Masarykova univerzita v Brně

Transkript

1 Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta Růst a meiotické zrání oocytu - možnosti realizace in vitro BAKALÁŘSKÁ PRÁCE v oboru zdravotní laborant Vedoucí práce: doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc. Autor: Jana Němečková Brno, duben

2 Bibliografická identifikace Jméno a příjmení autora: Jana Němečková Název bakalářské práce: Růst a meiotické zrání oocytu možnosti realizace in vitro Pracoviště: Lékařská fakulta, Masarykova univerzita, Brno Vedoucí bakalářské práce: doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc. Rok obhajoby bakalářské práce: 2013 Souhrn: Tato práce se zaměřuje na fyziologické zrání oocytů v ovariích, průběh buněčného cyklu, popis ovariálního a menstruačního cyklu a diskutuje možnosti in vitro kultivace a maturace oocytu. Klíčová slova: Oocyt, růst, zrání, meióza, in vitro maturace, in vitro fertilizace, asistovaná reprodukce Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem. 2

3 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením doc. MVDr. Aleše Hampla, CSc. a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne

4 Ráda bych touto cestou poděkovala doc. MVDr. Aleši Hamplovi, CSc za výbornou spolupráci a neocenitelné odborné informace. Dále bych poděkovala RNDr. Petru Vaňharovi, Ph.D. a Mgr. Vítu Hubinkovi ze cenné rady a věnovaný čas. Samozřejmě také celé své rodině, nejvíce však svému manželovi za trpělivost a podporu ve všech mých často náročných zkouškových obdobích. 4

5 Obsah 1 Úvod Cíle práce Buněčný cyklus, mitóza, meióza, Buněčný cyklus Mitóza Meióza Fyziologický ovariální a menstruační cyklus a jejich hormonální regulace Oocyt a jeho vývoj Kultivace oocytu in vitro Závěr Literatura Seznam obrázků Přílohy

6 Použité symboly a zkratky GV FSH GIFT GnRH ICSI IUI IVF IVM LH MAP M1 M2 ZP OHSS AMH PBD CGH FISH germinal vesicle (zárodečný váček) folikuly stimulující hormon laparoskopicky provedený transfer do vejcovodu gonadotropin releasing hormone intracytoplazmatická injekce spermie intrauterinní inseminace in vitro fertilizace in vitro maturace luteinizační hormon mitóza aktivační kinázový protein metafáze I. meiotického dělení metafáze II. meiotického dělení zona pellucida ovariální hyperstimulační syndrom anti-mullerian hormon polar body diagnosis (diagnostika polárních tělísek) komparativní genomová hybridizace fluorescenční in situ hybridizace 6

7 1 Úvod Asistovaná reprodukce a fertilizace in vitro Metody asistované reprodukce umožňují početí v případech, kdy fyziologické početí a těhotenství není možné. Asistovaná reprodukce má význam v léčbě neplodnosti, resp. předcházení výskytu geneticky podmíněných vrozených onemocněních, v případech, kdy rodiče jsou přenašeči monogenní dědičné choroby. Mezi základní používané přístupy asistované reprodukce patří in vitro fertilizace (IVF), kryoprezervace gamet či embryí, intrauterinní inseminace (IUI) či např. laparoskopicky provedený transfer gamet do vejcovodu (GIFT). Vlastní léčba neplodnosti u žen zahrnuje zejména stimulaci dozrávání ovariálních folikulů a hormonální úpravu a synchronizaci ovariálního a menstruačního cyklu. V případech, kdy i přes hormonální léčbu neplodnosti není možné dosáhnout fyziologického početí, právě laboratorní metody asistované reprodukce umožňují oplození oocytu spermií v kontrolovaných laboratorních podmínkách, kontrolu raného embryonálního vývoje a implantaci vyvíjejícího se embrya do děložní sliznice. Původní metody IVF využívaly oocyty získané během přirozeného ovariálního cyklu. Tento přístup, vzhledem k nízké efektivitě, byl nahrazen hormonální stimulací gonadotropiny vedoucí k hyperovulaci s cílem získat větší počet zralých folikulů pro následnou IVF. U řady pacientek však není možné hormonální stimulaci použít. Důvodem může být např. genetická predispozice pacientky ke karcinomu prsu či ovarií, kdy aplikace hormonů může přispívat k rozvoji nádorového onemocnění. Jednou z komplikací hormonální stimulace může být také syndrom polycystických ovarií, který se projevuje při hyperstimulačním syndromu. Dále nelze využít hormonální stimulace v případech, kdy je potřeba urychlit odběr oocytů např. v případě onkologických pacientek s nadcházející chemoterapií, která by rostoucí folikuly mohla poškodit. Řešením je odběr nezralých oocytů, jejich kultivace ve specifickém médiu, které umožňuje jejich dozrávání v podmínkách, které se blíží fyziologickým, až do stádia kdy je zralý oocyt schopen oplodnění in vitro. Tato práce se zaměřuje na fyziologické zrání oocytů v ovariích, průběh buněčného cyklu, popis ovariálního a menstruačního cyklu a diskutuje možnosti in vitro kultivace a maturace oocytu. 7

