Rodina proteinů : Dvojsečná zbraň v nádorové biologii
|
|
- Jiří Toman
- před 8 lety
- Počet zobrazení:
Transkript
1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie Rodina proteinů : Dvojsečná zbraň v nádorové biologii Bakalářská práce Brno 2011 Jana Nováková
2 Poděkování Ráda bych touto cestou poděkovala Mgr. Pavlu Bouchalovi PhD. za odborné vedení, rady a korekce, poskytnuté materiály, cenný čas a za laskavý přístup. Také Mgr. Ivě Struhárové za neocenitelnou pomoc při provádění experimentu a jeho vyhodnocování, stejně tak jako za vstřícnost. Děkuji Mgr. Jakubu Tremlovi za vytvoření elektronické formy schémat působení proteinů v G 1 /S a G 2 /M kontrolních uzlech buněčného cyklu. Zároveň bych tímto ráda vyjádřila vděčnost své rodině a přátelům za blízkost a podporu během studia. Můj největší dík patří mému Bohu, Ježíši Kristu. Práce byla řešena v rámci grantového projektu Grantové agentury České republiky č. P304/10/0868 a s podporou Evropského fondu pro regionální rozvoj (RECAMO; CZ 1.05/2.1.00/ ). Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci Rodina proteinů : Dvojsečná zbraň ve vývoji nádorů vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Pavla Bouchala PhD. za použití uvedených zdrojů a literatury. V Brně, Jana Nováková 2
3 Informovaný souhlas pacientů Pacienti Masarykova onkologického ústavu (MOÚ) dávají informovaný souhlas s podstoupením operačního výkonu. MOÚ užívá řadu informovaných souhlasů podle účelu a povahy výkonu. Součástí souhlasů jsou také prohlášení, že pacient souhlasí s tím, že: v rámci běžných diagnostických postupů byl odebrán z jeho těla biologický materiál, který může být použit pro výzkumné účely a aby údaje z jeho zdravotnické dokumentace (demografické údaje, údaje o zdravotním stavu, údaje o poskytnuté zdravotní péči) mohly být využívány zdravotnickými pracovníky MOÚ pro vědecké studie v oboru lékařské vědy či v příbuzném oboru s tím, že mimo zdravotnické pracovníky MOÚ budou tyto údaje sdělovány výlučně v anonymizované podobě, tj. nikdo z těchto údajů nepozná, že se týkají pacientovy osoby. 3
4 OBSAH 1. SEZNAM ZKRATEK ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST OBECNÁ CHARAKTERISTIKA PROTEINŮ Objevení a název Výskyt Struktura Vazebné vlastnosti Význam a funkce REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU Přechod z G 2 fáze do mitózy Přechod z G 1 do S fáze FOXO APOPTÓZA Rodina Bcl POTENCIÁLNÍ ONKOGENY Ras-Raf-MAPK Bcr-Abl Cbl IGF-IR-IRS-1-PI-3K TERT Histonové deacetylázy (HDACs) Integriny Σ (STRATIFIN) Struktura Regulace exprese σ σ a vznik nádorů Metastázování a invazivita nádorů Terapeutika PRINCIP POUŽITÝCH METOD SDS Gelová polyakrylamidová elektroforéza (SDS PAGE) Western Blotting itraq-2dlc-ms/ms EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST MATERIÁL A METODY
5 4.1.1 Přístroje a materiál Použité chemikálie Metody VÝSLEDKY DISKUSE SOUHRN SUMMARY SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
6 1. SEZNAM ZKRATEK Abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 ADAM22 a disintegrin and metalloprotease domain 22 AKT proteinová rodina protein kinas b APS ammonium persulphate ASK apoptosis signal-regulating kinase BAD Bcl-2-associated death promoter BAK Bcl-2 homologous antagonist/killer BAX Bcl-2 associated X protein Bcl-2 B-cell lymphoma 2 Bcl-X L B-cell lymphoma-extra large Bcl-X S B-cell lymphoma-extra small Bcr breakpoint cluster region Bfl-1/A1 B cell lymphoma-2 related gene expressed in fetal liver-1/a1 BID BH3 domain interacting death agonist BRCA1 breast cancer growth suppressor protein 1 BSA bovine serum albumin Cbl casitas B-lineage lymphoma CDC2 cell division control protien 2 CDC25 cell division cycle 25 Chk1 checkpoint kinase 1 CDK cyclin-dependent kinase CRD cysteine rich domain CSB complete sample buffer C-TAK1 Cdc twenty-five C associated protein kinase DEAE diethylaminoethanole DNMT DNA methyltransferase ECL enhanced chemiluminiscence EFP estrogen-induced zinc finger protein FOXO the forkhead box O G x fáze gap phase 6
7 GPIbα glycoprotein Ib α HDACs histone deacetylases HPLC high performance liquid chromatography IGF-1R insulin-like growth factor 1 receptor IRS-1 insulin receptor substrate 1 itraq-2dlc- MS/MS isobaric tags for relative and absolute quantification and twodimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry M fáze mitosis phase MAPK mitogen-activated protein kinase Mcl-1 induced myeloid leukemia cell differentiation protein MEK = MAPKK mitogen-activated protein kinase kinase MOPS 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOÚ Masarykův onkologický ústav NHS N-hydroxysuccinimide P130Cas protein 130 Crk-associated substrate p27 KIP1 protein 27 PBS phosphate buffered saline PI-3K phosphatidylinositol 3 kinase Raf rapidly accelerated fibrosacroma RAMPx rabbit anti mouse peroxidase Ras rat sarcinoma S fáze synthesis phase SDS sodium dodecyl sulphate SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N, N, N, N - tetramethylethylendiamin TERT telomerase reverse transcriptase TRP tetratricopeptide repead helices 7
8 2. ÚVOD Rodina proteinů je velmi rozmanitá, přitažlivá a rozhodně ne nudná. Je zapojena v mnoha buněčných pochodech u živočichů i rostlin. Tato bakalářská práce však bude věnována okruhu jejich působení, o němž se ve společnosti mluví lehčeji, netýká-li se přímo nás nebo někoho blízkého, nikdy však ne lehce. Jde o rakovinu. Jak již název práce napovídá, proteiny zde budou nastíněny jako dvojsečná zbraň v nádorové biologii. Nebo možná jako herci. Herci s mnoha rolemi a mnoha tvářemi. Rádi se převlékají z jedné role, z jedné funkce v buňce, do druhé a nasazují si při tom masky. Jednou milé a dobré, když buňce s poškozenou DNA nedovolí pokračovat v buněčném cyklu, jindy zlé a škaredé, pokud té samé buňce umožní neuposlechnout příkaz o tom, že má raději sama sebe zabít, než aby později zničila celý organismus. K důkladnému pochopení charakteru divadelních postav je často potřeba podívat se i za jeviště do míst, která se samotným představením na první pohled příliš nesouvisí. Zaměříme se tedy i na strukturu a vazebné vlastnosti , protože právě z nich vyplývá způsob, jakým interagují s klientními proteiny. Hlavním hrdinou dramatu je σ, známý také jako stratifin. Ani kladný, ani záporný. I u něho se projevuje rozpolcený charakter vlastní celé rodině. Točit se kolem něj budeme rovněž v experimentální části práce. Všem čtenářům přeji, aby si na následujících stranách užili dobrodružství s rodinou a aby je uchvátila tak, jako si získala mě. 8
