POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA NÁVODY KE CVIČENÍM

Rozměr: px
Začít zobrazení ze stránky:

Download "POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA NÁVODY KE CVIČENÍM"

Transkript

1 POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY NÁVODY KE CVIČENÍM BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: / II. TURNUS:

2

3 POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY NÁVODY KE CVIČENÍM BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: II. TURNUS: MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: POKROČILÉ PRAKTICKÉ VZDĚLÁVÁNÍ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII OPERAČNÍ PROGRAM VZDĚLÁVÁNÍ PRO KONKURENCESCHOPNOST ČÍSLO PROJEKTU: CZ.1.07/2.3.00/

4 POKROČILÝ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL návody ke cvičením editoval: Václav Brázda autoři: Václav Brázda, Marie Brázdová, Miroslav Fojta, Luděk Havran, Iva Kejnovská, Lucie Navrátilová, Petr Orság, Hana Pivoňková Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Česká republika Brno 2012 Česká Republika První vydání ISBN:

5 Obsah Kapitola 1: Studium vazby různých isoforem proteinu p73 na DNA... 7 I. Příprava rekombinantních proteinů p73 pomocí eukaryotického bezbuněčného expresního systému (in vitro transkripce/translace, IVTT)... 7 II. Separace rekombinantních proteinů p73 připravených pomocí IVTT na SDS PAGE a jejich následná detekce pomocí Western blotu III. Studium vazby dvou isoforem proteinu p73 na nadšroubovicovou a lineární DNA pomocí imunoprecipitace na magnetických kuličkách Kapitola 2: Elektrochemická detekce poškození DNA a monitorování látek poškozujících DNA I. Detekce poškození DNA na rtuťových elektrodách HMDE modifikovaná scdna jako senzor pro stanovení látek poškozujících DNA II. Detekce poškození DNA na uhlíkových elektrodách III. Kontrola štěpení DNA na agarózovém gelu Kapitola 3: Využití elektroaktivních značek pro identifikaci nukleotidových sekvencí I. Analýza nukleotidových sekvencí pomocí DNA značené terminální transferázou II. Analýza nukleotidové sekvence metodou primer extension Kapitola 4: Analýza proteinů a komplexů proteinů s DNA I. Elektroforéza proteinů v přítomnosti SDS SDS PAGE II. Stanovení koncentrace proteinů podle Bradfordové III. Přímé stanovení koncentrace proteinů při 280nm

6 IV. EMSA Gelová retardační analýza Kapitola 5: Využití spektroskopie cirkulárního dichroismu při sledování konformačních přechodů DNA I. Kooperativní přechod II. Nekooperativní přechod III. Termální denaturace kvadruplexů DNA

7 Kapitola 1: Studium vazby různých isoforem proteinu p73 na DNA I. Příprava rekombinantních proteinů p73 pomocí eukaryotického bezbuněčného expresního systému (in vitro transkripce/translace, IVTT) Princip úlohy: Využití bezbuněčných systémů patří k velmi rozšířeným metodám přípravy rekombinantních proteinů.tyto systémy dnes umožňují velice rychlou a snadnou přípravu relativně dostatečného množství rekombinantních proteinů, které lze následně využít v celé řadě funkčních studií. Tradičně se používá k ověření čtecích rámců, studia proteinových mutací, studia protein:proteinových, protein:dna vazebných interakcí, stanovení aktivity proteinů atd. V poslední době se těchto metod používá k potvrzení výsledků metod interakce proteinů ve 2-hybridních systémech, provedení in vitro expresního klonovaní a pro přípravu proteinových substrátů pro studium aktivity a modifikace enzymů atd. Bezbuněčné expresní systémy lze primárně rozdělit dle typu použitého expresního systému bud na prokaryotické (S30 E.coli extrakt) nebo eukaryotické {králičí retikulocytární extrakt (Rabbit reticulocyte extract), extrakt z pšeničných klíčků (wheat germ extract)}. V obou případech je příprava rekombinantních proteinů provedena translací in vivo nebo in vitro připravené mrna. V současné době se, zejména s ohledem na problémy s manipulací s in vivo izolovanou mrna, častěji uplatňuje přístup využívající kombinaci prokaryotické transkripce pomocí fágové RNA polymerázy (T7, T3, SP6) a následné translace během jediné reakce, tzv. systémy spojené in vitro transkripce a translace (in vitro transcription and translation systems, IVTT). Pro tyto spojené IVTT expresní systémy pak lze jako templáty pro transkripci a následnou translaci využít připravené DNA expresní vektory. Příslušná mrna daného proteinu se generuje transkripcí z úseku DNA z vektoru pod příslušným promotorem (T3, T7, SP6 součásti většiny expresních vektorů)

