HAMA-ELISA medac. Česky A-VPCZ/010414

Transkript

1 HAMAELISA medac Česky 10018AVPCZ/010414

2 VÝROBCE medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg MARKETING medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Bereich Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: Fax: ADRESA PRO PŘÍJEM OBJEDNÁVEK Tel.: Fax: AVPCZ/010414

3 HAMAELISA medac Enzymatický imunologický test pro kvantitativní stanovení lidských protilátek proti myším protilátkám Human AntiMouse Antibodies (HAMA) Katalogové číslo: 10018A POUZE PRO POUŽITÍ IN VITRO ÚVOD Monoklonální myší protilátky se používají in vivo pro imunosupresi po transplantaci orgánů, aby se zabránilo riziku odmítnutí a akutním fázím autoimunopatie, a pro imunoscintigrafii či imunoterapii in vivo u pacientů s tumorem. Při použití monoklonálních myších protilátek může u pacientů docházet k indukci humánních proti myších protilátek HAMA. Opakované používání monoklonálních myších protilátek vede zpravidla k výraznému zvýšení koncentrace HAMA v séru pacientů. Vzniknuté HAMA jsou nejčastěji antiizotypy, výjimečně antiidiotypy. HAMA mohou negativně ovlivnit účinnost imunoterapie nebo imunoscintigrafie takým způsobem, že vazbou použitých protilátek a vytvářením imunních komplexů (HAMAmAb) snižují jejich terapeutickou účinnost a diagnostickou výpověď. U HAMApozitivních pacientů hrozí po opakovaném podání monoklonálních myších protilátek vyšší riziko anafylaktických reakcí. Imunologické testy pro diagnostiku in vitro se často zakládají na používání monoklonálních proti myších protilátek. Proto se musí u nepodložených falešně pozitivních a falešně negativních výsledcích vždy myslet na výskyt HAMA v sérech pacientů jako možnou příčinu. Dokonce aplikace myších protilátek do ředících médií toho času dostupných imunologických testů nemůže vždy úplně odstranit rušivé účinky, které způsobují HAMA protilátky. Test HAMAELISA firmy medac je jednoduchý a rychlý jednofázový imunologický test pro kvantitativní stanovení HAMA protilátek v séru. Test je kalibrovaný na proti myší protilátky IgG. Rozsah měření testu HAMA ELISA medac leží v intervalu mezi AVPCZ/

4 PRINCIP TESTU Mikrotitrační destička je pokryta myšími protilátkami IgG (Antigén). Mikrotiterstreifen Přidají se vzorky a peroxidázou konjugované myší protilátky IgG (konjugát)(p = peroxidáza). Humánní proti myší protilátky (HAMA) se vážou na pevnou fázi a na peroxidázou konjugované myší protilátky IgG (můstková vazba). Inkubace se substrátem TMB (*). Reakce se zastaví kyselinou sírovou. Vyhodnocení se provádí fotometricky. Výhody testu Jednofázový test s krátkou dobou inkubace. Lámací proužky mikrotitrační destičky umožňují optimální využití testu. Barevné reagencie umožňují vizuálně sledovat každý krok pipetování. Test lze automatizovat na otevřených zařízeních pro testy ELISA AVPCZ/

5 OBSAH SOUPRAVY: Katalogové číslo: 10018A 1. MTP Mikrotitrační destička: 12 testovacích proužků po 8 jamkách (potlačená označením HAM, se stojanem a desikantem v hliníkovém vakuovém balení), lámací proužky, dno tvaru písmena U, pokryté myšími protilátkami IgG a BSA, připravená k použití. 2. CONTROL 1 + Pozitivní kontrola 1: 1 lahvička s obsahem 0,75 ml, kozí protilátky proti myším protilátkam IgG, připravená k použití, zbarvená modře, obsahuje BSA, FSC, fenol, ProClin TM 300 a gentamycin sulfát. 3. CONTROL 2 + Pozitivní kontrola 2: 1 lahvička s obsahem 0,75 ml, kozí protilátky proti myším protilátkam IgG, připravená k použití, zbarvená modře, obsahuje BSA, FSC, fenol, ProClin TM 300 a gentamycin sulfát. 4. CAL Kalibrátory: 1 lahvička s obsahem 0,75 ml, kozí protilátky proti myším IgG, připravená k použití, zbarvená modře, obsahuje BSA, FSC, fenol, ProClin TM 300 a gentamycin sulfát. 4a. CAL 1 Kalibrátor 1: b. CAL 2 Kalibrátor 2: c. CAL 3 Kalibrátor 3: 500 4d. CAL 4 Kalibrátor 4: 200 4e. CAL 5 Kalibrátor 5: WB Promývací roztok: 1 láhev s obsahem 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, obsahuje ProClin TM VIRDIL Roztok na ředění vzorků: 1 láhev s obsahem 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, připravený k použití, zbarvený modře, obsahuje ProClin TM AVPCZ/

