Polymorfismus genu EDNRB ve vztahu ke zbarvení a onemocnění u koní

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Polymorfismus genu EDNRB ve vztahu ke zbarvení a onemocnění u koní Diplomová práce Vedoucí práce: prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Vypracovala: Bc. Lucie Svobodová Brno

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Polymorfizmus genu EDNRB ve vztahu ke zbarvení a onemocnění u koní vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne. podpis diplomanta 2

3 PODĚKOVÁNÍ Chtěla bych poděkovat Mgr. Zuzaně Vykoukalové, Ph.D. za velikou pomoc při práci v laboratoři a celkově za pomoc při psaní diplomové práce. Za pomoc s vyhodnocením statistiky děkuji doc. Ing. Tomáši Urbanovi, Ph.D. Za další nápady a pomoc děkuji Terce Sobíškové. Největší poděkování patří babičce Ing. Jitce Houškové za hlídání syna Filípka a celé mojí rodině za podporu při studiích. Poděkování patří také všem chovatelům a majitelům, kteří ochotně poskytli vzorky od svých koní a umožnili jejich fotografickou dokumentaci. Diplomová práce byla zpracována s podporou projektu CEITEC CZ.1.05/1.1.00/

4 ABSTRAKT Zbarvení srsti u koní je významné nejen z hlediska ochrany před predátory a vlivy počasí, ale má svůj význam při jejich identifikaci či jako plemenný znak. Strakatost typu frame overo je ovlivněna dominantní alelou frame Fr F (L), která vzniká dinukleotidovou substitucí TC AG v kodonu 118 genu EDNRB, způsobující záměnu aminokyseliny isoleucinu za lysin. Páření dvou jedinců s touto alelou se ale nedoporučuje - s 25% pravděpodobností se může narodit hříbě s tzv. OLWS (letální syndrom bílých hříbat). Postižená hříbata se rodí převážně celá bílá s modře pigmentovanou duhovkou a s neinervovanou částí trávicího traktu. Asi po 12-ti hodinách života vykazují příznaky koliky a za několik dní umírají. V nejasných případech je zapotřebí nechat určit genotypy rodičů v laboratoři. Hříbata s letálním syndromem značíme jako homozygoty L/L, jedince s frame vzorem jako heterozygoty L/N a koně bez mutace N/N. V této práci byl polymorfismus v genu EDNRB způsobující OLWS analyzován u 133 koní plemene paint horse. Detekce alely byla prováděna metodou AS-PCR a potvrzena u 27 koní vzorů frame overo, frame sabino a tovero. U těchto jedinců byl vzor frame dohledatelný v původu. U 109 jedinců vzorů tobiano, sabino, tovero a solid nebyla mutace detekována. Žádný žijící jedinec L/L nebyl zaznamenán. klíčová slova: paint horse, OLWS, EDNRB, frame overo, letální syndrom bílých hříbat. 4

5 ABSTRACT The frame overo coat pattern is characterised by spotting of irregular size, which usually occur on the middle of the side of the body and neck, and tends to have clear edges. Genetic control of the frame pattern is affected by dominant allele Fr F (L). There was detected dinucleotid substitution TC AG in codon 118 of the EDNBR gene, Ile118Lys mutation. Mating two horses that carry the allele is not recomended. There is 25% probability that the foal produced by this mating will have the OLWS syndrome (overo lethal white syndrome). These foals are predominantly white with blue iris and they have not innerved portions of the intestinal tract. The foal exhibites symptoms of colic in about 12 hours of birth and die within a few days. Genetical testing for the frame allele is available and it is recomended to have the horses tested to avoid the mating of two carriers. The foals with OLWS are analysed as homozygotes L/L, horses with frame pattern as L/N and horses without this mutation as N/N. Using the AS-PCR method, from the sample of 133 horses (American Paint Horse) the mutation was detected within 27 horses with the frame overo, frame sabino of tovero pattern. All these horses have the frame pattern inherited from their ancestors. 109 horses without the mutation were the tobiano, sabino or tovero pattern or solid colored. No one living L/L horse was found. Key word: American Paint Horse, OLWS, EDNRB, Frame overo, lethal white foals syndrom 5

6 Obsah PROHLÁŠENÍ... 2 PODĚKOVÁNÍ... 3 ABSTRAKT ÚVOD CÍL LITERÁRNÍ PŘEHLED American Paint Horse Historie plemene Základní zbarvení koní Lokus Color C (MATP) Extension a Agouti lokus Lokus Extension E (MC1R) Lokus Agouti A (gen ASIP) Známé lokusy ovlivňující základní zbarvení koní White marks/odznaky (WM) základní vzory strakatosti Tobiano (KIT) Overo Lokus sabino Sb (KIT) Lokus splashed white Spl (PAX3) Lokus Frame Overo Fr (EDNRB) Hříbě OLWS ze solid QH klisny Waanderbung-Hirschsprung syndrome Tovero MATERIÁL A METODIKA Odběr vzorků Izolace DNA

7 4.3 Detekce polymorfismu Ile118Lys mutace AS-PCR Statistické vyhodnocení Frekvence genotypů a alel VÝSLEDKY Izolace DNA Stanovení genotypů polymorfismu Ile118Lys pomocí AS-PCR Statistické vyhodnocení Frekvence genotypů a alel Ile118Lys mutace genu EDNRB Absolutní frekvence genotypů vzhledem k fenotypu jedinců DISKUZE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK SEZNAM ZKRATEK PŘÍLOHY SEZNAM PŘÍLOH

8 1 ÚVOD Zbarvení srsti u divokých koní je významné z hlediska ochrany před predátory a vlivy počasí. U domestikovaných jedinců nabývá i dalšího významu jakou je identifikace či plemenný znak. V dnešní době jsou na barvu srsti kladeny vysoké nároky. Některá atraktivní a žádaná zbarvení jsou však asociována s různými chorobami nebo mohou být zcela letální. V současné době zažívá velký pokrok genetika barev - je již objasněna dědičnost většiny typů zbarvení. Jsou také detekovány mnohé příčinné mutace i jejich místo v genomu. Dnes se tedy nemusíme spoléhat na odhady výsledného zbarvení u hříbat pouze z rodokmenů, ale stačí laboratorně jedincům identifikovat genotyp pro zbarvení DNA testy. Díky určenému genotypu lze snadněji sestavit rodičovský pár, předpovědět zbarvení potomků a hlavně se vyvarovat možné letální sestavě genů. Strakatí koně jsou oblíbení po celém světě a vyskytují se u různých plemen. Některé plemenné knihy však nedovolují vůbec registrovat tyto jedince kvůli případným zdravotním komplikacím (př. American Quarter Horse AQH). U plemene paint horse (PH) je však strakatý kůň chovatelským cílem a registruje tři základní typy strakatosti (tobiano, overo (frame, sabino, splashed white) a tovero). Vzor frame overo je geneticky podmíněn dominantní alelou Fr F polymorfismu Ile118Lys v genu EDNRB. Tato alela však v homozygotní sestavě působí letálně na narozené hříbě. Vzor frame overo má sice zcela charakteristický fenotyp, ale díky vzájemnému křížení a interakci různých vzorů, může být mutace detekována i u zdánlivě jednobarevného koně plemene paint horse. Testování koní je tedy jedinou spolehlivou metodou jak určit zygotnost jedince a zajistit tak produkci životaschopných koní s žádaným zbarvením. 2 CÍL Cílem této práce je shromáždit dostupné informace o plemeni paint horse, popsat známé vzory strakatostí a jejich genetické založení, stanovit genotypy polymorfizmu Ile118Lis v genu EDNRB a vyhodnotit jejich asociace s fenotypem, dále pak stanovit frekvence alel a genotypů u daného souboru zvířat a vyhodnotit je pomocí statistiky. 7