8 Pro následnou translaci je v závislosti na použitém translačním systému nutná přítomnost dalších regulačních sekvencí v promotoru expresního vektoru: místo vazby ribozomu (RBS site, ribosome binding site) exprese v prokaryotických expresních systémech, Kozakova sekvence (Kozak sequence) exprese v eukaryotických expresních systémech. Cílem úlohy je příprava dvou rekombinantních isoforem proteinu p73 (p73alfa a p73delta) z připravených expresních vektorů pcdna3.1/p73alfa a pcdna3.1/p73delta pomocí eukaryotického expresního systému T7 TNT Quick Coupled Transcription/Translation System. Princip metody IVTT + DNA templát Nuclease free voda inkubace 30 C, 60 min rekombinantní protein Postup: 1. Vyjmout kit T7 TNT Quick Coupled Transcription/Translation (Promega) z mrazáku -70 C. Rychle rozmrazit zkumavky s T7 TNT Quick master mix zahřátím v ruce, pak umístit na led. Rozmrazit ostatní komponenty reakce při laboratorní teplotě a umístit je na led. 2. Zapnout termostat a nastavit teplotu 30 C 3. Přípravit a popsat dvě ependorky, označit číslem skupiny: Zkumavka č.1 - p73 alfa a zkumavka č.2 - p73delta. 4. Napipetovat postupně do připravených zkumavek jednotlivé komponenty reakce dle tabulky. Po napipetování všech komponent mírně promíchat pipetováním a následně krátce stočit na centrifuze pro odstranění případných bublin. 5. Zkumavky umístit do termostatu a inkubovat 60 minut při 30 C - 8 -

9 Tabulka Zkumavka č.1: Zkumavka č.2: p73 alfa p73 delta Komponenty Objem (ul) Objem (ul) Nuclease-free voda 2,9 3 Methionin (1mM) 0,4 0,4 Plazmidová DNA: p73 alfa (872 ng/ul) 0,7 - Plazmidová DNA: p73 delta (1080 ng/ul) - 0,6 TNT Quick Master mix Celkový objem Seznam potřebného vybavení a chemikálií Kit T7 TNT Quick Coupled Transcription/Translation System (Promega) 1 mm Methionin Nuclease-free voda Plazmidová DNA pcdna3.1/p73alfa a pcdna3.1/p73delta Pipety Špičky Zkumavky 1,5 ml Nádobka na led a led Centrifuga Termoblok - 9 -

10 II. Separace rekombinantních proteinů p73 připravených pomocí IVTT na SDS-PAGE a jejich následná detekce pomocí Western blotu Princip úlohy: Western blot (česky označovaný někdy termínem imunoblot) je technika kombinující separaci proteinů pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE) s transferem proteinů na membránu a jejich následnou detekcí pomocí specifických protilátek. Je to v současné době rutinní technika, která se používá jak k detekci proteinů z komplexních směsí, tak k monitorování exprese a purifikace proteinů. Touto metodou se v praxi diagnostikuje řada infekčních onemocnění člověka a zvířat. Oproti běžným sérologickým metodám, jako je ELISA, je Western Blot sice časově náročnější a dražší, ale za to přesnější (větší specifičnost).western blot poskytuje jednak kvalitativní (velikost proteinu dle standartu) tak i semikvantitativní data (srovnání se vzorkem o známé koncentraci) o analyzovaném proteinu. Metodika Western blotu zahrnuje celkem 5. fází: 1. fáze: Gelová elektroforéza První část se skládá z polyakrylamidové gelové elektroforézy v přítomnosti dodecyl sulfátu sodného (SDS, laurylsíran sodný) SDS-PAGE. Proteiny jsou separovány v akrylamidovém gelu na základě jejich molekulové hmotnosti a tvoří tvz. bandy (z angl. proužky, pásky). Podrobněji k SDS-PAGE viz. K Proteiny migrují v elektrickém poli na základě jejich tvaru (globulární proteiny migrují rychleji než vláknité) a hustoty náboje (poměr velikosti náboje k jednotce hmoty). SDS se váže na bílkovinný řetězec v poměru 1.4 g SDS na 1 g bílkoviny, přičemž délka komplexu SDS bílkovina je úměrná jeho molekulové hmotnosti. Často se disulfidické vazby v proteinu eliminují redukčním činidlem ( -merkaptoethanol) a denaturace se dokončí varem. Výsledně je jediným faktorem rozhodujícím o pohyblivosti proteinů při denaturačním SDS-PAGE jejich molekulová hmotnost. Na základě srovnání relativních mobilit neznámé bílkoviny a standardů je pak možné určit její relativní molekulovou hmotnost

