonovou. Žíhání je tvořeno černými pruhy probíhajícími ve směru žeber na plavém pozadí. Pruhování může být řídké nebo tak 12

13 husté, že základní plavá barva sotva prosvítá. Tito psi jsou často nazývání jako černě žíhaní (Obr. 5) (Walker, 2001). Téměř každý jedinec má tmavší zbarvení na hlavě (Dostál 1995). U boxeru existují tři typy barevných znaků celobarevní, s bílými znaky a bílí. Za konkrétní znakové zbarvení jsou zodpovědné pouze dva geny, gen plné barvy a gen bílé barvy, který způsobuje bílé znaky nebo bílé zbarvení (Obr. 6). Boxer s bílými znaky, který má stejný genotyp jako jiný boxer s bílými znaky, nebude stejný fenotypově. Jeden může mít bílý krk, další může mít bílé pouze ponožky, apod. Geneticky celobarevný boxer může mít malé znaky na packách, hrudníku a na břichu (Tichá, 2003). Obr. 4 Zbarvení boxera Obr. 5 Černě žíhaný boxer Obr. 6 Bílý boxer Obr. 7 Zlatý boxer 13

14 3.1.5 Dědičnost zbarvení boxera Gen pro žíhaní je dominantní, což znamená, že stačí, aby nesl alespoň jednu dominantní alelu, a bude žíhaný. Níže jsou různé genetické kombinace, které mohou nastat u boxerů (upraveno dle Walkera, 2001). K K k k K KK KK K Kk Kk K KK KK K Kk Kk Genotyp: 100 % KK Genotyp: 100 % Kk Fenotyp: 100 % žíhaných Fenotyp: 100 % žíhaných K k k k K KK Kk K Kk Kk K KK Kk k kk kk Genotyp: 50 % KK a 50 % Kk Genotyp: 50 % Kk a 50 % kk Fenotyp: 100 % žíhaných Fenotyp: 50 % žíhaných a 50 % zlatých K k k k K KK Kk k kk kk k Kk kk k kk kk Genotyp: 25 % KK, 50 % Kk a 25 % kk Genotyp: 100 % kk Fenotyp: 75 % žíhaných a 25 % zlatých Fenotyp: 100 % zlatých Pes s jednou alelou K může být stejně žíhaný, jako ten se dvěma alelami K (protože je tato alela úplně dominantní a nemůžeme tedy fenotypově odlišit heterozygota od dominantního homozygota). Existuje mylná představa, že psi se dvěma alelami K jsou tmavší. To ale není pravda, což nám potvrzuje mnoho velmi tmavě žíhaných psů, kteří dali plavá štěňata, z čehož vyplývá, že jedna jeho alela musela být pro plavou barvu (k) (Walker, 2001). Martinec (2001) popisuje stejnou dědičnost, jen používá název tohoto genu E s alelou e pro zlatou barvu a alelou E br pro žíhanou barvu. Stejně je tomu i u bílých znaků, jen s genem S (white spotting bílé tečkování). Jedinci SS budou celobarevní, jedinci SS w budou mít bílé znaky a jedinci S w S w budou bílí. Použití celobarevného boxera v jakémkoliv spojení garantuje, že ani jedno ze štěňat nebude bílé. Chovatelé, kteří 14

15 nechtějí mít ve vrhu bílá štěňata, mohou učinit tento jednoduchý krok. Je však nemožné bez testu DNA s jistotou říci, zda je pes geneticky dominantní homozygot a má pouze velmi malé bílé znaky nebo je to heterozygot. Ale použití psa s velmi malými bílými znaky, který by mohl být dominantním homozygotem, je humánnější, než později bílá štěňata utrácet (což je dnes i protizákonné) (Tichá, 2003). Podle 2. odstavce 5 zákona 246/1992 na ochranu proti týrání zvířat se smí utrácet jen slabá, nevyléčitelná, zvířata s těžkým poraněním, genetickou nebo vrozenou vadou, celkově vyčerpaná nebo stará zvířata, jsou-li pro další přežívání spojeny s trvalým utrpením (portal.gov.cz, 2010). Barva není důvodem k utracení. 3.2 Tvorba pigmentu srsti Základem zbarvení srsti je pigment melanin, který vzniká v cytoplazmě melanocytů. Syntetizuje ho tyrozin, který přechází enzymatickou oxidací na bezbarvý chromogen 3,4-dioxyfenylalanin, jehož produkce kontroluje alelou c. Homozygot cc je albínem, což znamená, že má bílou srst, nepigmentovanou kůži, červené oči a sliznice a bílé drápy. Plně pigmentovaný jedinec má nese dominantní alelu C. Důležitý je i gen E, kdy alela E kontroluje produkci černého nebo hnědého eumelaninu, který je tyčinkové struktury, kdežto alela e kontroluje syntézu feomelaninu, který je žlutý nebo červený a má sférický tvar. Melanin nevzniká jen v určitou, u všech psů stejnou, dobu během jejich nitroděložního či postnatálního vývoje. U některých plemen psů začíná syntéza pigmentu dříve, u jiných později. Mění se také množství produkovaného pigmentu. Některá plemena se narodí zbarvená tak, jak zůstávají po celý život, pomineme-li stařecké šedivění. Ale u jiných plemen se během života zbarvení mění. Proto známe plemena, která stářím světlají (kerry blue terier se narodí černý a stářím světlá nebo modrá), jiní se narodí světlí a postupně tmavnou (bělouš českého fouska se narodí čistě bílý s maskou a postupně prokvétá hnědými, pigmentovanými chlupy) (Dostál, 2007). 3.3 Geny a alely ovlivňující zbarvení Genetika zbarvení srsti u psů, stejně jako u ostatních savců, je studována již mnoho let. Little (1957) a Winge (1950) napsali knihy o potencionálních genech, které by mohly vysvětlovat dědičnost zbarvení v rodinách. Jejich hypotézy vycházely z chovatelských 15