9 3. TEORETICKÁ ČÁST 3.1 OBECNÁ CHARAKTERISTIKA PROTEINŮ Objevení a název Proteiny jsou hojně se vyskytující polypeptidy kyselé povahy, o velikosti monomeru kda [1, 2] a velkém množství isoelektrických bodů [8]. Poprvé je identifikovali Moore a Perez v roce 1967 [3, 10, 12, 15], řidčeji se můžeme setkat i s letopočtem 1968 [11, 13]. Stalo se tak během analýzy proteinového složení hovězí mozkové tkáně, se zaměřením na bílkoviny rozpustné ve vodě. Při práci využívali podomácku vyrobenou aparaturu pro DEAE-celulózovou chromatografii a s její pomocí získané frakce dále vyhodnocovali elektroforézou na škrobovém gelu [8, 10, 12, 15]. A právě díky těmto dvěma separačním metodám dostaly své neobvyklé jméno. Z chromatografické kolony totiž vystoupily ve 14. frakci a v následujícím kroku se staly součástí podílu nazvaného 3.3 [12]. Rodina má různý počet členů v závislosti na zkoumaném organismu, u savců jich však najdeme sedm. Své pojmenování isoformy dostaly podle pořadí, v jakém eluovaly z HPLC [13]. Rozeznáváme tedy β, γ, ε, ζ, σ, τ a η [1, 2, 4, 5, 6]. Fosforylovaná forma β se značí jako α a pokud se setkáme se δ, jde o fosforylovanou ζ [15]. Každá z isoforem je kódována svým vlastním, charakteristickým genem [2, 4] Výskyt Rodina proteinů vykazuje vysokou homologii a nachází se ve všech eukaryotických organismech od kvasinek přes octomilky a africké žáby rodu Xenopus [4] až k savcům [2] včetně člověka [4]. Přičemž u kvasinek, Drosophila a Caenohabditis elegans se vyskytují dvě isoformy, u rostlin třináct (podle některých zdrojů patnáct [10, 14]) a u savců sedm [2]. A právě těmito sedmi členy rodiny se budeme dále zabývat. Je důležité, že každý ze sedmi podtypů má jiné rozšíření a lokalizaci. 9
10 14-3-3ζ se ve vysoké koncentraci nachází v šedé hmotě mozkové. Isoformy β, γ a η nalezneme především v Purkyňových buňkách mozečku, ε v hypofýze a τ v gliových buňkách bílé hmoty [15]. Jednotlivé isoformy jsou vysoce konzervativní a jsou přítomny nejen v mozku, ale i v různých lidských tkáních [7]. Například τ a σ jsou ve zvýšeném množství exprimovány v epiteliálních buňkách a T lymfocytech [12, 13]. Rozdíly v distribuci a množství odrážejí funkční rozdílnost jednotlivých podtypů [15] Struktura Trojrozměrná struktura proteinů byla odhalena rentgenovou strukturní analýzou u krystalů isoforem ζ a τ. S ohledem na vysokou homologii v rámci celé rodiny lze výsledky zobecnit na celou skupinu [8, 12]. Sekvenční homologie je vysoká jak v rámci jednotlivých isoforem, tak i mezi vyskytujícími se u různých živočišných druhů [15]. Proteiny se pořadím aminokyselin a tím pádem i strukturou odlišují od většiny ostatních bílkovin. Jedinou významnější podobnost lze najít v oblasti TRP (tetratricopeptide repeat helices), která se nachází u širokého spektra proteinů. Skládá se ze sady 3-16 motivů, které dohromady zformují nosné struktury schopné zprostředkovávat spojení mezi dvěma proteiny i sdružování multiproteinových komplexů [12]. Struktura monomeru Každý monomer se skládá z devíti antiparalelně uspořádaných α helixů [3], seskupených do N-koncové a C-koncové domény [12], takže v konečném důsledku vytvářejí formaci, která připomíná písmeno L [8] nebo třeba šálek na čaj [14]. Vnitřní část struktury se skládá ze čtyř helixů: α 3 a α 5, které obsahují polární, nabité aminokyseliny α 7 a α 9 s vysokým obsahem nepolárních, hydrofobních aminokyselin [8]. Velmi zajímavý je fakt, že struktura vnitřní části, tvořící vazebnou kapsu, je v rámci celé proteinové rodiny víceméně konzervativní. Naproti tomu vnější povrch monomeru vykazuje vysokou variabilitu [3]. 10
11 Struktura dimeru Monomery proteinů mají schopnost se samy sdružovat do homo nebo heterodimerů s tím, že někteří členové rodiny především σ a γ upřednostňují homodimerizaci, zatímco jiní hlavně ε preferují tvorbu heterodimerů [1]. Dimerizace nastává mezi N-koncovými doménami [12]; tedy mezi helixem α 1 prvního a řetězci α 3 a α 4 druhého monomeru. A právě vysoká podobnost v pořadí aminokyselin u α 1 a α 3 umožňuje výše zmíněnou heterodimerizaci [8]. Ale nezávisle na tom, jestli se dimer skládá ze dvou stejných nebo různých podjednotek, má vždy podobný tvar. Při pohledu zepředu připomíná řecké písmeno ω. Jeho vnitřní část je tvořena helixy α 1, α 3 a α 4 a šroubovice α 5 až α 9 jsou uskupeny do vnější struktury, která ohraničuje jako zeď dvě vnitřní vazebná místa pro ligandy z řad peptidů nebo proteinů [12]. Jsou uspořádána opačným směrem, jakoby naproti sobě [3, 12]. Tento fakt je velmi důležitý pro pochopení funkcí proteinů Díky dvěma vazebným místům mohou současně interagovat s: dvěma klientními proteiny a upravovat tak jejich aktivitu a účinky. Je pravděpodobné, že tento způsob existuje jen pro určité, specifické páry. Příkladem může být třeba souběžné vázání Raf-1 s Brc nebo A20. (Fyziologický dopad zatím nebyl objasněn.) pouze jediným proteinem, ovšem za vzniku daleko pevnější vazby, pokud ligand obsahuje vazebné motivy s nízkou schopností interakce. Za tuto skupinu můžeme jmenovat například Cbl. Nebo, pokud protein obsahuje dvě vazebná místa s vysokou afinitou ke , např. Raf-1, má spojení za následek změnu jeho konformace a tím pádem i funkce [3]. Jak nepřímo vyplývá z výše uvedeného, ke vzniku interakce musí být přítomen motiv o specifické struktuře nejen na , ale i na proteinu, který se s ním váže. Jelikož se jedná o velmi důležitou problematiku, bude jí věnována následující podkapitola Vazebné vlastnosti Homo i heterodimery proteinů interagují s řadou buněčných proteinů, jejichž počet se podle střízlivých odhadů pohybuje kolem dvou set [6], jiné zdroje mluví až o sedmi stech [4]. Jiné označení pro ně zní klientní proteiny. V antickém světě se klientem rozuměla osoba závislá na svém ochránci, zatímco v současném jazyce je jako klient 11
12 označován spíše někdo, kdo využívá služby jistého odborníka [9]. A přesně tyto dva významy vystihují vztah proteinů a jejich ligandů. V důsledku vazby na protein rodiny u klientního proteinu může dojít k aktivaci nebo represi jeho enzymové aktivity či funkce, zamezení jeho degradace či zabránění pohybu proteinu z cytoplazmy do jádra nebo naopak [4]. Vazebné motivy klientních proteinů Jak bylo objasněno výše, struktura vazebného místa je vysoce konzervativní, dokonce i mezi jednotlivými členy rodiny A proto musí ligandy obsahovat taktéž vysoce konzervativní vazebné motivy. Většina z nich je závislá na předchozí fosforylaci, avšak malé množství proteinů se může vázat na pomocí specifických sekvencí, které fosforylaci nevyžadují [4]. Motivy spojené s fosforylací K jejich odhalení došlo pomocí kinázy Raf [12]. Ukázalo se, že předchozí fosforylace proteinu je nepostradatelná pro jeho navázání na Muslin et al. poskytli důkaz o dvou vazebných motivech: RSXpSXP (modus 1) je podporovaný v pozici -1 aromatickými nebo kladně nabitými aminokyselinami RXXXpSXP (modus 2), u něhož nacházíme aromatické aminokyseliny v pozici -2, aminokyselinové zbytky s kladným nábojem v poloze -1 a Leu, Glu, Ala nebo Met v poloze +1 [15] V obou případech ps znamená fosfoserin [1], X značí aminokyselinu. Nově došlo k objevení C-koncového vazebného motivu SWTX (modus 3), známého u šesti vazebných proteinů; X znamená jakoukoli aminokyselinu kromě prolinu [14]. Mezi ligandy rodiny , které jsou závislé na fosforylaci, patří například [11]: o kinázy (Raf-1, kináza MEK, kináza P13) o receptory (receptor pro glukokortikoidy) o enzymy (tyrosin a tryptofan hydroxyláza, N-acetyltransferáza) o strukturní a cytoskeletální proteiny (vimentin a keratiny) o proteiny zapojené v regulaci buněčného cyklu (CDC25, p53, p27 a WEE1) o transkripční faktory (proteiny vážící se na TATA-box) 12