9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED Není-li uvedeno jinak v seznamu obrázku, tabulek a příloh; autor: Lucie Svobodová. 3.1 American Paint Horse V naší republice se představitelé plemene paint horse začali objevovat teprve na konci 20. století a roku 1995 byl založen Paint Horse Club ČR. Stejně jako u quarterů je hlavním požadavkem tzv. dobytkářský ráz. Typické je výrazné osvalení s pevnou kostrou způsobilé pro celodenní práci na ranči s dobytkem. U tohoto kompaktního koně je také kladen důraz na povahové vlastnosti. Důležitá je klidná povaha se smyslem pro samostatnou práci a pro práci s dobytkem, tzv. cow sense. Ohledně zbarvení je chovatelským cílem dosáhnout kontrastních vzorů, kdy barevná srst na pigmentované kůži se střídá se srstí bílou na nepigmentované pokožce. Minimálním požadavkem na zbarvení je alespoň jedna bílá skvrna, která má v průměru asi 5 cm a u převážně bílého koně musí být tato skvrna v kontrastní tmavé barvě. Klasické odznaky na hlavě a na končetinách nejsou brány v úvahu. V popisu zbarvení se vždy uvádí základní barva srsti a typ strakatosti př. bay tobiano. American Paint Horse Association (APHA) povoluje všechny typy zbarvení, kdy strakaté jedince registruje v základním registru (Regular Registry) a nestrakaté v registru jednobarevných paintů (Solid Paint Bred Registry). Asociace také registruje koně splňující minimální požadavek na zbarvení plemen QH a A1/1 u kterých se vyskytují také overo vzory strakatosti (czpha.cz) Historie plemene Kdy se objevil první strakatý kůň je pro dnešní svět tajemstvím. Je však jisté, že tato mutace spadá do dávné historie díky nálezům jeskynních maleb zobrazující strakaté jedince. Historie plemene PH jak jí známe dnes, však začíná na začátku 16. století, kdy se španělský průzkumník Hernando Cortes plavil do Nového světa. Podle španělského historika, který cestoval s expedicí, bylo na palubě 16 koní, kdy jednoho z nich popsal jako pinto s rozsáhlými odznaky na předních končetinách, druhého jako tmavého nevybělujícího bělouše se skvrnami. Jednalo se tedy o první záznamy o strakatých koních v Novém světě. Postupem času další evropští průzkumníci přivedli do dnešní 8

10 Ameriky nespočet koní různých plemen, především nejrůznější poníky z Anglie charakteristické odolností, pevnou konstitucí a vytrvalostí, koně španělských dobyvatelů již přivyklých práci s dobytkem a v pozdější době svou roli sehrál i anglický plnokrevník, jehož použili chovatelé ke zvýšení výkonnosti svých kříženců. Ve 20. století v Americe vznikalo postupně několik asociací, kam se tito koně mohli registrovat. American Paint Stock Horse Association založená 1962 registrovala strakaté jedince s cílem dosáhnout uznání painta za samostatné plemeno. American Paint Quarter Horse Association registrovala painty, kteří se narodili údajným jednobarevným quarterům, spadající do asociace American Quarter Horse, která byla založena kvůli záchraně mizejících dobytkářských koní, kdy již při založení této organizace bylo rozhodnuto, že strakatí quarteři budou z plemenné knihy vyřazeni. Vzhledem k tehdejším znalostem zákonů genetiky si tito lidé nedokázali vysvětlit, proč se strakatí koně mohou narodit i rodičům zdánlivě jednobarevným. Tito jedinci byli většinou fenotypu s rozsáhlými bílými odznaky na hlavě (tzv. lucernou) a se všemi vysoko bílými končetinami, s největší pravděpodobností byli tedy nositeli genu pro strakatost. Konečně roku 1965 došlo ke spojení APSHA a APQHA do asociace, kterou známe dnes American Paint Horse Association. Plemeno paint horse můžeme tedy brát jako barevnou variantu dobytkářského plemene quarter horse (APHA.com). 3.2 Základní zbarvení koní Níže v literárním přehledu uvádím pro lepší orientaci souhrn základních informací o zbarvení u koní a výčet známých ředících lokusů, jenž všechny APHA povoluje při registraci. V této práci budu užívat americké názvosloví, které nejpřesněji koresponduje s genetickým založením jedince Lokus Color C (MATP) Lokus Color kóduje gen pro transportní protein asociovaný s membránou (MATP, membrane associated transporter protein), který rozhoduje o tom, zda se z prekurzorů barviva vytvoří pigment melanin (Mariat at al., 2003). Melanogeneze probíhá v melanocytech, kde leží buněčné organely melanosomy dvojího typu (eumelanosomy, phaeomelanosomy). Melaniny migrují pomocí mikrotubulů na vnější okraj buňky, kde 9

11 se pigmenty uvolňují pomocí exocytózy do epidermálních buněk, které jsou pak začleněny do okolních keratocytů (Thiruvenkadan et al., 2008). Vývoj melanocytů začíná již v embryonálním vývoji v oblasti neurální lišty, kde rovněž dochází k vývoji primárních senzorických a autonomních neuronů. Melaniny během embryonálního vývoje migrují do specifických míst na obou stranách těla. K dispozici jsou tři taková místa na hlavě (v blízkosti očí, uší a na temeni hlavy), šest míst po obou stranách těla a několik podél ocasu. Do těchto míst vstupují pigmentové buňky, které dále proliferují a migrují až do vlasových folikulů. Gen C vykazuje úplnou dominanci, téměř všichni savci mají tento gen, který v recesivní sestavě C c C c způsobuje nepřítomnost pigmentu. Tito jedinci vykazují červené zbarvení očí, růžové zbarvení kůže a bílé (albinotické) zbarvení srsti. Genotyp C c C c nebyl u koní zatím zaznamenán, většina plemen má obě alely dominantní C C C C. U koní je také na stejném lokusu alela C Cr (cream), která je neúplně dominantní a má ředící efekt. Genotyp C cr C cr zesvětluje základní barvy tak intenzivně, že jsou jedinci s touto recesivní sestavou označováni jako albíni, i když pravými albíny nejsou (Jakubec, 1998; Sponenberg, 1996) Extension a Agouti lokus Základní zbarvení koní je podmíněno interakcí lokusů Extension (E) a Agouti (A). Lokus Extension se podílí na tvorbě pigmentu eumelaninu a phaeomelaninu a Agouti má vliv na distribuci černého pigmentu eumelaninu do jednotlivých částí těla viz tab.1. Tab. 1 Interakce Extension a Agouti lokus (Sponenberg, 2009) Agouti locus Extension lokus Výsledná barva A A A - E E E - bay/brown A a A a E E E - black A A A - E e E e sorrel/chestnut A a A a E e E e sorrel/chestnut 10