16 dat. Každý z autorů použil jiná písmena k označení různých lokusů se dvěma nebo více alelami. Ale v základu se jejich hypotézy o množství genů s různými efekty velice podobaly. Určité barvy byly u některých plemen důvodem vyřazení z chovu, protože mohly mít zdraví škodlivý efekt nebo jiné nežádoucí efekty. V posledních několika letech nastal velký pokrok v identifikaci genů, které jsou zodpovědné za pigmentaci u psů. K tomu přispěla srovnávací (kompartivní) genomika. Bylo identifikováno sedm genů, určující specifickou barvu kůže u psů nebo různé vzory: melanocortin 1 receptor (MC1R), tyrosinase releated protein 1 (TYRP1), agouti signal peptide (ASIP), melanophilin (MLPH), silver homolog SILV (dříve PMEL17), microphthalmia-associated transcription factor (MITF) a beta-defensin 103 (CBD103). Ačkoliv ještě nebyly určeny všechny alely na každém lokusu, pro mnoho z nich jsou vyvinuty DNA testy. Identifikace těchto alel poskytuje zejména informace o interakcích v tomto komplexu genů, které jsou zodpovědné jak za vývoj pigmentace, tak za vývoj neurologický. Určité geny pro zbarvení také mohou vyvolávat nemoci (Schmutz and Berryere, 2007). Dostál (2007) uvádí, že zbarvení u psů kontroluje celkem 10 genů z celkem 10 lokusů, a ty jsou označovány následujícími písmeny abecedy: A, B, C, D, E, G, M, P, S a T. Některé z těchto genů mají jen dvě kvalitativně odlišné formy alely, které jsou vůči sobě dominantní a recesivní. Jiné geny jsou vícealelové, a ty pak tvoří celé alelické série se vzájemnou dominancí a recesivitou mezi sebou. Vzájemné interakce mezi těmito geny dávají výsledné zbarvení psů. Genotyp boxera je podle Dostála (2007) A y B C D E (E br ) g L m S (s i s w ) t A (Agouti) Gen ASIP byl identifikován na CFA 24 (Kerns et al., 2004). Berryere et al. (2005) ve svém výzkumu, který zahrnoval třicet sedm plemen, identifikovali Agouti alely u 22 plemen v aminokyselinových změnách A82S a R83H, které se projevily u psů s plavou nebo sobolí srstí. U psů, kteří jsou černí s pálením nebo u trikolórů nalezeny nebyly. Recesivní alela tohoto genu R96C (a) (polymorfizmus c.288c>t) zapříčiňuje černé zbarvení srsti např. u německých ovčáků (Obr. 8). Tato alela byla také identifikována u samojedů a amerických eskymáckých psů (Obr. 9), kteří jsou bílí (Schmutz and Berryere, 2007). 16

17 Obr. 8 Černý německý ovčák Alely genu ASIP jsou: a způsobuje černé zbarvení srsti. Vznikla mutací (c.288c>t) a je příčinou černého zbarvení německých ovčáků a šeltie. Vyskytuje se také u černých jedinců plemen čiperky, belgických ovčáků a puliho. Alela ale byla také identifikována u bílých plemen, jako je samojed a americký eskymácký pes. Obr. 9 Americký eskymácký pes ( a w vlkošedé zbarvení. Sekvence této alely je homologní se sekvencí vlka a sekvence aminokyselin v proteinu je shodná se sekvencí u kojota. Tato alela zapříčiňuje pruhované dorzální chlupy a světle žluté ventrální. Nachází se u některých vlků, kojotů, německých ovčáků a husky. 17

18 Obr. 10 Vlkošedé zbarvení německého ovčáka (Schmutz, 2009) a t tato alela kontroluje pálení Obr. 11 Tricolor gordon setr (Schmutz, 2009) a s zbarvení tvořící sedlo, v současné době není pro tuto alelu žádný důkaz (Schmutz and Berryere, 2007) a y kontroluje zbarvení žluté nebo červenohnědé. U některých plemen se setkáváme s příměsí chlupů, které jsou černě zabarvené na konečcích, je-li těchto chlupů více, tak tomuto zbarvení říkáme sobolí (Dostál, 2007). Alela a y, která se běžně nachází u domestikovaných psů, vznikla pravděpodobně mutací z alely a w, která se nachází u jejich předků - vlků. Některá plemena psů, jako jsou jezevčíci, německá doga, čau-čau a francouzští buldočci, normálně nesoucí gen MC1R, v červenožluté variantě barvy srsti místo něj zřejmě nesou alelu Agouti a y spojenou se žlutou srstí (Berryere et al., 2005). Alela a y je recesivní oproti a w, ale částečně dominantní nad alelou a t, což znamená, že pes s alelami a y a t bude tmavší barvy než pes s alelami a y a y (Bowling, 2000). 18

19 Obr. 12 Žluté zbarvení u plemene mops (Schmutz 2009) Typ pigmentu syntetizovaný u savců, žlutočervený feomelanin nebo černohnědý eumelanin závisí na interakci mezi Agouti proteinem a alelou genu MC1R. Pokud je alela genu MC1R funkční (což je děděno dominantně (Kerns et al., 2007)), tak tlumí projev proteinu Agouti a podporuje syntézu eumelaninu, namísto feomelaninu. Pokud tato alela ztratí svou funkci (což je děděno recesivně (Kerns et al., 2007)), tak se zvýší projev proteinu Agouti a podpoří se syntéza feomelaninu namísto eumelaninu (Berryere et al., 2005) E (Extension) MC1R byl prvním genem studovaným molekulárními metodami v genetice psů. Byl mapován na 5. chromozomu (Schmutz and Berryere, 2007). MC1R se nachází na Extension lokusu u mnoha druhů savců. Polymorfizmus (914 C>T) způsobující ztrátu funkce tohoto genu, zapříčiňuje čistě červené zbarvení srsti. Bylo odhaleno šest variant sekvencí, z nichž dvě S90G a R306ter (914C>T), kdy vzniká stop kodon místo argininu, částečně korelují s černohnědou a červenožlutou srstí (Newton et al., 2000). E původní dominantní divoká alela (Schmutz and Berryere, 2007). 19

20 Obr. 13 Genotyp E/E u velkého münsterlandského ohaře ( e normální rozložení světlého pigmentu v srsti. Tato alela omezuje tvorbu tmavé pigmentace, ať má takový jedinec jakýkoliv genotyp v genu A. Alela kontroluje pouze pigmentaci srsti. Pigmentace nosu, kůže, pysků, sliznic a víček není ovlivněna, a proto zůstávají tyto části tmavé (Dostál, 2007). Tato alela je následkem ztráty funkce genu MC1R, což zapříčiní to, že se bude výhradně produkovat červený/žlutý feomelanin (Newton et al., 2000), který se projeví krémovou barvou. Bílí knírači nesou genotyp e/e (Obr.14). Rodiče těchto kníračů mohou být zbarveni jako pepř a sůl. Je tedy vidět, že všechen feomelanin je zředěn až na bílou nebo stříbrnou (Schmutz, 2009). Obr. 14 Bílý malý knírač (Schmutz, 2009) E M melanistická maska černá maska je charakteristickým vzorem u červených, žlutých, světle hnědých nebo plavých psů. Představuje černou barvu čumáku, která může pokrývat obličejovou část až k uším (Obr. 15). Melanistická maska je dominantně dědičná autozomální cestou. Všichni psi s melanistickou maskou měli nejméně jednu kopii záměny valinu za metionin na aminokyselině 264, která vznikla jednonukleotidovou substitucí (799A>G), a žádný nebyl homozygotem pro stop kodon R306ter (Schmutz et al. 2003). U psů s bílým čumákem, kteří v této oblasti neprodukují melanin, se maska neprojeví, i když ponesou tuto alelu. 20

