Validace analytické metody

Transkript

1 Nejoty v analytcké chem přednáška z cyklu Analytcká cheme II Patrk Kana Proč valdace metod a nejoty výsledků? Výsledky analýz se v dnešní době čím dál tím víc podílejí na rozhodnutích s významným ekonomckým náklady. Z toho vyplývá nutno mít spolehlvá a věrohodná data. K získání takových dat je třeba vždy vybrat nejvhodnější analytckou metodu. Valdace analytcké metody a prové její VALIDACI pro daný účel a k získaným výsledkům přřadt jejch NEJISTOTY Co je valdace analytcké metody? K čemu je valdace užtečná? - proces, př němž se určuje vhodno dané analytcké metody pro získání spolehlvých dat Laboratoře by měly prokázat, že pracují v syému jako, jsou odborně kompetentní a jsou schopny produkovat věrohodné výsledky. - př valdac posuzujeme, zda jsou parametry analytcké metody takové, aby bylo možno touto metodou získat výsledky požadované jako Mez základní prvky syému jako patří: Valdace měřcí metody Nejota výsledku měření

2 K čemu je valdace užtečná? Jaké metody by měly být valdovány? valdace poskytuje nformace o pracovních charakterkách analytcké metody valdace zvyšuje spolehlvo výsledku: pro užvatele metody (analytka v laboratoř pro užvatele výsledků (zákazníka valdace umožňuje lepší dalog mez zákazníkem a analytkem! neandardní vyvnuté v laboratoř andardní, ale používané mmo rámec andardu andardní, ale upravené laboratoří Zdroje andardních metod: - poupy uveřejněné v meznárodních, regonálních, národních normách (ISO, EN, DIN, BS, ASTM, - poupy uveřejněné uznávaným organzacem v jejch publkacích (AOAC pro potravny a zemědělské produkty; ICH pro klnckou analýzu Typcký průběh valdace metody Typcké pracovní charakterky metody anovení pracovních charakterk dané analytcké metody anovení rozsahu a omezení dané analytcké metody dentfkace ovlvňujících parametrů, které mohou měnt pracovní charakterky dané analytcké metody jaký analyt můžeme anovt, v jaké matrc, za přítomno jakých nterferentů? za jakých defnovaných podmínek můžeme dosáhnout předem určenou nejotu? selektvta, specfčno výtěžno lnearta, pracovní rozsah, ctlvo LOD, LO opakovatelno robuno rozšířená nejota Selektvta, specfčno Selektvta, specfčno Selektvta je schopno rozlšovat mez analytem, který má být anoven, a oatním složkam vzorku (matrcí. Nízká Selektvta Střední Vysoká Specfcká metoda Specfčno je 00%-ní selektvta. - jen málo analytckých metod je specfckých Vážení Acdobazcké ttrace EDTA ttrace Spektrofotometre Chromatografe GC-MS Rotační spektroskope

3 Response Response odezva Výtěžno, R Lneární rozsah, pracovní rozsah Míra pravdvo dané analytcké metody referenční hodnotu obdržíme z: - CRM (certfkovaného materálu - spku čé látky nalezená _ hodnota R referenční _ hodnota Cnalezená R CCRM cnalezená c R c spke matrce,0 0,8 0,6 0,4 0, 0 LOD LO pracovní rozsah lneární rozsah Čím je R blíže k, tím je menší vychýlení metody a pravdvo metody je vyšší. 0 0, 0,4 0,6 0,8,0, koncentrace Ctlvo Mez detekce (LOD - lmt of detecton - změna odezvy měřcího zařízení dělená odpovídající změnou nezávslé proměnné (koncentrace, obsah, množví - ctlvo je směrnce kalbračního vztahu - ctlvo není rovna detekčnímu lmtu!!! Mez detekce analytcké metody je dána nejmenším množvím analytu ve vzorku, které může být detekováno. - určuje se z hodnot analytckého sgnálu, LOD je tedy sgnálově orentovaná velčna - je rovna hodnotě slepého pokusu Y bl + s (s je odhad směrodatné odchylky slepého pokusu, tzv. blanku Y LOD = Y bl + s bl Odpovídající koncentrace analytu se vypočte pomocí kalbrační rovnce: sgnál Y = b 0 + b *c LOD = (Y LOD b 0 /b Mez anovtelno (LO - lmt of quantfcaton Robuno Mez anovtelno analytcké metody je nejnžší množví analytu, které může být anoveno s přjatelnou nejotou. - určuje se z hodnot analytckého sgnálu, LO je tedy sgnálově orentovaná velčna - je rovna hodnotě slepého pokusu Y bl + 0s (s je odhad směrodatné odchylky slepého pokusu, tzv. blanku Y LO = Y bl + 0 s bl Robuno analytcké metody je charakterzována nectlvoí výsledku vůč malým změnám expermentálních podmínek, např. ph, teplotě, množví čndla... Nerobuní parametr Robuní parametr D~0 Odpovídající koncentrace analytu se vypočte pomocí kalbrační rovnce: D sgnál Y = b 0 + b *c LO = (Y LO b 0 /b Parameter Values Parameter Values P n P a P n P a