11 2. fáze: Transfer Po provedení SDS PAGE jsou rozdělené proteiny přeneseny z polyakrylamidového gelu na vhodnou membránu (PVDF, nitrocelulóza). Při kontaktu gelu s membránou v blotovacím zařízení dochází po aplikaci elektrického proudu k transferu proteinů z gelu a jejich ukotvení na membráně. Výsledkem je kopie proteinů separovaných na gelu. Efektivita přenosu závisí na celé řadě faktorů: složení gelu, doba přenosu, velikost a vlastnosti proteinů, přítomnosti detergentů a alkoholu v elektrodovém pufru. Optimální podmínky pro přenos proteinů jsou při použití pufrů s nízkou iontovou silou a nízkých proudových hodnot. Před dalším krokem je žádoucí kontrolovat efektivitu přenosu proteinů na membránu. Pro tuto kontrolu se využívají reversibilní barvení pomocí barviček, které neinterferují s vazbou protilátek v dalších krocích (Ponceau S)

12 3. fáze: Blokování Po transferu je nutné provést zablokování míst na membráně, kde nedošlo k navázání proteinů, a zabránit tak nespecifickým vazbám protilátek použitých v dalších krocích. Pro blokování se nejčastěji používají roztoky 1-5% odtučněného mléka nebo bovinního sérového albuminu (BSA) ve fosfátových (PBS) nebo trisových (TBS) pufrech s minimálními přídavky detergentů, jako je Tween 20 nebo Triton X-100. Použití blokačního pufru je specifické v závislosti na použitých protilátkách. 4. fáze: Detekce V průběhu detekce je membrána inkubována s primární protilátkou, která rozeznává specifický protein(y) nebo epitop(y). Po promytí membrány (odstranění nenavázané primární protilátky) je následně inkubována se sekundární protilátkou, která rozeznává druhově specifiké struktury primární protilátky (např. anti-myší, anti-kozí, anti-králičí sekudární protilátky). Sekundární protilátka je nejčastěji konjugována s reportérovým enzymem (alkalická fosfatáza AP, křenová peroxidáza HRP). Pro vizualizaci vazby nejčastěji používané sekundární protilátky s HRP je použit chemiluminiscenční substrát. HRP katalyzuje reakci za vzniku luminiscenčního produktu, který je následně detekován pomocí rentgenových filmů nebo moderněji pomocí dokumentačních systémů 5. fáze: Analýza Výsledkem analýzy western blotu by (v ideálním případě detekce určitého proteinu) mělo být zviditelnění jednoho,,bandu na membráně odpovídající tomuto proteinu (závisí zejména na volbě použité primární protilátky a na celkovém provedení

13 metody). Na základě srovnání jeho pozice vůči standardu můžeme určit přibližnou velikost proteinu. V případě, že výsledkem western blotu je přítomnost více,,bandů, než by mělo odpovídat našemu proteinu, jedná se o nejčastěji o nespecifickou vazbu nebo kros-reaktivitu primární protilátky s epitopy jiných nebo příbuzných proteinů. Pracovní postup: 1. Příprava polyakrylamidového gelu akrylamid používaný na přípravu gelu je v monomerní formě silně neurotoxický jed. Proto celou dobu přípravy polyakrylamidového gelu budeme pracovat výhradně v rukavicích!!! a. Destilovanou vodou a etanolem důkladně očistíme a poté vysušíme skla, pro jeden gel vždy dvojice 1.5mm sklo se spacerem a krycí sklo, skla přiložím k sobě podle obrázku, umístíme do držáku, srovnáme spodní hranu skel a zaaretujeme v držáku, následně umístíme do nalévacího stojánku (viz. obrázek)