21 Obr. 15 Maska u plavého boxera Všichni psi, kteří mají barvu srsti černou, hnědou nebo šedou (ať už jednobarevnou nebo skrvnitou), ji zdědili dominantně a mají nejméně jednu alelu E nebo E M. K tomu mají také nejméně jednu alelu K B (Schmutz and Berryere 2007). Dříve se předpokládalo, že v této sérii také existuje alela E br, která je zodpovědná za žíhání (Dostál 2007). Dnes ale víme, že tato alela, zodpovědná za ukládání dvojího pigmentu - černého a žlutého v pruzích, patří do série genu CBD103 pod názvem k br (Kerns et al. 2007) B (Brown).TYRP1 je genem zapříčiňujícím hnědou barvu srsti. Byl nalezen na chromozomu 11 (Schmutz et al., 2002). Newton et al. (2000) popsali a prozkoumali předčasný stop kodon, který se projevil u všech psů s červenou nebo žlutou srstí. Psi s černou nebo hnědou srstí tento promotor stop kodonu nenesli nebo byli heterozygoty. Schmutz et al. (2002) našli tři relativně běžné polymorfismy DNA u hnědých psů. Dva polymorfismy byly nalezeny na exonu 5. První z nich zapříčiňující alelu (b s ) obsahuje stop kodon v exonu 5 (Q331ter) (c.991c>t), druhý (b d ) obsahuje deleci prolinu v exonu 5 (345delP) (c deleted). Třetí polymorfismus (b c ) je substitucí v exonu 2 způsobující záměnu tyminu za cysteinu (S41C) (c.121t>c). Jeden polymorfismus byl nalezen v exonu 7, a ačkoliv to nebyla záměna aminokyselin, byl užitečný pro mapování TYRP1. Všichni hnědí psi nesli dva nebo více těchto polymorfismů, pravděpodobně zasahující do funkce TYRP1, kdežto žádný z černých psů nenesl tyto varianty. Proto se předpokládá, že všechny tři alely ovlivňují produkci eumelaninu a způsobují záměnu černého pigmentu za hnědý. Psi s černým nosem a hnědým nosem, kteří byli červení, 21

22 žlutí, zlatí, světle oranžový nebo oranžový, byli homozygoti pro stop kodon R306X genu MC1R ukazující jeho spojení s fenotypem této barvy srsti. Černý nebo hnědý nos naprosto koreloval s absencí nebo přítomností dříve popsaných tří variant TYRP1. Hnědá barva se dědí recesivně vůči černé. Byly detekovány tři alely b s, b d a b c. Obr. 16 Genotyp b s /b s u anglického setra Obr. 17 Genotyp b d /b d u dobrmana Obr. 18 Genotyp b c /b c u italského chrtíka VŠECHNY TŘI OBRÁZKY JSOU Z WEBOVÉ STRÁNKY K (Black) Gen CBD103 je třetím důležitým genem vedle MC1R a ASIP a byl nalezen na 16 chromozomu. Kóduje ligand-receptor systém, který přepíná mezi syntézami eumelaninu a feomelaninu. Studie vzájemného působení ukázaly, že Extension je epistatický nad Agouti a K. Epistatická příbuznost mezi Agouti a K záleží na tom, které alely těchto genů se mezi sebou budou testovat. Na lokusu K jsou tři alely, které jsou vůči sobě dominantní v tomto pořadí: K B k br k y. Žíhání u psů je tvořeno střídajícími se pruhy feomelaninu a eumelaninu. Při převaze eumelaninu se pes jeví jako černý. K B černí jedinci jsou fenotypově stejní jako psi, u kterých gen Agouti ztratil svou funkci (nonagouti) 22

23 Obr. 19 Černá německá doga ( k br žíhání, které se vyskytuje u různých plemen psů, jako je boxer, greyhound, francouzský buldoček atd., je některými autory spojováno s variantami Agouti, jiní si myslí, že ji zapříčiňuje varianta MC1R (Kerns et al., 2007). Za přítomnosti alely a y se projeví žíhání po celém těle. V přítomnosti a t /a t se žíhání projeví pouze na břichu (Berryere et al., 2005). Obr. 20 Žíhaný whippet (Schmutz,2009) k y žlutý, jedinci jsou stejní jako psi, u kterých ztratil funkci Mc1R Interakce mezi alelami na lokusu K a těmi na Agouti a MC1R odhalují jednoduchou genetiku, která vysvětluje všechny známé eumelanicko-feomelanické varianty a pomáhá odhalit, jak selektovat morfologické znaky u různých plemen domácích psů. V tabulce č. 1 je vyjádřen epistatický vztah mezi ASIP, K lokusem a MC1R. Z této tabulky vyplývá, že žíhání se projeví, pouze pokud v genotypu psa je přítomna alela E (Kerns et al., 2007). Tab. 1 Epistatická příbuznost mezi alelami Agouti, K, a Extension (Kerns et al., 2007) 23

24 Agouti K Extension Fenotyp Vzorek od: a t /a t k/k +/+ černý s německý ovčák pálením a t /a t k/k e/e žlutý afghánský chrt a y /a y k/k e/e žlutý afghánský chrt a y /a y k br/ k br e/e žlutý afghánský chrt a t /a t k br/ k br +/+ černý, žíhané tečky stafordšírský bullteriér a t /a t k br/ k br e/e žlutý francouzský buldoček a t /a t K B /K B +/+ černý černý labrador retriever a t /a t K B /K B e/e žlutý žlutý labrador retriever a y /a y k/k E+/+ žlutý boxer a y /a y k br/ k br +/+ žíhaný boxer a y /a y K B /K B +/+ černá německá doga a y /a y K B /K B e/e žlutý pudl S (white spotting) Lokus S white spotting kontroluje strakatost u psů. Bílé skvrny se mohou vyskytovat jen na některé části těla (náprsenka, lysinka a punčošky) (Obr. 21). Geneticky je kontrolován výskyt a velikost bílé skvrny. Ta může být i tak veliká, že bude pokrývat téměř celé tělo jedince. V takovém případě jde o jednu bílou skvrnu. Není to však albinismus, protože takový jedinec má tmavé oko, tmavý nos i pigmentované sliznice. Alela s i kontroluje výskyt bílé na ploše těla menší než 20% celkové plochy kůže (Dostál, 2007). Nejextrémnější alela s w nalezená u dalmatinů, anglických setrů, bílých bullteriérů, bílých boxerů, atd. U těchto psů je vždy barva srsti bílá. Většina kůže je bez pigmentů. Může se vytvořit několik barevných skvrn, zejména kolem očí a uší (Obr. 22). Někteří jedinci jsou celoplášťově bílí, jiní mají malé skvrny po celém těle (Obr. 23) (Cattanach, 1999). Podle Dostála (1995) alela s w byla selekcí postupně z populací boxera odstraněna. 24

