Technologie kvantitativních metod

Transkript

1 Technologie kvantitativních metod Klíčová slova: optické metody, elektrochemické metody, elektromigrační metody, fyzikální metody,amplifikace termocyklery a termomixéry, izotopové metody, chromatografické metody Optické metody Absorpční fotometrie je optická metoda, která se zabývá kvantitativním hodnocením změny intenzity záření po průchodu analytickým prostředím. Základním vztahem pro absorpční fotometrii je zákon Lambertův-Beerův-Bouguerův: Φ 0 log = A = a.c.l Φ Φ o = světlo vstupující do měřeného prostředí Φ = světlo z měřeného prostředí vystupující A = absorbance a = absorpční koeficient pro danou vlnovou délku c = koncentrace roztoku l = délka optické dráhy (tj. tloušťka vrstvy roztoku) Přístroje, které se používají k měření intenzity záření v ultrafialové (UV) nebo viditelné (VIS) oblasti spektra se nazývají fotometry nebo spektrofotometry. Fotometry jsou jednodušší a používají k vymezení úzkého pásma vlnových délek filtry. Spektrofotometry používají mřížkový monochromátor, který dovoluje kontinuálně měnit vlnovou délku měření v širokém intervalu. Všechny fotometry a spektrofotometry sestávají ze tří základních částí: a) zdroje zářivé energie, b) filtru nebo mřížky pro izolaci úzkého pásma zářivé energie, c) detektoru měřícího zářivou energii propuštěnou vzorkem. Mezi filtr, resp. mřížku a detektor se vkládá kyveta s roztokem měřeného vzorku.

2 U V V I S I R Spektrální distribuční křivky W žárovky b.t. W ~ 3600 C Energie 2000 C 4000 C 3000 C vlnová délka [nm] Nejpoužívanějším zdrojem světla je žárovka s wolframovým vláknem. Na obrázku jsou spektrální distribuční křivky wolframové žárovky při různých teplotách. Emitovaná světelná energie při žhavení vlákna na 2000 C téměř nezasahuje do oblasti viditelného spektra. Teprve při teplotě wolframového vlákna 3000 C lze použít wolframovou žárovku jako zdroj v celém rozsahu viditelného spektra. Nicméně v intervalu nm je signál velmi slabý a bez zesilovače nepoužitelný. Při 4000 C je emitované záření wolframového vlákna dostatečně silné i ve střední UV oblasti spektra. Tento rozsah ale nelze použít, protože bod tání wolframu je 3600 C, takže žhavení wolframového vlákna nesmí překročit 3500 C. Za těchto okolností je emitované záření dostatečné ve viditelné oblasti, ale v blízké UV oblasti je zapotřebí použít zesilovač a pro střední UV oblast je wolframová žárovka nepoužitelná. Kromě žárovky se používají výbojky deuteriové (190 až 375 nm), xenonové a rtuťové.

3 Rozdělení spektrální energie u nízkonapěťové deuteriové výbojky Energie vlnová délka [nm] Nízkonapěťové deuteriové výbojky používají napětí 40 V, zatímco vysokonapěťové až 2500 V. Tlak deuteria ve výbojce je 27 až 660 Pa. Spektrum deuteriové výbojky je monotónní (bez výkyvů) v oblasti 165 až 375 nm a nazývá se kontinuum. Používá se v rozsahu od 165 nm (litý křemen) nebo 200 nm (běžný křemen). Při vlnových délkách < 185 nm již dochází k absorpci záření vzduchem a proto se vzdálená UV oblast ve spektrofotometrech běžné konstrukce nepoužívá.

4 Relativní energie [arb.j.] U V V I S I R Distribuce spektrální energie vysokotlaké Xe výbojky vlnová délka [nm] Xenonová výbojka poskytuje velmi silné světlo v blízké UV oblasti a proto je oblíbeným zdrojem světla v rutinních analyzátorech a fluorimetrech. Výbojka používá nízké napětí, ale výboj mezi 8 mm vzdálenými wolframovými elektrodami vzniká při vysokém tlaku xenonu (1 3 MPa). Velmi intenzivní záření v IR oblasti (teplo) vyžaduje, aby měla výbojka vodní plášť. V kvalitních spektrofotometrech se tento světelný zdroj nepoužívá, protože je nestabilní a s vysokým rozptylem záření. Zdroje záření mění svou výstupní intenzitu toku s vlnovou délkou. Pro selektivitu, správnost a citlivost všech měření je nutné vybrat úzké pásmo vlnových délek, vyzařovaných ze širokospektrálního zdroje. K tomu účelu se obvykle používají interferenční filtry, které pracují na principu mnohonásobné interference mezi plochami s výbornými odrazovými vlastnostmi, nebo reflexní mřížky. Monochromátor tvoří: vstupní štěrbina vymezující svazek heterochromatického záření, mřížka jako rozptylový prvek a výstupní štěrbina, propouštějící pásmo světla blízké nominální vlnové délce. Detektory používané ve VIS a UV oblasti převádějí zářivou energii na elektrickou energii. Používají se fotonky, fotonásobiče a diodová pole.

