Separace purinových derivátů a oligonukleotidů metodou HPLC

Transkript

1 Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Ústav chemie Separace purinových derivátů a oligonukleotidů metodou HPLC Bakalářská práce Brno 2008 Petra Kristová

2

3 Prohlašuji, že jsem při zpracování této bakalářské práce vycházela pouze z uvedené literatury, vlastního výzkumu a z poznatků získaných v laboratořích analytické chemie Přírodovědecké fakulty MU v Brně. Petra Kristová

4 Děkuji RNDr. M. Farkové, CSc. za odborné vedení a užitečné rady při řešení této bakalářské práce. Dále děkuji doc. RNDr. P. Lubalovi, Ph.D. a Ing. B. Hégrové za cenné připomínky a pomoc při získávání experimentálních dat a jejich vyhodnocení. Velké díky také patří všem pracovníkům a studentům analytické chemie Přírodovědecké fakulty MU v Brně.

5 OBSAH 1 Úvod Cíl práce Teoretická část Chromatografické metody kapalinová chromatografie Historie Teorie chromatografie Dělení chromatografie Princip chromatografie Kritéria separace látek Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC Dělení HPLC Chromatografický systém Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení Výhody a nevýhody HPLC Využití HPLC Purinové báze Adenin aminopurin ,6-diaminopurin Metody stanovení purinových derivátů Oligonukleotidy Separace oligonukleotidů Statistické vyhodnocení Experimentální část Přístrojové vybavení Chemikálie RP-HPLC Podmínky měření Optimalizace systému Spektrální vlastnosti purinových derivátů Fluorescenční vlastnosti purinových derivátů Závěr

6 6 Seznam použitých zkratek Seznam použité literatury

7 1 Úvod Puriny jsou přírodní látky, které jsou nedílnou součástí živých systémů. Jsou odvozené od purinového skeletu, který se skládá z pyrimidinového a imidazolového kruhu. Řada derivátů purinu jsou biochemicky významné látky, např. adenin a guanin. Adenin je obsažen v rybách a v některých rostlinách, guanin v hadích a rybích šupinách. Puriny jsou součástí nukleových kyselin a nukleotidů. Mohou se ale vyskytovat i jako samostatné metabolity, např. kofein, theobromin a theofylin. Dalším významným derivátem purinu je kyselina močová, která je konečným produktem metabolismu u ptáků, ještěrek a plazů. U savců tvoří tato kyselina konečný produkt metabolismu nukleových kyselin. 2-aminopurin, 6-aminopurin a 2,6-diaminopurin mají významné biochemické vlastnosti. Identifikace těchto purinových derivátů má svůj význam při studiu metabolických procesů v lidském těle, při kterých může docházet v jednotlivých krocích k chybným přeměnám látek a tyto přeměny mohou způsobit velmi vážné zdravotní problémy. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je analytická metoda používaná pro separaci, identifikaci a kvantitativní analýzu látek ve směsích. Ve své bakalářské práci jsem se zaměřila na optimalizaci podmínek pro separaci purinových derivátů (2-aminopurin, 6-aminopurin a 2,6-diaminopurin) metodou HPLC. Bylo optimalizováno složení mobilní fáze. 2 Cíl práce Cílem práce bylo seznámení s vysokoúčinnou kapalinovovou chromatografií (High Performance Liquid Chromatography, HPLC). Dále jsem se věnovala separaci purinových derivátů a oligonukleotidů touto metodou. 7

8 3 Teoretická část 3.1 Chromatografické metody kapalinová chromatografie Historie Počátek chromatografie je datován od roku Avšak k jejímu rozvoji došlo až v 50. letech 20. století, do té doby se setkávala s nedůvěrou a řadou kritik. Za objevitele chromatografie je považován ruský botanik a chemik Michail Semjovič Cvět, který se věnoval studiu separace pigmentů chloroplastů při fotosyntéze. Jeho cílem bylo izolovat barvivo chlorofyl tak, aby si zachoval své vlastnosti, které má v přírodním stavu. V roce 1890 se Cvět zaměřil na tzv. novou metodu, zabývající se adsorpcí látek rozpuštěných v organických kapalinách na pevných organických sloučeninách nebo na různých minerálech. Dokázal oddělit pigmenty z extraktů na koloně naplněné uhličitanem vápenatým a určil je kvalitativně i kvantitativně. První Nobelova cena za rozvoj této metody byla udělena A. Tiseliovi za výzkumy elektroforézy a adsorpční chromatografie, a to hlavně za objevy komplexní povahy sérových bílkovin. Tiselius rozdělil chromatografii na frontální, eluční a vytěsňovací analýzu. V letech Martin a Synge zjistili, že rychlost separace je omezená difúzní rychlostí rozpuštěné látky z kapalné fáze. V roce 1952 pak získali Nobelovu cenu za objev rozdělovací chromatografie. V 50. letech 20. století byla objevena plynová chromatografie v systému plyn kapalina a od 60. let je chromatografie využívána v mnoha průmyslových odvětvích, a to zejména v potravinářství, farmaceutickém průmyslu, kosmetice, petrochemii, biochemii, zdravotnictví, zemědělství a v řadě dalších odvětví. V letech Halasz, Horvath, Kirkland a Regnier vynalezli techniku vysokoúčinné kapalinové chromatografie HPLC ( High Performance Liquid Chromatography ) [1, 2] Teorie chromatografie Chromatografie je instrumentální analytická metoda. Jejím základem je rozdělení složek směsi mezi dvě fáze, stacionární nepohyblivou a mobilní pohyblivou. Může jít o adsorpci, chemisorpci, rozpouštění, tvorbu komplexů, sítový efekt nebo srážení [2, 3]. 8

9 3.2 Dělení chromatografie Podle povahy mobilní fáze rozlišujeme dva základní typy chromatografických metod: 1) plynová chromatografie je-li mobilní fáze plynná 2) kapalinová chromatografie je-li mobilní fáze kapalná Z hlediska geometrického uspořádání stacionární fáze rozlišujeme: 1) kolonová chromatografie stacionární fázi tvoří sloupec adsorbentu v trubici nebo vrstva adsorbentu na vnitřním povrchu trubice 2) plošná (planární) chromatografie stacionární fáze je nanesená na skleněnou desku, hliníkovou fólii nebo ve formě vrstvy gelu Podle principu separace: 1) rozdělovací chromatografie separace na základě rozdílné rozpustnosti v mobilní a ve stacionární fázi 2) adsorpční chromatografie separace na základě interakcí látek s plynnou a pevnou fází nebo s kapalnou a pevnou fází 3) iontově výměnná chromatografie separace na základě výměny iontů mezi pohyblivou a nepohyblivou fází 4) gelová permeační chromatografie separace na základě rozdílné velikosti molekul separovaných složek 5) afinitní chromatografie separace biologických molekul (určitý biopolymer reaguje s afinitním ligandem, který je navázaný na matrici) Podle vnášení vzorku do chromatografického systému: 1) eluční chromatografie diskontinuální zavádění vzorku, složky vzorku se sorbují silněji než mobilní fáze 2) vytěsňovací chromatografie diskontinuální zavádění vzorku, mobilní fáze se sorbují silněji než složky vzorku 3) frontální chromatografie kontinuální zavádění vzorku Z hlediska účelu rozdělujeme chromatografii: 1) analytická chromatografie 3) preparativní (preparační) chromatografie [2, 3, 4] 9