8 2 Cíle práce Cílem této práce bylo popsat proces dozrávání oocytů v ováriích v návaznosti na průběh buněčného cyklu. Dále tato práce dává do souvislosti možnosti in vitro kultivace a maturace oocytů. 8

9 3 Buněčný cyklus, mitóza, meióza, 3.1 Buněčný cyklus Buněčný cyklus je sled dějů, během kterých dochází k duplikaci genomu a cytokinezi. Buněčný cyklus se stává z několika fází zajišťujících replikaci a rozdělení genomu a vlastního buněčného dělení G0, G1, S, G2, M (Obr. 1). Obr. 1 Buněčný cyklus (Wheeler, 2013) G0 - gap (mezera) - zastavení buněčného cyklu, klidová fáze G1 - gap 1 - přípravná fáze na další dělení S - DNA se replikuje na dvojnásobné množství G2 - Zdvojování organel, tvorba struktur potřebných pro dělení buňky M - Mitóza (jaderné dělení) a vlastní cytokineze (dělení celé buňky) viz. níže 9

10 3.2 Mitóza Mitóza je závěrečná fáze buněčného cyklu, ve které dochází k rozdělení duplikovaných chromosomů do dceřiných buněk. Jednotlivé fáze odrážejí strukturní změny jádra, kondenzaci chromosomů, interakce s dělicím vřeténkem a rozchod chromatid (obr. 2). Mitóza, která trvá přibližně jednu hodinu, se stává ze šesti úseků: a) Profáze dochází k syntéze centriol a duplikaci centrosomů, následně k zahájení kondenzace chromosomů a tvorbě mitotického vřeténka. Sesterské centrosomy vytvářejí póly sestavujícího se dělicího vřeténka. b) Prometafáze vymizí jaderný obal, rozpadne se a na mikrotubuly dělícího vřeténka se připojí chromosomy. c) Metafáze tzv. kontrolní bod vřeténka veškeré kinetochory musí být připojené ke správnému mikrotubulu, v opačném případě dojde k zastavení mitózy. Seřazení chromozomů do ekvatoriální roviny, tzv. metafázové ploténky. d) Anafáze - zkracováním mikrotubulů dělícího vřeténka dochází k rozchodu chromatid k pólům buňky. Spojení sesterských chromatid se uvolní. e) Telofáze dělící vřeténko vymizí, jaderný obal se začíná znovu vytvářet. U chromatidy dekondenzují. f) Cytokineze - vzniká přepážka mezi dceřinými buňkami způsobem zvaným rýhování. Rýhování - je dostředivé dělení, buňka se jakoby zaškrtí od krajů do středu. Následně je buněčné tělo zcela rozděleno (Lüllmann-Rauch, 2012). 10

11 Obr. 2. Schématický průběh mitózy (Ušaková, 1999) 11

12 3.3 Meióza Na rozdíl od mitózy, kdy se zachovává stupeň ploidie a dceřiné buňky jsou diploidní (2n), je cílem meiózy zajistit, aby dceřiné buňky obsahovaly pouze polovinu genetického materiálu, byly haploidní (n). Meióza je způsob buněčného dělení, při kterém postupně probíhají dvě fáze - první (obr. 3) a druhé (obr. 4) meiotické (redukční) dělení. Před meiózou I proběhne S-fáze, čímž celkové množství DNA dosáhne 4n. Přehled jednotlivých fází meiotického dělení shrnuje tab. 1. Obr. 3 Schématický průběh meiózy I a II (Cummings, 2005) 12

13 Tab. 1 Přehled prvního meiotického dělení PROFÁZE I Leptotenní Zygotenní Pachytenní kondenzace a párování chromosomů formování synaptonemálního komplexu crossing over Diplotenní rozvolnění synaptonemálního komplexu PROMETAFÁZE I METAFÁZE I ANAFÁZE I TELOFÁZE I vymizení jaderného obalu seřazení chromosomů do ekvatoriální roviny pohyb chromosomů k opačným pólům u oogeneze přechod z meiózy I do meiózy II 13

14 Prvé redukční heterotypické dělení, meióza I Meióza I se dělí na několik fází, které odpovídají stupni kondenzace chromatinu, tvorbě bivalentů, chromosomální rekombinaci či tvorbě dělícího vřeténka. Nejdelší fází je profáze I, která se dále dělí na čtyři stádia leptotenní, zygotenní, pachytenní a diplotenní. Po ukončení profáze I následují podobně jako u mitózy metafáze, předcházená prometafází, anafáze a telofáze (Lüllmann-Rauch, 2012). V profázi se homologní chromosomy za účasti proteinových komplexů obsahujících kohesiny párují vytváří se synaptonemální komplex, který oba homology (sesterské chromatidy) spojuje. Jako bivalenty se označují párové chromosomy obsahující jeden chromosom otcovského původu a jeden původu mateřského - tedy čtyři chromatidy (obr. 4). A B C D Obr. 4. Stádia profáze I (Mitóza ) (A) Leptotenní - vláknité chromosomy se začínají kondenzovat a párovat (B) Zygotenní stádium - vznik bivalentů, formuje se synaptonemální komplex. (C) Pachytenní - v tomto stádiu je ukončena synapse a objevují se rekombinační uzlíky. Obsahují enzymy, které jsou potřebné pro rekombinaci a opravu DNA. Dochází k výměně genů mezi homologickými nesesterskými chromatidami - crossing overu. (D) Diplotenní stádium - profáze končí, rekombinace DNA je dokončena. Dochází k rozvolnění synaptonemálního komplexu. 14