13 o proteiny navozující apoptózu (BAD) Motivy nezávislé na fosforylaci Ačkoli většina, minimálně více než polovina [14], proteinů využívá pro spojení se fosforylované sekvence, není tomu tak ve všech případech. Proteiny jsou schopné interakce i s nefosforylovanými ligandy a je více než pravděpodobné, že obě dvě skupiny využívají totéž vazebné místo na Napovídá tomu i fakt, že interakce s nefosforylovanými klientními proteiny neproběhne v přítomnosti fosforylovaných ligandů. Tato třída klientních proteinů využívá dva vazebné motivy [3]: RSESEE, který je podobný již zmiňovanému modu 1, tedy RSXpSXP RSX 1-3 E motiv objevený s využitím bakteriofágních proteinů Z proteinů, které se váží s nezávisle na fosforylaci, lze jmenovat například [10, 3]: o Exoenzym S o R18 o Raf-1, která obsahuje třetí, na fosforylaci nezávislé místo pro vazbu , velmi bohaté na Cys. Bývá proto označováno jako CRD (cysteine-rich domain) o GPIbα nacházející se v krevních destičkách o 5-fosfatáza Na první pohled by se mohlo zdát, že ligandy se sekvencí, jenž nevyžaduje fosforylaci, jsou znevýhodněné oproti silnější a početnější skupině. Není to však pravidlem, neboť vazba, kterou vytvoří, je velmi stabilní a vysokoafinitní, srovnatelná s vysokoafinitní u fosforylovaných proteinů, které ji však ne vždy musí vytvořit [3], jak bude vysvětleno dále. Síla interakce Nezávisle na potřebě fosforylace se zdá, že různá vazebná místa se na váží s různou silou či razancí a pokud je jich na proteinu víc, jejich účinek se násobí. Ligand se dvěma motivy se váže třicetkrát silněji než ten s jedním. U většiny proteinů najdeme jedno hlavní místo, které plní roli strážce nebo vrátného. Pokud chybí nebo není fosforylované, afinita druhotných vazebných míst k je příliš slabá na to, aby přerostla ve stabilní interakci. Na druhou stranu, když je dominantní místo fosforylované a spojí se s jedním z vazebných míst v molekule dimeru 13
14 14-3-3, druhotná místa jsou rovněž schopná interakce a dodávají celému komplexu mnohem vyšší stabilitu Význam a funkce V době svého objevu byly považovány za sice hojně rozšířené (tvoří 1% všech ve vodě rozpustných bílkovin v centrální nervové soustavě [3]), avšak funkčně nikterak důležité proteiny. Na své znovuobjevení si musela tato jedinečná rodina zhruba dvě desetiletí [15] počkat. První funkcí, připsanou těmto proteinům, byla aktivace tyrozinových a tryptofanových hydroláz, což jsou enzymy podílející se na syntéze serotoninu, katecholaminu, dopaminu a dalších neurotransmiterů. Následně se ukázalo, že regulují (konkrétně inhibují) aktivitu protein kinázy C a jsou schopny interakce s Brc. Od tohoto objevu byl již jen krůček ke zjištění, že tvoří komplexy s nepřeberným množstvím kináz, fosfatáz a dalších proteinů [12], které kontrolují například [2, 4, 12, 13]: průběh buněčného cyklu (CDC25) vnitrobuněčnou signalizaci (Raf-1) odpověď na stres a apoptózu (BAD, což je protein vázající se na Bcl-2) regulaci transkripce buněčný metabolismus integritu cytoskeletu Mimo to hrají díky svému přirozenému výskytu v savčím mozku roli při vzniku neurodegenerativních onemocnění jako je Creutzfeldt-Jakobova nemoc nebo Alzheimerova a Parkinsonova nemoc [12]. To staví do role velice důležitých buněčných regulátorů a mnohé způsoby jejich působení jistě ještě čekají na své odhalení. Následující kapitoly však budou pojednávat o úloze v oblasti vývoje nádorů. Na základě mnohých výzkumů má největší vliv při tomto procesu jejich zapojení v regulaci buněčného cyklu a apoptózy. Následně se více zaměříme na negativní stranu charakteru shrneme si jejich roli ve tvorbě nádorů, kdy se mohou chovat jako 14
15 možné onkogeny. Tento potenciál je dán schopností regulovat rozmanité produkty vzniklé transkripcí onkogenů stejně jako produkty genů, jenž vznik nádorů potlačují [14, 15]. V předposlední kapitole teoretické části se zastavíme u zcela výjimečného člena rodiny , a to u isoformy σ. Ze strukturních odlišností pochopíme důvody jeho jedinečné reaktivity, shrneme způsoby, jakými může být regulován a nakonec bude rozvinuta i jeho úloha v tumorigenezi, metastázování nádorů a ve spojitosti s nádorovými terapeutiky. 15
16 3.2 REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU V následujících dvou kapitolách rozebereme úlohu v průběhu života buňky i při její smrti: buněčný cyklus a apoptózu. Čtenář při tom bude mít možnost porozumět dvojsečnému charakteru ve vývoji a vzniku nádorů. Buněčný cyklus je uspořádaný sled událostí v životě eukaryotické buňky, od jejího vzniku dělením rodičovské buňky až do jejího vlastního rozdělení na dvě nové buňky. Skládá se z fází M, G 1, S a G 2 [30]. Zdárný průběh buněčného cyklu je velmi důležitý pro udržení integrity genomu. Proto se hned několik kontrolních mechanismů stará o to, aby buňka do další fáze cyklu vstoupila až po zkontrolování dokončení fáze předchozí [4]. V buňce proto nalézáme tzv. řídící soustavu buněčného cyklu. Občas bývá přirovnávána k programátoru automatické pračky. Stejně jako on pracuje i řídící soustava samovolně, poháněna zabudovaným časovačem. A stejně jako prací cyklus je i ten buněčný ovlivněn vnějšími (u pračky např. dodávka vody) i vnitřními (čidla hlídající, kdy se buben naplní vodou) zásahy. Buněčný cyklus lze takto ovlivnit ve třech místech, nazývaných jako kontrolní nebo též rozhodovací uzly. Nacházejí se v G 1, G 2 a M fázi [30]. Rodina proteinů je významně zapojena v G 2 a G 1 kontrolním uzlu buněčného cyklu [4]. Obr. č. 1: Řídící soustava buněčného cyklu na mechanickém modelu [30]. 16
17 3.2.1 Přechod z G 2 fáze do mitózy U dělící se buňky se střídá mitotická fáze s interfází, růstovým obdobím. Po první části interfáze (G 1 ) následuje S-fáze, kdy se zdvojují chromozomy. Závěrečná část interfáze se označuje G 2. V průběhu M-fáze dochází k rozdělení jádra na dvě dceřiná se stejnou genetickou informací [30]. Stěžejním regulačním krokem pro přechod G 2 /M je u eukaryot aktivace komplexu CDC2-cyklin B, který spouští vstup do mitózy a stal se proto díky této své funkci rovněž známý pod názvem faktor podporující M-fázi. Hlavním místem zásahu regulačních faktorů je v komplexu právě protein kináza CDC2. Aktivuje se defosforylací [3, 24]. Obr. č.2: Schématické působení v souvislosti s komplexem CDC2-cyklin B v G 2 /M kontrolním uzlu buněčného cyklu (nakresleno podle [4]). CDC25 Fosfatáza CDC25 je klíčový aktivátor kinázy CDC2. Není proto překvapením, že díky své důležitosti je silně regulována [3]. V následující části budou shrnuty hlavní regulátory, mezi nimiž mají výsadní postavení právě proteiny Proteiny Ovlivňují fosfatázu CDC25 dvěma způsoby. Jednak změnou funkce a jednak změnou lokalizace. Během interfáze, kdy je nežádoucí vstup do mitózy, je CDC25 deaktivována vazbou po předchozí fosforylaci. Pokud je neschopen vazby, dojde ke vstupu do mitózy i v případě poškození DNA. 17