10 3.2.1 Princip chromatografie Obr.1: Princip chromatografie [2] Mezi stacionární a mobilní fází dochází k distribuci/dělení analytů podle jejich afinity k těmto bázím. Stacionární fáze je zakotvena na pevném nosiči uvnitř kolony. Mobilní fáze protéká pod vysokým tlakem kolonou. Mechanismus separace spočívá v opakování dynamické extrakci analytů na rozhraní obou fází [2, 3, 4]. Z chromatografické kolony je separovaný analyt unášen mobilní fází na detektor. Výstupem chromatografie je závislost signálu na čase, tzv. chromatogram [2, 3, 4]. Obr.2: Chromatogram eluční křivky [2] kde I [mau] = signál, t [min] = čas, t R = retenční čas, t M = mrtvý čas. 10

11 V ideálním případě má pík tvar Gaussovy křivky. Při neideálním průběhu vzniká nesymetrický tvar píku, píky mohou být rozmyté vpředu nebo vzadu [2] Kritéria separace látek Hlavním cílem separace látek u kapalinové chromatografie je co nejlépe separovat složky v přijatelném čase a dosažení dostatečného rozlišení u píků, které by měly mít Gaussovský tvar [4, 5, 6, 7]. Doba od nástřiku na kolonu po dosažení maxima píku se nazývá retenční (eluční) čas t R. Retenční objem V R je celkový objem mobilní fáze, který proteče kolonou od nástřiku až po maximum píku. Retenční objem V R lze vypočítat dle vztahu [4]: kde F je objemový průtok mobilní fáze [4]. Mrtvý retenční čas t M retenční objem V M ze vztahů [4]: V R = t F (1) R (složka se pohybuje stejnou rychlostí jako mobilní fáze) a mrtvý (objem složky, která proteče kolonou bez zadržení na koloně) lze vypočítat t = t + t (2) R R R R M V = V + V (3) kde t R je redukovaný retenční čas, V R je redukovaný retenční objem. Retenční faktor (kapacitní poměr) k i lze vypočítat podle vztahu [4]: M t t V V t V k = R M R M R R i = = = (4) t M VM t M VM Účinnost kolony přímo určuje rozlišení, což je vzdálenost středů dvou píků při základně. Rozdělení píků považujeme za dokonalé, je-li hodnota rozlišení R 1,2 1,5 [4, 6, 7]. R ( t t ) 2 Δt R1 R2 R 1,2 = 2 = (5) w1 + w2 w1 + w2 kde w 1 a w2 jsou šířky píků analytů při základně. Účinnost chromatografické kolony je dána počtem teoretických pater n. Její hodnotu lze vypočítat podle vztahu [3]: kde Y 0, 5 je šířka píku v půlce jeho výšky. t n = 5,54 Y R 0,5 2 (6) 11

12 Výškový ekvivalent teoretického patra H se používá k posouzení kvality náplně kolony a vypočítá se [3]: L H = (7) n kde L je délka chromatografické kolony, n je počet teoretických pater. Van Deemterova rovnice popisuje kinetické děje v koloně, které mají vliv na rozšiřování zón analytu. Výškový ekvivalent teoretického patra závisí na rychlosti průtoku mobilní fáze a skládá se z: H = H + H + H + H (8) v p s m kde H v je vířivá difúze ( H v = A, závisí na vlastnostech stacionární fáze), H p je podélná B difúze ( H p = ), H s a u v mobilní fázi ( H C u H = C u) s s H m představují odpor proti přenosu hmoty ve stacionární a =,. Dosadíme-li do rovnice tyto dílčí příspěvky, dostaneme zkrácenou van Deemterovu rovnici [6, 7]: m m H B = A + + C u (9) u Obr.3: Van Deemterova křivka [6] Optimální průtoková rychlost odpovídá minimu této křivky. Kolona s takovou průtokovou rychlostí má nejvyšší účinnost. 12

13 3.3 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je instrumentální analytická technika, která se používá pro separaci široké škály analytů. K velkému rozmachu této metody došlo v 70 letech minulého století. Mobilní fáze je vždy kapalná, může být polární i nepolární a nesmí chemicky reagovat se žádnou složkou směsi. Mobilní fází může být např. voda, organická rozpouštědla, jako je acetonitril, alkoholy, pufry (např. fosfátový). Stacionární (pevnou) fází mohou být částice silikagelu, na kterých bývají navázány nejčastěji nepolární uhlovodíky, např. oktan C8 nebo oktadekan C18. Obě fáze musí být při separaci vzájemně nemísitelné, tj. musí mít různé polarity. Mobilní fáze i analyty se musejí před stanovením dostatečně odplynit [3, 4, 5]. Metody odplynění: - degaser - ultrazvuk - probublávání inertním plynem Dělení HPLC 1) podle typu fáze: a) chromatografie s normální fází (normal-phase chromatography) Stacionární fází je látka povahy polární, nejčastěji se používá silikagel nebo dioly. Mobilní fází je látka méně polární, například chloroform. b) chromatografie s reverzní fází (reverse-phase chromatography) Stacionární fáze je povahy nepolární, je navázaná na nosič se zakotvenou kapalnou fází. Nosičem může být silikagel, chemicky upravený vrstvou silikonového polymeru. Mobilní fáze je povahy polární. Používají se alkoholy nebo acetonitril, které se často užívají s vodou. Chromatografie s reverzní fází se vyznačuje velkou účinností. 2) podle typu eluce: a) izokratická je-li složení mobilní fáze stálé. Během analýzy je eluční síla mobilní fáze konstantní. Nevýhodou izokratického elučního systému je dlouhá doba analýzy. 13

14 b) gradientová mění-li se složení mobilní fáze. Používá se hlavně pro separaci velkého počtu analytů s různou afinitou ke stacionární fázi. Eluční síla mobilní fáze se zvyšuje se zvyšujícím se obsahem organické fáze. Výhodou gradientového elučního systému je krátká doba analýzy [6, 7] Chromatografický systém Zařízení pro kapalinovou chromatografii se nazývá kapalinový chromatograf. Je tvořen detektorem, kolonou, dávkovacím zařízením, pumpou (jedna nebo více), řídící jednotkou, degaserem (slouží k odplynění mobilní fáze) a PC (na řízení, sběr a zpracování dat). Obr.4: Chromatografický systém [10] Pumpy Jsou používány 3 typy pump: injektorové pumpy, tandemové pístové pumpy a tlakové pumpy, které mohou být vzduchové nebo konstantní. Nejvíce používané jsou tandemové pumpy, které se skládají z malých válcových komor, jejichž písty se pohybují nerovnoměrně. V době, kdy jedno čerpadlo nasává kapalinu, druhé čerpadlo kapalinu vytlačuje skrz ventil do kolony a naopak. Touto pumpou můžeme získat velice stabilní konstantní tlak [5, 6, 7, 8, 9]. 14