15 Dále meióza I pokračuje dalšími stádii, kdy dochází k dokončení prvého meiotického dělení (Obr. 5) A B C D Obr. 5. Schéma meióza I (Mitóza, 2001) (A) Prometafáze I - jaderný obal vymizí, zároveň se formují kinetochory, které připojují chromosomy k mikrotubulům dělícího vřeténka tak, aby se obě sesterské chromatidy dostaly k jednomu pólu. (B) Metafáze I - bivalenty vytváří metafázovou ploténku. Každý bivalent je složen ze dvou chromosomů, tzn. čtyř chromatid. Jejich orientace vzhledem k pólům dělícího vřeténka je náhodná, z toho vyplývá, že je úplně stejná pravděpodobnost, zda-li přejde do jedné nebo druhé budoucí buňky chromosom mateřský nebo otcovský. (C) Anafáze I - po-té, co koheziny uvolní chiasmata, se chiasmata oddělí a chromosomy se začnou pohybovat k opačným pólům (D) Telofáze I - u oogeneze zde přechází meióza I do meiózy II 15

16 Výsledkem meiózy I - je vznik dvou buněk s haploidním počtem chromosomů. Z nichž každý chromosom obsahuje dvě chromatidy. Chromatidy, ale nejsou rovnocenné, protože při crossing overu došlo k výměně částí chromatid. Výsledkem meiózy I u oogeneze je vznik prvého pólového tělíska (Lüllmann-Rauch, 2012) (obr. 6). Obr. 6. Oocyt s prvním pólovým tělískem a zona pellucida (šipky) (orig. Malenovská, 2013). Druhé zrací homotypické dělení, meióza II Mezi meiotickým dělením k S-fázi nedochází. Naopak je cytokineze následována meiózou II. Meióza II má podobné fáze jako mitóza. V anafázi II se sesterské chromatidy oddělí. Dále pak již jako samostatné chromosomy putují v telofázi k opačným pólům dělícího vřeténka. Výsledkem meiózy II je, že se z každé buňky vytváří dvě haploidní dceřiné buňky, ve kterých je každý chromosom složen z jedné chromatidy. Zde je množství DNA 1n (Lüllmann-Rauch, 2012). Možné meiotické chyby - důsledek jejich vzniku Mohou být způsobeny selháním buněčných kontrolních mechanismů (kontrolní body buněčného cyklu) nebo vystavením látkám či podmínkám prostředím navozujícím chromozomální aberace (chemické klastogeny, UV záření, ionizující záření atd.). Příkladem mohou být aneuploidie, vznikající jako důsledek nerovnoměrného rozdělení chromozomů, výsledný počet chromozomů neodpovídá počtu 2x23 v somatických buňkách nebo 1x23 ve zralých gametách, nejběžnější aneuploidií je např. trisomie 21, způsobující Downův syndrom. Mezi strukturní abnormality patří delece, inverze, translokace vznikající např. důsledkem chybného crossing-overu (Trávník, 2011). Odhalení chromozomálních abnormalit je důležitým úkolem preimplantační genetické diagnostiky. 16

17 Časové zařazení meiózy v oogenezi 1) Prenatální vývoj oocytů - od gonocytu až po oocyt I. v zastavené meióze 2) Postnatální vývoj oocytů - od folikulogeneze do začátku meiózy II 3) Postovulační vývoj oocytů - jen v případě oplození je meióza II dokončena Diploidní je tedy oogonie a primární oocyt, sekundární oocyt je haploidní (Obr. 7). Obr. 7. Shrnutí oogoneze z pohledu buněčného cyklu a cytokineze ve vztahu k vývoji folikulů (Cumming, 2005). 17