25 Proto se jedinci s větší bílou plochou již prakticky nevyskytují. Podle Tiché (2003) a statistiky chovu z boxerklubu je však vidět, že alela s w rozhodně z populace odstraněna nebyla a bílá štěňata se rodí stále více. To je zapříčiněno tím, že ve výstavním kruhu jsou cennější zvířata, která mají bílou náprsenku, a tato zvířata samozřejmě alelu pro bílou barvu nesou a mohou nám dávat homozygoty bílé barvy. Kdyby v chovech zůstalo více celoplášťově zbarvených zvířat, bylo by možné bílá štěňata z populace odstranit humánně, a ne tím, že by se ihned po narození zabíjela (Vlha J., 2009). Obr. 21 Žíhaný boxer se znaky Obr. 22 Bílí boxeři se skvrnami Obr. 23 Bílý boxer se skvrnami po celém těle Do roku 2006 nebyl identifikován žádný gen způsobující skvrnité vzory u psů. Metallinos & Rine (2000) byly jedni z prvních, kteří se pokusili najít gen spojený se skvrnitostí. Pro studii využili rodinu psů, u které se projevovali znaky. Vyloučili oba dva geny, jak EDNRB, tak KIT, jako geny způsobující bílé znaky na spodní straně těla u velkého množství border kolií, které byly segregovány jako autozomálně recesivní znaky u kříženců F1 generace novofoundlandů s border kolií (Schmutz & Berryere, 2007). Stejně tak van Hagen et al. (2004) vyloučili tyto geny jako původce bílých znaků u boxerů. V roce 2006 byl objeven na 20. chromozomu gen MITF. Rothschild et al. (2006) prokázali, že tento gen zapříčiňuje skvrny strakatých nebo nepravidelných vzorů u kříženců. Také způsobuje Landseerský vzor u novofoundlandských psů (Obr. 24, 25). Identifikovali mutaci v intronu 3. Další studie předložené Karlsonem et al. (2007) ukázaly, že MITF je gen způsobující formy celobarevné, s odznaky a celé bílé u boxerů a bull teriérů. Objevili dvě formy mutace v oblasti MITF působící na pigmentaci, které jsou nezbytné pro vznik bílé barvy u těchto plemen. Jednou z nich je tzv. SINE (short interpsersed nukleotide element) a druhou je LP (lenght polymorphism), což je řetězec opakujících se alel, které se liší v délce u různě skvrnitých psů. Jejich údaje naznačují, že 25

26 LP je delší u plemen s bílými znaky, než u psů bez bílé barvy. Bílé skvrny u boxerů jsou monogenní a semidominantní (Leegwater et al., 2007). Recesivní alela kontroluje bílou skvrnitost u psů a je-li pes homozygotní, má značné množství bílé barvy. Když má dominantní alelu, tak bílé znaky nejsou přítomny nebo jsou minimální, obvykle na nohou, špičce ocasu nebo hrudníku. Mohou existovat i jiné geny, podílející se na skvrnitosti, ale k jejich zjištění je zapotřebí dalšího výzkumu (Schmutz et al., 2009). Bylo nalezeno 10 genů s mutacemi, které zapříčiňují bílé skvrny u myší. Dodnes bylo testováno devět kandidátních genů spojených se skvrnitostí u psů, zahrnující SOX10, MCOLN3, EDN3, KITLG, PAX3, MITF, ASIP, ADAMTS20 a SNAI1. Tyto geny byly buďto vyřazeny (SOX10, MCOLN3, EDN3, KITLG a PAX3), neinformativní u plemen v této studii (ASIP, ADAMTS20 a SNAI1) nebo stále studované (MITF) (Rotschild et al., 2006). Obr. 24 Landseerský vzor ( Obr. 25 Landseerský vzor 1 ( Bylo nalezeno několik isoforem, které se liší v poslední aminoskupině na exonu 1. Byly nazvány: MITF-M, MITF-A, MITF-C a MITF-H. Tyto isoformy ovlivňují aktivaci transkripce a působí na vazbu DNA. MITF-M omezuje funkci melanocytů. MITF-A je častější a obohacuje RPE (retinal pigment epithelium pigmentovaná vrstva buněk okolo sítnice). MITF-C a MITF-H se téměř nevyskytují, a ještě není zjištěno, jakou mají funkci. Obě isoformy MITF-M i MITF-H označovány jako verze (-) a (+). Stále zůstává několik otázek. Např.: Zda mutace v genu MITF zapříčiňují ztrátu melanocytů ve stáří a poruchy pigmentace tvořící bílé skvrny? Jsou některé geny způsobující zbarvení srsti ovlivněny tímto genem? Dává MITF nějaké signály melanocytům? Které mutace genu zapříčiňují změnu melanocytů (Gooding, 2000). 26

27 Obr. 26 Psí chromosom 20 ( Mutace v tomto genu u lidí zapříčiňuje Waardenburg syndrom, který je charakteristický hypopigmentací a hluchotou (Leegwater et al., 2007). Charakteristickými projevy této nemoci jsou: široká základna nosu (papouščí nos), porucha pigmentace, jako jsou dvě odlišně zbarvené oči (jedno modré a druhé hnědé), bílé obočí řasy, předčasné šedivění vlasů a určitý stupeň hlemýžďovité hluchoty (NCBI, 2007). Tato nemoc byla pojmenována po Petru Johannesovi Waardenburgovi, německém očním lékaři, který si v roce 1947, jako první všiml u lidí s odlišně barevnýma očima častých problémů se sluchem (Bason et al., 2002). Několik typů Waardenburgova syndromu je dědičných. Prováděly se výzkumy několika generací rodin s typickým projevem, které měli jeden nebo více příznaků hluchoty. Typ I této choroby je charakterizován složeným víčkem, zatímco typ II nemá tento příznak, ale místo toho má častější výskyt hluchoty (NCBI, 2007). Typ III je stejný jako typ I, navíc zahrnuje zkrácení svalů. Typ IV je také stejný jako typ I, ale dalším příznakem je malformace trávícího traktu (Bason et al., 2002). Obr. 27 Sourozenci s Waardenburg syndromem ( U myší mutace v MITF ovlivňují různý stupeň nedostatku melanocytů, který se projevuje od skvrnitosti přes zředění barvy až po bílou srst. Některé mutace také vedou 27

