Úvodní přednáška k PCR. Doc. RNDr. J: Pazlarová, CSc

Transkript

1 Úvodní přednáška k PCR Doc. RDr. J: Pazlarová, CSc

2 Deoxyribonukleová kyselina Deoxyribonucleic acid DA

3 Úvod Studie na jednobuněčných organismech vedly k poznání, že genetické informace, podle kterých se tvoří jednotlivé proteiny těchto organismů, jsou obsaženy v genech, tvořených deoxyribonukleovými kyselinami (DA). Teprve určení struktury DA umožnilo pochopit, jakým způsobem je zakodována instrukce pro tvorbu bílkovin.

4 DA a její struktura Molekula DA se skládá ze dvou komplementár-ních řetězců nukleotidů. Dlouhá polynukleotidová vlákna DA jsou složeny ze čtyř typů podjednotek (monomérů). ukleotidy jsou propojeny pomocí kovalentních vazeb deoxyribosy a fosfátové skupiny, čímž se tvoří t.zv."skelet", ve kterém se střídají cukr-fosfát-cukr-fosfát atd. a deoxyribosu jsou navázány dané báze, a to adenin (značený A),cytosin (C), guanin (G) nebo thymin (T).

5 Složky DA 2-deoxy-D-ribosa H H 2 CH 2 OH O OH H H H H O OH H Adenin Guanin Cytosin H 2 O H Thymin H O H 3 C H H H O H 2 Ve vláknech DA jsou umístněny nukleosidy s anti-konformací příklad : deoxyadenosin H 2 H O CH 2 O H H H H OH H

6 Dvojšroubovnice DA Oba polynukleotidové řetězce vytváří dvojšroubovnici pomocí vodíkových můstků mezi nukleotidovými bázemi, a to mezi bází purinového a bází pyrimidonového typu (adenin -thymin nebo guanin - cytosin a naopak). Toto párování se ukázalo z hlediska energetického jako nejvýhodnější. O CH 3 O H H H O H H H H O H Thymin Adenin Cytosin Guanin Vzhledem na způsob vytváření polymeru je zřejmé, že řetězec polynukleotidů je polarizován. Je-li zakončení -OH skupinou sacharidu, je označován jako 3, končí-li fosfátovou skupinou, pak 5. Všechny báze jsou uvnitř dvojšroubovnice, cukrofosfátový skelet je pak vně.

7 Transkripce DA v prokaryotní buňce Biologická informace je zakódována pomocí čtyřpísmenkové abecedy, a to : A - T T - A G - C C - G DA neřídí přímo syntézu bílkovin, nýbrž je zkopíro-vána - transkribována - do jiné nukleové kyseliny - do ribo-nukleové kyseliny (RA). Teprve podle RA jsou tvořeny bílkoviny.

8 Transkripce DA do RA enzymem RApolymerasou RA-transkript RA-polymerasa dvojšroubovnice DA místo opětného spojení -faktor místo rozepnutí Buňka uskutečňuje své genetické informace teprve transkripcí a translací DA do RA a pak do bílkovin. ejprve dojde k rozvolnění určitého úseku dvojšroubovnice DA, pak jeden z uvolněného úseku slouží jako matice (templát) pro tvorbu RA.

9 Replikace DA semikonzervativní způsob replikace DA in vivo složitý komplex interakcí mezi proteiny a DA počátek oric, rozvolnění dvoušroubovice DA polymerasa - klíčová úloha

10 Bakteriální RA-polymerasa Bakteriální RA-polymerasa se váže slabě na molekulu DA. Jakmile RA-polymerasa náhodně narazí na DA, začne po ní rychle skluzem lézt. Když RA-polymerasa nalezne v sekvenci DA promotor, který má informaci o začátku transkripce, pevně se naváže, rozvolní v krátkém úseku dvojšroubovnici DA a začne vytvářet jednořetězcový úsek RA.