18 4 Fyziologický ovariální a menstruační cyklus a jejich hormonální regulace Reprodukční procesy v ženském organismu jsou řízeny prostřednictvím hormonálních interakcí mezi hypothalamem, hypofýzou a vaječníky. Zásadní rozdíl v kontrole činnosti gonád u obou pohlaví spočívá v tom, že u žen jsou hormony vylučovány cyklicky a nikoliv kontinuálně (Sadler, 1963). Klíčovou pozici v řízení činnosti gonád zaujímá gonadoliberin (GnRH-Gonadotropin- Releasing Hormone, také FSH/LH-RH), který je syntetizovaný u obou pohlaví v nervových buňkách (nukleus arcuatus) hypothalamu, jejichž odvodné výběžky (axony) se zakončují na tzv. eminentia mediana hypofýzy. Zde se GnRH dostává do hypofyzárního oběhu a jeho prostřednictvím ke gonadotropním buňkám předního laloku hypofýzy. Sekrece a výdej GnRH do oběhu se děje přerušovaně a v malých dávkách (pulzativně). U mužů se GnRH vylučuje z hypothalamu v asi 2-4 hodinových pulzech ve velmi malém a prakticky neměnném množství, kdežto u dívek a žen počínaje obdobím puberty podléhá výdej liberinu měsíčním rytmům. Před ovulací je GnRH přerušovaně vydáván každých 90 až 60 min, zatímco po ovulaci činí intervaly mezi jednotlivými pulzy 3-4 hod. GnRH v hypofýze stimuluje gonadotropní buňky a řídí uvolňování folikuly stimulujícího hormonu (FSH) a hormonu luteinizačního (LH). U žen oba hormony spolu s dalšími faktory na principu pozitivních a negativních mechanizmů zpětné vazby pak regulují celý ovariální cyklus (Sadler, 2011). Jako ovariální cyklus se souhrnně označují cyklicky se opakující morfologické a funkční změny, které probíhají ve vaječnících pohlavně dospělých žen. Tento cyklus trvá přibližně 28 dní a má tři fáze: 1. preovulační, také folikulární ( den) 2. ovulaci ( den) 3. postovulační, také luteální ( den) Fáze preovulační. Jestliže je GnRH uvolňován s frekvencí každých 90 nebo 60 minut, vzrůstá výdej FSH a LH z gonadotropních buněk adenohypofýzy do krevního oběhu. Zvýšené hladiny LH a FSH stimulují růst 10 až 15 primárních folikulů (fáze náboru), z nichž jeden zaujme přednostní pozici (fáze výběru) a dozraje později jako Graafův folikul. Na zvýšenou hladinu FSH odpovídají folikulární buňky rostoucích folikulů zvýšenou syntézou estrogenu (hlavně estradiolu E2), který přechází do krve s malým množstvím progesteronu, testosteronu a androstendionu. Vzestup hladiny estradiolu v krvi vyvolává obnovu děložní sliznice po 18

19 předchozí menstruaci (tj. v proliferační fázi), dále stimuluje hypothalamus k dalšímu pulzativnímu uvolňování GnRH, který dále zvyšuje hladinu krevního FSH a LH. Jeden až dva dny před ovulací tvorba estradiolu v dozrávajícím folikulu ustává a snižuje se jeho hladina v krvi (Sadler, 1963). Asi 14. den hladina krevního LH a FSH dosahuje vrcholu, což se označuje jako preovulační vlna LH a FSH. Účinkem LH vlny dochází v Grafově folikulu k důležitým strukturním změnám. Začíná rapidně vzrůstat produkce folikulární tekutiny, stěna folikulu v místě stigmatu (místo ruptury stěny folikulu) atakují proteolytické enzymy, stěna se ztenčuje a vyklenuje nad úroveň ovariálního povrchu, až konečně praská. Tím se folikulární tekutina spolu s kumulem masivně uvolní do abdominální dutiny, kde je tato tekutina nasávána fimbriemi vejcovodu. Soubor dějů, zahrnujících prasknutí stěny folikulu a uvolnění kumulu s oocytem II, který v době ovulace zahajuje druhé meiotické dělení, se označuje jako ovulace (Sadler, 1963). Bezprostředně po ovulaci buňky membrana granulosa hypertrofují (na jejich množství a vyzrávání má vliv CDF 9) a přeměňují se ve žluté tělísko. Zahájení změn indukuje především LH, zatímco funkce FSH v průběhu luteální fáze není dosud objasněna. Ještě před ukončením morfologické diferenciace žlutého tělíska začínají jeho buňky produkovat progesteron a malé množství estradiolu. Působí společně na děložní sliznici a zabezpečí nástup sekreční fáze menstruačního cyklu. Zároveň však působí na hypothalamus a v něm inhibují výdej GnRH; intervaly jeho výdeje klesnou na 3-4 ). Tato situace se na úrovni adenohypofýzy projeví sníženým vylučováním LH a FSH a poklesem jejich hladin v krvi. Spolu s poklesem LH a FSH slábnou podněty pro diferenciaci folikulů, takže v luteální fázi je jejich růst zastaven. Asi 8. dne po ovulaci začíná žluté tělísko postupně zanikat (v případě corpus luteum menstruationis), což má za následek snížení syntézy a výdeje progesteronu a estrogenu a pokles jejich hladin v krvi. Tento pokles hladiny hormonů se na děložní sliznici odrazí ischemií a poté menstruačním krvácením (Sadler, 1963). V závěru luteální fáze dosahují hladiny progesteronu a estrogenu v krvi minimálních hodnot, takže ustává jejich tlumivý vliv na pulzy výdeje GnRH a jeho vylučování z hypothalamu začíná stoupat (doba mezi pulzy se zkracuje na min). Gonadotropní buňky předního laloku hypofýzy znovu uvolňují LH a FSH a nastupuje folikulární fáze ovariálního cyklu (Sadler, 1963). 19