6 7. CON Konjugát: 2 lahvičky, každá s obsahem 5,0 ml, myší IgG, konjugovaný HRP, připravený k použití, zbarvený oranžově, obsahuje BSA, fenol, ProClin TM 300 a gentamycin sulfát. 8. TMB Substrát TMB: 2 lahvičky, každá s obsahem 10 ml, připravený k použití. 9. STOP Roztok na zastavení reakce: 1 lahvička s obsahem 11 ml, 0,5 M kyselina sírová (H 2 SO 4 ), připravený k použití. 1. SKLADOVÁNÍ A STABILITA Materiál/Reagencie Stav Skladování Stabilita Zkušební souprava neotevřená C Do uplynutí doby použitelnosti Mikrotitrační C v sáčku otevřená destička s desikantem 4 týdny Kontroly otevřené C 4 týdny Kalibrátory otevřené C 4 týdny Promývací roztok zředěný C 4 týdny Roztok na ředění vzorků otevřený C 4 týdny Konjugát otevřený C 4 týdny Substrát TMB otevřený C 4 týdny Roztok na zastavení reakce použitelnosti Do uplynutí doby otevřený C Nepoužívejte reagencie po uplynutí doby použitelnosti. 2. DALŠÍ POŽADOVANÉ REAGENCIE A MATERIÁLY 2.1. Destilovaná nebo deionizovaná voda Mikropipety pro potřebné objemy Čisté skleněné nádoby nebo nádoby z umělé hmoty na ředění promývacího roztoku a sér pacientů Vhodné zařízení na promývání mikrotitračních destiček (např. multikanálová pipeta nebo promývačka na testy ELISA) Inkubátor pro 37 C Fotometr na mikrotitrační destičky s filtry na 450 nm a nm AVPCZ/

7 3. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ Před zahájením testu vytemperujte všechny komponenty na pokojovou teplotu. Stanovte požadovaný počet mikrotitračních jamek Mikrotitrační destička Hliníkový sáček s desikantem se musí po každém otevření opět pevně uzavřít. Skladování a životnost jsou uvedeny v bodě Promývací roztok Smíchejte jednu objemovou část koncentrátu promývacího roztoku (10x) s devíti částmi destilovaná/deionizovaná vody (např. 50 ml koncentrátu roztoku (10x) s 450 ml vody). Na 8 jamek budete potřebovat 5 ml zředěného roztoku promývacího roztoku. Případné krystaly v promývacím roztoku (10x) se musí rozpustit zahřáním (max. na 37 C) a/nebo promícháním při pokojové teplotě. Reagencie jedné šarže nezaměňujte s reagenciemi jiných šarží nebo výrobců. Validní a reprodukovatelné výsledky získáte pouze při přesném dodržení pracovního postupu a při použití reagencií specifických pro tento test. 4. VZORKY 4.1. Test je vhodný pro vyšetření séra. Séra pacientů můžete uchovávat maximálně 7 dní při teplotě 2 8 o C. Delší uchovávní se musí provádět při teplotě 20 o C. Opakované zmražování a rozmražování sér nedoporučujeme Před testem není potřebné provádět žádnou úpravu séra např. deaktivaci. Testované vzorky séra však nesmí být kontaminované mikroorganismy ani nesmí obsahovat červené krvinky Vzorky séra se musí zředit v poměru 1:10 roztokem na ředění vzorků (například 20 μl séra μl roztoku na ředění vzorků). Vzorky mimo oblast měření mohou být naředěny libovolně výše (viz 6.A.). 5.A. PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU 5.1. Hliníkový sáček rozřízněte nad zipovým uzávěrem a vyjměte požadovaný počet mikrotitračních jamek (viz 3.1.). Mikrotitrační jamky jsou připraveny k použití a nemusí se promývat AVPCZ/