12 Lokus Extension E (MC1R) Za tvorbu eumelaninu je zodpovědná dominantní alela E E a za tvorbu phaeomelaninu zase recesivní alela E e genu MC1R. Lokus Extension kóduje melanokortinový receptor 1, který leží na povrchu melanonocytů. Produkce eumelaninu a phaeomelaninu je regulována interakcí genu MC1R s α-melanocyty stimulujícím hormonem (α-msh) nebo agouti signálním proteinem (ASIP) (Sponenberg, 2009). MC1R je spolu s KIT genem řazen do skupiny LG II lokalizovaném v oblasti ECA3p12 (Raudsepp et al., 1999) Lokus Agouti A (gen ASIP) Dominantní alela A A genu pro Agouti-signaling-protein (ASIP) distribuuje černý pigment do okrajových částí těla (ocas, hříva, distální část končetin, špičky uší). Recesivní sestava A a A a distribuuje pigment rovnoměrně po celém těle za předpokladu, že je jedinec zároveň nositelem jedné dominantní alely E E genu MC1R. Sestava alel E e E e působí epistaticky vůči lokusu Agouti a zabraňuje jeho expresi. ASIP blokuje povrchový receptor pro α-msh na melanocytech, v přítomnosti ASIP není možná stimulace α-msh a je tvořen pouze phaeomelanin. V případě kdy není Agouti protein exprimován je produkován i eumelanin (Sponenberg, 2009) Známé lokusy ovlivňující základní zbarvení koní Další lokusy ovlivňující výsledné zbarvení koní můžeme rozdělit podle výsledného fenotypu do tří základních skupin viz Tab

13 Tab. 2 Lokusy ovlivňující základní zbarvení koní (Sponenberg, 2009) ředící Cream (CR), Dun (D), Silver Dapple (Z), Flaxen (F), Pearl (Prl), Champagne (CH) vybělující Grey (G) depigmentující Roan (RN), Overo (O), Tobiano (TO), Sabino (SB), Manchado (MA), Splashed white (SPl), Leopard (LP), White (W), White marks (WM) 3.3 White marks/odznaky (WM) U koní se také vyskytují tzv. bílé odznaky, které se mohou projevit u všech kombinací barev, kromě zcela bílých koní, kde jejich projev je zastřen fenotypem, ale jejich genetické založení zůstává stejné (sabino, white, grey). U vzorů strakatosti odznaky rozšiřují jejich celkový projev. Typické odznaky u koní jsou tedy charakteristické projevem bílé srsti na nepigmentované růžové kůži s variabilní asymetrickou strukturou (tzv. parciální albinismus), na rozdíl od pravidelných bílých vzorů u divokých druhů zvířat. Ve studii lišek chovaných pro kožešiny sovětský genetik Belyaev (1979) objevil spontánně se vyskytující bílé odznaky v selektovaných (pro tzv. domácí chování) chovných liniích. Tyto experimenty ukázaly, že odznaky mohou být fyziologicky spojeny s vlastnostmi, které odlišují zdomestikované jedince od volně žijících populací (Bowling, 1996). Domestikace je všeobecně proces, který vede k četným morfologickým, fyziologickým a behaviorálním změnám, kde barva srsti je nejvíce zřejmá. Zatímco mnoho druhů ve volné přírodě vykazuje relativně jednotné zbarvení, domácí zvířata můžeme vidět v široké škále vzorů barev (Rieder, 2009). Odznaky mají dnes hlavní funkci v identifikaci a popisují se vždy topograficky. Žádní dva koně s bílými odznaky nemají stejné vzory, tato známá pestrost odznaků tedy odráží i velkou rozmanitost alel a negenetických vlivů působící na migraci melanocytů. Pro jakoukoli analýzu znaku s genetickou variancí je důležité rozumět vlivu prostředí na výslednou podobu znaku. Některé bílé odznaky mohou vzniknout destrukcí melanocytů v lokalizovaných oblastech jako následek úrazu bez genetického přičinění (tzv. získané odznaky) (Bowling, 1996). 12

14 Klíčem k zahrnutí negenetických vlivů je asymetrie odznaků na končetinách. Všechny čtyři nohy u jednotlivých koní mají přesně stejnou genetickou výbavu, ale i přesto může být jedna končetina bez odznaků, jiná se spěnkou či s vysoko bílou končetinou, vzniká nám tedy nekonečné množství různých kombinací. Pro klasický genetický výzkum, který se snaží pochopit vliv prostředí, je výhodné využívat k pozorování jednovaječná dvojčata, kdy lze pozorovat stejné pohlaví i barvu, ale totožnost bílých odznaků potvrzena být nemůže. Negenetické komponenty, které ovlivnily variabilní projev znaku nebyly zjištěny, ale přesto výzkum dramaticky ilustruje, že jakékoli úvahy o genetice odznaků musí zahrnovat pochopení, že ne všechny pozorované rozdíly mezi jedinci se zakládají v genech (Bowling, 1996). Woolf (1998) zjistil, že počet oblastí na hlavě s bílou srstí souvisí s počtem odznaků na končetinách, což nám ukazuje, že jsou založeny stejným genetickým mechanismem a jsou tedy ve vzájemné korelaci. Jeho údaje také potvrdily vliv základní barvy na projev odznaku (zbarvení sorrel se jeví s více odznaky jak bay či black) a na vliv pohlaví (samci mají širší bílé odznaky, než samice). Bílé skvrny na hlavě a znaky na končetinách jsou dnes asociovány s geny MC1R, KIT a MITF, kdy v závislosti na základním zbarvení způsobují primárně bílé odznaky. Vzhledem k interakci genu MC1R a KIT mají koně zbarvení sorrel/chestnut rozsáhlejší bílé odznaky, než jedinci bay nesoucí jednu alelu E e (Sponenberg, 2009). U savců se prekurzory melanocytů zakládají již v neurální liště. Rawles (1947) ukázal, že u myší je melanoblast přítomný téměř ve všech oblastí integumenta, odkud dále migrují směrem k cílovým oblastem do distálních částí těla. Kompletní migrace a klonální proliferace melanoblastu v mesodermu zajišťuje plný počet melanocytů, což vede ke zcela pigmentovaným oblastem končetin. Přestože nám chybí vědecká potvrzení, je logické předpokládat, že bílé odznaky vyplívají z inhibice melanoblastu v distálních končetinách během zárodečného vývoje. Odznaky se, však projevují i bez podkladu růžové kůže, ale tyto plochy se vyskytují jako úzké oblasti na hlavě, končetinách a jako okrajové oblasti u větších skvrn. Tmavá kůže pod těmito odznaky je pravděpodobně důsledkem omezené migrace melanocytů z přilehlých pigmentovaných oblastí, kdy se tyto buňky později přemisťují a nemusí již proniknout strukturou chlupu tak, aby tato celá oblast zůstala pigmentovaná (Sponenberg, 2009). Nepigmentovaná srst je tedy důsledkem zablokované exprese melanocytů v typických oblastech charakteristických pro dané typy vzorů strakatostí. Kit-ligand 13