15 Kolony Kapalinové chromatografické kolony jsou obvykle složeny z nerezové trubice, avšak někdy jsou používány trubice skleněné nebo plastové pro nižší tlak. Kolona je naplněna polární nebo nepolární stacionární fází. Nejčastěji používanou stacionární fází je silikagel nebo oxid hlinitý. Velikost částic v koloně je od 3 do 5 μm. Většina kolon má délku od 50 do 250 mm a vnitřní průměr od 1 do 4,6 mm. Před chromatografickou kolonu je umístěna tzv. předkolona, která slouží k zadržení různých nečistot [5, 6, 7, 8, 9]. Dávkovací zařízení Provádí se přímý nástřik vzorku pomocí injekční stříkačky přes septum nebo přímo na vrstvu sorbentu, kdy mobilní fáze musí mít zastavený tok. Tato metoda není vhodná pro kvantitativní analýzu. Nejčastěji se používají dávkovací šesticestné vysokotlaké ventily se smyčkou [5, 6, 7, 8, 9]. Detektory Detektor je zařízení sledující zóny analytů, které vychází z kolony, a tím též koncentraci separovaných složek. Výsledkem je chromatografický pík, který vyjadřuje závislost signálu na čase. Detektor má mít vysokou citlivost, široký dynamický rozsah, reprodukovatelnost a co nejnižší mez detekce. Nejvíce se používají spektrofotometrické detektory, které jsou velmi jednoduché, spolehlivé a citlivé. Dále jsou hojně využívány fluorimetrické detektory, které se používají pro látky s přirozenou fluorescencí. Mezi nejuniverzálnější detektory patří refraktometrické detektory. Jejich nevýhodou je malá citlivost. Elektrochemické detektory se používají pro látky, které jsou elektrochemicky aktivní (redukovatelné/oxidovatelné). Pro detekci iontů se užívá vodivostní detektor, který měří elektrickou vodivost eluátu. Hmotnostní detektory reagují na celkové množství detektovaného množství analytu v čidle a jsou vhodné pro identifikaci látek ve směsích.[5, 6, 7, 8, 9] Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení Jako kvalitativní údaje se používají retenční veličiny. Patří sem např. retenční čas nebo objem, které určují, o jakou látku se jedná. Jako kvantitativní údaj se používá plocha píku, která určuje koncentraci složky směsi. 15

16 3.3.4 Výhody a nevýhody HPLC Jednou z hlavních výhod této metody je časová úspora, snížení spotřeby mobilní fáze, selektivita, možnost stanovení široké škály analytů od nepolárních až po polární a také přímý nástřik analytů na kolonu. Nevýhodou HPLC jsou vyšší finanční náklady na analýzu [10] Využití HPLC Využití metody HPLC je široké, např. pro stanovení aminokyselin, peptidů, polyamidů, nukleových kyselin, léčiv, alkaloidů, vitamínů a steroidů [10]. 16

17 3.4 Purinové báze Puriny jsou látky odvozené od purinového skeletu, který se skládá ze šestičetného pyrimidinového a pětičetného imidazolového systému. Obsahují uhlíkové a dusíkové atomy. Chemické a fyzikální vlastnosti purinů: Purinové báze jsou krystalické, ve vodě dobře rozpustné látky, které mají bod varu asi 217 C. Mají plochou strukturu. Jejich vodné roztoky vykazují v ultrafialové oblasti charakteristická absorpční spektra závislá na ph, což se využívá na jejich identifikaci a stanovení. Schopnost absorbovat ultrafialové záření si purinové báze zachovávají i po vazbě na cukernou složku. Tyto heterocyklické sloučeniny nemají centra schopná reagovat s elektrofilními činidly, k nukleofilům se chovají podobně jako pyrimidin. Purinové a pyrimidinové deriváty jeví keto enol tautomerii. Oxoskupiny vytváří dvojice keto enol tautomerů a aminoskupiny zase amino imino tautomerů. Biochemické vlastnosti purinů: Mezi biochemicky významné puriny patří adenin (6 aminopurin) a guanin (2 amino 6 hydroxypurin). Tyto báze jsou základními složkami řady koenzymů (NAD +, FAD + ), nukleosidů (např. adenosin), nukleotidů (ATP) a nukleových kyselin, které jsou nositeli genetické informace. Samotný purin v přírodě nenajdeme, spíše jeho deriváty vznikající substitucí CH 3 -, OH- a NH 2 - skupinami. Nejznámějšími substituovanými purinovými bázemi jsou hypoxanthin, xanthin, kyselina močová, theobromin, theofylin a kofein. Vliv purinů na lidský organismus: Deficit purinů je u lidí vzácný. Způsobuje ho nedostatek kyseliny listové a někdy i vitamínu B 12, ale jen v případě, pokud je tento deficit způsoben nedostatkem folátových derivátů. Mezi lidské choroby způsobené poruchami purinového metabolismu patří dna, Lesch Nyhanův syndrom, deficit purinnukleosidfosforylázy a adenosindeaminázy. Většina těchto poruch se projevuje postižením ledvin, kloubů a neurologickým postižením. Dna je klinický syndrom, který vzniká v důsledku vypadávání krystalků urátu sodného z extracelulární tekutiny při hyperurikémii. Lesch Nyhanův syndrom patří mezi nejčastější onemocnění purinového metabolismu. Většina těchto nemocí je geneticky podmíněna změnami v aktivitě enzymů, které mají za následek abnormální hromadění metabolitů ve tkáních, čímž dochází k poškození organismu. 17

18 Nukleotidy, nukleosidy: Spojením purinové báze s cukernou složkou vznikají tzv. nukleosidy. Po chemické stránce se jedná o heteroglykosidy spojené N-glykosidickou vazbou. Jsou to krystalické látky, lépe rozpustné ve vodě než volné báze. Cukerná složka totiž dodává nukleosidům hydrofilní vlastnosti. Kyselou hydrolýzou se nukleosidy štěpí na volné báze a příslušnou pentózu. Nukleosidy jsou významnými meziprodukty při biosyntéze nukleových kyselin a dalších látek ve tkáních. Nukleotid je nukleosid, kde na pátém uhlíku pentózy je vázán fosfoesterovou vazbou zbytek kyseliny fosforečné. Mezi významné nukleotidy patří adenosin 3, 5 fosfát, který zprostředkovává účinek adrenalinu a aktivuje enzym fosforylázu. Významné postavení v metabolických procesech mají nukleosidpolyfosfáty. Jsou to nukleosidy, které mají k 5 vodíku připojený větší počet fosfátových skupin, spojených do řetězce formou anhydridu. Nukleosidpolyfosfáty představují zdroj energie pro buňku. Nejznámějším je ATP, který je hlavním koenzymem energetického metabolismu, dále se podílí na aktivaci AMK při proteosyntéze a na aktivaci mastných kyselin. Puriny, jejich nukleosidy a nukleotidy jsou biologicky i fyziologicky důležité v medicíně jako součást chemoterapie při léčbě nádorů a také v biologických výzkumech [12, 13, 14, 15, 16, 17, 18] Adenin Chemické a fyzikální vlastnosti: Chemický název je 6 aminopurin. Adenin má sumární vzorec C 5 H 5 N 2. Jeho molární hmotnost činí 135,13 g mol -1. Teplota tání je 360 C a teplota varu 220 C. Obr.5: Vzorec adeninu [12] 18