20 5 Oocyt a jeho vývoj Oocyt je ženská haploidní pohlavní buňka, která dosahuje ve zralém stavu velikosti až 150 μm. Pro klasifikaci oocytů je důležitý stav ploidie, interakce s folikulárními buňkami a jejich uspořádání i celková velikost a struktura folikulu (Sadler, 2011). Zárodečnou buňkou v diferenciaci oocytů jsou diploidní oogonie, které jsou během fetálního vývoje mitoticky aktivní a kolonizují ovariální kůru a stroma. Pokud se dostanou do kontaktu s buňkami zárodečného epitelu, přestávají se dělit a vytvářejí tzv. primordiální folikul. Oogonie, které se do kontaktu nedostaly, typicky oogonie ve stromatu, odumírají mechanismem programované buněčné smrti. Primordiální folikuly tak obsahuje pouze ovariální kůra. Proliferace oogonií vrcholí během 2-3 měsíce vývoje in utero a ustává kolem 6. měsíce intrauterinního vývoje, kdy je v ovariích uloženo 6-7 milionu oogonií. Oogonie, které vytvořily primordiální folikul, vstupují do prvního meiotického dělení, které přerušují v profázi meiózy I a nazývají se primární oocyty. V klidovém stavu jsou až do nástupu puberty, kdy každý vaječník obsahuje folikulů. Část primordiálních folikulů, cca 15-20, vstupuje pravidelně do ovariálního cyklu, vedoucího k dozrávání primárního oocytu (Sadler, 2011). Během růstu primordiálního folikulu dochází ke změně tvaru folikulárních buněk z plochých na kubické, folikul se označuje jako primární a jejich dělením vzniká kolem oocytu vícevrstevný útvar, budoucí membrana granulosa. Folikul s vrstevnatým folikulárním epitelem se označuje jako sekundární. Následně se mezi folikulárními buňkami vytváří štěrbiny, které následně splývají v tzv. antrum foliculi. Hovoříme o terciárních, tzv. antrálních folikulech. Rostoucí folikuly také získávají citlivost (receptory) vůči FSH, který následně řídí jejich maturaci. Na konci postovulační luteální fáze mají folikuly velikost cca 2 mm. Z nich jediný folikul pokračuje ve vývoji, ostatní podléhají atresii zániku. Růst dominantního folikulu akceleruje, produkuje estrogeny, které tlumí vývoj ostatních folikulů snížením hladiny FSH. Dominantní folikul dále mění svoji stavbu, z folikulárních buněk se vytváří membrana granulosa a cumulus oophorus, v jehož vrcholu je umístěný oocyt. Zároveň se vyváří glykoproteinový obal, zona pellucida. Buňky v cumulus oophorus se organizují do tzv. corona radiata vyživující oocyt (Obr. 8A, B). Kumulární buňky zároveň brání dokončit první meiotické dělení. Po vzestupu LH h před ovulací jejich inhibiční účinek mizí, oocyt dokončuje meiózu I a mění se v sekundární oocyt. Odlučuje se také první pólové tělísko. Sekundární oocyt plynule přechází do druhého zracího dělení, meiózy II. Zralý, diferencovaný folikul o velikosti až 2cm se označuje jako Graafův folikul. Prasknutím 20

21 stěny Graafova folikulu dochází k ovulaci a vyplavení oocytu i s cumulus oophorus směrem k fimbriím v ústí vejcovodu (Sadler, 2011), (Obr. 8). Oocyt je schopen oplození hodin po ovulaci, jinak zaniká. V případě fertilizace, oocyt dokončí druhé meiotické dělení, dojde ke splynutí samčího a samičího genomu a vzniku zygoty. Přehled oogenze shrnuje obr. 9 (Sadler, 2011). A B C Obr. 8. (A) Schéma lidského vajíčka s corona radiata (orig. Malenovská, 2012). (B) Schéma oocytu s corona radiata (Henry, 2008). (C) Terciární, antrální folikul. MG - membrana granulosa, CO - cumulus oophorus, Cav antrum (Sadler, 2011). 21