18 Aby mohla CDC25 vykonávat svou funkci iniciátora mitózy, je potřebný vstup do jádra, kde se nachází CDC2. Interakce se velmi dobře koreluje s jejím umístěním v cytoplazmě, ačkoli mechanismus tohoto děje nebyl doposud spolehlivě objasněn. Vlastní interakce CDC rovněž podléhá regulaci. Kinázy jako Chk1, Chk2 nebo C-TAK1 specificky fosforylují v reakci na buněčné signály fosfatázu CDC25 na Ser216 [3, 4, 25]. Chk1 Po poškození DNA je aktivována Chk1 [11], která, jak už bylo zmíněno výše, fosforyluje CDC25. K její aktivaci je však potřebná i vazba [4], což znamená, že jsou jí nejen regulovány, ale vystupují rovněž jako její regulátory. WEE1 Tato kináza inaktivuje komplex CDC2-cyklin B fosforylací CDC2. Rovněž patří mezi regulační cíle Při společné expresi WEE1 a β roste účinnost WEE1 a tím i zabránění vstupu buňky do mitózy. Avšak isoforma τ má na WEE1 naprosto opačný účinek: pokud se na ni po předchozí fosforylaci naváže, deaktivuje WEE1 rozpadem v cytoplazmě. To umožňuje vstup do mitózy. Tyto poznatky nutně vedou k závěru, že jednotliví členové proteinové rodiny mají při regulaci buněčného cyklu odlišné funkce [4, 24]. Protein σ (Stratifin) Po poškození DNA se zvýší produkce σ. Jistou úlohu sehrává i BRCA1 ve spolupráci s p53. Stratifin inaktivuje CDC2 a zabraňuje tím vstupu buňky do mitózy [4]. Děje se tak změnou její lokalizace, protože σ znemožní vstup do jádra a tím pádem i zahájení mitotické fáze [3]. Buňky, kterým chybí σ, po poškození DNA ztrácí schopnost zastavit se v G 2 /M kontrolním bodu a začnou se nekontrolovatelně dělit [4]. Pokud bychom tedy měli shrnout funkci při přechodu z G 2 do M fáze buněčného cyklu, lze konstatovat, že po poškození DNA či jiných signálech zadržují buňku v G 2 fázi a brání jejímu dalšímu dělení. 18
19 3.2.2 Přechod z G 1 do S fáze Tento kontrolní uzel se zdá být pro většinu buněk nejdůležitějším. Jestliže v něm buňka obdrží signál, obvykle dokončí cyklus a rozdělí se. Jestliže v tomto bodu naopak spouštěcí signál neobdrží, přenese se do nedělícího se stavu, nazývaného G 0 fáze. V té se nachází většina buněk lidského těla [30]. Pro přechod G 1 /S je rozhodující přítomnost a aktivita CDK komplexů, analogů mitotického komplexu CDC2-cyklin B. Pro svoji důležitost jsou i ony vysoce regulovány různými molekulami, mezi nimiž jsou opět důležité V následujících podkapitolách budou uvedeny podrobnější informace o jednotlivých regulátorech CDK komplexů, které souvisejí se [4]. Obr. č. 3: Schématické působení v souvislosti s komplexem CDK-cyklin v G 1 /S kontrolním uzlu buněčného cyklu (nakresleno podle [4]). CDC25A Fosfatáza CDC25A zaujímá funkci ústředního regulátora v tomto kontrolním bodě buněčného cyklu. Defosforyluje CDK2 na Thr-14 a Thr-15 a tím jí umožňuje vykonat její úlohu. Proteiny ji inaktivují rozpadem v cytoplazmě σ Stratifin je v rámci své rodiny skutečně výjimečný, neboť jako jediný může interagovat přímo s kinázami CDK2 a 4. Výzkumy ukázaly, že σ zabránil inaktivací činnosti komplexu CDK-cyklin pokračování buněčného cyklu u buněk rakoviny prsu [4]. 19
20 p27 KIP1 Tento buněčný regulátor inaktivuje komplex CDK-cyklin a zapříčiňuje tím zastavení v G 1 fázi buněčného cyklu [4]. Plní tedy funkci nádorového supresoru a jeho hladina je snížena v mnoha typech lidských nádorů [2]. Jestli však p27 KIP1 bude skutečně působit jako inhibitor, závisí na jeho koncentraci, případné vazbě s dalšími komplexy a jeho lokalizaci. A právě umístění je regulováno fosforylačně-dependentní vazbou s proteiny rodiny Je k němu, jako ve většině případů, potřebná předchozí fosforylace, o níž se stará kináza zvaná AKT. Svou práci může vykonat na dvou odlišných threoninových zbytcích: Po fosforylaci na Thr-198 se p27 KIP1 váže s ε, η a τ ( nikoli však s β a ζ) a je zadržen v cytoplazmě. To znamená, že AKT tímto způsobem podporuje aktivaci CDK a pokračování v buněčném cyklu. Pokud proběhne fosforylace na Thr-157, vytvoří se vazebné místo pro β, ε, γ, τ, ζ (avšak nikoli pro σ) a dochází k přemístění p27 KIP1 v cytoplazmě a opět se tím otevírá cesta k pokračování v buněčném cyklu [4]. Jde tedy o v této skupině výjimečný případ, kdy nezastavily, ale pomohly spustit průběh buněčného cyklu FOXO Transkripční faktory FOXO (the forkhead box O) neovlivňují přímo aktivitu CDK ani CDC2 komplexů. Jejich vliv na průběh buněčného cyklu je však natolik významný, že je nelze opomenout. Jde o klíčové regulátory funkcí inzulinu a ostatních faktorů, které aktivuje níže zmíněná dráha PI-3K-AKT. Jsou zapojené v mnoha biologických procesech, jako je délka života buňky, buněčná smrt a buněčný cyklus [2]. Konkrétně v buněčném cyklu zprostředkovávají zastavení v G 1 fázi aktivací genu pro p27 KIP1, která probíhá přes jednu z isoforem Zároveň jsou zapletené do regulace přechodu z G 2 do M fáze buněčného cyklu. Zřejmě i v tomto případě jsou zapojené proteiny [4]. Znamená to tedy, že transkripční faktory FOXO patří mezi nádorové supresory a rodina jejich práci zdárně podporuje. 20
21 3.3. APOPTÓZA Apoptózou rozumíme konečné stádium geneticky řízeného děje, kdy geny, které jsou naprogramované k buněčné smrti, spustí na základě určitých podnětů kaskádu sebevražedných proteinů [30]. Fenomén programované buněčné smrti je běžným jevem u obratlovců i bezobratlých a poprvé byl pozorován v 50. letech 20. století. Sehrává důležitou úlohu v mnoha fyziologických pochodech, jako je například embryonální vývoj, homeostáza již diferenciovaných tkání nebo odstranění imunitních buněk, které reagují s vlastními strukturami a vyvolaly by tak vznik autoimunitního onemocnění. Selhání apoptózy je příčinou řady nemocí, mimo jiné i rakoviny [30]. Za normálních podmínek buňka osciluje v rovnováze mezi pro-apoptickými a antiapoptickými signály, které mohou být posunuty extracelulárními vlivy. Proteiny hrají důležitou roli v několika apoptických drahách [16]. Nejvýznamnější z nich jsou spojeny s rodinou Bcl-2, kterou se budeme nadále zabývat Rodina Bcl-2 Členové této rodiny jsou významnými regulačními proteiny v oblasti apoptózy indukované mnoha rozdílnými stimuly [27]. Lze je rozdělit na: o Proteiny pro-apoptické (BAD, BID, BAX, Bak, Bcl-x s ) o Proteiny anti-apoptické (Bcl-2, Bcl-X L, Bfl-1/A1, Mcl-1) Nejrozsáhleji studovanými proteiny, u kterých se navíc jako u jediných prokázala vazba se , jsou BAD a BAX [16]. BAX Za normálních okolností se BAX vždy nachází v cytoplazmě v neaktivním stavu. Po poškození DNA, pokud v buňce z nějakého důvodu chybí σ, se BAX přemístí do mitochondrie a do oblasti centrosomů a nutí buňku k rychlé apoptóze. Pokud je však σ přítomen, situace vypadá naprosto jinak. Interaguje s BAX a zadrží jej v cytoplazmě [11]. To buňce umožní neuposlechnout apoptické signály a existuje dále i s poškozenou DNA. 21
22 BAD BAD, stejně jako ostatní homology Bcl-2, je schopný dimerizovat s některými členy své vlastní proteinové rodiny. Má nespornou důležitost jako mediátor apoptózy hned ze dvou důvodů, kterými je vysoké rozšíření v lidských tkáních a koncentrace dynamicky regulovaná apoptickými stimuly [3]. BAD zapříčiňuje buněčnou smrt tím, že svou vazbou inaktivuje anti-apoptické proteiny Bcl-2 nebo Bcl-x. To se může změnit díky fosforylačně-dependentní vazbě Ta způsobí konformační změny BAD, které vyústí v jeho oddělení od Bcl-2 a Bcl-x. Vliv BAD, jenž by vedl k apoptóze, je tím potlačen. Na jednu stranu to buňce poskytuje více času na opravy DNA, na druhou stranu se může začít nekontrolovatelně dělit a v případě nerozeznání imunitním systémem se změnit v nádor [11]. Lze si tedy povšimnout skutečně dvojí tváře proteinů : na jednu stranu figurují jako ochránci v kontrolních uzlech buněčného cyklu, kdy svými regulačními mechanismy nepustí do další fáze buňku s poškozenou DNA. Navíc působí synergisticky s proteinem p53 [4]. Na druhou stranu umožňují svým anti-apoptickým působením buňce nepodlehnout signálu, který ji nutí spáchat sebevraždu. To jim propůjčuje masku potenciálních onkogenů. Protože však nejde o jediný případ takovéhoto jejich chování, bude čtvrtá část shrnutí vlastností proteinů věnována právě případům, kdy svým regulačním působením podporují tumorigenezi. 22