5 Dopadající záření K A E R L k zesilovači ~ 90 V Ve fotonkách se elektrony uvolněné z fotokatody po dopadu fotonů pohybují k anodě účinkem sacího napětí. Fotonky mohou být evakuované nebo plněné plynem. Ve vakuových fotonkách je fotoelektrický proud úměrný toku záření. Jsou-li fotonky plněné plynem, mohou elektrony z katody ionizovat jeho molekuly a tím dochází k zesílení fotoelektrického proudu. Směr osvětlení 1 3 k 2 a R R R R B A Fotonásobiče jsou uspořádány tak, že elektrony dopadnou po ozáření fotokatody (k) na první zesilovací elektrodu (1), dynodu, kde je počet fotoelektronů násoben sekundární emisí. Takových dynod je ve fotonásobiči 10 i více a výsledný efekt zesílení může být i několik milionů.

6 Zjednodušené schéma ukazuje jen tři dynody pře koncovou anodou (a), dále odpory děliče napětí (R), zdroje konstantního napětí (B) a měřič fotoelektrického proudu (A). Sací napětí 1000 až 3000 V je rozděleno na dynody po 75 až 300 V. Každá dioda zesiluje dopadající fotoelektrický proud 4 až 5-krát. Výsledné zesílení při 10 dynodách může být až několik milionů. Takto lze měřit až 200-krát slabší intenzitu světla, než v kombinaci fotonka se zesilovačem. bílé světlo všechny vlnové délky jsou měřeny současně mřížka vzorek červené diodové pole modré V detektoru diodového pole je světlo rozptylováno mřížkou na pole mnoha světlocitlivých diod a vzniká napětí, které je převedeno na digitální signál. Tyto detektory umožňují měřit současně celé spektrum. Rozlišovací schopnost jednotlivých diod je lepší než 1 nm. Analyzátory mají 8 až 16 diod v místech kde fixovaná mřížka odráží světlo vhodné vlnové délky. V HPLC mohou mít detektory i více než 300 diod a pracovat v rozsahu nm. Odečítání celého spektra je extrémně rychlé (např. 12 ms). mřížka červené bílé světlo štěrbina rotující mřížka pro měření různých vlnových délek vzorek detektor modré Klasické uspořádání využívá k separaci jednotlivých vlnových délek monochromátor, obsahující vstupní štěrbinu, holograficky laserem vypálenou mřížku a výstupní štěrbinu. K získání celého spektra, obvykle v rozsahu nm je zapotřebí obvykle několik minut a proto musí být měřený vzorek alespoň po tuto dobu stabilní. Zatímco u klasické absorpční fotometrie prochází paprsek kyvetou horizontálně, při vertikální fotometrii prochází kyvetou vertikálně.

7 Vertikální fotometry mají jeden zdroj světla (žárovku), sadu filtrů a fotonku jako detektor. Sofistikovanější přístroje jsou vybaveny skleněnými optickými vlákny, světlovody, které přivádějí světlo ze zdroje do osmi nebo více jamek najednou, a dalšími světlovody, které prošlé světlo odvádějí k detektoru. Mikrotitrační destička nebo strip (tj. proužek s osmi mikrotitračními jamkami), určené k měření, mají vždy konstantní plochu kruhové základny a pro stejnou koncentraci je konstantní součin absorbance a délky optické dráhy roztokem. Tato výhoda vertikální fotometrie v praxi znamená to, že i při poměrně krátké optické dráze ( 3 mm) a s dosti nepřesnými multikanálovými pipetami získáme solidní výsledky. Reflexní fotometrie sleduje odražené záření od homogenně zbarvené podložky. Matrice pro suchá činidla v systémech tzv. "suché chemie" může být dvojího druhu: buď se jedná o impregnovaná vlákna anebo o vícevrstvý film. Proužky z impregnovaných vláken umožňují vyšetřovat celou řadu analytů z plné krve.