28 k RPE (Bauer et al., 2009). Dalšími defekty jsou malé oči, vstřebávání sekundární vrstvy kostní tkáně a snížení imunity (Hodgkinson et al., 1993) M (Merle) Gen pro merle zbarvení SILV byl nalezen na CFA10. Byla nalezena SINE v rozmezí exonů 10 a 11, která zapříčiňuje fenotyp merle u mnoha plemen. Merle, je charakterizováno skvrnami zředěného pigmentu smíchaného s normálním melaninem (Clark et al., 2006). Často se u těchto jedinců vyskytují modré oči (Hédan et al., 2006). Pro několik plemen je to standardní zbarvení (např. pro šeltii, australského ovčáka, welsh corgi, jezevčíky, catahoula leopardího psa, bergamasca a pyrenejského ovčáka). Ačkoliv merle není akceptovanou barvou u německých dog, tak žádoucí vzor harlekýn vyplývá z interakce merle lokusu a harlekýn lokusu. Merle je děděno autozomální cestou s neúplnou dominancí. Dominantní homozygoti jsou celí bílí, heterozygoti mají merle zbarvení a recesivní homozygoti mají normální zbarvení (Obr. 28) Heterozygoti nebo homozygoti pro merle představují širokou škálu sluchových a očních abnormalit (Clark et al., 2006). Obr. 28 Normální, merle a bílé zbarvení šeltie (Clark et al., 2006) C (Albinismus) Dominantní alela je pravděpodobně strukturálním genem pro tyrozinázu (enzym podílející se na syntéze melaninu z tyrozinu) (Bowling, 2000). U albínů tento enzym nemůže být tvořen, a proto nemůže být produkován melanin (Bowling, 2000). Tyrozináza byla mapována na chromozomu CFA21 v exonu 1. V exonu 4 byly nalezeny dva polymorfismy R408Q a L438F vedoucí k záměně aminokyselin (Schmutz and Berryere, 2007). 28

29 C dominantní alela umožňuje, aby se normálně projevil pigment a je pravděpodobně genem pro tyrozinázu. c a recesivní alela, která zcela zamezuje v homozygotní formě vzniku jakéhokoliv melaninu v srsti nebo duhovce očí, které jsou potom červené nebo růžové (Bowling, 2000), bez pigmentace na nose a polštářcích. Existují albinotické rodové linie dobrmanů. Kompletní kód sekvence tyrozinázy u těchto dobrmanů byl porovnán se sekvencí pudla krémové barvy, ale neukázal žádný polymorfismus, který by vysvětloval albinismus u těchto zvířat (Schmutz and Berryere, 2007). Bílou barvu u dobrmanů by mohla zapříčiňovat alela c p, která se vyskytuje u jiných zvířat. Tato barva je recesivně dědičná. Dalším charakteristickým albinem je tato lhasa apso (Obr. 28), u kterého také nenašli mutaci v kódující sekvenci Tyrozinázy. Po spojení s normálně barevným psem měla štěňata normálně zbarvená a s barevným nosem (Schmutz, 2009). Obr. 29 Albino lhasa apso (Schmutz 2009) c ch činčila šedé nebo vlčí zbarvení c e extrémní ředění, nachází se u některých bílých psích plemen, jako např. West highland terier, oči mohou být světlé c h Himalyan, u psů není znám, v homozygotní formě dává vznik eumelaninu v závislosti na teplotě kůže c p Platinum, je opticky podobný albínům, ale zachovává si velmi slabou aktivitu tyrozinázy, a má lesklou srst. Zřejmě se vyskytuje u bílých dobrmanů s modrýma očima (Bowling, 2000) 29

30 Obr. 30 Albino dobrman ( c b cornaz, modrooký albín (Dostál, 2007) G (Greying) Šedivění začíná na různých částech těla, a v různém věku u plemen, které představují progresivní šedivění. Některým psům se jako reakce na vakcinaci nebo injekci barva tohoto místa vrátí do tmavého juvenilního pigmentu. Po pár měsících toto místo opět zesvětlá. U koní byla tato alela nalezena na chromozomu ECA25q, který koresponduje s HSA9q a významná část tohoto chromozomu koresponduje se psím chromozomem 11. Proto by se hledání lokusu G u psů mělo zaměřit na tento chromozom (Schmutz and Berryere, 2007). Obr. 31 Tito puli se narodili jako černí, odstup mezi nimi je rok (Berryere, 2009) Efekt tohoto genu je velmi složitý. Není zcela jasné, zdali je alela G úplně či neúplně dominantní nad alelou g, která kontroluje normální pigmentaci osrstění až do stařeckého šedivění (Dostál, 2007). 30

31 3.3.9 D (Dilutes eumelanin) Gen pro ředění eumelaninu MLPH se nachází na CFA25. Někteří psi se rodí šedí a časem modrají. Jiní psi během několika měsíců přecházejí z černé na šedou. Obě tyto varianty zapříčiňují dědičné modifikace eumelaninu i feomelaninu, kdy dochází k zesvětlení srsti. U feomelaninu tato změna není tak dramatická jako u zředění eumelaninu (Schmutz and Berryere, 2007). Zředění zřejmě způsobuje shlukování pigmentových granulí v chlupech (Bowling, 2000). Philipp et al. (2005) nalezli při sekvenování psího genu MLPH u plemene německý pinč mutaci v exonu 7 (R199H) a u plemene dobrman, stejně tak i u velkého münsterlanda s BHFD (black hair follicular dysplasia), sadu SNP okolo exonu 2. U dobrmanů je zředění spojováno s rozšiřující se nemocí color dilution alopecia (CPA), která se také nazývá syndromem modrého dobrmana (Obr. 32). Mutace byly také nalezeny u myší na exonu 2, kde dochází k záměně C>T a u dětí jako mutace R35W na konci exonu 2, která způsobuje určitou formu albinismu. U psů zatím nalezeny nebyly (Schmutz and Berryere, 2007). Obr. 32 Modrý dobrman (Philipp et al. 2005) D kontroluje normální hustotu granulí v chlupech a je dominantní nad alelou d d kontroluje řídké rozvrstvení granulí v chlupech, a je recesivní k alele D U kořene chlupu je vždy poněkud řidší rozvrstvení granulí. Proto se nám chlupy jeví u kořene světlejší než na konečcích, kde je rozvrstvení granulí hustší (Dostál, 2007). 31

32 T (Ticking, tečkování) Tečkování se nachází například u dalmatinů. Jsou to drobné tečky na bílém pozadí. Tyto tečky se neukážou při narození, ale začínají se objevovat až po pár týdnech (Schmutz and Berryere, 2007). Obr. 33 Tečkovaný dalmatin (Berryere, 2009) Na lokusu T se vyskytují dvě alely T kontroluje tečkování a je dominantní nad alelou t, která kontroluje čistě bílé zbarvení (Dostál, 2007). 3.4 L (délka srsti) Mnoho let je známo, že délka srsti u psů je ovlivněna několika geny, ale žádný z nich zatím nebyl identifikován. Analýza sekvence genu Fibroblast growth factor 5 (FGF5) u dlouhosrstých a krátkosrstých psů plemene korgi identifikovala mutace ve dvou kódujících oblastech (Housley and Venta, 2006). Délka srsti je děděna recesivně autozomální cestou. Alela N zapříčiňuje krátkou srst a je dominantní nad alelou F, která svou mutací zapříčiňuje dlouhou srst (Vetdnacenter, 2010). Drögemüller, et al.(2007) našli mutace v genu FGF5 u koček (c.194c>a), (c.182t>a), (c.474delt) a (c.475a>c), zapříčiňující dlouhou srst. Kočky s krátkou srstí neměly žádnou nebo jednu kopii této alely. 3.5 Testy DNA pro barvu srsti Tyto testy se provádí v zahraničí například Vetdnacenter na Michiganské státní univerzitě nebo také Vetgen z Michiganu. Obě instituce provádí testy na alely E, E m, B, D, K B, a y, a a délku srsti. Vetgen navíc provádí test na alelu k y. Cena testu za jeden lokus 32