4 Závěr valdace - valdační zpráva ukázka valdační zprávy: Závěr valdace - valdační zpráva ukázka valdační zprávy: Poup: Měřená velčna: Matrce: Zdroj metody: Předpokládané použtí: Analytcký poup: Stanovení obsahu kadma podle EN-4 (GF-AAS Obsah celkového kadma v potravnářských výrobcích Potravny a krmva Vlaní, vypracovaná laboratoří Rychlé posuzování výrobků Rozklad v MW, analýza GF-AAS selektvta/nterference výtěžno lnearta pracovní rozsah LOD; LO opakovatelno robuno rozšířená nejota žádné nterference do 000 ng/g chlordů např. (95 ± % CRM (mléko lneární v rozmezí,5-0 ng/g pracovní rozsah,5-7 ng/g LOD = ng/g; LO =,5 ng/g s r = % př 0 ng/g neteováno U = 0 % (k = Kalbrace: Kalbrační roztoky od výrobce ZZZ detaly o nejotách výsledku budou probrány na následujících snímcích Měřená velčna - obsah alkoholu v krv [mg/g] Nejoty výsledků měření Chyba versus nejota Hodnota, rozdíl a nejota Nejota měření - znamená pochybno o exaktno výsledku měření - je parametr souvsející s výsledkem měření, který charakterzuje rozptyl hodnot, které by bylo možno důvodně bas rozpětí nejoty y U y + U přřadt měřené velčně - má podobu rozsahu (ntervalu - nejotu nelze použít ke korekc výsledku výsledek = hodnota ± nejota 0,5 ± 0,07 mg/kg y-u y R y y+u měřená velčna Chyba měření - je rozdíl mez ndvduálním výsledkem a skutečnou hodnotou měřené velčny - má dskrétní hodnotu - lze j využít ke korekc výsledku referenční hodnota (nejlepší odhad pravé hodnoty chyba má naměřená průměrná hodnota ndvduální výsledek 4

5 Zlepšení pravdvo (trueness K čemu je nejota výsledku užtečná? Kdy se vyhodnocuje nejota výsledků měření? nejota výsledku prokazuje KVALITU měření (ale pozor, měření s nejmenší nejotou nemusí být nejkvaltnější!!! je vyžadována normou ISO 705 akredtace zlepšuje poznání měřcího poupu v laboratoř dokumentuje měřcí poup transparentním způsobem pro koncového užvatele poskytuje výsledku patřčnou důvěryhodno umožňuje porovnávání výsledků dentfkuje hlavní příspěvky nejoty a umožňuje zlepšt daný poup když je metoda nově zaváděna do laboratoře když se změní krtcký faktor v používané metodě (příroj, operator, typ vzorku během / zároveň s valdací poupu samoatné vyhodnocování pro každý dosažený výsledek není nutné! Typy nejot Základní pojmy spojené s nejotam Typ A: - vyhodnocena pomocí atckých metod z naměřených údajů a vyjádřena ve formě směrodatné odchylky - měřena v laboratoř Typ B: - vyhodnocena jnak než atckou analýzou (předchozí expermenty, údaje z lteratury, nformace výrobce a expertní odhad měřená velčna - velčna, která je předmětem měření analyt - látka, která má být detekována nebo kvanttatvně anovena přesno - těsno souhlasu mez výsledkem měření a přjatou referenční hodnotou. Je určena pravdvoí a precznoí. pravdvo - těsno souhlasu mez průměrnou hodnotou získanou z velkého počtu výsledků měření s přjatou referenční hodnotou. Pravdvo se obvykle vyjadřuje vychýlením - basem. Základní pojmy spojené s nejotam Vztah preczno, pravdvo a přesno preczno - těsno souhlasu mez jednotlvým nezávslým výsledky měření. Přesno je obvykle vyjádřena mírou nepřesno a vypočte se jako směrodatná odchylka výsledků měření. Menší přesno je vyjádřena větší směrodatnou odchylkou. opakovatelno - přesno za podmínek opakovatelno. Podmínkam opakovatelno se rozumějí podmínky, př nchž jsou nezávslé výsledky měření získány toutéž metodou, tímtéž pracovníkem př použtí téhož zařízení a v krátkém časovém období. reprodukovatelno - přesno za podmínek reprodukovatelno. Podmínkam reprodukovatelno se rozumějí podmínky, př nchž jsou výsledky měření získány toutéž metodou, v různých laboratořích př použtí různého zařízení. Zlepšení preczno (precson Odchylka (bas 5