8 Zdrojem světla je pulzující světlo emitující dioda nebo několik diod, když je zapotřebí několika vlnových délek. Vzhledem k tomu, že světelný výtěžek odraženého světla je poměrně malý, používá se bílý kulový reflektor - Ulbrichtova koule - který fokusuje veškeré odražené světlo z reagenčního políčka impregnovaného vlákna na fotonku. Při měření odraženého světla v normále, tj. kolmo na políčko, dosáhneme stejného výsledku, jako bychom osvětlovali políčko v jednom směru a ve všech směrech bychom sledovali reflexi. Vícevrstvý film představuje na rozdíl od impregnovaných vláken homogenní matrici a reflexní fotometrie prováděná tímto způsobem může při vysoké automatizaci poskytnout výsledky srovnatelné s absorpční fotometrií v roztocích.

9 Zdrojem světla je žárovka s halogenovou atmosférou. Světlo selektované interferenčním filtrem dopadá na film, prochází absorpční vrstvou, odráží se od reflexní podložky, opět prochází absorpční vrstvou a dopadá na fotonásobič. V tomto případě se používá složitější optika a mnohem citlivější detektor - fotonásobič. Měření reflexe se provádí z opačné strany, než byl aplikován vzorek. Atomová absorpční spektrofotometrie (AAS) je optická metoda založená na měření absorpce elektromagnetického záření v ultrafialové a viditelné části spektra. Atomizace vyžaduje teplotu 2000 až 3000 o C. Volné atomy stanovovaného prvku, v klinické biochemii nejčastěji Ca, Mg a dále Cu, Zn, popřípadě Fe a jiné, absorbují výhradně záření takových vlnových délek, které mohou samy vyzařovat.

10 Paprsek světla vhodné vlnové délky prochází plamenem, do něhož je rozprašován vzorek, nebo je veden přes elektrickou pec (tzv. bezplamenová verze), do které se zavádí vzorek. Zdrojem záření je při stanovení netěkavých kovů dutá katodová výbojka (katoda je z kovu, pro který je lampa určena). V plamenové verzi je vzorek rozprašován tryskou do mlžné komory a proudí společně s palivem (acetylén-vzduch) přes hořák do laminárního plamene. Deuteriová výbojka je zdrojem spojitého záření ke korekci absorpčního pozadí (např. molekulární absorpce). Paprsek je modulován rotující clonkou, aby došlo k rozlišení záření zdroje od interferujících emisí. Požadovaná vlnová délka je separována kvalitním monochromátorem a signál je detekován fotonásobičem. Bezplamenové elektrotermické atomizátory pracují ve třech teplotně odlišných krocích: napřed se vzorek z odporově vyhřívané podložky v elektrické peci odpaří, poté se odstraní těkavé látky pyrolýzou a nakonec se provede atomizace. K izolaci analyzované spektrální čáry od ostatních čar zdroje záření se používá monochromátor (mřížka) a k detekci fotonásobič. Fluorimetrie využívá jevu, kdy v některých látkách po ozáření dostatečně energetickým zdrojem světla vzniká fotoluminiscence. Látky přitom vyzařují světlo, jehož intenzita je přímo úměrná koncentraci fluoreskující sloučeniny. Emitované záření fluoreskujících sloučenin má vždy vyšší vlnovou délku (tj. méně energie) než excitační záření, vyvolávající fotoluminiscenci.

11 Základní konstrukce fluorimetrů sestává ze zdroje zářivé energie, dvou optických separačních prvků a detektoru. Zdrojem záření jsou nejčastěji halogenové žárovky a xenonové výbojky. Světlo ze zdroje prochází buď interferenčním filtrem nebo mřížkovým monochromátorem. Dále prochází kyvetou s roztokem měřeného vzorku a emitovaná fluorescence se měří pod úhlem 90, kdy po průchodu filtrem nebo po difrakci reflexní mřížkou dopadá emitované světlo vybrané vlnové délky na fotonásobič. Fluorimetr obsahuje také pomocné optické prvky jako clonku, čočky a zrcadla; špičkový přístroj má navíc dělič paprsku přivádějící část světla k referenčnímu fotonásobiči. Fluorescenční polarizace používá k excitaci polarizované světlo. Využívá se rozdílné rychlosti rotace malé molekuly antigenu a velké molekuly imunokomplexu, vzniklé po navázání protilátky. V imunokomplexu je zabrzděna původně volná rotace antigenu a emitované světlo fluorochromu je ve stejné rovině delší dobu. Chemiluminiscence se liší od ostatních luminiscenčních jevů tím, že excitace fotonů je vyvolána chemickou reakcí, která proběhne buď po nástřiku syntetizovaného činidla, nebo se k aktivaci činidel využívá oxidace na anodě (elektrochemiluminiscence).