23 3.4 POTENCIÁLNÍ ONKOGENY Jak jsme si ukázali v kapitole 3.1.4, proteiny mají schopnost vázat a regulovat veliké množství klientních proteinů. Mezi nimi také produkty onkogenů stejně jako produkty genů potlačujících vnik a rozvoj nádorů. Oprávněně proto zaznívají úvahy, že se podílejí na karcinogenezi [2]. Na druhou stranu je nutno podotknout, že se zatím nezískaly žádné důkazy o přímé roli ve vzniku rakoviny [11]. Výjimku tvoří pouze σ, který bude rozvinut v příští kapitole Ras-Raf-MAPK Raf-1 je kináza regulována extracelulárními signály. Lze se s ní rovněž setkat pod názvem MAP (mitogen-activated protein). MAPK signální kaskáda kontroluje buněčný růst, dělení a přežití. Je rozdělena do mnoha kroků o ještě větším množství substrátů [11] mohou regulovat Raf dvojím způsobem: V G 0 buňkách, které nedostávají žádný singál zvenčí, udržují Raf kinázu v neaktivním stavu tím, že stabilizují její konformaci (děje se tak vazbou přes konkrétní serinový zbytek). Pokud je však přijat vnější signál, podporují aktivaci Raf a stabilizují její aktivní konformaci (opět díky vazbě na serinový zbytek). Aktivovaná Raf se naváže na Ras a aktivuje MAPK signální dráhu [2, 3]. Na Raf lze dobře vysledovat protichůdné působení Mohou totiž buněčný růst jak potlačit inhibicí Raf, tak i navodit tím, že umožní její aktivaci. Ačkoli mutace Raf nejsou přímo spojené s výskytem rakoviny, je funkce této kinázy potřebná pro růst rakovinných buněk indukovaný změnami v hladinách růstových faktorů a nebo mutacemi v genu Ras [2]. A protože se na její aktivaci přímo podílí, mají zde funkci potenciálních onkogenů Bcr-Abl Jde o protein vytvořený z produktu genu BCR a Abl tyrosin kinázy. Přestože se jedná o jeden z prvních objevených klientních proteinů , přesný způsob regulace zůstává 23
IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek
IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod: detekce přímo v buňkách - fluorescenční barvení
VíceWestern blotting. 10% APS 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl
Western blotting 1. Příprava gelu složení aparatury hustotu gelu volit podle velikosti proteinů příprava rozdělovacího gelu: 10% 12% počet gelů 1 2 4 1 2 4 objem 6 ml 12 ml 24 ml 6 ml 12 ml 24 ml 40% akrylamid
VíceInovace studia molekulární a buněčné biologie
Inovace studia molekulární a buněčné biologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. MBIO1/Molekulární biologie 1 Tento projekt je spolufinancován
VíceCo nás učí nádory? Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav patologie FN Brno Přírodovědecká a Lékařská fakulta MU Brno
Co nás učí nádory? Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav patologie FN Brno Přírodovědecká a Lékařská fakulta MU Brno Brno, 17.5.2011 Izidor (Easy Door) Osnova přednášky 1. Proč nás rakovina tolik zajímá?
VíceVÝZNAM REGULACE APOPTÓZY V MEDICÍNĚ
REGULACE APOPTÓZY 1 VÝZNAM REGULACE APOPTÓZY V MEDICÍNĚ Příklad: Regulace apoptózy: protein p53 je klíčová molekula regulace buněčného cyklu a regulace apoptózy Onemocnění: více než polovina (70-75%) nádorů
VíceBUŇEČNÝ CYKLUS A JEHO KONTROLA
BUŇEČNÝ CYKLUS A JEHO KONTROLA MITOSA - fáze: Profáze - kondensace chromosomů - 30 nm chromatine fibres vázané na matrix Rozpad Metafáze - párové ( sesterské ) chromatidy - vázané centromerou, seřazené
VíceApoptóza Onkogeny. Srbová Martina
Apoptóza Onkogeny Srbová Martina Buněčný cyklus Regulace buněčného cyklu 1. Cyklin-dependentní kináza (Cdk) cyclin Regulace buněčného cyklu 2. Retinoblastomový protein (prb) E2F Regulace buněčného cyklu
VíceBuněčný cyklus. Replikace DNA a dělení buňky
Buněčný cyklus Replikace DNA a dělení buňky 2 Regulace buněčného dělení buněčný cyklus: buněčné dělení buněčný růst kontrola kvality potomstva (dceřinných buněk) bránípřenosu nekompletně zreplikovaných
VíceStruktura a funkce biomakromolekul
Struktura a funkce biomakromolekul KBC/BPOL 10. Struktury signálních komplexů Ivo Frébort Typy hormonů Steroidní hormony deriváty cholesterolu, regulují metabolismus, osmotickou rovnováhu, sexuální funkce
VíceImunochemické metody. na principu vazby antigenu a protilátky
Imunochemické metody na principu vazby antigenu a protilátky ANTIGEN (Ag) specifická látka (struktura) vyvolávající imunitní reakci a schopná vazby na protilátku PROTILÁTKA (Ab antibody) molekula bílkoviny
VíceSDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE)
SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) Princip SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza slouží k separaci proteinů na základě jejich velikosti (molekulové hmotnosti). Zahřátím vzorku za
VíceStruktura a funkce biomakromolekul
Struktura a funkce biomakromolekul KBC/BPOL 7. Interakce DNA/RNA - protein Ivo Frébort Interakce DNA/RNA - proteiny v buňce Základní dogma molekulární biologie Replikace DNA v E. coli DNA polymerasa a
VíceVýukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996
Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996 Šablona: III/2 č. materiálu: VY_32_INOVACE_CHE_413 Jméno autora: Mgr. Alena Krejčíková Třída/ročník:
VíceStruktura proteinů. - testík na procvičení. Vladimíra Kvasnicová
Struktura proteinů - testík na procvičení Vladimíra Kvasnicová Mezi proteinogenní aminokyseliny patří a) kyselina asparagová b) kyselina glutarová c) kyselina acetoctová d) kyselina glutamová Mezi proteinogenní
VíceVÝZNAM FUNKCE PROTEINŮ V MEDICÍNĚ
FUNKCE PROTEINŮ 1 VÝZNAM FUNKCE PROTEINŮ V MEDICÍNĚ Příklad: protein: dystrofin onemocnění: Duchenneova svalová dystrofie 2 3 4 FUNKCE PROTEINŮ: 1. Vztah struktury a funkce proteinů 2. Rodiny proteinů
Více7. Regulace genové exprese, diferenciace buněk a epigenetika
7. Regulace genové exprese, diferenciace buněk a epigenetika Aby mohl mnohobuněčný organismus efektivně fungovat, je třeba, aby se jednotlivé buňky specializovaly na určité funkce. Nový jedinec přitom
VíceBuněčný cyklus a molekulární mechanismy onkogeneze
Buněčný cyklus a molekulární mechanismy onkogeneze Imunofluorescence DAPI Přehled regulace buněčného cyklu Základní terminologie: Cycliny evolučně konzervované proteiny s homologními oblastmi; jejich
VíceMetabolismus bílkovin. Václav Pelouch
ZÁKLADY OBECNÉ A KLINICKÉ BIOCHEMIE 2004 Metabolismus bílkovin Václav Pelouch kapitola ve skriptech - 3.2 Výživa Vyvážená strava člověka musí obsahovat: cukry (50 55 %) tuky (30 %) bílkoviny (15 20 %)
VíceMETODY STUDIA PROTEINŮ
METODY STUDIA PROTEINŮ Mgr. Vlasta Němcová vlasta.furstova@tiscali.cz OBSAH PŘEDNÁŠKY 1) Stanovení koncentrace proteinu 2) Stanovení AMK sekvence proteinu Hmotnostní spektrometrie Edmanovo odbourávání
VíceBiologie buňky. systém schopný udržovat se a rozmnožovat
Biologie buňky 1665 - Robert Hook (korek, cellulae = buňka) Cytologie - věda zabývající se studiem buňek Buňka ozákladní funkční a stavební jednotka živých organismů onejmenší známý uspořádaný dynamický
VíceEvropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY
Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY ELEKTROFORÉZA K čemu to je? kritérium čistoty preparátu stanovení molekulové hmotnosti makromolekul stanovení izoelektrického
VíceS filtračními papíry a membránou je nutno manipulovat pinzetou s tupým koncem.