19 Adenin je purin, skládající se z šestičetného kruhu, který je připojen na pětičetný kruh. Tvoří nukleovou bázi, která je v DNA komplementární s thyminem a v RNA s uracilem. Adenin je základní složkou adenosinmonofosfátu (AMP), adenosindifosfátu (ADP) a adenosintrifosfátu (ATP). ATP je významným zdrojem energie v lidském těle. Je také součástí hub a některých rostlin [12, 16] aminopurin Chemické a fyzikální vlastnosti: 2-aminopurin má stejný sumární vzorec i molární hmotnost jako adenin. Teplota tání je asi 282 C. Obr.6: Vzorec 2-aminopurinu [19, 20] 2-aminopurin je fluorescent analogu guanosinu a adenosinu. Je používán ke zjišťování struktury a dynamiky nukleových kyselin. Jeho fluorescenční vlastnosti jsou vysoce citlivé na změny v chemickém prostředí. 2-aminopurin je vhodný substituent za guanin v komplementaritě bází guanin cytosin v DNA. Dále se jedná o bázi, která způsobuje přeměnu a posunovou mutaci v Escherichia coli. Tyto mutace působí dvěma mechanismy: přímo párováním s cytosinem a nepřímo saturací záměny opravy. 2-aminopurin je isomerem adeninu [19, 20] ,6-diaminopurin Chemické a fyzikální vlastnosti: 2,6-diaminopurin má sumární vzorec C 5 H 6 N 3, jeho molární hmotnost je tedy 150,14 g mol -1. Teplota tání 2,6-diaminopurinu je 302 C a rozpustnost při teplotě 20 C 2,38 g l -1. Obr.7: Vzorec 2,6-diaminopurinu [23] 19

20 2,6-diaminopurin se používá jako lék na leukémii, což je maligní onemocnění kostní dřeně, které způsobuje abnormální bujení bílých krvinek (leukocytů). 2,6-diaminopurin je účinný prekurzor guaninu. Je také užívaný ke změně exocyklických skupin, nacházejících se na purinech. [21, 22, 23, 24] Metody stanovení purinových derivátů Kapilární elektroforéza je analytická metoda, která využívá pohyb nabitých částic malých iontů nebo makromolekul v elektrickém poli. Separace se provádí v tenké skleněné kapiláře s vnitřním průměrem 75 μm. V současné době má tato metoda široké uplatnění, a to díky vysoké separační účinnosti a rychlosti analýzy [28]. Pro stanovení poměru adeninu a cytosinu v oligonukleotidovém řetězci se používá metoda eliminační voltametrie [29]. NMR spektrometrie (Nuclear magnetic resonance, nukleární magnetická rezonance) a MALDI TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry, hmotnostní spektrometrie s laserovou ionizací za asistence matrice a s detekcí zajištěnou pomocí měření doby letu molekul) jsou vhodné na zjišťování molekulové hmotnosti molekul (např. peptidů, proteinů a purinových derivátů) [6, 30]. Z výsledků, ze kterých vycházel R. Tomáš [6] a S. Mach [25], byla pro separaci purinových derivátů zvolena metoda HPLC s reverzní fází C18 a s UV detekcí. Separace byla prováděna na chromatografické koloně Phenomenex Luna C18, 250 x 4 mm, zrnění 5 μm. 20

21 3.5 Oligonukleotidy Oligonukleotidy jsou krátké úseky DNA nebo RNA, které se skládají ze 2 až 100 nukleotidů spojených fosfodiesterovými vazbami. Opakující se jednotka v makromolekule polymeru, jejíž chemické složení odpovídá složení molekuly příslušného monomeru se nazývá Mer (z řecky MEROS části ). Oligonukleotidy nacházejí široké uplatnění v molekulární biologii a v medicíně jako antigenová léčiva [25] Separace oligonukleotidů Metodika získávání čistých oligonukleotidů je založena na tradičních separačních metodách, jako jsou elektroforéza polyakrylamidového gelu (PAGE), iontově výměnná chromatografie nebo HPLC. Metoda PAGE je časově náročná a pracná. Iontově výměnná chromatografie separuje oligonukleotidy podle pozice nabité skupiny. Citlivost separace se snižuje se zvyšující délkou oligonukleotidů. Metoda Trityl on HPLC zachycuje produkty s tritylovou skupinou. Nevýhodou je obtížnost čištění. Trityl on HPLC metoda bývá často kombinovaná s iontově výměnnou chromatografií [26]. Podmínky separace oligonukleotidů HPLC je doporučená metoda pro separaci syntetických oligonukleotidů. Stacionární fází je pórovitý C18. Velikost pórovité částečky je 2,5 μm. Zvýšená teplota a relativně malá rychlost průtoku jsou využity ke zlepšení přenosu. Krátká 50 mm kolona poskytuje účinnou separaci až do 30 mer oligonukleotidů. Mobilní fází je trimethylammonium acetát. Pro vysokou účinnost a separaci heterooligonukleotidů se používá jako mobilní fáze triethylamin s pufrovaným hexafluoroisopropanolem [26]. 21

22 3.6 Statistické vyhodnocení Pro n paralelních stanovení (n 10) provedených pro jeden analyt se směrodatná odchylka s počítá dle vzorce podle vztahu: s = n i= 1 ( x x) i n 1 kde x je hodnota aritmetického měření, n je počet měření Pro malý počet paralelních stanovení (n 7) provedených pro jeden analyt se směrodatná odchylka s vypočítá: 2 (10) s = k R (11) n kde kn je tabelovaná hodnota koeficientu, je závislé na n. R je rozpětí, které se vypočítá: kde x max a x min jsou největší a nejmenší výsledky měření. Relativní směrodatná odchylka s r je definována vztahem: Interval spolehlivosti se počítá podle vztahu: (14) R = x max x min (12) s s r = 100 (13) x t IS = x ± α,υ s n kde n je počet měření, x je hodnota aritmetického průměru, t α, υ je kvantil Studentova rozdělení pro úroveň jistoty 1 - α a počet stupňů volnosti ν = n 1. V našem případě byly použity hodnoty t 0,05, 2 = 4,303 a t 0,05, 9 = 2,262. Pro malé soubory (n 7) se používá výpočet intervalu spolehlivosti navržený Dean Dixonem: IS =, x ± Kα n R (15) kde K α, n je kritická hodnota Lordova rozdělení, je závislé na α i na n, x je hodnota mediánu, což je střední hodnota jednotlivých měření [27]. 22

23 4 Experimentální část 4.1 Přístrojové vybavení - HPLC systém 10 AVP (Shimadzu, Kyoto, Japonsko): a. odplyňovač GT-154, b. systémová řídící jednotka SCL-10AVP, c. pumpa LC-10AVP na přenos mobilní fáze pod tlakem, d. pícka CTO-10ASVP s dávkovacím kohoutem Rheodyne 7120 a dávkovací smyčkou 20 µl na injektování vzorku na kolonu, e. fotometrický detektor s diodovým polem, SPD-M10AVP, řídící software Class-VP 5.02, f. chromatografická kolona rozměrů 250 x 4 mm plněná sorbentem Silasorb C18, zrnění 5µm (silikagel s chemicky vázanou oktadecylovou skupinou) g. injekční stříkačka se speciálně upravenou jehlou pro dávkování vzorků - ultrazvuková lázeň - odměrné baňky a další běžné laboratorní vybavení - fotometr UV VIS SYSTÉM HP 8453 (Hewlett Packard, Praha, Česká republika) - ph metr model 720A (Orion Research, Boston, USA) - spektrofluorimetr Aminco Bowman, Series 2 (AB 2) (Thermospectronic, USA) 4.2 Chemikálie -standard adeninu od firmy Sigma Aldrich, Steinheim, Německo -standard 2-aminopurinu od firmy Sigma Aldrich, Steinheim, Německo -standard 2,6-diaminopurinu od firmy Sigma Aldrich, Steinheim, Německo -thiomočovina od firmy Lachema, Brno, Česká republika -aceton od firmy Lachema, Brno, Česká republika -benzen od firmy Lachema, Brno, Česká republika -toluen od firmy Merci s. r. o, Brno, Česká republika -destilovaná voda křemenná aparatura, Heraeus, Hanau, Německo -dodekahydrát hydrogenfosforečnanu sodného od firmy Lachema, Brno, Česká republika -dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného od firmy Lachema, Brno, Česká republika -methanol od firmy Penta, Chrudim, Česká republika 23