12 Rutheniový komplex Světlo Elektrody 2 V Na streptavidinové paramagnetické kuličky se naváže protilátka biotinovou kotvou. Markerem je tris(bipyridyl)ruthéniový ester. Tripropylamin slouží jako donor elektronů a zároveň jako promývací činidlo. Měřící komůrka používá tři pracovní kroky: a) magnet přitáhne kuličky a tripropylamin je promyje, b) nízké napětí (definovaný potenciál zajišťuje Ag/AgCl elektroda) vyvolá luminiscenci, která se měří fotonásobičem, c) magnet se odsune a cela se promyje louhem při vysokém napětí. Přímá emise fotonu z excitovaného produktu obvykle poskytuje krátké záblesky světla, zatímco transfer energie na fluoreskující sloučeniny se většinou projevuje jako dlouhodobá světelná emise (v minutách). Citlivost chemiluminiscenčních metod je vyšší než u izotopových metod. Luminometry nemají před měřicí kyvetou žádný zdroj světla ani filtr. Uspořádání za kyvetou odpovídá fluorimetrům (filtr, fotonásobič). Turbidimetrie je založená na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích. Nejobtížnější je získat reprodukovatelně suspenzi měřené reakční směsi, která je dostatečně stálá. K tomu účelu se používají ochranné koloidy (nejčastěji polyetylenglykol).

13 TURBIDIMETRIE NEFELOMETRIE Absorpce záření po průchodu nehomogenním prostředím se měří absorpčními fotometry a spektrofotometry. Fotometrická citlivost je nepřímo úměrná vlnové délce. Nefelometrie měří intenzitu difusně rozptýleného světla na dispergovaných částicích. Rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry (tzv. světlo Tyndallovo) a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření. Laserový nefelometr používá jako světelného zdroje helium-neonového laseru. Tento zdroj monochromatického světla je mimořádně intenzivní a má vysoký stupeň směrovosti. Rozptýlené světlo se sleduje detektorem nastaveným pod úhlem 5 až 35 (fotonkou nebo fotonásobičem), ale ve víceúčelových přístrojích pod úhlem 90. Konvenční nefelometry používají jako světelných zdrojů žárovku nebo xenonovou výbojku a mají interferenční filtr. Detektor je nastaven pod úhlem 70 až 90 o. Nefelometry mohou měřit také rychlost změny rozptylu světla - kinetiku, která je přímo úměrná rychlosti vzniku imunokomplexu antigen - protilátka.

14 Elektrochemické metody Potenciometrie měří rozdíl potenciálů (napětí) mezi dvěma elektrodami. Jedna z elektrod je referenční (srovnávací) a má konstantní potenciál. Druhá elektroda je indikační (měrná) a její potenciál závisí na aktivitě měřeného analytu ve zkoumaném roztoku. Napětí mezi oběma elektrodami se měří digitálním voltmetrem. Indikační elektroda může mít tvar okénka s ionselektivní membránou, které je obtékáno vzorkem. Tyto elektrody se velmi snadno a rychle vyměňují, ale mají menší plochu (nižší citlivost) než elektrody ve tvaru válce, jejíž ionselektivní membránu vnitřního pláště protéká vzorek. Rozeznáváme dva typy metod. Nepřímé metody, kde je vzorek vkládán do měřicí komůrky s dosti velkým obsahem diluentu o vysoké iontové síle. Jestliže se měření provádí bez ředění, hovoříme o přímé metodě. Iontově selektivní elektrody (ISE) jsou konstruovány jako ponorné, průtočné a suché elektrodové systémy. Citlivou membránu tvoří anorganická sůl, sklovina, polymerní matrice nebo iontoměničový roztok, nasáklý do vhodné pórovité struktury (kapalná membrána). Jako referenční elektroda je používána Ag/AgCl elektroda.

15 Složená Severinghausova elektroda k měření CO 2 je skleněná elektroda, která je od měřeného prostředí oddělena silikonovou membránou propouštějící CO 2. Difusí CO 2 do vodného prostředí hydrogenuhličitanového pufru vzniká disociovaná kyselina uhličitá a množství H + je stanoveno ph elektrodou. Potenciál se měří proti referenční Ag/AgCl elektrodě ponořené do NaHCO 3 pufru. Na základě zjištění dvou hodnot ph odpovídajících známým hodnotám pco 2 v kalibrátorech je možné zjišťovat parciální tlak oxidu uhličitého v neznámých vzorcích krve. Při stanovení v moči se musí vzorky vždy ředit diluentem s velkou iontovou silou, aby se kompenzoval vliv kolísání iontové síly ve vzorku moče. Podstatou konstrukce enzymových elektrod je předřazení membrány s imobilizovaným enzymem (např. ureasou pro stanovení močoviny nebo glukosaoxidasou pro stanovení glukosy) před vlastní elektrochemické čidlo. Stanovovaný substrát difunduje do enzymové membrány, kde reaguje s imobilizovaným enzymem na produkt, který se pak detekuje potenciometricky nebo ampérometricky.