Western Blotting Příprava blotovacího sendviče... 1 Blotování... 2 Kontrola přenesení proteinů na membránu... 2 Blokování membrány... 2 Aplikace protilátek... 2 Vizualizace... 3 Vyvolání filmu... 4 Chemikálie
VíceGymnázium a Střední odborná škola, Rokycany, Mládežníků 1115
Gymnázium a Střední odborná škola, Rokycany, Mládežníků 1115 Číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0410 Číslo šablony: V/2 - inovace směřující k rozvoji odborných kompetencí Název materiálu: Buněčný cyklus
VícePROTOKOL WESTERN BLOT
WESTERN BLOT 1. PŘÍPRAVA ELEKTROFORETICKÉ APARATURY Saponátem a vodou se důkladně umyjí skla, plastové vložky a hřebínek, poté se důkladně opláchnou deionizovanou/destilovanou vodou a etanolem a nechají
VíceV organismu se bílkoviny nedají nahradit žádnými jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy.
BÍLKOVINY Bílkoviny jsou biomakromolekulární látky, které se skládají z velkého počtu aminokyselinových zbytků. Vytvářejí látkový základ života všech organismů. V tkáních vyšších organismů a člověka je
VíceZáklady molekulární biologie KBC/MBIOZ
Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Mária Čudejková 2. Transkripce genu a její regulace Transkripce genetické informace z DNA na RNA Transkripce dvou genů zachycená na snímku z elektronového mikroskopu.
VíceProteiny Genová exprese. 2013 Doc. MVDr. Eva Bártová, Ph.D.
Proteiny Genová exprese 2013 Doc. MVDr. Eva Bártová, Ph.D. Bílkoviny (proteiny), 15% 1g = 17 kj Monomer = aminokyseliny aminová skupina karboxylová skupina α -uhlík postranní řetězec Znát obecný vzorec
VíceRegulace metabolických drah na úrovni buňky
Regulace metabolických drah na úrovni buňky EB Obsah přednášky Obecné principy regulace metabolických drah na úrovni buňky regulace zajištěná kompartmentací metabolických dějů změna absolutní koncentrace
VíceToxikologie PřF UK, ZS 2016/ Toxikodynamika I.
Toxikodynamika toxikodynamika (řec. δίνευω = pohánět, točit) interakce xenobiotika s cílovým místem (buňkou, receptorem) biologická odpověď jak xenobiotikum působí na organismus toxický účinek nespecifický
VíceMechanismy hormonální regulace metabolismu. Vladimíra Kvasnicová
Mechanismy hormonální regulace metabolismu Vladimíra Kvasnicová Osnova semináře 1. Obecný mechanismus působení hormonů (opakování) 2. Příklady mechanismů účinku vybraných hormonů na energetický metabolismus
VíceBunka a bunecné interakce v patogeneze tkánového poškození
Bunka a bunecné interakce v patogeneze tkánového poškození bunka - stejná genetická výbava - funkce (proliferace, produkce látek atd.) závisí na diferenciaci diferenciace tkán - specializovaná produkce
VíceAminokyseliny, proteiny, enzymy Základy lékařské chemie a biochemie 2014/2015 Ing. Jarmila Krotká Metabolismus základní projev života látková přeměna souhrn veškerých dějů, které probíhají uvnitř organismu
VíceBílkoviny - proteiny
Bílkoviny - proteiny Proteiny jsou složeny z 20 kódovaných aminokyselin L-enantiomery Chemická struktura aminokyselin R představuje jeden z 20 různých typů postranních řetězců R Hlavní řetězec je neměnný
Více"Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT ". Základy genetiky, základní pojmy
"Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT ". Základy genetiky, základní pojmy 1/75 Genetika = věda o dědičnosti Studuje biologickou informaci. Organizmy uchovávají,
VíceHemoglobin a jemu podobní... Studijní materiál. Jan Komárek
Hemoglobin a jemu podobní... Studijní materiál Jan Komárek Bioinformatika Bioinformatika je vědní disciplína, která se zabývá metodami pro shromážďování, analýzu a vizualizaci rozsáhlých souborů biologických
VíceDUM č. 11 v sadě. 37. Bi-2 Cytologie, molekulární biologie a genetika
projekt GML Brno Docens DUM č. 11 v sadě 37. Bi-2 Cytologie, molekulární biologie a genetika Autor: Martin Krejčí Datum: 30.06.2014 Ročník: 6AF, 6BF Anotace DUMu: Princip genové exprese, intenzita překladu
VíceInterakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk
MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk
VíceOPVK CZ.1.07/2.2.00/
OPVK CZ.1.07/2.2.00/28.0184 Základní principy vývoje nových léčiv OCH/ZPVNL Mgr. Radim Nencka, Ph.D. ZS 2012/2013 První kroky k objevu léčiva Nobelova cena za chemii 2013 Martin Karplus Michael Levitt
VíceTranslace (druhý krok genové exprese)
Translace (druhý krok genové exprese) Od RN k proteinu Milada Roštejnská Helena Klímová 1 enetický kód trn minoacyl-trn-synthetasa Translace probíhá na ribosomech Iniciace translace Elongace translace
VíceObsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování
Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování Protein Gel Electrophoresis Kit obsahuje veškerý potřebný materiál provádění vertikální polyakrilamidové gelové elektroforézy. Experiment provádějí
VíceSpecifická imunitní odpověd. Veřejné zdravotnictví
Specifická imunitní odpověd Veřejné zdravotnictví MHC molekuly glykoproteiny exprimovány na všech jaderných buňkách (MHC I) nebo jenom na antigen prezentujících buňkách (MHC II) u lidí označovány jako
VíceINTRACELULÁRNÍ SIGNALIZACE II
INTRACELULÁRNÍ SIGNALIZACE II 1 VÝZNAM INTRACELULÁRNÍ SIGNALIZACE V MEDICÍNĚ Příklad: Intracelulární signalizace: aktivace Ras proteinu (aktivace receptorové kinázy aktivace Ras aktivace kinázové kaskády
VíceMetody testování humorální imunity
Metody testování humorální imunity Co je to humorální imunita? Humorální = látková Buněčné produkty Nespecifická imunita příklady:» Lysozym v slinách, slzách» Sérové proteiny (proteiny akutní fáze)» Komplementový
Víceve srovnání s eukaryoty (životnost v řádu hodin) u prokaryot kratší (životnost v řádu minut) na životnost / stabilitu molekuly mají vliv
Urbanová Anna ve srovnání s eukaryoty (životnost v řádu hodin) u prokaryot kratší (životnost v řádu minut) na životnost / stabilitu molekuly mají vliv strukturní rysy mrna proces degradace každá mrna v
VíceTypy molekul, látek a jejich vazeb v organismech
Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech Typy molekul, látek a jejich vazeb v organismech Organismy se skládají z molekul rozličných látek Jednotlivé látky si organismus vytváří sám z jiných látek,
VíceSDS-PAGE elektroforéza
SDS-PAGE elektroforéza Příprava gelu... 1 Recept na 0.75 mm gel (1 gel/2 gely)... 2 Recept na 1.5 mm gel (1 gel/2 gely)... 2 Příprava vzorku... 3 Elektroforéza... 3 Barvení gelů Blue Silver... 4 Chemikálie
VíceLékařská chemie a biochemie modelový vstupní test ke zkoušce
Lékařská chemie a biochemie modelový vstupní test ke zkoušce 1. Máte pufr připravený smísením 150 ml CH3COOH o c = 0,2 mol/l a 100 ml CH3COONa o c = 0,25 mol/l. Jaké bude ph pufru, pokud přidáme 10 ml
VíceExprese genetické informace
Exprese genetické informace Tok genetické informace DNA RNA Protein (výjimečně RNA DNA) DNA RNA : transkripce RNA protein : translace Gen jednotka dědičnosti sekvence DNA nutná k produkci funkčního produktu
VíceNUKLEOVÉ KYSELINY. Základ života
NUKLEOVÉ KYSELINY Základ života HISTORIE 1. H. Braconnot (30. léta 19. století) - Strassburg vinné kvasinky izolace matiére animale. 2. J.F. Meischer - experimenty z hnisem štěpení trypsinem odstředěním
VícePROTEINY. Biochemický ústav LF MU (H.P.)
PROTEINY Biochemický ústav LF MU 2013 - (H.P.) 1 proteiny peptidy aminokyseliny 2 Aminokyseliny 3 Charakteristika základní stavební jednotky proteinů geneticky kódované 20 základních aminokyselin 4 a-aminokyselina
VíceBUNĚČNÁ TRANSFORMACE A NÁDOROVÉ BUŇKY
BUNĚČNÁ TRANSFORMACE A NÁDOROVÉ BUŇKY 1 VÝZNAM BUNĚČNÉ TRANSFORMACE V MEDICÍNĚ Příklad: Buněčná transformace: postupná kumulace genetických změn Nádorové onemocnění: kolorektální karcinom 2 3 BUNĚČNÁ TRANSFORMACE
VíceIntracelulární detekce Foxp3
Intracelulární detekce Foxp3 Ústav imunologie 2.LFUK a FN Motol Daniela Rožková, Jan Laštovička T regulační lymfocyty (Treg) Jsou definovány funkčně svou schopností potlačovat aktivaci a proliferaci CD4+
VíceWESTERN BLOT. Velikost signálu je vyhodnocována srovnáním s naneseným proteinovým markerem, což je komerčně dostupná směs proteinů o známé velikosti.