24 4.3 RP-HPLC 4.4 Podmínky měření Při měření je testováno ověření funkčnosti a stavu kolony v systému RP-HPLC v mobilní fázi 70 % methanolu testovací směsí, složené ze 44 ml methanolu, 4 ml acetonu, 1 ml benzenu a 1 ml toluenu. Jednotlivé složky jsou na základě polarity eluovány z kolony v pořadí aceton, benzen a nakonec toluen. Každá chemikálie se musí před stanovením dostatečně odplynit na ultrazvuku. Pro stanovení mrtvého času t M se používá standard thiomočoviny o c = 0,002 mol l -1, který se měří při vlnové délce 254 nm, stejně jako testovací směs. Pro stanovení všech analytů (adenin, 2-aminopurin a 2,6-diaminopurin) byl jako mobilní fáze použit 30 mmol l -1 fosfátový pufr s různým obsahem methanolu a o různém ph. Standard adeninu byl měřen při vlnové délce λ = 260 nm, 2-aminopurinu při λ = 305 nm a 2,6- diaminopurinu při λ = 280 nm. Koncentrace všech standardů byla 0,1 mmol l -1. Průtok mobilní fáze byl 0,5 ml min -1. Objem dávkovaného vzorku byl 20 μl. 4.5 Optimalizace systému Hlavním úkolem při optimalizaci systému bylo nalézt mobilní fázi o složení vhodném pro separaci purinových derivátů, která by zaručovala krátké retenční časy jednotlivých standardů purinových derivátů společně s kvalitním rozlišením (R > 1,5). Pro výpočet směrodatné odchylky a intervalu spolehlivosti byl použit v případech, kdy byl počet měření roven 3, postup podle Dean Dixona. V ostatních případech byla směrodatná odchylka počítána podle vztahu (10) a interval spolehlivosti podle vztahu (14). Úroveň jistoty byla ve všech případech 0,95. Mobilní fází byl fosfátový pufr o c = 30 mmol l -1 ve 14 % methanolu o ph = 7. Průtok mobilní fáze byl 0,5 ml min -1. Objem dávkovaného standardu byl 20 μl. Za těchto podmínek byly měřeny standardy thiomočoviny, adeninu, 2-aminopurinu a 2,6-diaminopurinu při vlnových délkách λ = 254, 260, 305 a 280 nm. Standard thiomočoviny měl koncentraci 0,002 mol l -1, ostatní standardy měly koncentraci 0,1 mmol l -1. Získané výsledky jsou v tabulkách č

25 Tab.č.1: Standard thiomočoviny c = 0,002 mol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 14 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1, λ = 254 nm, V = 20 μl. Číslo stanovení t M [min] V M [ml] A [min] Y 0,5 1 2,709 1, ,10 2 2,709 1, ,11 3 2,709 1, ,11 arit. průměr 2,709 1, ,11 počet teoretických pater: n = 3360 výškový ekvivalent teoretického patra: H = 7, m Tab.č.2: Standard adeninu c = 0,1 mmol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 14 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 260 nm; V = 20 μl Číslo stanovení t R [min] V R [ml] A [min] Y 0,5 1 5,355 2, ,15 2 5,355 2, ,15 3 5,344 2, ,15 arit. průměr 5,352 2, ,15 s(t R ) = 0,006 s r (t R ) = 0,121 % IS = 0,029 t R = (5,355 ± 0,014) min n = 7050 H = 3, m Tab.č.3: Standard 2-aminopurinu c = 0,1 mmol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 14 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 305 nm; V = 20 μl Číslo stanovení t R [min] V R [ml] A [min] Y 0,5 1 4,501 2, ,13 2 4,491 2, ,13 3 4,491 2, ,14 arit. průměr 4,494 2, ,13 s (t R ) = 0,006 s r (t R ) = 0,131 % IS = 0,026 t R =(4,491 ± 0,013) min n = 6620, H = 3, m 25

26 Tab.č.4: Standard 2,6-diaminopurinu c = 0,1 mmol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l 1, 14 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 280 nm; V = 20 μl Číslo stanovení t R [min] V R [ml] A [min] Y 0,5 1 4,277 2, ,13 2 4,277 2, ,13 3 4,288 2, ,14 arit. průměr 4,281 2, ,13 s (t R ) = 0,006 s r (t R ) =0,152 % IS = 0,029 t R =(4,277 ± 0,014) min n = 6008 H = 4, m Tab.č.5: Výpočet kapacitního faktoru k i pro jednotlivé standardy purinových derivátů (MF: fosfátový pufr c = 30 mmol l -1, 14 % MetOH, ph = 7) Standard k i adenin 0, aminopurin 0,6589 2,6-diaminopurin 0,5803 Tab.č.6: Výpočet rozlišení R 1,2 pro jednotlivé standardy purinových derivátů (MF: fosfátový pufr c = 30 mmol l -1, 14 % MetOH, ph = 7) Standard R 1,2 adenin a 2-aminopurin 3,0610 adenin a 2,6-diaminopurin 3, aminopurin a 2,6-diaminopurin 0,

27 Chromatogram purinových derivátů I [mau] adenin 2-aminopurin 2,6-diaminopurin 0 3,5 4 4,5 5 5,5 6 t [min] Obr.8: Chromatogram purinových derivátů (MF = fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 14 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 260, 280, 305 nm, V = 20 μl). Pro zjištění mrtvého času byl použit standard thiomočoviny. Ze zjištěných výsledků vyplývá, že nejdéle se zadržoval na koloně standard adeninu, pak 2-aminopurin a nejméně zadržovaným standardem byl 2,6-diaminopurin. Pro další měření byl jako mobilní fáze použit fosfátový pufr o c = 30 mmol l -1 v 15 % methanolu o ph = 7. Průtok mobilní fáze byl 0,5 ml min -1. Objem dávkovaného standardu byl 20 μl. Za těchto podmínek se měřily standardy thiomočoviny, adeninu, 2-aminopurinu a 2,6- diaminopurinu při vlnových délkách λ = 254, 260, 305 a 280 nm. Standard thiomočoviny měl koncentraci 0,002 mol l -1, ostatní standardy měly koncentraci 0,1 mmol l -1. Získané výsledky jsou v tabulkách č