33 se pohybuje kolem 50$. Dalším centrem je HealthGene z Toronta. V České republice žádná firma testy DNA pro barvu srsti psů komerčně neprovádí. 3.6 Nemoci spojené s barvou srsti Hluchota Nejrozšířenější je u dalmatinů. V USA je postiženo 30 % populace. Dědičnost hluchoty u tohoto plemene je neznámá. Z 266 psů bylo 18,1 % postiženo jednostranně a 7,5 % oboustranně (Cargill et al., 2004). Jednostrannou hluchotu může prokázat test BAER. Hluchota je spojena se dvěma alelami (Tab. 2). Jednou z nich je dominantní alela M (která se nachází u kolií, welsh korgi pembroke a harlekýnské německé dogy), která v homozygotním stavu projeví jedince jako celého bílého. Ti mohou být slepí, hluší nebo jinak nemocní. Druhou alelou je recesivní s w, typická pro dalmatiny, anglické setry, bílé bulteriéry, bílé boxery a další. Jejich srst je celá bílá nebo se skvrnami. Objasnění těchto pigmentovaných/nepigmentovaných vzorů je vodítkem pro vysvětlení spojitosti mezi bílou barvou srsti a hluchotou (Cattanach, 1999). U postižených psů se totiž ukázala absence melanocytů ve stria vascularis (součást vnitřního ucha), a tyto buňky potom ovlivňují koncentraci iontů v hlemýždi. Také dalmatini s modrým okem jsou ke hluchotě náchylnější než dalmatini s hnědýma očima (tab. 3). A třetím znakem spojitosti hluchoty s pigmentací je, že dalmatini se skvrnami mají menší náchylnost ke hluchotě než dalmatini bez skvrn. Barva skvrn nehraje roli. Způsob dědičnosti u dalmatinů ještě nebyl odhalen. Při páření dvou zdravých jedinců se narodil hluchý jedinec, což vylučuje dominantní alelu pro hluchotu. Vyloučení recesivní autozomální alely není možné, protože se nikdy nepářili dva oboustranně hluší jedinci. Když byli páření dva jednostranně hluší jedinci, tak produkovali normálně slyšící potomstvo. To ale stále nevylučuje recesivní autozomální alely (Cargill et al., 2004). Tab. 2 Plemena s hluchotou, která je přisuzována alelám s a M (Cattanach, 1999) Plemeno Oboustranná hluchota Jednostranná hluchota Normální Počet psů Genotyp dalmatin 8,0 % 21,8 % 70,2 % 4566* s w s w bílí bulteriér 1,5 % 17,5 % 81,0 % 269 s w s w anglický setr 2,4 % 12,7 % 84,9 % 370 s w s w 33

34 anglický kokršpaněl 1,8 % 7,0 % 91,2 % 388 s p s p barevný bulteriér 0,0 % 2,1 % 97,9 % s w? australský honácký pes 2,9 % 8,5 % 88,6 % 70 M + dunker 75,0 % - 25,0 %? MM Zbarvení duhovky Zbarvení oka je výsledkem spolupůsobení genů kontrolujících zbarvení srsti psů a modifikujících polygenů. Alely b a d kontrolují zesvětlené zbarvení oka. Tmavší zbarvení oka je dominantní nad zbarvením světlejším. Vlivem redukce pigmentace u pseudoalbínů pozorujeme oko modré nebo červenomodré a u úplných albínů červené. U merle zbarvených jedinců je modré oko způsobeno redukcí pigmentace oka, která je spojená s redukcí pigmentace osrstění. U plemen jako je pudlpointr nebo sibiřský husky, ale i dalších plemen, světlé oko s redukcí pigmentace osrstění nesouvisí. U savců všeobecně je popisován vliv genu P (pink-eyed dilution) na zbarvení oka. Alela P kontroluje normální zbarvení oka. Alela p kontroluje značné zesvětlení oka na modro červené nebo hnědě červené. Alela c b a alela p spolu vzájemně reagují tak, že vzniká pseudoalbín, který má téměř bílé osrstění a růžové oči (Dostál, 2007). Modré oko se také nachází u boxera (Obr. 33, 34), který nemá dříve zmiňované alely. U těchto jedinců je nevybarvenost duhovky zřejmě zapříčiněna alelou s w, protože mutace v genu MITF (Waardenberg syndrom a Tietz syndom) u lidí způsobují hypopigmentaci (Smith et al., 2000). Obr. 34 Jedno modré oko Obr. 35 Obě oči modré Tab. 3 Vztah modrých očí ke hluchotě u dalmatinů (Cattanach, 1999) 34

35 Autoři Barva očí Oboustraná hluchota Jednostraná hluchota Normální Počet psů Strain et al hnědé/hnědé 6,9% 20,3% 72,8% 915 (1992) hnědé/modré 18,4% 30,3% 51,3% 76 modré/modré 12,5% 43,8% 43,8% 32 Holliday et al hnědé/hnědé 5,6% 18,8% 75,5% 799 (1992) hnědé/modré 15,8% 39,5% 44,7% 76 modré/modré 22,2% 33,3% 44,4% Color dilution alopecia Tato nemoc se projevuje se postupnou ztrátou chlupů, která je někdy doprovázena opakovanou bakteriální infekcí chlupových folikulů. Shluk melanosomů vyskytující se v melanocytech kůže a vlasových folikulů, vyústí v makromelanosomy v chlupových jamkách, které se následně zlomí při nově vznikající z kůže. Napadená kůže CDA postižených psů je často suchá a šupinatá, náchylná ke spálení nebo omrzlinám. BHFD je formou alopecie, kdy je postižená pouze plocha s černou srstí, projevuje se stejně jako CDA (Philipp et al., 2005). Obr. 36 CDA ( 3.7 Použité metody molekulární genetiky Elektroforéza Technika na separaci nukleových kyselin. Je to fyzikálně-chemická metoda pro dělení látek v elektrickém poli. Zařízení se skládá z elektroforetické vany s anodou, katodou a pufrem, vlastního držáku gelu, ve kterém bude k separaci docházet, a externího zdroje stejnosměrného napětí. 35