11 mra Zdrojem výstavby RA jsou ribonukleosidtrifosfáty (ATP, UTP, CTP a GTP). V RA je thymin nahražen uracilem, takže, kde je v DA thymin, je v RA uracil. Takže pro RA je čtyřpísmenkový kód A - U G - C C - G U - A

12 Polymerázová řetězová reakce Autor Kary Mullis obelova cena za chemii, 1993 Molekulárně genetická metoda Selektivní zmnožení určité oblasti DA způsobem podobným in vivo replikaci

13 Polymerázová řetězová reakce Princip PCR je založen na využití DA polymerázy pro opakované kopírování templátové (vzorové) molekuly DA. Syntéza je řízena krátkými oligonukleotidy (primery), které nasedají na templátovou DA na začátku a konci amplifikovaného fragmentu, každý s jiným vláknem původní dvouřetězcové DA. PCR je velice citlivá metoda umožňující detekci až jediné buňky. Mnohonásobné amplifikace je dosaženo opakováním tří základních kroků - denaturace, hybridizace a syntézy nových vláken

14 Polymerázová řetězová reakce Vysvětlení základních pojmů templát DA, která slouží jako vzor (šablona) pro syntézu nových řetězců. Pro reakci PCR se používá genomová DA o koncentraci přibližně 10 ug/ml. DA polymeráza termostabilní enzym používaný k syntéze nové DA ve směru 5-3 podle sekvence nukleotidů v templátu od místa navázaného primeru až po jeho konec. Enzym Taq DA, který se nejčastěji používá pro PCR, je izolován z bakterie Thermus aquaticus a umožňuje opakované zahřátí na teplotu 95 C. Enzym zůstává při této teplotě aktivní až 40 minut. dtp - nukleotidtrifosfáty (adenin, guanin, cytosin a thymin)

15

16 annealing temperature extending temperature

17 Teploty řídící PCR Denaturace DA C Prodlužování, extense 72 C asednutí, annealing velká variabilita teplot. Hlavní faktor - GC% primerů. Primery bohaté na GC - 63 C, 62 % Primery s nízkým obsahem GC - 45 C 33 %

18 Polymerázová řetězová reakce Vysvětlení základních pojmů primery jsou oligonukleotidy (obvykle bazí), které svou sekvencí odpovídají DA templátu a které vymezují úsek templátu, který bude amplifikován master mix reakční směs zajišťující optimální podmínky pro průběh reakce. Je složena z koncentrovaného pracovního pufru obsahujícího hořečnaté ionty zajišťujícího vhodné podmínky pro aktivitu polymerázy, směsi dtp, polymerázy, specifických primerů a vody. termocykler (teplotní cyklátor) - je zařízení, ve kterém za optimálních teplotních podmínek probíhá PCR reakce. marker velikostní standard, používá se k odhadu velikostí DA produktů na základě pohyblivosti v agarózovém gelu

19 1) primer (oligonucleotide) sequence random primers will amplify anything (usually a mixture of short oligonucleotides (6-10 nt) degenerate primers, contain a few wobbly nucleotides (mixture of oligos with a different nucleotide in the wobbly positions), can bind multiple related templates eg. TGYGCGGRCCAT (-any base; Y-either pyrimidine, R-either purine) specific primers, designed to amplify exactly matching template

20 2) annealing temperature Computer programs and web-sites exist that can calculate Tm for primers in various salt concentrations, as well as predict possible secondary structure (hairpins) or primer-dimer formation. Custom oligo synthesis fully automated, commercially available, relatively cheap. Many primer modifications available (fluorescence, DIG, end-group tagging, etc)

21 2) annealing temperature Computer programs and web-sites exist that can calculate Tm for primers in various salt concentrations, as well as predict possible secondary structure (hairpins) or primer-dimer formation. Custom oligo synthesis fully automated, commercially available, relatively cheap. Many primer modifications available (fluorescence, DIG, end-group tagging, etc)

22 Amplifikace DA tři opakující se kroky: 1. denaturace 2. annealing 3. polymerace Enzym DA polymerase používá primery jako startovací body pro syntézu nového řetězce Při teplotě 94 C se oddělují řetězce DA C nasedají primery 2. Polymeráza pokračuje v syntéze nového řetězce komplementárně k cílové DA sekvenci Cílová DA sekvence, ohraničená primery, je zdvojená a proces může znovu začít

23 PCR PCR se používá převážně pro amplifikaci úseků DA do 2000 bazí. S větší délkou roste pravděpodobnost chyb polymerasy. Používané oligonukleotidové primery mají mezi nukleotidy, důležitá je rovnoměrná distribuce oblastí bohatých na G/C a A/T páry, specifický annealing a pevnost vazby při C. Pro PCR je důležitá čistá práce, tj. vyhýbat se kontaminacím v laboratoři (rukavice, nekontaminované chemikálie atd.). Produkty PCR se analyzují elekroforézou (velikost), jinou možností je hybridizace se značenými oligonukleotidy, detekce značenou protilátkou Real-time termocykléry - amplifikovaná DA je detekována v exponenciální fázi citlivými on-line metodami (fluorescence -proby, barviva).