22 Obr. 9 Proces oogeneze (Robert et al. 2006). 22

23 6 Kultivace oocytu in vitro Fyziologické zrání oocytu je komplexní biologický proces, který není jednoduché rekapitulovat v laboratorních podmínkách. Jeho úspěšnost závisí také na stupni maturace folikulu a čase jeho odběru z ovariální tkáně. Nejmenší pravděpodobnost úspěšného dokončení oogeneze a následné fertilizace mají nejméně zralé folikuly. Experimenty provedené na myších ukázaly, že zatímco sekundární folikuly s několika vrstvami buněk membrana granulusa mají vysokou úspěšnost fertilizace in vitro, pouze minimální počet primordiálních folikulů je schopen projít procesem růstu a maturace in vitro. Existují dva základní přístupy kultivace oocytů in vitro. První zahrnuje odběr plně zralých oocytů z antrálních folikulů. V optimálních podmínkách oocyt bude pokračovat v meiotickém dělení, které dokončí ideálně během hodin a bude připraven k fertilizaci (Cha a Chin, 1998). Druhý způsob, vlastní in vitro maturace (IVM) je založen na kultivaci primordiálních a preantrálních folikulů in vitro, navození podmínek, které umožňují jejich růst a maturaci a následnou fertilizaci. Historicky existují různé techniky kultivace a maturace nezralých folikulů (obr. 10): Technika tkáňové kultivace Důležitým předpokladem úspěšné kultivace nezralých oocytů v kultuře in vitro, je snaha o udržení maximální integrity ovariálního folikulu, tak aby interakce mezi oocytem a folikulárními buňkami membrana granulosa, resp. thékálními buňkami zůstala zachována. Toho lze docílit např. kultivací částí ovariální kortikální tkáně, získané laparoskopicky, např. během diagnostiky infertility. Značná část primordiálních folikulů v těchto podmínkách zahajuje růst a maturaci. Nevýhodou je rychlá degradace ovariální tkáně, která podléhá v kultivačních podmínkách nekróze. Obtížné je také sledování rostoucích folikulů, které je možné pouze histologickými technikami (počet, velikost, stádium atd.) nebo sledováním úrovně steroidogeneze. Folikuly kultivované touto technikou dosahovaly stádia preantrálních, resp. raných antrálních stádií vývoje. Častou atrézii, která růst folikulů v in vitro podmínkách doprovázela, bylo možné omezit použitím komplexních médií, využívaných v buněčné biologii, např. -MEM s přídavkem FSH. Zvířecí sérum, používané jako doplněk v buněčných kultivacích in vitro neurčených k humánnímu použití, bylo možné nahradit lidským sérovým albuminem a směsí insulinu, transferrinu a selenu, v běžných koncentracích pro buněčné a tkáňové kultury (Hardy et al. 2000). 23

24 Kultivace izolovaných preantrálních folikulů Obr. 10. Izolační a kultivační strategie používané v in vitro maturaci oocytů (Hardy et al. 2000). Kultivace mechanicky či enzymaticky izolovaných primordiálních folikulů Primordiální folikuly jsou mechanicky uvolněny z ovariálního kortexu, po předchozím enzymatickém rozvolnění tkáně kolagenázou a DNázou. Přestože je možné touto metodou zachovat více než 50% izolovaných folikulů, jejich integrita nebývá zachována a dochází k časté extruzi oocytu (Hardy et al. 2000). Aspirace malých antrálních folikulů - v ultrazvukové navigaci Malé antrální folikuly velké 2-10mm je možné izolovat transvaginální asporací pod ultrazvukovou kontrolou. Z těchto folikulů je poté možné izolovat komplex cumulus oophorus a oocytu (COC), které mohou být kultivovány v médiu doplněném sérovými albuminy a gonadotropiny. Během 48 hodiny 60-80% COC pokračuje v meiotickém dělení I a 24

25 dosahují meiózy II. Po odstranění kumulárních buněk je možné oocyty fertilizovat s použitím konvečních IVF metod či intracytoplazamtickou injekcí spermie. Z oocytů maturovaných in vitro je schopno fertilizace 25-80%. Nicméně, podíl oocytů, které úspěšně dozrají a dokončí II. meiotické dělení, jsou úspěšně fertilizovány, vzniklá zygota zahájí rýhovací dělení a je schopná embryotransferu, je nízký - kolem 1-2% (Wynn et al. 1998). Přesto, takto vzniklá embrya jsou životaschopná a těhotenství je zakončeno živým porodem (obr. 11). Hormonální stimulací, např. FSH během kultivace in vitro je možné zvýšit podíl dozrávajících oocytů i rýhujících se zygot (Hardy et al. 2000). Volba vhodné techniky odběru, metody kultivace in vitro a případná hormonální stimulace, tak výrazně ovlivňují úspěšnost IVM v asistované reprodukci (obr. 12). Diagnostika polárních tělísek Biopsie polárních tělísek v preimplantační genetické diagnostice (PBD) je metoda vhodná k odhalení monogenně podmíněných chorob a aneuploidií. Je indikována u starších pacientek (u 40-ti letých žen se u 50-70% oocytů vyskytují chromozomální abnormality), maternálních translokací, či u nezdařených opakovaných embryotransferů, při implantačních selháních a spontánních potratech nedeterminované etiologie. Diagnóza aneuploidie je důkazem odpovídající chromozómové početní aberace v oocytu. Vyšetření předchází vhodně načasované otevření zona pellucida pomocí laseru a izolace polárního tělíska. Následuje vlastní genetická diagnostika zejména fluorescenční in situ hybridizace, FISH nebo komparativní genomové hybridizace CGH. Pomocí setu FISH sond pro pět chromozomů je možné zachytit 37% chromozomálních abnormalit. Pomocí FISH sondy pro dvanáct chromozomů se úspěšnost záchytu chromozomálních abnormalit zvyšuje až na 67%. U FISH analýzy pomocí sondy pro pět chromozomů u prvního i druhého polárního tělíska se záchyt aneuplidií pohybuje kolem 62%. Konkrétně, 8% aneuploidií se vyskytuje ve fázi prvního meiotického dělení. 1/3 aneuploidií se objevuje v čase druhého meiotického dělení a byly detekovány u druhého polárního tělíska. Kolem 90% chromozomálních abnormalit u embryí je mateřského původu. Nevýhodou PBD je, že umožňuje detekci pouze maternálních chromozomálních abnormalit, zejména aneuploidií, nebo stanovení, zda je žena nositelkou translokací či chorob vázaných na X chromozom (Van der Ven et al. 2008). 25