28 Tab.č.7: Standard thiomočoviny c = 0,002 mol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 15 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1, λ = 254 nm, V = 20 μl. Číslo stanovení t M [min] V M [ml] A [min] Y 0,5 1 2,667 1, ,10 2 2,656 1, ,10 3 2,667 1, ,10 4 2,688 1, ,10 5 2,688 1, ,10 6 2,688 1, ,10 7 2,677 1, ,10 8 2,677 1, ,10 9 2,699 1, , ,699 1, ,10 arit. průměr 2,680 1, ,10 s (t M ) = 0,01 s r (t M ) = 0,522 % IS = 0,020 t M = (2,68 ± 0,01) min n = 3979 H = 6, m Tab.č.8: Standard adeninu c = 0,1 mmol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 15 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 260 nm; V = 20 μl Číslo stanovení t R [min] V R [ml] A [min] Y 0,5 1 5,131 2, ,14 2 5,120 2, ,14 3 5,109 2, ,14 4 5,056 2, ,14 5 5,045 2, ,14 6 5,035 2, ,14 7 4,960 2, ,14 8 4,960 2, ,14 9 4,949 2, , ,960 2, ,14 arit. průměr 5,033 2, ,14 s (t R ) = 0,07 s r (t R ) = 1,351 % IS = 0,096 t R = (5,03 ± 0,05) min n = 7160, H = 3, m 28

29 Tab.č.9: Standard 2-aminopurinu c = 0,1 mmol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 15 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 305 nm; V = 20 μl Číslo stanovení t R [min] V R [ml] A [min] Y 0,5 1 4,277 2, ,13 2 4,267 2, ,13 3 4,256 2, ,13 4 4,309 2, ,15 5 4,309 2, ,15 6 4,299 2, ,15 7 4,213 2, ,13 8 4,192 2, ,13 9 4,224 2, , ,224 2, ,13 arit. průměr 4,257 2, ,14 s (t R ) = 0,04 s r (t R ) = 0,893 % IS = 0,054 t R = (4,26 ± 0,03) min n = 5122 H = 4, m Tab.č.10: Standard 2,6-diaminopurinu c = 0,1 mmol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l 1, 15 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 280 nm; V = 20 μl Číslo stanovení t R [min] V R [ml] A [min] Y 0,5 1 4,021 2, ,13 2 4,032 2, ,13 3 4,032 2, ,13 4 4,021 2, ,13 5 4,035 2, ,13 6 4,117 2, ,14 7 4,107 2, ,14 8 4,107 2, ,14 9 4,107 2, , ,075 2, ,13 arit. průměr 4,065 2, ,13 s (t R ) = 0,04 s r (t R ) = 0,845 % IS = 0,959 t R = (4,07 ± 0,48) min 29

30 n = 5417 H = 4, m Tab.č.11: Výpočet kapacitního faktoru k i pro jednotlivé standardy purinových derivátů (MF: fosfátový pufr c = 30 mmol l -1, 15 % MetOH, ph = 7) Standard k i adenin 0, aminopurin 0,5884 2,6-diaminopurin 0,5168 Tab.č.12: Výpočet rozlišení R 1,2 pro jednotlivé standardy purinových derivátů (MF: fosfátový pufr c = 30 mmol l -1, 15 % MetOH, ph = 7) Standardy R 1,2 adenin a 2-aminopurin 2,771 adenin a 2,6-diaminopurin 3,585 2-aminopurin a 2,6-diaminopurin 0,711 Chromatogram purinových derivátů I [mau] 100 adenin 2-aminopurin 2,6-diaminopurin ,5 4 4,5 5 5,5 6 t [min] Obr.9: Chromatogram purinových derivátů (MF = fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 15 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 260, 280, 305 nm, V = 20μl). Při tomto měření byla použita mobilní fáze fosfátový pufr o c = 30 mmol l -1 v 15 % MetOH o ph = 7. Při této mobilní fázi se jednotlivé standardy eluovaly v kratším retenčním čase než v předchozím měření, kde byla použita stejná mobilní fáze, ale s nižším obsahem MetOH. 30

31 Pro další měření byl jako mobilní fáze použit fosfátový pufr o c = 30 mmol l -1 v 15 % methanolu o ph = 7. Průtok mobilní fáze byl 0,5 ml min -1. Objem dávkovaného standardu byl 20 μl. Za těchto podmínek se měřily standardy thiomočoviny, adeninu, 2-aminopurinu a 2,6- diaminopurinu při vlnových délkách λ = 254, 260, 305 a 280 nm. Standard thiomočoviny měl koncentraci 0,002 mol l -1, ostatní standardy měly koncentraci 0,1 mmol l -1. Získané výsledky jsou v tabulkách č Tab.č.13: Standard thiomočoviny c = 0,002 mol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 16 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1, λ = 254 nm, V = 20 μl. Číslo stanovení t M [min] V M [ml] A [min] Y 0,5 1 2,677 1, ,10 2 2,677 1, ,11 3 2,688 1, ,11 arit. průměr 2,681 1, ,11 s (t M ) = 0,006 s r (t M ) = 0,242 % IS = 0,029 t M = (2,677 ± 0,014) min n = 3982 H = 6, m Tab.č.14: Standard adeninu c = 0,1 mmol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 16 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 260 nm; V = 20 μl Číslo stanovení t R [min] V R [ml] A [min] Y 0,5 1 4,832 2, ,14 2 4,832 2, ,14 3 4,832 2, ,14 arit. průměr 4,832 2, ,14 n = 6599 H = 3, m 31

32 Tab.č.15: Standard 2-aminopurinu c = 0,1 mmol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 16 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 305 nm; V = 20 μl Číslo stanovení t R [min] V R [ml] A [min] Y 0,5 1 4,096 2, ,13 2 4,085 2, ,13 3 4,096 2, ,13 arit. průměr 4,092 2, ,13 s (t R ) = 0,006 s r (t R ) = 0,159 % IS = 0,029 t R = (4,096 ± 0,014) min n = 5489 H = 4, m Tab.č.16: Standard 2,6-diaminopurinu c = 0,1 mmol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l 1, 16 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 280 nm; V = 20 μl Číslo stanovení t R [min] V R [ml] A [min] Y 0,5 1 3,915 1, ,13 2 3,915 1, ,13 3 3,925 1, ,13 arit. průměr 3,918 1, ,13 s (t R ) = 0,006 s r (t R ) = 0,151 % IS = 0,026 t R = (3,915 ± 0,013) min n = 5032 H = 4, m Tab.č.17: Výpočet kapacitního faktoru k i pro jednotlivé standardy purinových derivátů (MF: fosfátový pufr c = 30 mmol l -1, 16 % MetOH, ph = 7) Standard k i adenin 0, aminopurin 0,5263 2,6-diaminopurin 0,

33 Tab.č.18: Výpočet rozlišení R 1,2 pro jednotlivé standardy purinových derivátů (MF: fosfátový pufr c = 30 mmol l -1, 16 % MetOH, ph = 7) standardy R 1,2 adenin a 2-aminopurin 2,741 adenin a 2,6-diaminopurin 3,385 2-aminopurin a 2,6-diaminopurin 0,669 Chromatogram purinových derivátů I [mau] adenin 2-aminopurin 2.6-diaminopurin 0 3,5 4,5 5,5 t [min] Obr.10: Chromatogram purinových derivátů (MF = fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 16 % MetOH, ph = 7; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 260, 280, 305 nm, V = 20μl). Ze všech dosud získaných výsledků plyne, že optimální mobilní fáze je fosfátový pufr o c = 30 mmol l -1 ve 14 % MetOH o ph = 7. Dále byl studován vliv ph mobilní fáze. Jako mobilní fáze byl použit fosfátový pufr o c = 30 mmol l -1 v 15 % methanolu o ph = 7,5. Průtok mobilní fáze byl 0,5 ml min -1. Objem dávkovaného standardu byl 20 μl. Za těchto podmínek se měřily standardy thiomočoviny, adeninu, 2-aminopurinu a 2,6-diaminopurinu při vlnových délkách λ = 254, 260, 305 a 280 nm. Standard thiomočoviny měl koncentraci 0,002 mol l -1, ostatní standardy měly koncentraci 0,1 mmol l -1. Získané výsledky jsou v tabulkách č