6 Druhy nejot Standardní nejota, x: nejota hodnoty velčny vyjádřená jako směrodatná odchylka (k =. Kombnovaná andardní nejota, y: andardní nejota výsledku měření získaná z odpovídajících hodnot nejot vupních velčn. Je rovna kladné hodnotě druhé odmocnny součtu výrazů nejot vupních velčn a případných kovarancí těchto velčn (k =. Rozšířená nejota, U(y: velčna defnující nterval hodnot v okolí výsledku měření, o kterém lze předpokládat, že se v něm nalézá skutečná hodnota měřené velčny na vyšší úrovn spolehlvo. Hodnota U(y se získá vynásobením andardní kombnované nejoty y koefcentem rozšíření k. Pro hladnu spolehlvo přblžně 95 % má k hodnotu. Výpočet andardních nejot záleží na atckém rozdělení uvažované velčny v případě velčny s NORMÁLNÍM ROZDĚLENÍM, které je charakterzováno řední hodnotou (očekávanou a rozptylem je andardní nejota velčny rovna výběrové směrodatné odchylce x s použtí: př odhadu nejotu z opakovaných měření náhodného procesu Výpočet andardních nejot v případě velčny s ROVNOMĚRNÝM ROZDĚLENÍM, které je charakterzováno řední hodnotou (očekávanou x a rozptylem a / Výpočet andardních nejot v případě velčny s TROJÚHELNÍKOVÝM ROZDĚLENÍM, které je charakterzováno řední hodnotou (očekávanou x a rozptylem a /6 je andardní nejota velčny rovna a(= a je andardní nejota velčny rovna a(= a x a / /a x a / 6 /a použtí: - pokud v certfkátu nebo jné specfkac jsou uvedeny meze bez udání hladny spolehlvo (např. 5 ml 0,05 ml - pokud odhad ve formě rozpětí ( a je udán bez typu rozdělení X použtí: - pokud hodnoty těsně kolem x jsou pravděpodobnější než v blízko hranc - toto rozdělení mají např. tolerance odměrného nádobí podle ČSN X Výpočet kombnované nejoty využtí zákona šíření nejot Výpočet kombnované nejoty Adtvní model měření (platí pro operace sčítání a odečítání y N c x N N j j c c x, x j y = k(x + x + x (k je konanta kde c jsou ctlvo (koefcenty selektvty měřené hodnoty y vzhledem k hodnotám jednotlvých vupních velčn y c x pokud jsou vupní velčny x vzájemně nezávslé, je kovaranční člen roven nule a pro výpočet kombnované nejoty se využívá zjednodušeného vztahu: y k x x x y N c x 6