26 Aplikace in vitro maturace IVM je využívána jako alternativa v případě, kdy selhává normální stimulace a oocyty při této technice nedozrávají, resp. pokud hrozí závažný stupeň ovariálního hyperstimulačního syndromu, prakticky je vyhrazena mladým ženám se syndromem polycystických ovárií, které mají vysoký počet antrálních folikulů. Dále je vhodnou alternativou u žen, pro které není vhodné ze zdravotních důvodů podávat preparáty stimulující indukci ovulace. Vhodnou metodou není u žen starších 35 let, u žen obézních, u žen, které mají vyšší hladiny FSH a nižší hladiny AMH, případně u žen, kde není možné optimálně zviditelnit vaječníky pomocí ultrasonografie. Obr. 11. Procentuální zastoupení kultivovaných nezralých oocytů, které dosáhnou meiózy II, jsou schopné fertilizace a vzniklé zygoty prochází in vitro rýhovacím dělením. Bílý sloupec nezralé oocyty získané z nestimulovaných ovarií pacientek se syndromem polycystických ovarií; šrafované sloupce oocyty získané z ovarií nestimulovaných pacientek s normálním menstruačním cyklem; černé sloupce oocyty pacientek stimulovaných FSH. (Hardy et al. 2000). 26

27 Obr. 12. Přehled stádií folikulogeneze ve vztahu k používaným technikám izolace folikulů (Hardy et al. 2000). 27

28 7 Závěr Metody asistované reprodukce zahrnující také in vitro fertilizaci představují často jedinou možnost početí u infertilních párů. Nejběžněji využívaná metoda sběru stimulovaných antrálních folikulů, následná fertilizace v laboratorních podmínkách a embryotransfer představují zlatý standard mezi používanými technikami. V mnoha případech, ale hormonální stimulaci gonadotropiny nelze provést v důsledku zvýšeného zdravotního rizika (hyperstimulační syndrom, riziko rozvoje nádorového onemocnění) nebo nedostatku času (chemoterapie), případně hormonální stimulace zcela selhává a folikuly nedozrávají. Kultivace nezralých folikulů, jejich růst a maturace in vitro umožňuje získat zralé oocyty vhodné pro fertilizaci. Metoda in vitro maturace tak představuje metodu s velkým klinickým potenciálem, která zároveň minimalizuje zátěž pro organismus dárkyně. Poznání mechanismů, které řídí růst a vývoj folikulů a oocytů in vivo, tak přispívá k praktickému použití v klinické reprodukční medicíně. První dítě narozené touto metodou v České republice bylo v liberecké klinice GENNET

29 8 Literatura ALBERTINI, DF. Maturitas ex vivo: the case for oocyte in vitro maturation in human ARTs. J Assist Reprod Genet (6): BREWIS, IA WONG CH. Gamete recognition: sperm proteins that interact with the egg zona pellucida. Rev Reprod Sep; 4(3): CARABATSOS, JM aj. Characterization of oocyte and follicle development in growth differentiation factor-9-deficient mice. Dev Biol (2): DONG, J aj. Growth differentiation factor-9 is required during early ovarion folliculogenesis. Nature (6600): EPPIG, JJ - O'BRIEN, M WIGGLESWORTH, K. Mammalian Oocyte Growth and Development In vitro. Mol Reprod Dev : EPPIG, JJ aj. Relationship between the evelopmental programs controlling nuclear and cytoplasmic maturation of mouse oocytes. Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine Dev Biol : 1-9 FAUSER, BCJM aj. Reproductive Medicine: Molecular, Cellular and Genetic Fundamentals. Parthenon. 2. vyd s. ISBN: GUPTA, SK aj. Structural and functional attributes of zona pellucida glycoproteins. Soc Reprod Fertil Suppl. 2007; 63: HARDY, K aj. In vitro maturation of oocytes. Br Med Bull. 2000;56(3): Review. HOODHBOY, T DEAN, J. Insights into the molecular basis of sperm-egg recognition in mammals. Reproduction Apr;127(4): CHA, KY CHIAN RC. Maturation m vitro of immature human oocytes for clinical use. Hum. Reprod. Update (1998) 4(2): CHIU, PC aj. Native human zona pellucida glycoproteins: purification and binding properties. Hum Reprod Jun;23(6): JOYCE, M aj. Comparison of recombinant growth differentiation factor-9 and oocyte regulation of KITligand messenger ribonucleic acid expression in mouse ovarian follicles. Biol Reprod : KANATSU-SHINOHARA, M SCHULTZ, RM KOPF, GS aj. Acquisition of meiotic competence in mouse ocytes:absolute amounts of p34cdc2, cyclin B1, cdc25c, and wee 1 in meiotically incompetent and competent oocytes. Biol Reprod : KING, RC - STANSFIELD, W - MULLIGAN, PK. Dictionary of Genetics. Seventh Edition. Oxford University Press, ISBN: LITSCHER, ES WASSARMAN, PM. Egg extracellular coat proteins: from fish to mammals. Histol Histopathol (3):