15 (Kitl) faktor kmenových buněk a mastocytů hraje klíčovou roli v rozvoji a udržení melanocytů u dospělých jedinců (Sponenberg, 2009). 3.4 Základní vzory strakatosti Koně plemene PH se vyskytují ve čtyřech základních typech strakatosti, u kterých je přesně definován fenotyp. Všechny tyto vzory jsou patrné již od narození, zůstávají konstantní a působí ve vzájemné interakci, kdy tento tzv. kříženec v rámci zbarvení je označen jako tovero. Vzory strakatosti řadíme do skupiny tzv. depigmentující, kam také spadá vzor manchado, který u plemene PH nebyl zaznamenán a vzor Leopard vyskytující se jen u plemene Appaloosa a Knabstrubr (Sponenberg, 2009). Všechny vzory strakatosti vykazují společné komplexní vlastnosti s velkým fenotypovým rozptylem. Strakatost, jak jsem se již zmiňovala je výsledkem aberací ve vývoji melanocytů. Je to složitá genetická síť kontrolující proliferaci, migraci, diferenciaci a přežívání buněk produkujících pigment. Melanocyty vznikají během fetálního vývoje z melanoblastů, které vznikají v neurální liště a migrují přes vyvíjející se plod v zájmu dosažení své konečné polohy na těle. Pokud přežije málo migrujících melanoblastů, výsledkem je částečná nebo úplná depigmentace. Z genetického hlediska jsou vzory strakatosti komplexní zvláštností, kdy může dojít k různé kombinaci alel na několika lokusech. Je tedy nemožné předpovědět genotyp zvířete pouze na základě fenotypu (Hauswirth et al., 2012) Tobiano (KIT) Název vzoru tobiano pochází z Argentiny, kam v polovině 19. století přitáhl brazilský generál Tobías s vojskem na strakatých koních. Tento vzor strakatosti byl v Severní Americe velmi vzácný. Dnes patří tobiano mezi nejrozšířenější vzor u plemene PH, ale i u mnoha jiných plemen je velmi rozšířen (český teplokrevník, hucul, shetlandský pony, islandský pony, tennessee walking horse, american saddlebred, paso fino, irish cob atd.). Tobiano se může projevit velmi variabilním fenotypem. Lze se setkat s koňmi téměř jednobarevnými s minimem bílé i s jedinci téměř bílými se zbytky základní barvy. Pigmentovaná srst vytváří charakteristické oválné či kulaté skvrny pokrývající jeden 14

16 případně oba boky, krk nebo hruď, přesahující v některém místě mezi ušima a ocasem hřbet s tendencí vertikálního uspořádání viz obr.1. V bílé srsti se také mohou vyskytnout tzv. inkoustové skvrny, které byly asociované s homozygotností To To To To. (viz přílohy I. obr.c) Jsou však zaznamenáni i heterozygoti To To To to s těmito skvrnami. Hranice mezi bílou a tmavou barvou je tvořena pigmentovanou kůží překrytou bílými chlupy. Hlava bývá zpravidla tmavá, často s klasickými bílými odznaky. Oči tmavě pigmentované až na výjimky při rozsáhlejším odznaku na hlavě modré. Ocas a hříva bývají dvoubarevné. Končetiny jsou většinou celé bílé nebo alespoň od karpálních či hlezenních kloubů dolů. Na odznacích u končetin se mohou objevit tmavé skvrnky kolem korunky, které způsobují pigmentaci rohoviny i u bílých končetin. Minimálně exprimovaní tobiano mají pouze pravidelné bílé končetiny od karpů či hlezen dolů tzv. vysoko bílé. Na hlavě se mohou projevit i klasické odznaky. Podél hlavní hřbetní linie jsou často v hřívě nebo ocase bílé znaky viz obr.2. Maximálně exprimovaní jedinci mají zcela bílé tělo se zachovaným pigmentem v bocích a na hrudníku viz obr.3 (Sponenberg, 2009). Z fenotypu nelze přesně usuzovat zygotnost tobiano vzoru, ale kombinaci alel můžeme odvodit z potomstva, kdy přesnost predikce souvisí s počtem potomků viz tab. 3 (Sponenberg, 2009; Bowling, 1996). Tab. 3 Statistická zjištění predikce homozygotnosti tobiano vzoru (Bowling, 1996) Potomstvo z páření Tobiano ˣ solid % pravděpodobnost homozygotnosti 5 tobiano 97 % 7 tobiano 99% 10 tobiano 99,9% Dosud není znám mechanizmus, který ovlivňuje rozsah a umístění bílých skvrn, předpokládá se však vliv modifikujících genů exprimujících se pouze u strakatých koní. Gower (2000) uvádí příklad páření jednobarevného hřebce Rannock zbarvení chestnut s pěti různě exprimovanými klisnami vzoru tobiano. Všechna narozená hříbata byla téměř identického vzoru. Páření ukazuje na vliv modifikujících genů, které Rannock nese (Chalupová, 2008). DNA testy mohou také v budoucnu ukázat, zda je původ tobiano vzoru spjat s jedním plemenem nebo jestli jde o nezávislou mutaci, kdy jedinci nevykazují 15

17 společnou vazbu. Teorie jednoho předka je spíše nepravděpodobná z důvodu rozšíření vzoru tobiano po celém světě (Sponenberg, 2009). Bowling (1996) také uvádí testovací křížení vzorů tobiano a overo na příkladu křížení hřebce PH vzoru tovero s 42 klisnami solid plemen QH, A1/1. Byly zaznamenány tyto údaje: 9 jedinců solid, 10 tovero, 10 overo a 13 tobiano. Výsledky ukazují, že vzor tobiano se vzory overo nejsou ve vzájemné vazbě, ale pokud kůň zdědí oba tyto geny, působí ve vzájemné interakci typického fenotypu. Ze dvou jedinců vzoru tovero se může narodit i letální hříbě, ale existují i vzácné výjimky životaschopných bílých koní. Obr. 1 Vzor tobiano a)bay tobiano b) black tobiano Obr. 2 Minimálně exprimované vzory tobiano 16

18 a) black tobiano b) black tobiano Obr. 3 Maximálně exprimované vzory tobiano Vzor tobiano je determinován autozomálně dominantní alelou To To chromosomu 3 intronu 13 v blízkosti lokusu KIT (známý jako růstový faktor melanocytů). Alela To To je způsobena inverzí genetického materiálu o 70 kb na KIT lokusu (Brookes et al., 2002; Raudsepp et al., 1999, Sponenberg, 2009) Lokus KIT je asociován s vazbovou skupinou LG II s geny pro vazebné proteiny vitaminu D vázaný na bílkovinu Gc (group-specific component), s lokusy proteinů krevních skupin pro albumin (Al), dále esterázu (ES) a lokusu extension (E) a roan (Rn) (Sponenberg, 2009). Gen KIT také způsobuje bílou skvrnitost u člověka, prasete a myši. Studie pomocí PCR-RFLP prokázaly, že všichni vzorovaní tobiano nesou alelu určenou jako KM1 viz tab.4. U třech ze 104 plnokrevníků značených jako solid byla tato alela také detekována. V takovém případě mohlo jít pravděpodobně o minimální vyjádření znaku (Bowling, 1996; Brooks et al., 2002). Tab. 4 Genotyp vzoru tobiano (Bowling, 1996) Tobiano KM1KM1, KM1KM0 Not tobiano KM0KM0 17