34 Tab.č.19: Standard thiomočoviny c = 0,002 mol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 15 % MetOH, ph = 7,5; F = 0,5 ml min -1, λ = 254 nm, V = 20 μl. Číslo stanovení t M [min] V M [ml] A [min] Y 0,5 1 2,699 1, ,10 2 2,699 1, ,10 3 2,699 1, ,10 arit. průměr 2,699 1, ,10 n = 4036 H = 6, m Tab.č.20: Standard adeninu c = 0,1 mmol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 15 % MetOH, ph = 7,5; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 260 nm; V = 20 μl Číslo stanovení t R [min] V R [ml] A [min] Y 0,5 1 4,992 2, ,14 2 4,992 2, ,14 3 5,013 2, ,14 arit. průměr 4,999 2, ,14 s (t R ) = 0,01 s r (t R ) = 0,248 % IS = 0,055 t R =(4,99 ± 0,03) min n = 7064 H = 3, m Tab.č.21: Standard 2-aminopurinu c = 0,1 mmol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 15 % MetOH, ph = 7,5; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 305 nm; V = 20 μl Číslo stanovení t R [min] V R [ml] A [min] Y 0,5 1 4,245 2, ,13 2 4,235 2, ,13 3 4,245 2, ,13 arit. průměr 4,242 2, ,13 s (t R ) = 0,006 s r (t R ) = 0,139 % IS = 0,026 t R =(4,245 ± 0,013) min n = 5899, H = 4, m 34

35 Tab.č.22: Standard 2,6-diaminopurinu c = 0,1 mmol l -1 ; MF: fosfát. pufr o c = 30 mmol l 1, 15 % MetOH, ph = 7,5; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 280 nm; V = 20 μl Číslo stanovení t R [min] V R [ml] A [min] Y 0,5 1 4,064 2, ,13 2 4,064 2, ,13 3 4,075 2, ,13 arit. průměr 4,068 2, ,13 s (t R ) = 0,006 s r (t R ) = 0,160 % IS = 0,029 t R =(4,064 ± 0,014) min n = 5425 H = 4, m Tab.č.23: Výpočet kapacitního faktoru k i pro jednotlivé standardy purinových derivátů (MF: fosfátový pufr c = 30 mmol l -1, 15 % MetOH, ph = 7,5) Standard k i adenin 0, aminopurin 0,5717 2,6-diaminopurin 0,5072 Tab.č.24: Výpočet rozlišení R 1,2 pro jednotlivé standardy purinových derivátů (MF: fosfátový pufr c = 30 mmol l -1, 15 % MetOH, ph = 7,5) Standardy R 1,2 adenin a 2-aminopurin 2,804 adenin a 2,6-diaminopurin 3,448 2-aminopurin a 2,6-diaminopurin 0,669 35

36 Chromatogram purinových derivátů I [mau] 100 adenin 2-aminopurin 2,6-diaminopurin ,5 4 4,5 5 5,5 6 t [min] Obr.11: Chromatogram purinových derivátů (MF = fosfát. pufr o c = 30 mmol l -1, 15 % MetOH, ph = 7,5; F = 0,5 ml min -1 ; λ = 260, 280, 305 nm, V = 20μl). V tomto případě byl jako mobilní fáze použit fosfátový pufr o c = 30 mmol l -1 v 15 % MetOH o ph 7,5. V porovnání s mobilní fází fosfátového pufru o c = 30 mmol l -1 v 15 % MetOH o ph = 7 se retenční časy jednotlivých standardů zkrátily jen o velmi malé hodnoty. Pro separaci standardů purinových derivátů byl jako optimální mobilní fáze použit fosfátový pufr c = 30 mmol l -1 ve 14 % methanolu, ph = 7, protože hodnoty R 1,2 pro jednotlivé standardy purinových derivátů se nejvíce blížily kvalitnímu rozlišení (R 1,5). 36

37 4.6 Spektrální vlastnosti purinových derivátů Molekulová absorpční spektroskopie v oblasti UV/VIS je metoda, založená na interpretaci změn nastávajících v molekulách při absorpci záření v rozmezí vlnových délek od 200 až 800 nm. Látky, které absorbují záření v ultrafialové oblasti, jsou bezbarvé. Přechody mezi elektronovými hladinami způsobené absorpcí UV/VIS záření jsou energeticky nejnáročnější [3, 4]. Adenin A 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, ph = 2 ph = 3 ph = 4 ph = 5 ph = 6 ph = 7 ph = 8 λ [nm] Obr.12: Spektrální vlastnosti adeninu o c = 0,1 mmol l -1 při různém ph 2 - aminopurin 2 1,8 1,6 1,4 1,2 A 1 0,8 0,6 0,4 0, ph = 2 ph = 3 ph = 4 ph = 5 ph = 6 ph = 7 ph = 8 λ [nm] Obr.13: Spektrální vlastnosti 2-aminopurinu o c = 0,1 mmol l -1 při různém ph 37

38 2,6 - diaminopurin 2 1,8 1,6 1,4 1,2 A 1 0,8 0,6 0,4 0, ph = 2 ph = 3 ph = 4 ph = 5 ph = 6 ph = 7 ph = 8 λ [nm] Obr.14: Spektrální vlastnosti 2,6-diaminopurinu o c = 0,1 mmol l -1 při různém ph Adenin, 2-aminopurin a 2,6-diaminopurin při ph = A 3 2 Adenin 2-aminopurin 2,6-diaminopurin λ [nm] Obr.15: Spektrální vlastnosti adeninu, 2-aminopurinu a 2,6-diaminopurinu při ph = 7 U obr.12 křivka ph = 4 překrývá křivku ph = 5, u obr.13 křivka ph = 3 a křivka ph = 7 překrývají křivku ph = 7 a u obr.14 křivka ph = 2 a křivka ph = 6 překrývají ph = 7. Zdrojové hodnoty jsou totožné. Tato skutečnost ukazuje na systematickou chybu při sběru dat. 38

39 Ze získaných spekter jednotlivých standardů purinových derivátů byla zjištěna absorpční maxima adeninu při 260 nm, 2-aminopurinu při 305 nm a 2,6-diaminopurinu při 280 nm. Tyto puriny lze tedy spektrofotometricky separovat, což ukazuje obr.č

40 4.7 Fluorescenční vlastnosti purinových derivátů Fluorimetrie je metoda, která je založená na využití sekundárních emisních spekter molekul v ultrafialové a ve viditelné oblasti záření. Tato spektra vznikají na základě deaktivace molekul předem excitovaných absorpcí záření ve spektrální oblasti. Fluorimetrie nachází široké uplatnění v analytické chemii pro stanovení velmi citlivých a selektivních látek, které jsou obtížně stanovitelné jinými metodami. Excitační spektrum zobrazuje závislost fluorescenčního toku dané látky na vlnové délce λ excitujícího záření při konstantní vlnové délce emitovaného záření. Emisní spektrum zobrazuje závislost intenzity fluorescence na vlnové délce λ při konstantní vlnové délce excitace. Stokesův posun je rozdíl emisního a excitačního maxima [4]. Emisní a excitační spektrum adeninu Fluorescence (a. u) vlnová délka (nm) Obr.16: Emisní a excitační spektrum adeninu o c = 0,002 mol l -1 (napětí na fotonásobiči 820 V, emisní maximum při 359 nm, excitační maximum při 290 nm, Stokesův posun 69 nm) 40