30 LÜLMANN-RAUCH R, Histologie, Grada Publishing, a.s., 2012, Praha 7 LYNG, R aj. Sperm-egg binding requires a multiplicity of receptor-ligand interactions: new insights into the nature of gamete receptors derived from reproductive tract secretions. Soc Reprod Fertil Suppl. 2007;65: SADLER, T. Langman's Medical Embryology. 9. vyd., 2003 SADLER, T LANGMAN, W. Medical Embryology. Lippincott Williams & Wilkins s. 73. ISBN: SADLER, T. Lékařská embryologie, Grada 2011, Medical S. SIMON, MA aj. Female infertility in mice lacking connexin-37. Nature : SORENSON, R - WASSARMAN, P. Relation ship between growth and meiotic maturation of the mouse oocytes.dev Biol : TESAŘÍK, J aj. First Department of Obstetrics and Gynaecology. Faculty of Medicine, J.E.Purkyně University Brno and Institute of Molecular Genetics, Czechoslovak Academy of SciencesPrague, Czechoslovakia UŠAKOVÁ, K aj. Biológia pre gymnázia vyd. Bratislava : MEDIA TRADE s. ISBN: Van der Ven, K Montag, M Van der Ven, H. Polar Body Diagnosis a step in the right direction. Dtsch Arztebl Int March; 105(11): Review Article. WASSARMAN, P. Zona pellucida glycoproteins. J Biol Chem Jun 10. WYNN, P aj. Pretreatment with follicle stimulating hormone promotes the numbers of human oocytes reaching metaphase II by in-vitro maturation. Hum Reprod Nov;13(11): YONEZAWA, N KANAI, S NAKANO, M. Structural significance of N-glycans of the zona pellucida on species-selective recognition of spermatozoa between pig and cattle. Soc Reprod Fertil Suppl. 2007; 63: YUJI, H - TAKASHI, M. In vitro Growth of Mouse Oocytes: Oocyte Size at the Beginning of Culture Influences the Appropriate Length of Culture Period. J.Mamm.Ova.Res (25):

31 Elektronické zdroje (www) CUMMINGS, B. Essentials of Human Anatomy and Physiology, 7th edition [Citováno ] Dostupné na World Wide Web: JELÍNEK, R aj. Skripta Histologie a embryologie [Citováno ] Dostupné na World Wide Web: LISA, Karyo Typings [Citováno ] Dostupné na World Wide Web: TRÁVNÍK, P. Gametogeneze, mitóza a meióza [Citováno ] Dostupné na World Wide Web: petence WHEELER, R. Wikipedia. Buněčný cyklus [Citováno ] Dostupné na World Wide Web: Mitóza [Citováno ] Dostupné na World Wide Web: Fotografie, osobní sdělení MALENOVSKÁ A. Osobní sdělení. 2012,

32 9 Seznam obrázků Obr. 1 Obr. 2 Obr. 3 Obr. 4 Obr. 5 Obr. 6 Obr. 7 Obr. 8 Obr. 9 Obr. 10 Obr. 11 Obr. 12 Buněčný cyklus Schématický průběh mitózy Schématický průběh meiózy I a II Stádia profáze I (A) Prometafáze I (B) Metafáze I (C) Anafáze I (D) Telofáze I Oocyt s prvním pólovým tělískem a zona pellucida Shrnutí oogoneze z pohledu buněčného cyklu a cytokineze ve vztahu k vývoji folikulů (A) Schéma lidského vajíčka s corona radiata (B) Schéma oocytu s corona radiata (C) Terciární, antrální folikul, MG, CO, Cav Proces oogeneze Izolační a kultivační strategie používané v in vitro maturaci oocytů. Procentuální zastoupení kultivovaných nezralých oocytů Přehled stádií folikulogeneze ve vztahu k používaným technikám izolace folikulů 32

33 10 Přílohy Orig. foto: laboratoře kliniky reprodukční medicíny a gynekologie Reprofit International s.r.o. Fotografie mikromanipulátoru pro ICSI. Orig. foto: Klinika Reprofit International s.r.o. 33