7 Výpočet kombnované nejoty Multplkatvní model měření (platí pro operace násobení a dělení y = k(x x x (k je konanta y y ( x x x x ( ( x x Výpočet kombnované nejoty Výpočet kombnované nejoty pomocí Kragtenova algortmu - není třeba rozkládat model měření na adtvní a multplkatvní čá - pro n vupních velčn je třeba zkonruovat matc n x n - základem je zákon šíření nejot y y( x x y( x c x x y N c x kde koefcenty ctlvo c jsou aproxmovány Taylorovým rozvojem po dosazení výrazu pro koefcenty c do zákona šíření nejot doáváme fnální výraz pro kombnovanou nejotu N y y( x x y( x pomocí Kragtenova algortmu OBECNĚ x u x u x + u x x x u x x + u x x u x x x + u y (x, u y (x +u ;x ;x y (x ;x +u ;x y (x ;x ;x +u y (x y (x ; x ; x dff [y (x ;x ;x -y (x +u ;x ;x ] [y (x ;x ;x -y (x ;x +u ;x ] [y (x ;x ;x -y (x ;x ;x +u ] suma(dff dff +dff +dff ndex dff / suma(dff. 00% dff / suma(dff. 00% dff / suma(dff. 00 UKÁZKA Výpočet kombnované nejoty x y x x 5,0 0, 5,4 5,0 5,0 0,05 0,0005 0,05 0,058 0,05 60,5 0,5 60,5 60,5 60,50 y (x, u 46,074 9,67 7,8 y (x 7,78 Rozšířená nejota Rozšířená nejota, U(y: velčna defnující nterval hodnot v okolí výsledku měření, o kterém lze předpokládat, že se v něm nalézá skutečná hodnota měřené velčny na vyšší úrovn spolehlvo. Hodnota U(y se získá vynásobením andardní kombnované nejoty y koefcentem rozšíření k. Pro hladnu spolehlvo 95 % má k hodnotu 99,7 % má k hodnotu dff 75,64 59,8 0,06 suma(dff 5,06 ndex 55,99% 4,97% 0,05% uy ( suma(dff 5,06,6 výsledek lze zapsat 7 (k= UKÁZKA pomocí předchozího příkladu výsledek s rozšířenou nejotou (k = 7 4 (k= U(y = ky = = 4 7

8 Nejoty výsledků měření u složtějších syémů následující snímky lurují unverzální poup př určení nejoty výsledku Kroky pro vyhodnocení nejoty? - Defnujte měřcí poup a měřenou velčnu - Napšte modelovou rovnc (pro daný poup měření - Identfkujte (všechny možné zdroje nejoty 4 - Určete hodnotu každé vupní velčny 5 - Vyhodnoťte andardní nejotu (s každé vupní velčny 6 - Vypočtěte hodnotu měřené velčny (pomocí modelové rovnce 7 - Vypočtete kombnovanou andardní nejotu výsledku 8 - Vypočtete rozšířenou nejotu (s vybraným k 9 - Analyzujte příspěvky nejot 0 - Zapšte výsledky s rozšířenou nejotou Zpracování vzorku Navažování vzorku, m Extrakce, R Příprava roztoku vzorku, V - Naředění roztoku vzorku, f d Inrumentální měření, A - Krok Měřcí poup a měřená velčna Výpočet výsledku, - Stanovení dusčnanů v rolnném materálu ontovou chromatografí Příprava andardního roztoku, C Inrumentální měření, A Měřená velčna je v tomto případě celkový obsah NO - v (mg/g Krok - Modelová rovnce Krok - Možné zdroje nejot C A V A m fd R - obsah dusčnanů ve vzorku (mg/g C koncentrace dusčnanů ve andardním roztoku (mg/l A - ntenzta sgnálu (plocha píku odpovídající roztoku vzorku A ntenzta sgnálu (plocha píku odpovídající roztoku andardu V - objem roztoku vzorku ( l m hmotno vysušeného vzorku (g f d ředcí faktor (bezrozměrné; R faktor výtěžno (vz příprava vzorku vzorkování v laboratoř podmínky skladování čota reagencí výtěžno analytu z komplexních matrc příprava kalbračních andardů nejota andardů a CRM podmínky měření kalbrační odchylka (bas příroje varablta opakovaných pozorování nterference od oatních sloučenn předpokládaná echometre 8