36 3.7.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Při zahřátí se DNA denaturuje na jednotlivé řetězce. Na každý z nich se připojí jeden primer, který ohraničí cílovou sekvenci z každé strany. Pomocí DNA polymerázy se z nukleotidů vytvoří komplementárně nový řetězec, vzniknou tak dva duplexy, které se opět při denaturaci separují. Proces se opakuje mnohokrát, tím dochází k exponenciálnímu růstu počtu kopií původní sekvence (Řehout a kol., 2005) Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) Štěpením genomové DNA určitou restrikční endonukleázou se vytvoří různý počet a délka restrikčních fragmentů. Rozdíly ve velikosti restrikčních fragmentů u různých jedinců lze snadno detekovat gelovou elektroforézou (Šmarda a kol., 2005) Sekvenování Prováděli jsme metodu podle Sangera, která je v současné době nejběžnější metodou sekvenování DNA. Sekvenují se krátké sekvence jednovláknové DNA, která je matricí. DNA-polymeráza má schopnost vytvářet přesné kopie molekuly DNA a specificky syntetizovat řetězce DNA ve směru 5 3 od primeru s volnou 3 -OH skupinou. Syntéza řetězce na matricové DNA je zahájena od místa, ke kterému je připojen sekvenčně specifický primer pro sekvenování, a ukončena v místě, v němž je do rostoucího řetězce inkorporován místo normálního deoxyribonukleosidtrifosfátu (dntp) jeho analog 2,3 -dideoxyribonukleosidtrifostát (ddntp), postrádající 3 -OH skupinu. Ten má po začlenění do rostoucího řetězce DNA funkci koncového inhibitoru (terminátoru) syntézy DNA, jelikož DNA-polymeráza k němu nemůže v důsledku nepřítomnosti 3 -OH skupiny připojit další nukleotid. Fluorescenční barviva jsou navázaná na jednotlivé ddntp (Šmarda a kol. 2005), kterých jsou čtyři druhy ddttp, ddgtp, ddatp a ddctp. Jelikož jsou v každé reakci namíchány vždy a ddntp, je vždy věcí náhody, kdy se některý ddntp vmezeří do syntézy, a kde se tedy nový řetězec ukončí. Vždy je to na pozici, kde by v normální sekvenci byla normální forma nukleotidu (pokud se vmezeří ddgtp, tak nový řetězec bude končit v místě, kde se normálně nachází báze G) (Doleža,l 2009). Vhodně zvolený poměr mezi ddntp a odpovídajícím dntp (1:100) v reakční směsi rozhoduje o tom, jak dlouhé řetězce, náhodně zakončené v místech začlenění ddntp, budou DNA-polymerázou syntetizovány (Šmarda a kol., 36

37 2005). Analýza reakce se provádí pomocí kapilární elektroforézy (Obr. 37), kdy fragmenty se na základě velikosti rozdělí tím, jak putují kapilárou a na konci kapiláry je detektor, který je schopný zaznamenat barvu právě projíždějícího nukleotidu. Výsledkem je sekvence barevně odlišených nukleotidů (Obr. 42) (Doležal, 2009). Obr. 37 Kapilární elektroforéza (Doležal 2009) 37

38 4 MATERIÁLY A METODY ZPRACOVÁNÍ 4.1 Odběr vzorků Celkem bylo odebráno 29 žíhaných, 31 zlatých a 34 bílých německých boxerů. Bylo zaznamenáno jméno, pohlaví a barva + odznaky. Ve většině případů byla vytvořena fotografická dokumentace. 4.2 Izolace DNA DNA byla izolována pomocí JETQUICK Tissue DNA Spin Kit z bukální sliznice, která byla odebrána kartáčky Cytobrush Postup izolace -Odstřižené kartáčky vloženy do Eppendorfovy zkumavky, přidáno 200 µl pufru T1 a vortexováno 10 s. -Přidáno 25 µl proteinázy K, vortexováno 15 s., centrifugováno a inkubováno 2 hodiny při 56 C, po 1 hodině centrifugováno. -Přidáno 200 µl pufru T2, vortexováno 15 s. a inkubováno 10 minut při 70 C. -Roztok zchlazen na ledu 1 minutu a přidáno 200 µl 90% etanolu, vortexováno 15 s., centrifugováno. -Kolonka byla vložena do centrifugační zkumavky a byla do ní přepipetována směs, získaná v předchozím kroku, a centrifugováno 1min při rpm. -Obsah centrifugační zkumavky byl vylit, přidáno 500 µl pufru TX, centrifugováno 1 minutu při rpm. -Obsah znovu vylit, přidáno 500 µl pufru T3, centrifugováno 1 minutu při rpm. -Prázdná kolonka centrifugována 2 minuty při rpm. pro dokonalé odstranění T3 pufru. -Kolonka umístěna do sterilní Eppendorfovy zkumavky, přidáno 100 µl 10mM Tris HCl pufru, předehřátého na 70 C. -Inkubováno 2 minuty při pokojové teplotě. -Centrifugováno 2 minuty při rpm. DNA se nacházela v roztoku uvnitř Eppendorfovy zkumavky. 38

39 -Výsledek izolace byl ověřen na 1,5% agarózovém gelu v pufru TBE, vizualizace pomocí ethidium bromidu a UV světla. Obr. 38 Výsledek izolace DNA DNA byla uchována při -20 C pro následné analýzy. 4.3 PCR Reakční směs byla optimalizována pro termální cykler PTC 200 TM (MJ Research) Optimalizovaná reakční směs Celkové množství 15µl: H 2 O 6 µl Primer A 0,3 µl Primer B 0,3 µl hot star mix 7,2 µl DNA 1,2 µl Teplotní profil - úvodní denaturace 95 C/15 minut - 30x denaturace annealing elongace 94 C/30 sekund 56 C/30 sekund 72 C/30 sekund - závěrečná elongace72 C/7 minut 39

40 - konec4 C Výsledek PCR byl ověřen na 3% agarózovém gelu (pufr TBE). Vizualizace provedena ethidium bromidem při UV světle. Obr. 39 Výsledek PCR 4.4 RFLP PCR produkt byl štěpen restrikční endonukleázou BfaI, která štěpí nukleotidy v bodě c/taq Reakční směs Celkový objem 15 µl: H 2 O 8,4µl PCR produkt 5 µl enzym BfaI. 0,1µl Pufr Tango 1,5µl Inkubováno přes noc při 37 C. Naneseno na 3% agarózový gel a vizualizováno ehtidium bromidem při UV světle. 40