16 Ampérometrie se zabývá měřením proudu za konstantního potenciálu. Ampérometr slouží jako detektor elektronů v oxidačně-redukčních reakcích při stanovení glukosy. Sleduje se množství elektronů uvolněných při doprovodné reakci Fe 2+ Fe 3+ + e -. Katoda 0,65 V Pt drát Skleněná tyč Plastikové pouzdro Anoda 0V Ag/AgCl Fosfátový pufr Kryt elektrody Těsnicí kroužek Vstup vzorku Výstup vzorku Pt-katoda (odkrytý konec drátu) Polypropylenová membrána Kyveta propustná pro O 2 Skleněné okénko Polarografie sleduje intenzitu proudu při konstantním vnějším potenciálu (přepětí). Na tomto principu je založena Clarkova elektroda, která slouží ke stanovení množství kyslíku. Kyslík rozpuštěný ve vzorku nebo v pufru difunduje přes hydrofobní membránu do fosfátového pufru ke katodě (vytékání pufru z elektrody zabraňuje gumový prstenec), která je obvykle z platiny. Jako anoda slouží Ag/AgCl elektroda. Intenzita proudu spotřebovaného na redukci odpovídá po 2. Odezva měrné elektrody je lineární a při dvoubodové kalibraci lze měřit v rozsahu % kyslíku.

17 Coulometrie je analytická metoda, v níž se ke stanovení koncentrace látky v roztoku používá měření prošlého náboje při elektrochemické reakci. Podle délky titrace (t) se při konstantním proudu (I) určí náboj (Q) dle vztahu Q = I. t a tomu odpovídající množství titrované látky. Ze stříbrné anody se elektrickým proudem uvolňuje kation stříbrný, který reaguje s chloridovým aniontem z roztoku za vzniku nerozpustného chloridu stříbrného. Odpovídající potenciál je zajištěn referenční merkurosulfátovou (Hg 2 SO 4 ) elektrodou. Titrace se provádí ve zředěné kyselině sírové. Reakce musí probíhat se 100 % proudovým výtěžkem a činidlo musí reagovat rychle. Pomocí stříbrných registračních elektrod se měří potenciál roztoku a registruje se okamžik, kdy všechny chloridové anionty byly spotřebovány ve srážecí reakci. Konduktometrie měří vodivost analyzovaného roztoku. Elektrická vodivost roztoku závisí na koncentraci iontů, jejich pohyblivosti, disociaci a teplotě roztoku. K měření se používají dvě platinové elektrody, mezi kterými se měří vodivost. Elektromigrační metody Zónová elektroforéza je nejrozšířenější elektroforetickou metodou. Elektroforéza je založená na rozdílné pohyblivosti částic látky v elektrickém poli, která závisí na velikosti náboje, velikosti molekul a vlastnostech prostředí.

18 Zónová elektroforéza využívá jako nosiče acetylcelulózu, nebo různé gely (agarový, agarózový nebo polyakrylamidový). Při dělení na acetylcelulózových, agarových a agarózových fóliích dochází k distribuci převážně podle velikosti náboje. K dělení se v elektroforetické vaně používá napětí V/cm, intenzita stejnosměrného proudu do 0,3 až 0,5 ma/cm a elektroforéza trvá min. Podle uspořádání a zaměření elektroforézy se používají různé druhy pufrů, např. fosfátový, barbitalový nebo trishydroxymetylaminometanový Po ukončení dělení se jednotlivé složky fixují a barví. Pak se fólie odbarví, příp. zprůsvitní a vysuší. Při elektroforéze na polyakrylamidovém gelu se látky dělí nejen na základě elektrického náboje, ale i podle velikosti molekul. Efekt molekulového síta se zesílí v polyakrylamidovém gelu s gradientem hustoty. Jestliže se k polyakrylamidovému gelu přidá laurylsíran sodný (SDS), mají všechny molekuly téměř stejný elektrický náboj a dělí se jen podle velikosti svých molekul.