8 5.2. Do jamky A1 napipetujte 100 μl roztoku na ředění vzorků pro stanovení pozadí. Do příslušných jamek na destičce napipetujte dvojitě po 50 μl každého kalibrátoru, kontroly a naředěného vzorku. Potom do všech jamek s výjimkou jamky A1 napipetujte 50 μl konjugátu. Pipetování kalibrátorů, kontrol, vzorků a konjugátu musí být provedeno do 10 minut. Poté musí být destička okamžitě vložena do inkubátoru (viz 5. 3.). Poznámka: Při práci na automatizovaných přístrojích je nutné do každé jamky napipetovat 60 μl kalibrátoru, kontroly, vzorků a konjugátu, protože v inkubační komoře přístrojů dochází k intenzivnímu odpařování. Vhodnost testu pro automatizované zpracování byla prokázaná v rámkach validace testu. Přesto doporučujeme ověřit kompatibilitu testu s přístrojem používaném v laboratoři Inkubujte destičku po dobu 30 minut (± 1 minuta) při 37 C (± 1 C) ve vlhké komoře nebo uzavřené pod inkubační fólií Po inkubaci promyjte mikrotitrační destičku třikrát každou jamku 200 μl promývacího roztoku. Dbejte na to, aby se naplnily všechny jamky. Po promytí vyklepete mikrotitrační destičku na filtračním papíru. Jamky nenechte vyschnout! Pokračujte okamžitě v práci! 5.5. Do každé jamky napipetujte 100 μl substrátu TMB (také A1) a inkubujte po dobu 15 minut (± 1 minuta) při 37 C (± 1 C) ve vlhké komoře nebo uzavřené pod inkubační fólií ve tmě. Pozitivní vzorky se zbarví modře Reakci zastavte přidáním 50 μl roztoku na zastavení reakce do každé jamky (včetně A1). Pozitivní vzorky se zbarví žlutě. Před fotometrickým měřením dobře promíchejte obsah jamek jemným protřepáním a vyčistěte jamky ze spodu. Zkontrolujte, zdali v jamkách nejsou žádné bublinky vzduchu. Odečtení je nutno provést do 10 minut po přidání roztoku na zastavení reakce AVPCZ/

9 5.B. TABULKA ZNÁZORŇUJÍCÍ PRACOVNÍ POSTUP Roztok na ředění vzorků Kalibrátory Kontroly Vzorky Pozadí (A1) Kalibrátory Kontroly Vzorky 100 μl 50/60 μl*) 50/60 μl*) 50/60 μl*) Konjugát 50/60 μl*) 50/60 μl*) 50/60 μl*) Inkubujte po dobu 30 min. při 37 C, 3 x promyjte 200 μl promývacího roztoku Substrát TMB 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl Roztok na zastavení reakce Inkubujte ve tmě po dobu 15 min. při 37 C 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl Fotometrické odečtení při 450 nm (ref nm) *) manuální/automatický postup (viz 5.2.) 6.A. HODNOCENÍ TESTU (VALIDITA) Fotometrické vyhodnocení se provádí při vlnové délce 450 nm (referenční vlnová délka nm). Od všech hodnot OD se odečte OD pozadí (A1 jamka). Interval rozpětí nominální koncentrace kontrol je uveden na štítcích odpovídajících lahviček. Kritéria validity Hodnota OD pozadí musí být < 0,050. Průměrná hodnota OD kalibrátoru 5 musí být < 0,200. Průměrná hodnota OD kalibrátoru 1 musí být > 1,500. Koncentrace kontrol musí ležet v intervalu rozpětí nominální koncentrace (viz údaje na štítcích odpovídajících lahviček). Pokud udané kritéria validity nejsou splněna, musí se test opakovat AVPCZ/

10 Kalibrační křivka a kvantifikace naměřených výsledků Hodnoty OD kalibrátorů vůči koncentracím se zakreslují do grafu. Pro kalibrační křivku doporučujeme křivku typu kubické přispůsobení spline. Koncentrace odpovídající hodnotám OD vzorků lze odečíst z kalibrační křivky. Interval měření sahá od 40 do Vzorky s hodnotou koncentrací pod intervalom měření se hodnotí jako < 40. Vzorky s hodnotami koncentrací nad intervalem měření se hodnotí jako > Tyto hodnoty se nesmí extrapolovat. Tyto vzorky se musí otestovat znovu při vyšším ředění. Pokud byl některý vzorek měřen při naředění vyšším než 1:10, je nutné koncentraci odečtenou z kalibrační křivky vynásobit dodatečným faktorem zředění (např. ředění v testu 1:40, odečtená koncentrace = 1500 skutečná koncentrace = 1500 x 4 = 6000 ). Příklad kalibrační křivky: 6.B. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ/HRANICE METODY Test HAMAELISA medac lze používat pouze pro měření antiizotypických protilátek. Koncentrace HAMA > 40 se hodnotí jako pozitivní. Tyto koncentrace HAMA mohou negativně ovlivnit účinnost léčby pacientů monoklonálními myšími protilátkami nebo diagnostickou výpověď odpovídajících diagnostických metod AVPCZ/