41 Emisní a excitační spektrum 2-aminopurinu Fluorescence (a. u) vlnová délka (nm) Obr.17: Emisní a excitační spektrum 2-aminopurinu o c = 0,002 mol l -1 (napětí na fotonásobiči 520 V, emisní maximum při 364 nm, excitační maximum při 265 nm, Stokesův posun 99 nm) Emisní a excitační spektrum 2,6-diaminopurinu 120 Fluorescence (a. u) vlnová délka (nm) Obr.18: Emisní a excitační spektrum 2,6-diaminopurinu o c = 0,002 mol l -1 (napětí na fotonásobiči 520 V, emisní maximum při 347 nm, excitační maximum při 309 nm, Stokesův posun 38 nm) Všechny výše uvedené standardy vykazují fluorescenci, bylo by tedy možné je tyto standardy detekovat fluorescenčním detektorem pro separaci na HPLC. 41

42 5 Závěr Ve své bakalářské práci jsem se zabývala separací purinových derivátů (adenin, 2- aminopurin a 2,6-diaminopurin) metodou HPLC. Cílem bylo nalézt takové podmínky, které by zaručovaly krátké retenční časy a vysoké rozlišení mezi jednotlivými analyty. Separace byla prováděna na chromatografické koloně, která byla naplněna sorbentem Silasorb C18. Velká část této práce je věnována optimalizaci podmínek pro separaci uvedených purinových derivátů. Na základě informací z literatury a získaných výsledků byly jako optimální nalezeny tyto podmínky: fosfátový pufr o koncentraci 30 mmol l -1 ve 14 % methanolu při ph = 7 a rychlost průtoku 0,5 ml min -1. Za těchto podmínek se podařilo dosáhnout kvalitní separace purinových derivátů, a to adeninu s 2-aminopurinem a adeninu s 2,6-diaminopurinem. Při separaci standardů 2-aminopurinu a 2,6-diaminopurinu nebylo dosaženo tak kvalitního rozlišení jako u ostatních standardů. Dalším krokem bylo zjišťování spektrálních vlastností jednotlivých analytů při různém ph. Ze získaných spekter bylo zjištěno, že různé standardy mají absorpční maxima při různé vlnové délce: adenin při 260 nm, 2-aminopurin při 305 nm a 2,6-diaminopurin při 280 nm. Zmíněné puriny lze tedy spektrofotometricky separovat. Poslední částí bakalářské práce byla věnována fluorescenčním vlastnostem purinových derivátů. Všechny uvedené látky lze stanovit fluorimetricky. Z výsledků vyplývá, že nejlépe fluoreskuje 2-aminopurin a nejméně 2,6-diaminopurin. 42

43 6 Seznam použitých zkratek ADP adenosindifosfát AMK aminokyselina AMP adenosinmonofosfát ATP adenosintrifosfát DNA deoxyribonukleová kyselina FAD + flavinadenindinukleotid HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie MALDI TOF MS hmotnostní spektrometrie s laserovou ionizací za asistence matrice a s detekcí zajištěnou pomocí měření doby letu molekul Mer opakující se jednotka v makromolekule polymeru, jejíž chemické složení odpovídá složení molekuly příslušného monomeru MetOH - methanol MF mobilní fáze NAD + nikotinamidadenindinukleotid NMR nukleární magnetická rezonance PAGE elektroforéza polyakrylamidového gelu RNA ribonukleová kyselina 43

44 7 Seznam použité literatury [1] Smolková-Keulemanová E., Chem. Listy 97, (2003) [2] Havliš J., Separační metody A, studijní materiál k přednáškám Separační metody, MU, Brno [3] Pěnčíková H., Analytická chemie a chemická laboratorní cvičení, SPŠCH, Brno, 200 s, 2003 [4] Holzbecher Z., Churáček J. a kol., Analytická chemie, vyd: SNTL, Praha, 652 s, 1987, ISBN [5] Skoog D. A, et al, Analytical Chemistry - an introduction, 7 th ed. Fort Worth: Saunders College Publishing, 2000, 773 s, ISBN [6] Tomáš R., Inosin, deoxyinosin, adenosin, deoxyadenosin jako metabolické markery. Jejich stanovení pomocí metody HPLC a HPLC s kapilární monolitickou kolonou, Diplomová práce, MU, Brno, 2005 [7] Jedličková L., Stanovení trichothecenových mykotoxinů v ječmeni a sladu, Diplomová práce, MU, Brno, 2007 [8] Coufal P., HPLC, 2004, Dostupné na WWW: < [cit: ] [9] Chromatografie, Dostupné na WWW: < [cit: ] [10] Separační metody v analytické chemii, Dostupné na WWW: < [cit: ] [11] Pacáková V., Kapalinová chromatografie v analytické toxikologii, UK, Praha, Dostupné na WWW: < [cit: ] [12] Adenine, Dostupné na WWW: < [cit: ] [13] Koutník V., Vybrané kapitoly z organické chemie, SPŠCH, Brno, 86 s, 1998 [14] Schneiderka P. a kolektiv, Kapitoly z klinické biochemie, Univerzita Karlova v Praze, vyd: Karolinum, Praha

45 [15] Kaňková K., Poruchy metabolismu a výživy, MU Brno, 59 s, 2005 [16] Duchoň J. a kolektiv, Lekárska chémia a biochémia, vyd: Osveta, Martin, 1988, ISBN [17] Vodrážka Z., Biochemie, vyd: Academia, Praha, 506 s, 1999, ISBN [18] Murray R. K., Harperova biochemie, vyd: H&H, Praha, 872 s, 2001, ISBN [19] Jean J. M. and Hall K. B., Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, St. Louis, edited by E.R. Davidson, November 1, 2000, [20] Pitsikas P., Patapa J. M., Cupples C. G., Mechanism of 2-aminopurine stimulated mutagenesis in Escherichia coli, Mutation Research, Volume 550, Issues 1-2, June 2004, Pages [21] 2,6-diaminopurine, Dostupné na WWW: < [cit: ] [22] Thermo scientific, Dostupné na WWW: < [cit: ] [23] 2,6-diaminopurine, Dostupné na WWW: < [cit: ] [24] Dostupné na WWW: < [cit: ] [25] Mach S., Možnosti studia sekvence oligonukleotidů pomocí elektrochemických a separačních metod (voltametrie, HPLC), Diplomová práce, MU, Brno, 2008 [26] Gilar M., Fountain J. K., Budman Y., Neue U. W., Yardley K. R., Rainville P. D., Russel R. J., Gebler J.C, Ion pair reserved - phase high performance liquid chromatography analysis of oligonucleotides, Journal of chromatography A, 958 (2002), , USA, [27] Lubal P., Šenkýř J., Kvalitativní a kvantitativní analýza, MU, Brno, 2006 [28] Kapilární elektroforéza, Dostupné na WWW: < [cit: ] [29] Eliminační voltametrie, Dostupné na WWW: < [cit: ] [30] Heteronukleární NMR spektroskopie purinových derivátů a jejich komplexů, Dostupné na WWW: < [cit: ] 45