19 Vyhodnocení obarvených elektroforeogramů se provádí na denzitometru tak, že se elektroforeogram automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené vlnové délky. V místě frakcí dochází k částečné absorpci záření. To se projeví při jeho dopadu na čidlo a převodu signálu na analogový záznam elektroforeogramu. Po zpracování integrátorem získáme číselné výsledky jednotlivých elektroforetických frakcí. Zónová elektroforéza se používá ke stanovení frakcí bílkovin, lipoproteinů, glykoproteinů a jednotlivých izoenzymů. Izoelektrická fokusace probíhá v gradientu ph, který se mění rovnoměrně od kyselé do alkalické oblasti (u anody je ph nejnižší a směrem ke katodě roste). Gradientu se dosahuje pomocí amfolytů, tj. elektrolytů, obsahujících směsi organických látek (se skupinami -NH 2 a - COOH), které se ve stejnosměrném elektrickém poli seřadí podle velikosti svého izoelektrického bodu a vytvoří tak gradient ph. Izoelektrický bod je hodnota ph, při níž je pro danou látku vyvážen počet kladných a záporných nábojů, takže se molekula jeví navenek jako elektroneutrální. Při izoelektrické fokusaci je nosičem agarózový nebo polyakrylamidový gel. Izotachoforéza je analytická metoda pro dělení kationtů a aniontů podle jejich rozdílných pohyblivostí ve stejnosměrném elektrickém poli (až 35 kv). Vzorek je umístěn mezi dva různé elektrolyty s odlišnou pohyblivostí iontů. Na čele se pohybuje vedoucí elektrolyt, který musí mít větší pohyblivost než kterýkoliv z kationtů resp. aniontů (podle typu izotachoforézy) obsažených ve vzorku. Na konci kapiláry je koncový elektrolyt, který má menší pohyblivost než kterýkoliv z kationtů resp. aniontů (podle typu izotachoforézy) obsažených ve vzorku. Jednotlivé složky postupně vytvářejí ostře oddělené zóny seřazené těsně za sebou dle pohyblivosti. Na konci kapiláry je umístěné čidlo, které měří vodivost nebo absorpci UV světla dané vrstvy. Naměřený signál se pak převede na analogový zapisovač a digitalizuje.

20 Kapilární elektroforéza se provádí v tenkých skleněných kapilárách (světlost 0,1 mm) dlouhých až 1 m, které mohou být plněny polyakrylamidovým gelem nebo analytickým pufrem (obvykle fosfátový). Elektroforéza probíhá při vysokém napětí (100 V/cm). Detekce frakce se provádí UV absorpčním detektorem nebo detektorem diodového pole. Kapilární elektroforéza je rychlá (k dělení stačí 3 min), má vysokou rozlišovací schopnost a nízkou spotřebu vzorku. Z blottingových technik se nejvíce používá Western blotting. Některá média jako polyakrylamid neumožňují přímou imunoprecipitaci, ani v nich není vždy dostatečná koncentrace antigenu pro vznik imunoprecipitátu z protilátek, které se zachytí v gelu během zpracování. V těchto případech se převedou bílkoviny z média ve kterém se provedla elektroforéza na aktivovaný nitrocelulózový papír nebo kationizovanou nylonovou membránu, kde se zachytí adsorpcí nebo kovalentní vazbou. Citlivost dosažená tímto způsobem může být až 100-násobně vyšší ve srovnání s přímou imunoprecipitací a vybarvením bílkovin. Fyzikální metody Tlak rozpuštěných, zejména nízkomolekulárních látek a iontů v roztoku odděleném polopropustnou membránou od samotného rozpouštědla se nazývá osmotický tlak. Osmotický tlak je přímo úměrný celkovému počtu rozpuštěných nebo disociovaných částic. Látková koncentrace osmoticky aktivních částic v 1 kg rozpouštědla se označuje jako osmolalita (mmol/kg). V klinické biochemii se používají dva typy osmometrů. První typ využívá snížení bodu tuhnutí roztoku v závislosti na koncentraci částic v roztoku. Osmometry musí být