11 Pro individuální vyhodnocení se doporučuje provést testy na časový průběh tvorby protilátek pomocí následujících odběrů. V některých případech nelze vyloučit falešně pozitivní reakce způsobené heterofilními protilátkami. Séra obsahující revmatické faktory mohou vykazovat vyšší hodnoty HAMA. V 63% případů z celkově 43 vyšetřených sér byly naměřeny koncentrace HAMA > 40, v 5% případů byl naměřena koncentrace HAMA > 320. Ve vyšetřovaném kolektivu pacientů nebyly zjištěny hodnoty HAMA > Velmi zvýšené hodnoty lipidů nebo vysoké hodnoty hemoglobinu a bilirubinu výsledky testu neovlivňují. Linearita ředění byla vyšetřována v rámkách validace na základě vybraných vzorků (viz kapitola 7. D.). Je nutné poznamenat, že některé vzorky pacientů vykazují špatnou linearitu ředění. 7. CHARAKTESTIKA TESTU V rámkách validace testu jsme obdrželi následující charakteristky výkonnosti testu. 7.A. PREVALENCE V rámkách diagnostické evaluace bylo vyšetřeno 101 vzorků od dárců krve. Z nich 98 vzorků bylo negativních (koncentrace HAMA < 40 ). 7.B. PŘESNOST Vzorek Variace intraassay Vzorek Variace interassay Střední SD CV n Střední SD CV n hodnota OD (%) hodnota (%) Kalibr. 1 2,460 0,204 8,3 21 K ,6 11 Kalibr. 5 0,070 0,008 11,4 21 K ,8 11 K1 1,013 0,053 5,2 21 Vzorek ,1 11 K2 2,205 0,121 5,5 21 Vzorek ,4 11 Vzorek 1 0,128 0,011 8,6 22 Vzorek ,8 11 Vzorek 3 2,341 0,129 5,5 22 Kalib. = kalibrátor; K = kontrola 10018AVPCZ/

12 7.C. RECOVERY Průměrné procento recovery 99 % (SD = 12 %) bylo zjištěno přidáváním osmi definovaných koncentrací HAMA do tří různých sér. 7.D. LINEARITA ŘEDĚNÍ Linearitu ředění byla stanovena za pomoci 10 vysoce reaktivních sér, které byly testovány v 5 různých ředěních (postupné ředění 1:2). Ředění 1 Ředění 2 Ředění 3 Ředění 4 Ředění 5 Stř. hodnota SD č % č % č % č % č % č % č % č % č % č % CV 7.E. SPODNÍ HRANICE PRŮKAZU Spodní hranice průkazu je 40. Tato koncentrace leží výrazně nad nulovou hodnotou. VŠEOBECNÉ RADY TÝKAJÍCÍ SE MANIPULACE Aby se předešlo vzájemné kontaminaci jednotlivých reagencií, nezaměňujte lahvičky a jejich šroubové uzávěry. Reagencie je potřebné ihned po použití uzavřít, aby nedošlo k jejich vypařování a mikrobiální kontaminaci. Po skončení testu se musí reagencie uložit tak, jak je uvedené v pokynech, aby se zachovala jejich garantovaná životnost. Aby se předešlo záměně reagencií různých testovacích systémů nebo šarží, musí se všechny komponenty jednoho setu po použití skladovat spolu v původním balení (viz také 3) AVPCZ/

13 INFORMACE TÝKAJÍCÍ SE BEZPEČNOSTI A OCHRANY ZDRAVÍ Je nevyhnutné dodržovat platné národní předpisy týkající se bezpečnosti práce. S reagenciemi obsahujícími částí zvířecího původu (viz obsah setu), se musí zacházet jako s potenciálně nákažlivými, aby se předešlo riziku nákazy. RADY TÝKAJÍCÍ SE LIKVIDACE Zbytky chemikálií a preparátů v tomto testu jako i zbytky produktů vzniklých v půběhu testu jsou všeobecně považovány za nebezpečný odpad. Likvidace tohoto druhu odpadu se řídí národními a regionálními zákony a předpisy. Obraťte se na orgány místní správy nebo na organizace zabývající se odpady, které vám podají informace, jak nebezpečné odpady likvidovat. Datum vydání: AVPCZ/