19 3.4.2 Overo Overo vzor (stejně jako tobiano) se rozšířil při kolonizaci ze Španělska a v Jižní Americe už po staletí označoval jakékoli strakaté koně. Dnes díky vědeckým výzkumům víme, že pod toto základní označení spadají tři geneticky zcela odlišné verze zbarvení. U všech se však jedná o dominantní mutaci (Sponenberg, 2009). Geny způsobující overo strakatost se nemusí projevit ve fenotypu jedince, ale mohou se ukázat až po několika generacích, proto jsou tak často se vyskytující jedinci cropout vždy overo. Kůň, který ve fenotypu nevykazuje žádné znaky overo typů strakatosti, může být stále přenašeč těchto vzorů a také je může stále předávat dál. Všeobecná charakteristika overo vzorů vykazuje pigmentovanou srst, která obvykle vytváří souvislý pruh na hřbetní linii od kohoutku až po kořen ocasu, kdy i končetiny s žíněmi bývají pigmentované. Bílá srst nikdy nepřebíhá přes hřbetní linii mezi kohoutkem a bedry a bílé skvrny na rozdíl od tobiano vzoru jsou nepravidelné až rozptýlené. Hlava bývá více bílá s častějším výskytem modrého oka tzv. rybího (APHA.com) Lokus sabino Sb (KIT) Termín sabino pochází pravděpodobně ze španělštiny a v doslovném překladu znamená světlý nebo skvrnitý. V Mexiku a Argentině se tímto vzorem označují tečkovaní bělouši tzv. pstružáci a další zbylé vzory strakatosti. V Evropě a USA se používá označení sabino pro jedinečný vzor strakatosti (Sponenberg, 2009). Vzor sabino je běžný u clydesdaleských a shirských koní. V menší míře se může objevit i u tennessee walking horse, quarter horse, morgan u anglického plnokrevníka a u mnoha dalších. Minimální projevy vzoru jsou často přehlíženy nebo bývají zaměňovány za zbarvení roan, frame overo a tobiano vzory (skvrny se výjimečně mohou rozšířit i vertikálně). Sabina málo exprimovaná nemusí mít odznaky na hlavě. Nejspolehlivějším znakem takto značeného sabina je skvrna na bradě, skvrny na karpálních a hleznových kloubech, úzké rozšíření bílé na nohách tzv. údery blesku a prokvetlost viz obr.5. Sabino jako všechny vzory je nejvíce exprimované u zbarvení sorrel/chestnut a nejméně u black. Vzor je charakteristický ve středním projevu rozsáhlými bílými odznaky na hlavě a na končetinách (alespoň jedna, častěji dvě nebo všechny bílé), kdy skvrny 18

20 směřují od břicha dorzálně a jsou charakteristické neostrými okraji s typickou prokvetlostí viz obr.4. Vzor má všeobecně velmi variabilní projev od málo roztroušené bílé srsti po těle po zcela bílé koně (viz přílohy VIII. obr. F). Nejčastější je výskyt jedinců s pigmentací na uších, hrudníku, kořeni ocasu a podél hřbetní linie a ve slabinách. Oči jsou zřídkakdy modré nebo jen částečně. Prokvetlost nemusí být u hříbat patrná a s věkem se může rozšiřovat. Kůže může být v některých místech tečkovaná. Maximální projev sabino vzoru vykazuje skvrnité oblasti na uších, na kořeni ocasu, na bocích či hrudníku viz obr. 6. Kůň může mít pigmentované jen uši nebo je zcela bílý s tmavým okem (Sponenberg, 2009). U jedinců sabino bylo zaznamenáno i několik případů smrtící bílé. Je tedy pravděpodobné, že rodiče měli v původu frame koně a nesli mutaci Ile118Lys genu EDNRB (Hauswirth et al., 2012). Nedávné studie naznačují, že jde o několik vzorů ovlivněných více geny. Jedna mutace vedoucí k vzoru sabino je sabino-1 (Sbl Sbl ). Sekvenovaním se odhalila substituce T A v intronu 16 KIT lokusu na chromozomu 3 (asociace se vzory tobiano a roan), která vede k přeskočení exonu 17 kódující část druhé domény tyrozin kinázy, kdy může dojít k částečně nebo zcela nefunkčnímu proteinu. Alela Sbl Sbl se projevuje jako neúplně dominantní, kdy homozygoti jsou téměř úplně bílý a heterozygoti jsou charakterističtí bílými odznaky na dvou a více končetinách, bílou lysinou na hlavě, skvrnami s roztřepenými okraji a prokvetlostí na trupu. U 13 koní však nebyla SNP nalezena, tito jedinci vykazovali odlišný vzor sabino strakatosti, pravděpodobně se jednalo o další mutace v KIT genu nebo i v jiných genech (Brooks et Bailey, 2005). Sponenberg (2009) zkoumal potomky z jednobarevných klisen po pěti různě exprimovaných hřebcích sabino vzoru, kdy hřebci s větším poměrem bílé srsti měli vyšší procento skvrnitých potomků. Ze studie vyplývá, že v některých rodinách sabino hříbata produkují stejný poměr bílé jako rodiče. Takové pozorování je tedy v souladu s polygenní dědičností. U tohoto vzoru není neobvyklé, že strakatý jedinec určený jako sabino má v rodokmenu mnoho generací předků, kteří měli zcela standardní zbarvení s velkými odznaky. Plemena jako clydesdale či shirský kůň jsou šlechtěná záměrně na tyto extenzivní bílé odznaky na hlavě a končetinách bez projevu strakatosti po těle. V těchto případech se připařují strakatí koně s koněm, který má alespoň jednu nohu bílou a pokud chovatelé vyžadují strakaté jedince, tak páří koně v základní barvě se sabino v maximálním projevu. 19

21 Obr. 4 Vzor sabino Obr. 5 Minimálně exprimovaný vzor sabino Obr. 6 Maximální projev vzoru frame/sabino 20

22 Lokus splashed white Spl (PAX3) Splashed white se u plemene paint horse vyskytuje jen zřídka, ale díky atraktivnímu zbarvení se postupně v chovu rozšiřuje. Výskyt vzoru byl zaznamenán také u plemen quarter horse, morgan, A1/1, welsch pony, islandský pony a shetland. U splashed white jsou typické bílé končetiny, stejně tak hlava a ventrální část trupu. Hranice mezi bílou a pigmentovanou srstí je ostrá. Oči jsou často modré nebo jen částečně s tzv. čipy v dolní polovině duhovky doprovázené expresí bílých ploch. Minimálně značený vzor je podobný typu solid s odznaky s rozsáhlými bílými končetinami, někdy se skvrnou na břichu a hlavou obvykle kápovitého tvaru. Maximálně značení koně mají hlavu bílou, pigmentované uši, týl a krk viz obr.7. Vědci se naklání k hypotéze dominantního založení Spl S. Vědci studovali koně z různých plemen a zjistili jednu příčinnou mutaci v genu PAX3 chromozomu 6 a tři mutace v genu MITF. Mutace v genu PAX3 byla zmapovaná pouze u koní vzoru splashed white. Tato mutace způsobuje podobný fenotyp u lidí a myší, kdy ovlivňuje vysoce konzervovaný cysteinový zbytek v párové doméně, která se účastní vazby na DNA. Vědci odhadují stáří mutace genu PAX3 jen na 24 let s výskytem pouze u plemen QH a PH. Ve studii však nebyl zaznamenán žádný kůň, který by nesl PAX3 alelu od obou rodičů. Na základě údajů ze studií na myších, je nepravděpodobné, že takový kůň by byl životaschopný. Patrně dochází k embryonálnímu úmrtí. Mnoho splashed white je také neslyšících, někteří chovatelé tvrdí, že jsou spíše hluší ti s bílou srstí kolem očí. Žádné studie o tomto vztahu však nejsou k dispozici. Všechny tři mutace MITF vedou ke srovnatelným fenotypům, podobné mutace byli také nalezeny u lidí, myší a psů. Jedna mutace v genu MITF N310S má sníženou schopnost vázat DNA. Vědci mutaci zmapovali u jednoho koně plemene Franches-Montagnes, jenž se narodil solid rodičům, kde způsobila nový vzor nazvaný macchiato. Vzor se podobá kombinaci bílé strakatosti s ředící alelou. Jedinec byl ve dvou letech testován, kdy se odhalila hluchota a nízká pohyblivost spermií. Podobné mutace u člověka způsobují Waardenburgův a Tietzův syndrom způsobující vady pigmentace a hluchotu. Mutace MITF C280Sfs * 20 je výsledkem posuvné mutace za ztráty poloviny proteinu. MITF prom1 ovlivňuje oblast na melanocyt specifickém promotoru. Mutace MITF prom1 vznikla asi před sto lety a vykazuje poměrně častý výskyt u několika moderních plemen. Koně homozygotní pro tuto alelu jsou životaschopní a projevují se s výraznější depigmentací 21