21 vybaveny velmi citlivým teploměrem, protože snížení teploty tuhnutí je velmi malé (přibližně o 0,5 o C v séru). Druhý typ osmometru sleduje snížení tenze par rozpouštědla nad roztokem (zvýšení bodu varu), resp. snížení rosného bodu par nad roztokem v závislosti na koncentraci částic v roztoku pomocí termoelektrického hygrometru. Při využití průtokové cytometrie se složky moče identifikují a počítají na základě změny vodivosti impedanční elektrodou. Pak se proud vybarvených močových elementů hydrodynamicky zkoncentruje a přechází přes laserový paprsek. Dochází k rozptylu světla elementy a současně k jejich fluorescenci. Výsledek analýzy moče se získává souborným hodnocením (klastrovou analýzou) změn rozptylu světla, fluorescence a vodivosti. Nevýhodou tohoto postupu je, že jednotlivé elementy nevidíme a nemůžeme kontrolovat zjištěný nález. Amplifikace termocyklery a termomixéry Polymerázová řetězová reakce (PCR) je nejrozšířenější způsob amplifikace. Enzymová amplifikace DNA probíhá v termocykleru ve třech teplotních fázích, které se opakují podle potřeby. Prvním krokem je denaturace dvouvláknové DNA na dvě jednovláknové matricové molekuly při 95 C. Následuje ochlazení na 50 až 55 C a hybridizace, kdy se na oba konce amplifikované DNA připojí komplementární oligonukleotidové sondy - primery. Tyto krátké řetězce jsou počátkem syntézy nových vláken, která probíhá při 72 C za katalýzy DNApolymerázou. Jeden cyklus v termocykleru trvá 40 s a pro vizualizaci se vyžaduje při 85 % účinnosti amplifikace 42 až 45 cyklů, což trvá v optimálním případě 30 min. V termocykleru lze paralelně amplifikovat řadu vzorků. Spojením termocykleru s fluorimetrem vznikl světelný cykler. Touto inovací se výrazně urychlila amplifikace a detekce nukleových kyselin a celý proces trvá pouze 20 min. Specifické fluoreskující barvivo po vazbě na dvouvláknovou DNA výrazně zesiluje svou fluorescenci. Fluorimetrem se měří povrchová fluorescence. Izotopové metody Při těchto metodách se používá značení 125 I, což je γ-zářič, tedy zdroj tvrdého záření. Při radioimunoanalýze (RIA) se značí antigen, který se přidává do reakce a soutěží se stanovovaným antigenem o omezený počet míst na protilátce. Při metodě imunoradiometrické (IRMA) je značená protilátka. Na kotvící specifickou protilátku se naváže stanovovaný antigen a pak se přidává druhá protilátka (značená 125 I) v nadbytku.

22 Pro měření γ-záření se používají vícekanálové γ-měřiče (γ-počítače), schopné analyzovat současně více vzorků. Poloautomatický analyzátor sestává (zleva) z dávkovací stanice, inkubátoru, promývací stanice a detekční jednotky. Radioaktivita se měří jako počet impulsů za minutu. Detekční systém je založen na bázi krystalů NaI, které jsou kompaktně spojené s fotonásobičem a celý detektor je umístěný v olověném stínítku. Chromatografické metody Chromatografie na tenkých vrstvách (TLC) využívá rozdělovací, adsorpční, ionexový nebo afinitní princip. Vzorky se nanášejí pipetou na hliníkovou fólii s litým silikagelem nebo oxidem hlinitým a vyvíjejí se v chromatografické komoře v soustavě rozpouštědel. Je možné použít i dvourozměrné tenkovrstevné techniky, kdy se chromatogram po doběhnutí čela rozpouštědla na konec desky vysuší, deska se otočí o 90 o a provede se chromatografie v kolmém směru s jinou soustavou rozpouštědel. Detekce může být destruktivní (reakce s H 2 SO 4, KMnO 4, K 2 Cr 2 O 7 ) nebo nedestruktivní (UV světlo, přechodná absorpce par jódu). Vysoko účinná kapalinová chromatografie (HPLC) dělí látky ve dvoufázovém dělicím systému na základě adsorpce, výměny iontů, fyzikální distribuce látek mezi kapalnou mobilní a s ní nemísitelnou kapalnou stacionární fází, nebo na principu pronikání molekul z mobilní fáze do pórů tuhých částic, které mají funkci molekulového síta. Celý děj se odehrává v chromatografických kolonách. Účinnost chromatografických kolon je obrovská, dosahuje i několika set tisíc pater destilační kolony. HPLC pracuje s úzkými ocelovými, skleněnými nebo křemennými kolonami, které obsahují nosné částice (<10 µm) se stacionární fází. Průtok mobilní fáze probíhá obvykle pod tlakem MPa. Více se používá nízkotlaká HPLC (několik MPa) než vysokotlaká HPLC (desítky MPa).