9 Krok - Možné zdroje nejot Krok 4 Určení hodnoty každé vupní velčny (typ A & B Čota Koncentrace andardu, C Teplota C A V A m fd R opakovaná pozorování (A Hmotno andardu Kalbrace vah Certfkát nádobí Objem V Výtěžno, R valdační expermenty (A a/nebo B specfkace výrobce (B Ředění vzorku, V, f d Kalbrace vah Hmotno vzorku, m Stablta sgnájlu Sgnál Sgnál andardu A Kalbrace příroje - kalbrační certfkáty (B výsledky mezlaboratorní valdace metod (A/B ze zkušeno anebo z lteratury (B vzorku, A Krok 5 Vyhodnoťte nejotu (s každé vupní velčny Krok 6 - Vypočtěte hodnotu měřené velčny Před sloučením, všechny příspěvky nejoty musí být vyjádřeny/převedeny do odhadované andardní nejoty Použjte modelovou rovnc k výpočtu výupní velčny Y ( - pokud je k dspozc jako: směrodatná odchylka: použjte přímo konfdenční ntervaly: převeďte udávané rozpětí: převeďte rozšířené nejoty: převeďte C A V A m fd R 0,00,000 0,80 0 0,0,4 0,78 0,508 mg / g Krok 7 Vypočtěte kombnovanou andardní nejotu Krok 7 Vypočtěte kombnovanou andardní nejotu Tam, kde není žádná korelace mez vupním velčnam kombnovaná andardní nejota se vypočítá jako odmocnna sloučených rozptylů podle: u c ( NO C A ( NO A u V NO ( ( d ( u m u f u R C A A V m f d R u f c ( y X x Zákon šíření nejot kde u c (y = kombnovaná andardní nejota x = andardní nejota každé ze vupních velčn u ( kde u (X /X je relatvní andardní nejota X 0, ,000 0,0006 0,80 0,0 0,0 c NO NO 0,000 0, ,0 0,04 0,000,40 0,000 0,78 0,06 Může se prové pomocí tabulkového edtoru nebo jným jednoúčelovým softwarem! Absolutní nejota u c ( - = 0,06 0,508 mg/g = 0,0 mg/g 9

10 Krok 8 Vypočtěte rozšířenou nejotu Krok 8 Vypočtěte rozšířenou nejotu Rozšířená nejota U se získá vynásobením kombnované andardní nejoty u c (y koefcentem rozšíření k: U k Výsledek pak lze vyjádřt jako: u c Výsledek y U ( k?? Například: - = (0,50 ± 0,064 mg/g, k = nejlepším odhadem hodnoty přřazené měřené velčně je y, nterval [y U, y + U] je rozpětím, které zahrnuje velký podíl rozdělení hodnot, které by mohly být důvodně přřazeny měřené velčně. Rozšířená nejota poskytuje realčtější rozsah možných hodnot. Obvykle používaný koefcent rozšíření je k =, který znamená záběr okolo 95 %, je-l rozdělení normální Standardní nejota by se měla používat př vntřním použtí v laboratoř - pro potřebu šíření nejot Rozšířená nejota je lépe vyhujícím rozmezím určeným pro koncového užvatele výsledků Krok 9 Analyzujte příspěvky nejoty Krok 0 - Uvádění výsledků R Hlavní příspěvky : 68,7% Typu B? Typu A? - = (0,50 ± 0,064 mg/g (* (* uváděná nejota je rozšířená nejota vypočtená s použtím koefcentu rozšíření k =, což odpovídá hladně spolehlvo přblžně 95 % 7,4% A A -,6% 0,% Oatní Rozšířenou nejotu U nebo andardní nejotu u je zřídkakdy zapotřebí uvádět na více než platné číslce. Výsledek se musí zaokrouhlovat tak, aby byl v souladu s uváděnou nejotou.. Co je valdace analytcké metody?. Uveďte některé pracovní charakterky analytcké metody.. Vysvětlete rozdíl mez LOD a LO. 4. Vysvětlete rozdíl mez chybou a nejotou měření. 5. K čemu slouží nejota měření? 6. Jaké atcké rozdělení mají tolerance odměrného nádobí podle ČSN a jaký je vztah pro přepočet tolerance nádobí na jeho příslušnou nejotu? 7. Vysvětlete rozdíl mez pravdvoí a přesnoí. 8. Co je rozšířená nejota? Otázky 9. Uveďte vztahy pro výpočet kombnované nejoty adtvního a multplkatvního modelu. 0. Vysvětlete podatu Kragtenova algortmu. Zdroje nformací Jako v analytcké laboratoř 000: odpověd manažerům jako [edtor Mloslav Suchánek], Praha : Eurachem - ČR, kontakt: Ing. Patrk Kana, Ph.D. č. d. 5, budova A tel.: e-mal: kanap@vscht.cz 0