23 než heterozygoti. První dvě zmíněné alely MITF jsou extrémně vzácné. Data z myší opět naznačují, že tyto alely budou s největší pravděpodobností mít za následek vážné klinické projevy. Výzkumníci analyzovali celkem 239 koní (106 vzorů bílé strakatosti a 133 solid). Ze 106 kandidátů vzoru splashed white bylo 70 s alespoň minimálním projevem vzoru a 36 s extrémním projevem bílé. Celkem bylo zahrnuto 77 koní z plemene QH, PH a dále jiná plemena (plnokrevníci, islandský kůň, shetland pony, miniaturní kůň, odlenburský kůň) viz obr.8 a 9 (Hauswirth et al., 2012; Sponenberg, 2009). Obr. 7 Vzor splashed white 22

24 Obr. 8 Minimální projevy vzoru splashed white (Hauswirth et al., 2012) Obr. 9 Maximální projevy vzoru splashed white (Hauswirth et al., 2012) Lokus Frame Overo Fr (EDNRB) Tento typ zbarvení se vyskytuje jen u několika plemen, geneze většiny vzorů strakatosti se váže s koňmi španělského původu, ale vzhledem k častému výskytu sabino i frame u anglického plnokrevníka, který se ve velké míře využíval k zušlechtění amerických koní, lze předpokládat prapůvod tohoto vzoru zde. U vzoru frame overo jsou často 23

25 všechny končetiny pigmentované, nejméně je však jedna. Mohou se projevit klasické odznaky i modré oko v pigmentovaném okolí, ale barva očí nemůže být faktorem při určování vzoru. Klasické odznaky asociované s MC1R, KIT a MITF jsou s genem EDNRB ve vzájemné interakci a rozšiřují rozsah bílé srsti. Ocas bývá pigmentovaný. Typické jsou bílé skvrny uprostřed trupu a krku, které jsou zřetelně orámované (stále zůstávají více členité, než tobiano). Bílá je uspořádaná jakoby horizontálně a na rozdíl od zbarvení tobiano nezasahuje přes hřbetní linii. Hodně koní vykazuje ve fenotypu pigmentovaný horní pysk, který je v nesouladu s jinak bílou hlavou viz obr.12 (Sponenberg, 2009; Bowling, 1996). Minimálně značení frame overo jsou zcela bez skvrn s výraznou bílou hlavou (opak min. tobiano: bílé končetiny a tmavá hlava) viz obr. 13. Kombinace rozsáhlých bílých odznaků na hlavě s jednou bílou končetinou jsou neobvyklé. Klasické odznaky u solid koní jsou ve vzájemné korelaci jak na hlavě, tak i na končetinách. Středně až maximálně značení frame vykazuje téměř bílou hlavu, nízko pigmentované končetiny a rozsáhlé bíle orámované boky, kdy bílá může přesahovat přes horní linii nejčastěji v hřívě viz obr.14. Hříbata s letálním syndromem se rodí převážně nebo zcela bílá s několika tmavými pigmentovými okrsky v srsti a s modrýma očima a umírají během několika dní po porodu s příznaky koliky (viz příloha VIII). Žádní žijící homozygoti pro letální alelu nebyli zaznamenáni. Tato letalita je odlišná od jiných zbarvení (roan, white, splashed white) u kterých se v homozygotní sestavě předpokládá embryonální úmrtí. První výzkumy začaly až v roce 1996 a o rok později, tři různé nezávislé studie (Universita v Minnesotě v Californi a v Austrálii) identifikovaly DNA mutaci Ile118Lys genu EDNRB (Metallinos et al., 1998; Santschi et al., 1998; Yang et al., 1998). Yang et al. (1998) u koní identifikovali cdna fragment genu EDNRB (endothelinový receptor B), který obsahoval 1329 bp, kódující 443 aminokyselin, jenž má sedm transmembránových domén s typickou sekvencí a topografickou strukturou spadající do skupiny GPCR (G protein-coupled receptor) viz Obr.10. U EDNRB byly prozatím nalezeny dvě isoformy EDNRB a EDNRA. Komparativní sekvenování ukázalo, že je gen mezi savci vysoce konzervován. Byl stanoven vysoký stupeň homologie, 85 až 91 % (člověk, skot, prase, krysa, myš) identické sekvence u EDNRB a u EDNRA (člověk, skot, myš) 55 % viz Obr. 11. Sekvenční analýzou spolu s AS-PCR amplifikací analyzovali restrikční místo, kde odhalili dinukleotidovou substituci TC AG v kodonu 118 genu EDNRB ECA17, kde způsobuje uvnitř první 24

26 transmembránové domény záměnu isoleucinu za lysin (viz příloha X). Záměna v pořadí první transmembránové domény může narušit lokalizaci receptorů v plazmatické membráně nebo jeho signalizaci (Metallinos et al. 1998). Yang et al. (1998) také uvádí možnou mononukleotidovou mutaci odpovědnou za OLWS, kdy tato mutace nemusí být detekována AS-PCR. V takovém případě je vhodnější využít metodu RFLP. Obr. 10 Schéma mutací EDNRB u koní, člověka a myši (Metallinos et al., 1998) Obr. 11 EDNRA endothelin receptor A, EDNRB endothelin receptor B, hum-člověk, hor-kůň, bov-skot, mou-myš; (Yang et al., 1998) Gen reguluje tvorbu buněk neurální lišty, z níž se diferencují střevní ganglia a melanocyty, kde díky inervaci dochází k intestinální aganglióze. Enterický semiautonomní systém trávicí trubice je modifikovaný parasympatikem a sympatikem, tvořící dva plexy kolem střeva: myenterický (mezi svaly střeva) a submukosální (ve 25