23 Při dávkování vzorku do kapalinového chromatografu lze v případě nízkotlaké verze použít přímý nástřik na kolonu přes elastickou membránu. Vysokotlaká HPLC vyžaduje speciální ventil s dávkovací smyčkou. Moderní přístroje využívají obvykle dvě pulsní pístová čerpadla, jejichž činnost je fázově posunuta a pohybují se tak, aby došlo k maximálnímu potlačení pulsace toku mobilní fáze (rozpouštědla). Po průchodu ochrannou kolonou se látky rozdělují na koloně zpravidla eluční metodou. Na výstupu z kolony je připojen detektor UV-VIS, fluorimetrický, detektor diodového pole, popřípadě elektrochemický, kde se sleduje coulometricky oxidoredukční reakce stanovovaných látek na pracovní elektrodě. Získaný signál jde na analogový zapisovač a je číselně vyhodnocen integrátorem. Jako detektor lze také použít hmotnostní spektrometr, což je analyticky vynikající, ale technicky náročné řešení, protože je nutné propojit vysokotlakou HPLC část s hmotnostním spektrometrem, kde je naopak vysoké vakuum. Mobilní fáze může mít konstantní polaritu, kdy čerpadlo pumpuje do kolony jediné rozpouštědlo. Tento režim, který se nazývá izokratický, se používá nejčastěji. Je také možné měnit eluční sílu mobilní fáze tak, že se postupně mění zastoupení dvou nebo více rozpouštědel. Tuto gradientovou eluci lze provést jak v nízkotlaké, tak ve vysokotlaké variantě. Stacionární fáze je nepolární a mobilní fáze je polární. Nejrychleji se tedy eluují nejvíce polární sloučeniny. Toto uspořádání se nazývá reverzní (obrácené) fáze. Plynová chromatografie je fyzikálně chemická metoda, při které dochází k dělení směsi látek na základě distribuce mezi mobilní a stacionární fází. Mobilní fází je plyn, stacionární fází může být pevná látka a metoda se označuje jako adsorpční plynová chromatografie, nebo kapalina, a pak se jedná o rozdělovací plynovou chromatografii. Pevné vzorky se předem rozpustí v těkavých kapalinách.

24 Vzorky se nastřikují do vyhřívaného dávkovače přes plynotěsnou elastickou membránu. Pak dochází ke zplynění vzorku a jeho páry jsou nosným plynem, jímž je zpravidla dusík nebo argon, unášeny do vyhřívané kolony. Používají se kolony náplňové nebo kapilární. Při průchodu kolonou se jednotlivé látky dělí na principu adsorpční nebo rozdělovací chromatografie. Po rozdělení procházejí separované sloučeniny detektorem. Detektor pracuje na principu plamenoionizačním, kde se rozdělené složky zavádějí do plamene vodík-vzduch a sleduje se jejich ionizace, nebo se jedná o detektor elektronového záchytu, kde dochází k záchytu elektronů z γ- zářiče eletronegativními atomy stanovované látky a tím ke snížení měřeného ionizačního proudu. Signál jde na analogový zapisovač a integrátorem je zpracován na číselný výstup. Pro stanovení jednotlivých složek separovaných plynovou chromatografií lze použít také hmotnostního spektrometru.

25 Hmotnostní spektrometrie využívá iontového zdroje, kde při vysokém vakuu dostávají molekuly pozitivní náboj. Pak procházejí elektrickým polem, kde se jednotlivé fragmenty i molekulový kation urychlují podle velikosti náboje a kolmo působícím magnetickým polem, kde se vychylují podle své hmotnosti a dopadají na detektor (počítač částic). Tak vzniká hmotnostní spektrum. Literatura: 1. Anderson, S. C., Cockayne, S. Clinical chemistry. Concepts and Applications. New York : McGraw-Hill, 2003, 723 p., ISBN Burtis, C. A., Ashwood, E. R., Bruns, D. E. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics, 4 th Edition. St. Louis: Elsevier Saunders, 2006, 2412 p., ISBN Doležalová, V, Komárek, V., Parák, T., at al. Laboratorní technika v klinické biochemii a toxikologii. Brno : T. D. V. Vladimír Dilhof, 1995, 286 s., ISBN Churáček, J., Boček, P, Horna, A., et al. Nové trendy v teorii a instrumentaci vybraných analytických metod. Praha : Academia, 1993, 387 s., ISBN Kaplan, L. A., Pesce, A. J., Kazmierczak, S. C. Clinical chemistry. Theory, analysis, correlation, 4 rd Edition. St. Louis : Mosby, 2003, 1179 p., ISBN

26 6. Nichols, J. H. Point-if-Care Testing. New York, Basel : Marcel Dekker, Inc., 2003, 500 p., ISBN