41 Obr. 40 Výsledek štěpení 4.5 Sekvenování Přečištění Přečišťujeme, abychom odstranili nezačleněné terminátory, které by nám mohly zkreslit výsledek. Toto přečištění se provádí pomocí MinElute TM PCR Purigication Kit (QIAGEN) -přes kolonky -přidání pufrů -PBI (5x množství PCR produktu) stočit 1 min. při rpm. vylít -750µl PE stočit 1 min. při rpm. vylít a znovu stočit -do čistých zkumavek vložíme kolonku + 10µl EB elučního pufru 10 minut inkubovat při laboratorní teplotě stočit Kvantifikace PCR produktu -1µl 6x DNA LOADING DYE ke vzorkům -v každé jamce používáme snižující se množství markeru M50, již smíchané s L.D. 20 µl markeru 3 µl vzorku č µl markeru 3 µl vzorku č µl markeru 3 µl vzorku č. 30 2,5 µl markeru 1,25 µl marekur 0,63 µl markeru 41

42 -elektroforéza 85V minut Obr. 41 Výsledek kvantifikace PCR produktu Vlastní sekvenování -Big Dye Terminator v 3.1. Cycle Sequencing Kit (APPLIED BIOSYSTEMS) -primer A, reagent Ready Reaction Mix -Teplotní profil sekvenační reakce: 95/1 - (96/10-50/5-60/4 ) 25 x 4/00 -přečištění sekvenační reakce kitem Jelikož byl produkt větší než 600 bp, sekvenovali jsme i z druhé strany primerem B Vyhodnocení sekvenování -porovnání sekvence pomocí programu ClustalW2 [online] Obr. 42 SNP dle Rothschilda C/T 42

43 5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUZE 5.1 Vyhodnocení izolace DNA a vzorků boxerů. Celkem bylo izolováno 92 vzorků, z čehož bylo 35 bílých, 29 žíhaných a 28 zlatých 5.2 Zbarvení boxera U boxerů dominantní homozygot nemá prakticky žádné bílé odznaky a recesivní homozygot je prakticky celý bílý. Heterozygot je s bílými odznaky na hlavě, hrudi, krku nebo břichu (Schmutz et al. 2009). Toto se potvrdilo i v této práci, kdy všichni bílí psi, jak bez znaků (Obr. 42), tak i se znaky (Obr. 43), se projevili jako recesivní homozygoti s/s. Heterozygoti S/s jsou většinou psi s velkými bílými odznaky (Obr. 44), ale též byla testována fena s malými odznaky na hlavě (Obr. 45), která je také heterozygot. Psi bez odznaků (Obr. 46) jsou dominantní homozygoti S/S, občas mohou mít malé odznaky (Obr. 47). Byly nalezeny dva nové polymorfismy v intronu 3 genu MITF (c t>c) a (c a>g). Rothschild et al.,(2006) testovali plemeno čiperka, bígl a novofundlandské psy. Našli jeden polymorfismus v intronu 3 genu MITF (c c>t). Celobarevně zbarvená zvířata (SS) byla CC, heterozygoti (Ss) byli CT a skvrnitá zvířata (ss) byla TT. Genotypy jsou tedy stejné jako naše, což ukazuje, že tento MITF marker může předpovídat skvrnitost u těchto plemen. Podle Rotschilda et al. (2006) jiná plemena (německá doga a americký stafordšírský bulteriér) neukazovali spojitost mezi MITF a skvrnitostí. Křivánková (1999) píše, že se bílé zbarvení nachází až u 25 % boxerů. To by bylo možné, pokud by všichni boxeři v chovu byli pouze heterozygoti nesoucí alelu pro bílou barvu. V chovu se ovšem také používají dominantní homozygoti, kteří alelu bílou barvu nenesou, a proto nikdy bílá štěňata nedávají. Takže toto číslo musí být menší. I ze statistik Boxerklubu vyplývá, že se ve skutečnosti se rodí v průměru 10,5 % bílých jedinců. 43

44 Obr. 43 Recesivní homozygot bez znaků Obr. 44 Recesivní homozygot s odznakem Obr. 45 Heterozygot s velkými odznaky Obr. 46 Heterozygot s malým odznakem na hlavě, ale velkou náprsenkou Obr. 47 Dominantní homozygot téměř bez odznaků Obr. 48 Dominantní homozygot s malými odznaky SNP dle Rotschilda: štěpení restrikční endonukleázou BfaI: AA - 551, 131, Aa - 551, 293, 258, 131, aa - 293, 258,

45 Obr. 49 Genotypy žíhaných boxerů SNP NOVÉ: štěpení restrikční endonukleázou MspI: S/S- 682 bp, S/s - 682, 278, 404 a s/s- 278, 404 Heterozygot Dominantní homozygot Recesivní homozygot Obr. 50 Genotypy vybraných boxerů všech barev Tab. 4 Relativní frekvence genotypů a relativní frekvence alel Barva Počet psů s/s S/s S/S s S žíhaná ,655 0,345 0,33 0,67 zlatá ,607 0,393 0,30 0,70 bílá

46 5.3 Vyhodnocení sekvenování Byli osekvenováni tři psi: vzorek č. 4 = žíhaný pes (S/S) vzorek č. 18 = zlatá fena (S/S) vzorek č. 30 = bílý pes (s/s). Ke srovnání byla použita referenční sekvence 682 bp. MITF 2A MITF 1A CTGAAGGCTGTGGGAGTGAGTCTCGAGAGAAAACAAAGAAATGGCAGCCATCATTCAGATGAGGTTTCCTGGTTCATCTTTGCTTTTTGG GGGAGGCAGTTGAACCTCTGTAACACTTTAGAGCATGAGTTCAAGTTGTGGCTCTCACTCTCTTCCCATATGACATTCGGCAAATTGCTT CTCATTTATCTCACCTGGAAAATTCATGTTAATAGTACCTACATTGATAGGGTTATTGTGAGGGAGCAAAATAATTTAACCCATCAAAAA CCCTGAACCGGGTGCCTGGCACCTAGTAATCCCTCCCTAAGTGCTGGTTGCAGGTGTCATCATTGTCACCTGTTAGTGTCAGTGACTTTC AGTAATGTTCATATTTGGGAGGAAGAGGACGGTAGTTTCTCAGAATCTAACTGAAGAGCATTAGTGCTTAGGGTAAAAAAAGACCGTGGA TCTCTCTTTGGGTGGCTTTGCACAGTTTTTGCTTACATTTATCTCTCTTCCATTGCCCTTTTTCCTACAGATGGATGATGTAATTGATGA CATCATTAGCCTAGAATCAAGTTATAATGAAGAAATCCTGGGATTGATGGATCCTGCTTTGCAAATGGCAAATACGGTATTGATGACTTT TTTTTTTTTTTTAAAGAAAATCTTGAGATATTTCCAGTGTTCTCTCCCTTTC MITF 1B MITF 2B Tab. 5 Výsledky sekvenování: ref_sek SNP dle Rotschilda(C/T) T CC CC TT 2. SNP Nové (C/T) C TT TT CC 3.SNP Nové (A/G) A AA AA GG 46

47 Obr. 51 SNP dle Rotschilda C/T Obr. 52 SNP Nové C/T 47