27 střevní sliznici). Systém umožňuje posunování obsahu trávicího traktu díky koordinovaným pohybům, regulací enzymů, kyselin a některých gastrointestinálních hormonů. U hříbat postižených OLWS byly odebrány vzorky na histologické vyšetření a bylo zjištěno, že jedinci postrádají myenterický plexus (Santchi, et al. 1998). Hříbata s OLWS tedy nemají inervovanou trávicí soustavu a potrava nemůže procházet dále. Ve vzácných případech může chybět část traktu tenkého střeva (Bowling, 1996). Onemocnění nelze řešit léčbou ani chirurgickým zákrokem. Hříbata postižená OLWS by měla být humánně uspána. Důležité je však s jistotou vědět, že hříbě je skutečně lethal white, neboť bílí koně mohou být rovněž výsledkem maximálního vyjádření jednoho nebo několika vzorů a jsou plně životaschopní. U vzoru frame dochází k úmrtí až po porodu, z důvodu prenatální výživy pupeční šňůrou (Sponenberg, 2009). Podobná mutace byla také zaznamenána u plemene clydesdale. Jedinci vykazovali projevy apatie s břišním napětím. Střevní defekt byl analyzován ve velkém kolonu, kde mikroskopická analýza zaznamenala absenci ganglia. Takto popsané onemocnění je rozdílné od OLWS. U clydesdale se nenarodila bílá hříbata a onemocnění se projevilo až kolem 4-9 měsíce. U tohoto plemene je obvyklý vzor sabino a onemocní je popsáno jako intestinální defekt abdominálního diskomfortu. Vzhledem k tomu, že sabino a frame overo spadají do stejné skupiny overo vzorů, lze předpokládat určitou podobnost (Bowling, 1996). Alela Fr F je tedy dominantního založení s variabilní penetrancí. Dříve se soudilo, že je tato mutace recesivní, díky případům, kdy se frame overo narodil dvěma rodičům solid. Zpětnou kontrolou fenotypu bylo zjištěno, že někteří rodiče vykazovali zvláštní odznaky, téměř bílou hlavu se všemi pigmentovanými končetinami. Přezkoumáním záznamů plemenné knihy APHA vyšlo najevo, že frame se předává jako autozomálně dominantní znak, díky údajům z křížení dvou jedinců vzoru frame viz Tab. 5. (Bowling, 1996). Není také vyloučené, že kontrola vzoru frame je založená složitějším způsobem, než jen působením jedné dominantní alely. Tento neznámý vliv by mohl způsobit maskování vzoru. Na toto téma však neproběhly ještě žádné studie (Sponenberg, 2009). Tab. 5 Páření heterozygotů Fr F Fr f (Bowling, 1996) Alely Fr F Fr f Fr F Fr F Fr F - letální Fr F Fr f frame overo Fr f Fr F Fr f - frame overo Fr f Fr f - solid 26

28 Mnoho případů narození frame koně ze solid rodičů je zaznamenáno u anglického plnokrevníka, kde je známo několik rodin. První údaj o frame vzoru u plnokrevníků byl zaznamenán před 20 lety, ačkoli existují obrazy strakatých plnokrevníků z dřívějších dob, nezachovaly se bližší informace. Údajný první frame plnokrevník dnešní doby byl hřebec Tri Chrome zbarvení bay overo narozen 1991 po Blue Gazi (bay, 1978) z Miss Joslin (bay, 1981). Vykazoval typický fenotyp frame, jako mladý byl však kvůli zranění utracen. Další overo hřebec Blue Eyed Streaker narozen 1993 také po Blue Gazi z Bev s Gilr (bay, 1978) dosud působí jako plemeník v USA na Echo Hill Farm, jeho potomstvo vykazuje vzor frame z 50 %. Další známou rodinou produkující vzor frame vychází z páření Pesty Axe (gray, 1977) a Torchys Rainbow (bay, 1976), kteří měli stejného otce Give Em The Axe (gray, 1965). Z tohoto páření se narodili dvě hříbata. Nite Spot (bay overo,1985) nesoucí geny jak pro vzor frame overo i sabino a Patchy Lassy (sorrel sabino,1989), která vykazuje charakteristický fenotyp sabino, ale vzhledem k jejím potomkům nese i mutaci genu EDNRB. V roce 2000 se jí narodil hřebeček Ellusive Quest, který vykazuje jak vzor sabino i frame overo (viz příloha IX). Stejné případy, kdy se narodí kůň s frame vzorem jsou zaznamenány i u plemene QH, který má plnokrevníky v původu. Tito koně překračující akceptované meze AQHA nemohou být registrováni jako QH, ale mohou být zapsáni právě jako overo u APHA. Okolo 500-ti cropout koní bylo registrováno u APHA v době jejího založení z AQHA, kde v té době bylo registrováno koní (allbreedpedigree.com,2013; Bowling, 1996). Tato čísla ukazují, že 1 z 200 potomků QH rodičů vykazoval rozsáhlé bílé odznaky. Žádná teorie však nemůže dostatečně vysvětlit výskyt těchto koní. Můžeme předpokládat, že došlo k mutacím, ale ty jsou vzácné a ojedinělé. Pravděpodobnější je výskyt takové sestavy alel, u kterých nedojde k vyjádření vzoru (Bowling, 1996). Metallinos et al. (1998) ve své práci testovali 138 koní různých plemen, kdy heterozygoty zaznamenali u všech koní frame overo, ale také u několika koní označených jako tobiano, tovero, solid i u plemen QH, A 1/1 a miniaturních koní. Metallinos et al. (1998) ve své práci však neuvádí zbarvení koní ostatních plemen, které otestovali jako N/L a doporučuje testovat všechna plemena u kterých se vyskytuje frame vzor. Santschi et al. (1998) testovali vzorky 22 hříbat s OLWS a všechny určili jako homozygoty pro LYS118. Jejich rodiče bez výjimky jako heterozygoty, kdy všichni vykazovali typický vzor frame overo až na jednu klisnu fenotypu solid. Celkem % přenašečů mutace je maskováno jiným 27

29 vzorem nebo vykazují typ solid. Je tedy vysoce pravděpodobné, že další geny mohou ovlivnit expresy vzoru frame (Vrotsos et al., 2001). Vrotsos et al. (2001) testoval několik stovek koní, kde bylo 90 % PH a zbytek QH a A1/1 a strakatí koně jiných plemen. Všechna hříbata s OLWS byla homozygotní pro mutaci Ile118Lys genu EDNRB. Žijící jedinec s takovou sestavou alel také nebyl zaznamenán. Heterozygoti se objevily jak u všech vzorů strakatosti i u koní solid s bílými odznaky plemene PH i u plemene Miniature Horse, kdy jedinci byli zcela bez odznaků. Takové pozorování naznačuje vliv modifikačních genů v populaci Miniature Horse, který silně potlačuje frame vzor viz tab.6. Tab. 6 Výskyt Ile118Lys mutace genu EDNRB (Vrotsos et al., 2001) zbarvení počet koní N/N N/L L/L tobiano frame overo sabino splashed white medicine hat bílí kůň tovero solid/not PH white/not PH OLWS