WESTERN BLOT Western blot je metoda používaná pro kvalitativní nebo semikvantitativní detekci určitého proteinu ve vzorku. Metoda je tvořena třemi základními kroky: 1. elektroforetickou separací proteinů,
VíceAntiparalelní beta list
Antiparalelní beta list Paralelní beta list Schematický model beta listu (stužkový) Proteiny obsahují zpětné kličky (beta kličky nebo vlásenkové ohyby). Obvykle je CO skupina i-té aminokyseliny vázána
VíceRegulace enzymové aktivity
Regulace enzymové aktivity MUDR. MARTIN VEJRAŽKA, PHD. Regulace enzymové aktivity Organismus NENÍ rovnovážná soustava Rovnováha = smrt Život: homeostáza, ustálený stav Katalýza v uzavřené soustavě bez
VíceÚloha protein-nekódujících transkriptů ve virulenci patogenních bakterií
Téma bakalářské práce: Úloha protein-nekódujících transkriptů ve virulenci patogenních bakterií Nové odvětví molekulární biologie se zabývá RNA molekulami, které se nepřekládají do proteinů, ale slouží
VíceBÍLKOVINY. V organismu se nedají nahradit jinými sloučeninami, jen jako zdroj energie je mohou nahradit sacharidy a lipidy.
BÍLKOVINY o makromolekulární látky, z velkého počtu AMK zbytků o základ všech organismů o rostliny je vytvářejí z anorganických sloučenin (dusičnanů) o živočichové je musejí přijímat v potravě, v trávicím
VíceMolekulární mechanismy diferenciace a programované buněčné smrti - vztah k patologickým procesům buněk. Aleš Hampl
Molekulární mechanismy diferenciace a programované buněčné smrti - vztah k patologickým procesům buněk Aleš Hampl Tkáně Orgány Živé buňky, které plní různé funkce (podpora struktury, přijímání živin, lokomoce,
VíceBuněčné dělení ŘÍZENÍ BUNĚČNÉHO CYKLU
BUNĚČNÝ CYKLUS Buněčné dělení Cykliny a na cyklinech závislé proteinkinázy (Cyclin- Dependent Protein Kinases; Cdk-proteinkinázy) - proteiny, které jsou součástí řídícího systému buněčného cyklu 8 cyklinů
VíceIV117: Úvod do systémové biologie
IV117: Úvod do systémové biologie David Šafránek 3.12.2008 Obsah Obsah Robustnost chemotaxe opakování model chemotaxe bakterií nerozliseny stavy aktivity represoru aktivita = ligandy a konc. represoru
VíceMetody práce s proteinovými komplexy
Metody práce s proteinovými komplexy Zora Nováková, Zdeněk Hodný Proteinové komplexy tvořeny dvěma a více proteiny spojenými nekovalentními vazbami Van der Waalsovy síly vodíkové můstky hydrofobní interakce
Vícelaktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin
Aktivita KA 2340/4-8up Stanovení bílkovin v mléce pomocí SDS PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s přídavkem dodecyl sulfátu sodného) vypracovala: MVDr. Michaela Králová, Ph.D. Princip: Metoda
VíceStanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů
Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Bioanalytické metody Prof. RNDr. Pavel Peč, CSc. Úvod Kritéria výběru metod stanovení koncentrace proteinů jsou založena na možnostech pro vlastní analýzu,
VíceProtokoly Transformace plasmidu do elektrokompetentních buněk BL21 Pracovní postup:
Protokoly Pracovní potřeby, pufry a chemikálie jsou uvedeny na konci protokolu. Pracovní postupy jsou odvozeny od těchto kitů: Champion pet160 Directional TOPO Expression Kit with Lumio Technology (Invitrogen)
VíceIMUNOGENETIKA I. Imunologie. nauka o obraných schopnostech organismu. imunitní systém heterogenní populace buněk lymfatické tkáně lymfatické orgány
IMUNOGENETIKA I Imunologie nauka o obraných schopnostech organismu imunitní systém heterogenní populace buněk lymfatické tkáně lymfatické orgány lymfatická tkáň thymus Imunita reakce organismu proti cizorodým
VíceOpakování
Slabé vazebné interakce Opakování Co je to atom? Opakování Opakování Co je to atom? Atom je nejmenší částice hmoty, chemicky dále nedělitelná. Skládá se z atomového jádra obsahujícího protony a neutrony
Více5. Příjem, asimilace a fyziologické dopady anorganického dusíku. 5. Příjem, asimilace a fyziologické dopady anorganického dusíku
5. Příjem, asimilace a fyziologické dopady anorganického dusíku Zdroje dusíku dostupné v půdě: Amonné ionty + Dusičnany = největší zdroj dusíku v půdě Organický dusík (aminokyseliny, aminy, ureidy) zpracování
VíceVĚDA A VÝZKUM V PERIOPERAČNÍ PÉČI. Mgr. Markéta Jašková Dana Svobodová Gynekologicko-porodnická klinika Fakultní nemocnice Ostrava
VĚDA A VÝZKUM V PERIOPERAČNÍ PÉČI Mgr. Markéta Jašková Dana Svobodová Gynekologicko-porodnická klinika Fakultní nemocnice Ostrava VĚDA A VÝZKUM NA GOS Detekce mutace genu BRCA1 a BRCA2, a to přímo z nádorové
Více2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné:
Výběrové otázky: 1. Součástí všech prokaryotických buněk je: a) DNA, plazmidy b) plazmidy, mitochondrie c) plazmidy, ribozomy d) mitochondrie, endoplazmatické retikulum 2. Z následujících tvrzení, týkajících
VíceMonitorování hladiny metalothioneinu a thiolových sloučenin u biologických organismů vystavených působení kovových prvků a sloučenin
Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Monitorování hladiny metalothioneinu a thiolových sloučenin u biologických organismů vystavených působení kovových prvků a sloučenin Ing. Kateřina Tmejová, Ph. D.,
VícePREZENTACE ANTIGENU A REGULACE NA ÚROVNI Th (A DALŠÍCH) LYMFOCYTŮ PREZENTACE ANTIGENU
PREZENTACE ANTIGENU A REGULACE NA ÚROVNI Th (A DALŠÍCH) LYMFOCYTŮ PREZENTACE ANTIGENU Podstata prezentace antigenu (MHC restrikce) byla objevena v roce 1974 V současnosti je zřejmé, že to je jeden z klíčových
VíceEvropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY BÍLKOVIN
Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti URČOVÁNÍ PRIMÁRNÍ STRUKTURY BÍLKOVIN Primární struktura primární struktura bílkoviny je dána pořadím AK jejích polypeptidových řetězců
VíceMutace s dobrou prognózou, mutace se špatnou prognózou omezené možnosti biologické léčby pro onkologické pacienty
Mutace s dobrou prognózou, mutace se špatnou prognózou omezené možnosti biologické léčby pro onkologické pacienty J.Berkovcová, M.Dziechciarková, M.Staňková, A.Janošťáková, D.Dvořáková, M.Hajdúch Laboratoř
VíceMgr. Veronika Peňásová vpenasova@fnbrno.cz Laboratoř molekulární diagnostiky, OLG FN Brno Klinika dětské onkologie, FN Brno
Retinoblastom Mgr. Veronika Peňásová vpenasova@fnbrno.cz Laboratoř molekulární diagnostiky, OLG FN Brno Klinika dětské onkologie, FN Brno Retinoblastom (RBL) zhoubný nádor oka, pocházející z primitivních
VíceAminokyseliny příručka pro učitele. Obecné informace: Téma otevírá kapitolu Bílkoviny, která svým rozsahem překračuje rámec jedné vyučovací hodiny.
Obecné informace: Aminokyseliny příručka pro učitele Téma otevírá kapitolu Bílkoviny, která svým rozsahem překračuje rámec jedné vyučovací hodiny. Navazující učivo Před probráním tématu Aminokyseliny probereme
VíceGenomické databáze. Shlukování proteinových sekvencí. Ivana Rudolfová. školitel: doc. Ing. Jaroslav Zendulka, CSc.