24 eúspěšná PCR Špatně izolovaná genomová DA Kontaminace externí DA, dochází k tvorbě nežádoucích sekvencí. Jaká je prevence? Rozdělení pracovního prostoru do oblastí, ve kterých se provádí jednotlivé kroky. Odstranění inhibitorů PCR(cerebrospinální tekutina, hemoglobin, laktoferin, faeces)

25 Facilitátory - usnadňovače PCR BSA, hovězí serum albumin Betain Zlepšují specifitu a přesnost syntézy DA

26 Interní kontrola PCR Interní kontrola ( IC) je tvořena molekulami nukleové kyseliny, které (i) obsahují vazebná místa pro dané primery, (ii) jsou odlišitelné od aktuální cílové molekuly přítomností specifické oblasti probe binding region. Při úspěšné amplifikaci vzorku s cílovou K a IC, vznikají dva typy produktů. Správný poměr IC a primerů nutno vyzkoušet.

27 Závěr : 1) Reakci PCR je nutné empiricky optimalizovat 2) Existují protokoly,které budou funkční pro většinu aplikací ( rutinní PCR ) t.zn. Byly již někým optimalisovány

28 Detekce Campylobacter jejuni, C. coli a C. laridis pomocí PCR Složení PCR reakční směsi: Primery specifické pro 16S RA genu 0,44 μm ukleotidy 200 μm Tth DA polymeráza 1U Pufr pro Tth DA polymerázu 1x Templát DA 2 μl Voda do objemu 50 μl Teplotní režim PCR: Proces Teplota [ C] Čas Počáteční denaturace 94 2 min 35x cyklus denaturace sec annealing sec syntéza sec Závěrečná syntéza 72 4 min

29 Způsoby detekce PCR produktu po ukončení amplifikační reakce pomocí barviv integrující s DA (Ethidium bromid) radioaktivní značka přímo v PCR produktu nebo hybridizační sondě (radioaktivní izotopy) neradioaktivní značka digoxigenín, biotín (protilátky konjugované s enzymem), fluorescenční barviva a enyzmy

30 Elektroforetická detekce produktu PCR ejčastěji agarosová gelová elektroforéza Fragmenty DA elektrické pole podle velikosti Může být detekován až 1 ng DA Gel barven ethidium bromidem Ethidium bromid interkalační činidlo vážící se mezi vlákna DA a floreskuje po ozářením UV o λ nm

31 Způsoby detekce PCR produktu po ukončení amplifikační reakce pomocí barviv integrující s DA (Ethidium bromid) radioaktivní značka přímo v PCR produktu nebo hybridizační sondě (radioaktivní izotopy) neradioaktivní značka digoxigenín, biotín (protilátky konjugované s enzymem), fluorescenční barviva a enyzmy

32 Výsledky PCR Mr bp 500 bp Mr marker 100bp 1. Pozitivní kontrola 2. egativní kontrola 3. DA C. jejuni 4. DA C. coli 287 bp 100 bp

33 PCR Salmonella profile II, cycler Biometra - T gradient Mr A B C D Mr 372 bp A concentration 1.4*10 8 cells of Samonella in 1ml, added 1.4*10 5 in each PCR reaction B concentration 1.4*10 7 cells of Samonella in 1ml, added 1.4*10 4 in each PCR reaction C concentration 1.4*10 6 cells of Samonella in 1ml, added 1.4*10 3 in each PCR reaction D concentration 1.4*10 5 cells of Samonella in 1ml, added 1.4*10 2 in each PCR reaction incubation:37ºc, 24 hours, BHA plates

34 Analýzy po elektroforetickém rozdělení hybridizační analýza PCR produkt přenést na membránu Southern blot hybridizace s označenou specifickou DA sondou štěpení restrikčními enzymy specifický produkt PCR fragmenty DA o známé délce