14 LITERATURA Baum, R.P., et al.: Clinical Course of Ovarian Cancer Patients Under Repeated Stimulation of HAMA Using MAb OC 125 and B HYBRIDOMA 12 (5), (1993) Baum, R.P. et al.: Activating AntiIdiotypic Human AntiMouse Antibodies for Immunotherapy of Ovarian Carcinoma. CANCER 73 (3), (1994) Bock, J.L., J. Forgiuele, B. Wenz: False positive immunometric assays caused by antiimmunoglobulin antibodies: a case report. CLIN. CHIM. ACTA. 147, (1985) Boscato, L.M., G. Egan, M.C. Stuart: Covert cross reactants in a twosite immunoassay studied with monoclonal antibodies. ANAL. BIOCHEM. 146, (1985) Boscato, L.M. and M.C. Stuart: Incidence and specificity of interference in twosite immunoassays. CLIN. CHEM. 32, (1986) Boscato, L.M. and M.C. Stuart: Heterophilic Antibodies: A Problem for all immunoassays. CLIN. CHEM. 34/1, 2733 (1988) CourtenayLuck, N.S., et al.: Development of Primary and Secondary Immune Responses to Mouse Monoclonal Antibodies Used in the Diagnosis and Therapy of Malignant Neoplasms. CANCER RESEARCH 46, (1986) CourtenayLuck, N.S., A.A. Epenetos, C.G. Winearls, M.A. Ritter: Preexisting Human AntiMurine Immunoglobulin Reactivity Due to Polyclonal Rheumatoid Factors. CANCER RESEARCH 47, (1987) Cusick, C.F., K. Mistry, G.M. Addision: Interference in a TwoSite Immunoradiometric Assay for Thyrotropin in a Child. CLIN. CHEM. 31, (1985) Davies, A.G., et al.: Preexisting Antimouse Immunoglobulin in a Patient Receiving 131Imurine Monoclonal Antibody for Radioimmunolocalization. BR. J. CANCER 53, (1986) Hansen, H.J., E. Newman, G. LaFontaine: Human AntiMurine Antibody (HAMA) Can Cause FalsePositive and FalseNegative Carcinoembryonic Antigen (CEA) Assay Results. Presented at the Third International Conference of Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer, February 46 (1988) 10018AVPCZ/

15 Hertel, A., et al.: Antiidiotypic HAMA Triggered by OC 125 Radioimmunoscintigraphy: Beneficial to the Patient? in R. Klapdor (ed.): Tumor Associated Antigens, Oncogenes, Receptors, Cytokines in Tumor Diagnosis and Therapy at the Beginning of the Nineties. Cancer of the BreastState and Trends in Diagnosis and Therapy. Zuckerschwerdt Verlag München, Bern, Wien, New York, (1992) Hertel, A. and R. Baum: Influence of Human AntiMurine Antibodies on in vitro Assays in Ovarian Cancer Patients. HYBRIDOMA 12 (5), (1993) Klein, J.L., et al.: Detection of specific antiantibodies in patients treated with radiolabelled antibody. INT. J. RAD. ONCOL. BIOL. PHYS. 12, (1986) Kricka, L.J. and D. SchmerfeldPruss: Interlaboratory Survey of Methods for Measuring Human AntiMouse Antibodies. CLINICAL CHEMISTRY 38 (1), (1992) LaFontaine, G.S., H.J. Hansen, B.F. Weiss and D.M.Goldenberg: Enzyme Immunoassay for the Detection of Circulating Immunoglobulins in Humans to Mouse Monoclonal Antibody (HAMA). Presented at the Third International Conference of Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer, February 46 (1988) McCarthy, R.C., F.J. Ryan: Interference in immunoenzymometric assays (IEMA) using mouse monoclonal antibodies (MCAB) caused by human IgM antibody to mouse IgG (Abstract). CLIN. CHEM. 33, 918 (1987) Pimm, M.V., et al.: The Characteristics of Blood Borne Radiolabels and the Effect of AntiMouse IgG Antibodies on Localization of Radiolabelled Monoclonal Antibody in Cancer Patients. J. NUCL. MED. 26, (1985) Porstmann, T. (Hrsg.): Human antimausantikörper immer häufiger Ursache fehlerhafter Immunoassayergebnisse. INVITRO DIAGNOSTICA NACHRICHTEN 2 + 3, 15 (1993) Porstmann, T. (Hrsg.): Interferenzen durch humane AntiMausAntikörper (HAMA). INVITRO DIAGNOSTICA NACHRICHTEN 10, 8 (1993) 10018AVPCZ/