Genomické databáze Shlukování proteinových sekvencí Ivana Rudolfová školitel: doc. Ing. Jaroslav Zendulka, CSc. Obsah Proteiny Zdroje dat Predikce struktury proteinů Cíle disertační práce Vstupní data
VíceTestové úlohy aminokyseliny, proteiny. post test
Testové úlohy aminokyseliny, proteiny post test 1. Které aminokyseliny byste hledali na povrchu proteinů umístěných uvnitř fosfolipidových membrán a které na povrchu proteinů vyskytujících se ve vodném
VíceProtinádorová imunita. Jiří Jelínek
Protinádorová imunita Jiří Jelínek Imunitní systém vs. nádor l imunitní systém je poslední přirozený nástroj organismu jak eliminovat vlastní buňky které se vymkly kontrole l do boje proti nádorovým buňkám
Více1. Napište strukturní vzorce aminokyselin D a Y a vzorce adenosinu a thyminu
Test pro přijímací řízení magisterské studium Biochemie 2019 1. Napište strukturní vzorce aminokyselin D a Y a vzorce adenosinu a thyminu U dalších otázek zakroužkujte správné tvrzení (pouze jedna správná
VíceIMUNOCYTOCHEMICKÁ METODA JEJÍ PRINCIP A VYUŽITÍ V LABORATOŘI
IMUNOCYTOCHEMICKÁ METODA JEJÍ PRINCIP A VYUŽITÍ V LABORATOŘI Radka Závodská, PedF JU v Českých Budějovicích Imunocytochemická metoda - použítí protilátky k detekci antigenu v buňkách (Imunohistochemie-
VíceHybridizace nukleových kyselin
Hybridizace nukleových kyselin Tvorba dvouřetězcových hybridů za dvou jednořetězcových a komplementárních molekul Založena na schopnosti denaturace a renaturace DNA. Denaturace DNA oddělení komplementárních
VíceIMUNOANALÝZA elektroforetické separační metody. 3. ročník Klinická biologie a chemie
IMUNOANALÝZA elektroforetické separační metody 3. ročník Klinická biologie a chemie Princip elektroforézy I. Separační metoda využívající různé pohyblivosti různých iontů (složek směsi) ve stejnosměrném
VíceHumorální imunita. Nespecifické složky M. Průcha
Humorální imunita Nespecifické složky M. Průcha Humorální imunita Výkonné složky součásti séra Komplement Proteiny akutní fáze (RAF) Vztah k zánětu rozdílná funkce zánětu Zánět jako fyziologický kompenzační
VíceRECEPTORY CYTOKINŮ A PŘENOS SIGNÁLU. Jana Novotná
RECEPTORY CYTOKINŮ A PŘENOS SIGNÁLU Jana Novotná Co jsou to cytokiny? Skupina proteinů a peptidů (glykopeptidů( glykopeptidů), vylučovaných živočišnými buňkami a ovlivňujících buněčný růst (též růstové
VíceBílkoviny a rostlinná buňka
Bílkoviny a rostlinná buňka Bílkoviny Rostliny --- kontinuální diferenciace vytváření orgánů: - mitotická dělení -zvětšování buněk a tvorba buněčné stěny syntéza bílkovin --- fotosyntéza syntéza bílkovin
VíceVýzkumný ústav veterinárního lékařství v Brně
LIPIDY: FUNKCE, IZOLACE, SEPARACE, DETEKCE FOSFOLIPIDY chemické složení a funkce v buněčných membránách; metody stanovení fosfolipidů fosfolipázy - produkty reakcí (ceramid, DAG = 2nd messengers) a stanovení
Více8 cyklinů (A, B, C, D, E, F, G a H) - v jednotlivých fázích buněčného cyklu jsou přítomny určité typy cyklinů
Buněč ěčné dělení BUNĚČ ĚČNÝ CYKLUS ŘÍZENÍ BUNĚČ ĚČNÉHO CYKLU cykliny a na cyklinech závislé proteinkinázy (Cyclin-Dependent Protein Kinases; Cdk-proteinkinázy) - proteiny, které jsou součástí řídícího
Více44 somatických chromozomů pohlavní hormony (X,Y) 46 chromozomů
Buněčný cyklus MUDr.Kateřina Kapounková Inovace studijního oboru Regenerace a výţiva ve sportu (CZ.107/2.2.00/15.0209) 1 DNA,geny genom = soubor všech genů a všechna DNA buňky; kompletní genetický materiál
Vícetky proti annexinu V Protilátky u trombofilních stavů u opakovaných těhotenských ztrát 2003 By Default! Slide 1
Slide 1 Protilátky tky proti annexinu V u systémových onemocnění pojiva u trombofilních stavů u opakovaných těhotenských ztrát VFN 24.4.2007 Slide 2 ANNEXINY Annexiny jsou proteiny, společnou vlastností
VíceONKOGENETIKA. Spojuje: - lékařskou genetiku. - buněčnou biologii. - molekulární biologii. - cytogenetiku. - virologii
ONKOGENETIKA Spojuje: - lékařskou genetiku - buněčnou biologii - molekulární biologii - cytogenetiku - virologii Důležitost spolupráce různých specialistů při detekci hereditárních forem nádorů - (onkologů,internistů,chirurgů,kožních
VíceIMUNOFLUORESCENCE. Mgr. Petr Bejdák Ústav klinické imunologie a alergologie Fakultní nemocnice u sv. Anny a Lékařská fakulta MU
Mgr. Petr Bejdák Ústav klinické imunologie a alergologie Fakultní nemocnice u sv. Anny a Lékařská fakulta MU Luminiscence jev, při kterém látka emituje záření po absorpci excitačního záření (fotoluminiscence)
Více8. Polysacharidy, glykoproteiny a proteoglykany
Struktura a funkce biomakromolekul KBC/BPOL 8. Polysacharidy, glykoproteiny a proteoglykany Ivo Frébort Polysacharidy Funkce: uchovávání energie, struktura, rozpoznání a signalizace Homopolysacharidy a
VícePřírodní polymery proteiny
Přírodní polymery proteiny Funkční úloha bílkovin 1. Funkce dynamická transport kontrola metabolismu interakce (komunikace, kontrakce) katalýza chemických přeměn 2. Funkce strukturální architektura orgánů
VíceKOMBINACE PEPTIDŮ BRÁNÍCÍCH STÁRNUTÍ
KOMBINACE PEPTIDŮ BRÁNÍCÍCH STÁRNUTÍ GMP PEPTIDY PRO KOSMETICKÉ PŘÍPRAVKY NOVÁ SYNTETICKÁ SLOŽKA KOSMETICKÝCH PŘÍPRAVKŮ PŘEHLED Výzkum základních biochemických mechanismů působení proti vráskám vedl k
VíceBIOLOGICKÁ MEMBRÁNA Prokaryontní Eukaryontní KOMPARTMENTŮ
BIOMEMRÁNA BIOLOGICKÁ MEMBRÁNA - všechny buňky na povrchu plazmatickou membránu - Prokaryontní buňky (viry, bakterie, sinice) - Eukaryontní buňky vnitřní členění do soustavy membrán KOMPARTMENTŮ - za
VíceEPIGENETIKA reverzibilních změn funkce genů, Epigenetické faktory ovlivňují fenotyp bez změny genotypu. Epigenetická
EPIGENETIKA Epigenetika se zabývá studiem reverzibilních změn funkce genů, aniž by při tom došlo ke změnám v sekvenci jaderné DNA. Epigenetické faktory ovlivňují fenotyp bez změny genotypu. Epigenetická
VíceVýukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996
Výukový materiál zpracován v rámci projektu EU peníze školám Registrační číslo projektu: CZ.1.07/1.5.00/34.0996 Šablona: III/2 č. materiálu: VY_32_INOVACE_CHE_419 Jméno autora: Třída/ročník: Mgr. Alena
VíceSLEDOVÁNÍ VZTAHU MEZI OBSAHEM ENZYMU RUBISCO A KONCENTRACÍ CO 2 V CHLOROPLASTU
SLEDOVÁNÍ VZTAHU MEZI OBSAHEM ENZYMU RUBISCO A KONCENTRACÍ CO 2 V CHLOROPLASTU Nikola Burianová Experimentální biologie 2.ročník navazujícího studia Katedra Fyziky Ostravská univerzita v Ostravě OBSAH
VíceFluorescence (luminiscence)
Fluorescence (luminiscence) Patří mezi luminiscenční metody fotoluminiscence. Luminiscence efekt, kdy excitované molekuly či atomy vyzařují světlo při přechodu z excitovaného do základního stavu. Podle
VíceVýroba normálních a abnormálně dlouhých huntingtinů je řízena odlišným způsobem. Našli jsme novou cestu, jak udržet buňky při HCH zdravé?
Novinky ve výzkumu Huntingtonovy nemoci. Ve srozumitelném jazyce. Napsáno vědci. Určeno široké huntingtonské veřejnosti. Potíže s translací? Nový pohled na výrobu proteinů, které způsobují Huntingtonovu
Více