30 Obr. 12 Vzor frame overo a) black overo b) bay overo Obr. 13 Minimální vyjádření frame overo 29

31 a) black overo b) bay overo Obr. 14 Střední projev frame overo Hříbě OLWS ze solid QH klisny QH klisna zbarvení chestnut s hvězdou protáhlou v nosní pruh a s bílou šňupkou na hlavě s tmavými skvrnami nad nozdrami a s bílou skvrnou v pravé nozdře byla připuštěna hřebcem PH zbarvení sorrel/frame overo. Březost a porod proběhly bez komplikací. Narozená klisnička začala do dvou hodin spontánně pít, projevovala se velmi aktivně a zvídavě. Neobvyklé bylo zbarvení hříběte, celé bílé s modrýma očima a také nebyla zaznamenána smolka viz obr.15. Zhruba mezi hodinami života začalo hříbě projevovat první příznaky koliky. V rozmezí 24 hodin po porodu mělo hříbě silné bolesti břicha a stále se válelo. Hříbě vykazovalo zrychlený srdeční rytmus i dechovou frekvenci, rektální teplota byla v normě. Peristaltické pohyby byli nepatrné a smolka byla přítomna hluboko v rektu. Byla navržena podpůrná léčba minerálním olejem k uvolnění smolky a byly podány analgetika proti bolesti. Hříbě reagovalo zklidněním, ale příznaky koliky přetrvávaly i do dalšího dne, kdy byla doporučena eutanazie. Od hříběte i od matky byly odebrány krevní vzorky pro potvrzení OLWS. Matka byla stanovena jako heterozygot N/L a hříbě jako homozygot L/L. U hříběte byla také provedena pitva a histologické vyšetření. Hříbě mělo nafouklou břišní dutinu a postrádalo pigmentaci v kůži, kde bylo i málo aktivních chlupových folikulů. Játra a plíce byli naplněné. Kolon byl bez patogeneze až na chybějící ganglia. Malý kolon a rektum vykazovali bledou sliznici, většina trávicího traktu byla naplněná vzduchem. Dutina břišní obsahovala serosanguinální tekutinu, s předpokládaným posmrtným výskytem. 30

32 Heterozygoti N/L vykazují typický fenotyp, alela má však variabilní expresi a ve vzácných případech, kdy není gen EDNRB vyjádřen může být takoví jedinec typu solid. Nezbytné jsou tedy další studie, které vysvětlí sporadický výskyt letálních hříbat z nestrakatých rodičů. Dva heterozygoti podle klasické Mendlovi genetiky budou produkovat 25% letálních hříbat, záznamy z PK však ukazují na menší produkci. Je tedy pravděpodobné, že hříbata nebyla registrována nebo mohlo jít o embryonální úmrtí. Podle studií je více jak 95% frame overo heterozygotů N/L a méně jak 1% jsou jedinci typu solid (Lightbody, 2002). Obr. 15 Hříbě s OLWS Waandenburg-hirschsprung syndrome Bowling (1996) popisuje pět genů u myší ovlivňující distribuci pigmentu a nervové prekurzory v embryonálním vývoji derivované z neurální lišty. Geny SPLOTCH (SP) letální strakatost (LS), MICROPHTHALMIA (MI), piebald (S) a dominantní megacolon (DOM). Piebald na chromozomu 14 u myší vytváří podobný fenotyp jako u OLWS, 10% z těchto homozygotů je hluchých a mají také aganglionózu tlustého střeva. Tato mutace u myší vykazuje letalitu ve třech týdnech stáří (Metallinos et al., 1998). Několik těchto mutací je homologní s lidským onemocněním Waardenburgův syndrom i s výše 31

33 popsanými mutacemi u koní. Komparativní genomika v případě konzervovaných segmentů na DNA slouží pro rychlý vývoj genových map u domestikovaných zvířat. Integrace tohoto přístupu s radiační hybridizací (RH-panely) představuje jednu z přímých způsobů jak získat fyzické a srovnávací mapy. ECA17 u koní je v současné době nejvíc prozkoumaným chromozomem, kde markery jsou distribuované v intervalech 1,4 Mb, zahrnující 75 markerů (56 genů, 19 mikrosatelitů) z nich je 50 specifických genů (Lee et al., 2004). Waardenburgův syndrom (WS) v lidské populaci je onemocnění charakterizované různým stupněm percepční hluchoty, kosterní dysmorfií a abnormalitami v pigmentaci kůže a vlasů. Typické jsou bílé prameny nebo bílé kožní skvrny, nápadně modré nebo heterochromatické duhovky. WS je vzácné autozomálně dominantní onemocnění s výskytem 1/ živě narozených dětí. U 90% pacientů jsou postiženi i rodiče. WS vykazuje variabilní penetraci a několik klinických onemocnění. S WS bylo asociováno šest genů, jenž jsou nezbytné pro normální vývoj melanocytů PAX3, SOX10, MITF, SLUG, EDN3 a EDNRB. Geny EDNRB, EDN3 a SOX10 jsou zahrnuty do skupiny způsobující Waandenburg-hirschsprung syndrome, charakterizovaný navíc absencí ganglií v různě dlouhém úseku gastrointestinálního traktu. Onemocnění se projevuje již krátce po narození střevní neprůchodností s výskytem 1/5000 živě narozených dětí. Před postiženým úsekem střeva, který je zúžen se hromadí stolice a objevuje se zácpa. Může také docházet k zpětnému posunu a následnému zvracení. Břicho bývá na první pohled nafouklé a pohmatově citlivé. Mírnější formy nemoci mohou být diagnostikovány až v pozdějším věku. Pokud u novorozence do 48 hodin neodejde smolka je vyšetřen kolonoskopií či biopsií. Na rozdíl od koní je v tomto případě možná léčba, kdy terapie spočívá v odstranění postiženého úseku střeva a spojení zdravých úseků k sobě. Zákrok je velmi složitý a někdy vyžaduje více operací viz obr.16 (Verloes et al., 1993). 32

34 Obr. 16 Waandenburg-hirschsprung syndrome Tovero Kombinace všech vzorů vykazuje aditivní účinek, čím více alel různých vzorů jedinec nese, tím vykazuje ve fenotypu více bílé nebo je bílý zcela. Takový jedinec je významný v chovném programu, protože produkuje převahu strakatých koní ze solid klisen. Problém však nastává v případě, kdy je kůň heterozygot i pro vzor frame. V takové situaci by měli nechat chovatelé svým koním určit genotyp. Nejideálnější je samozřejmě chovný jedinec s homozygotní sestavou, ale homozygotnost se u strakatých vzorů omezuje jen na vzory tobiano, sabino-1 a splashed white MITF prom1. V blízkosti KIT lokusu leží většina vzorů jako tobiano, sabino-1, splashed white a mohou se dědit ve vazbě. Heterozygoti se solid klisnami produkují strakaté jedince s 50% pravděpodobností a heterozygot na dvou lokusech se solid klisnami vykazuje již 75% úspěšnost na strakaté potomky. V závislosti na síle vazby mohou někteří heterozygoti vykazovat téměř 100 % strakatých hříbat (Sponenberg, 2009). Ze spojení tobiano a overo koně se může narodit hříbě, které nese charakteristické znaky od obou vzorů a je označen jako tovero. U takových kombinací je často obtížné rozlišit z fenotypu jednotlivé vzory, z důvodů možného potlačení jednoho z nich. V extrémních případech jsou koně zcela tmaví s bílou hlavou nebo zcela bílí. Vzor tovero lze všeobecně charakterizovat tmavou pigmentací kolem uší, někdy s rozšířením na čelo nebo až k očím s pigmentací kolem huby s rozšiřující se tendencí k žuchvám. 33