35 Detekce PCR produktu během amplifikační reakce = Real Time PCR Systém TaqMan 5 exonukleázová aktivita Taq DA polymerazy a dvojitě značená fluorescenční oligonukleotidová sonda sonda 5 konec fluorescenční značka - 3 konec zhášecí značka

36

37

38

39

40

41 Reversní transkriptasa Reversní transkriptasa, RA-dependentní DA polymerasa, je enzym typu DA polymerasy který přepisuje jednořetězcovou RA na jednořetězcovou DA. ormální transkripce přepis, znamená syntézu RA z DA; takže, reversní transkripce je opak- reverse tohoto procesu. Reversní transkriptasa byla objevena Howardem Teminem na Universitě Wisconsin-Madison, a nezávisle také Davidem Baltimorem v roce Oba dva získali v roce 1975 obelovu Cenu za fysiologii a lékařství

42 Příklady reversní transkriptasy Běžné příklady reversní transkriptasy zahrnují: HIV-1 reversní transkriptasu z virusu lidské imunodeficience (human immunodeficiency virus) typ 1 (PDB 1HMV) M-MLV reversní transkriptasa z leukemického viru myší (Moloney murine leukemia virus) AMV reversní transkriptasa z ptačího viru (avian myeloblastosis virus) Telomerasa reversní transkriptasa, která reprodukuje telomery eukaryotických chromosomes

43 Rozdělení metod a přístupů užívaných k identifikaci mikroorganismů Klasický přístup (sledování fyziologických vlastností) - morfologie - nutriční požadavky - chemie buněčné stěny - struktura zásobních látek - obsah a složení pigmentů - schopnost využívat různé zdroje energie - patogenita - nároky na vodu, teplo, kyslík, tolerance k ph - citlivost k antibiotikům

44 Rozdělení metod a přístupů užívaných k identifikaci mikroorganismů Moderní metody identifikace (teorie) - klasické metody nedokáží dostatečně přesně mapovat fylogenezi jednotlivých druhů - nutnost najít spolehlivé fylogenetické markery 1965 (Zuckerkandl a Pauling) naznačili, že jediný kdo se přímo účastní evolučního procesu jsou molekuly, resp. molekulární sekvence molekuly RA úzce spojené s translací (transférové a ribozomální RA) (fylogeneze = proces, ve kterém se řadí organismy do linie, která se vyvinula oddělením od společných předků)

45 Rozdělení metod a přístupů užívaných k identifikaci mikroorganismů Moderní metody identifikace (teorie) - molekuly rra (16S a 23S rra) mají všechny předpoklady fylogenetických markerů (univerzální distribuci, strukturální i funkční zachovalost a dostatečnou velikost) Organizace ribozomální DA (rda) u různých druhů Model struktury 16S rra E. coli

46 Rozdělení metod a přístupů užívaných k identifikaci mikroorganismů Moderní metody identifikace (praxe) - významné vědecké objevy RESTRIKČÍ EDOUKLEÁZY (1978 obelova cena za medicínu: Daniel athans, Hamilton Smith) Revoluci v práci s nukleovými kyselinami přinesl objev tzv. restrikčních endonukleáz II. typu, které rozpoznávají v molekule DA krátké specifické sekvence a v místě výskytu této sekvence molekulu štěpí. Jako příklad můžeme uvést nejznámější restrikční endonukleázu EcoRI (podle zdroje - bakterie Escherichia coli, RI = restriktáza č. 1), která rozpoznává sekvenci 5'-GAATTC-3' a štěpí fosfodiesterovou vazbu v řetězci mezi prvním guanosinem (G) a druhým adenosinem (A).

47 Rozdělení metod a přístupů užívaných k identifikaci mikroorganismů Moderní metody identifikace (jednotlivé metody) - PCR (varianty a modifikace) a) náhodná PCR neboli náhodná amplifikace polymorfní DA (RAPD) b) interrepetitivni PCR (REP-PCR) c) amplifikace vnitřních přepisovaných mezerníků (ITS-PCR) - detekce polymorfismů a) polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) b) polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) c) polymorfismus délky fragmentů DA vytvořených cleavasou (CFLP) - sekvenování a) chemická metoda Maxamo-Gilbertova b) enzymová Sangerova metoda