14 b. Příprava separačního gelu (running gel) dle tabulky: připravit running gel podle tabulky v uvedeném pořadí nalít mezi skla do výšky asi 5 cm zakápnout 2-butanolem 1 gel 2 gely 4 gely 12,5% PAGE 10 ml 20 ml 40 ml 10% APS* 50 μl 100 μl 200 μl Temed* 25 μl 50 μl 100 μl c. Odsajeme butanol filtračním papírem, propláchneme destilovanou vodu a opět vysušíme filtračním papírem připravíme si koncentrační gel (stacking gel) podle tabulky promíchat směs vložíme 1,5 mm 10-ti jamkový hřebínek 1 gel 2 gely 4 gely 5,0% PAGE 2,5 ml 5 ml 10 ml 10% APS 25 μl 50 μl 100 μl Temed 12,5 μl 25 μl 50 μl d. Poté, co gel zpolymeruje (zkontrolujeme opět podle polymerizace nepoužitých zbytků směsi ve falkonce), opatrně vyjmeme hřebínek a starty promyjeme elektroforetickým pufrem, abychom se zbavili zbytků nezpolymerovaného akrylamidu. e. Gel se skly vložíme do aparatury a zalijeme elektrodovým pufrem 1xRB (10xRB: 25 mm Tris; 192 mm glycin; 0,1% SDS, ph 8,3)

15 2. Příprava vzorků 2xCSB obsahuje -merkaptoetanol, který silně zapáchá, proto pokud jej budeme přidávat do vzorku budeme pracovat v digestoři!!! a. Ze vzorků připravených IVTT rekcí (viz. První úloha) odebereme z každé zkumavky po 5 ul: IVTT-p73alfa 5 ul a IVTT-p73alfa 5 ul. Do každé zkumavky přidáme 7,5 l vody a přidáme 12,5 l 2xCSB (100 mm Tris-HCl, ph 6,8; 100 mm -merkaptoetanol; 2% SDS; 0,1% bromfenolová modř; 20% glycerol). Připravit 1x CSB (viz. Tabulka) b. Vzorky poté povaříme na termobloku při 99 C po dobu 5 min, zcentrifugujeme. c. Vzorky naneseme do sestavené elektroforetické aparatury s již připravenými gely, které jsou zality elektrodovým pufrem (RB). Do první dráhy naneseme 3,5 l směsi markerů molekulových hmotností (BioRad). Do dalších startů budeme pipetovat vlastní připravené vzoky a kontrolní vzorky dle následující tabulky. Tabulka - nanášení vzorků na SDS-PAGE jamka Objem (ul) 1 Marker 3,5 2 IVTT - p73 alfa 10 3 IVTT - p73 alfa 5 4 IVTT - p73 delta 10 5 IVTT - p73 delta 5 6 Kontrolní vzorek Kontrolní vzorek Kontrolní vzorek Kontrolní vzorek x CSB* 10 *1xCSB připravit naředěním 2XCSB (1 díl 2xCSB a 1 díl vody)

16 3. Elektroforéza a. Elektroforetickou aparaturu s nanesenými vzorky uzavřeme víkem s konektory a připojíme na zdroj napětí. b. Na zdroji nastavíme nejprve napětí 80 V (15-20 min) poté zvýšíme napětí na 170 V (50-60 min) a necháme probíhat elektroforézu dokud čelo představované bromfenolovou modří nedosáhne spodního okraje gelu. 4. Transfer proteinů z gelu na membránu bloting V mezičase než doběhne elektroforéza, připravíme nitrocelulozovou membránu a blotovací papíry, které budeme potřebovat v následujícím kroku. a. Připravit 4 blotovací papíry velikosti 10x7 cm. b. Připravit nitrocelulozou membránu velikosti 9x6 cm (membrána je mezi dvěma papíry, nedotýkat se přímo membrány, stříhat v rukavicích, následně manipulovat s membránou pomocí pinzety) c. Blotovací papíry a membránu ponoříme do roztoku Transferového pufru (TB) a necháme stát. Do TB ponoříme i 2 blotovací polštářky (pro 1 gel), které budeme potřebovat pro sestavení blotovací kazety. Zbylý TB dáme vychladit do ledničky. Pokračování po dokončení SDS-PAGE d. Vypneme zdroj, vyjmeme skla z apratury a poté opatně odělíme gel. e. Gel necháme 5 minut ekvilibrovat v Transferovém pufru (TB) f. Sestavení blotovací kazety (viz. Obrázek) Na podnos umístíme blotovací držák černou stranou dolů Na spodní stranu umístíme nejprve blotovací polštářek, na něj 2 ekvilibrované blotovací papíry. Přes blotovací papíry přejedeme zkumavkou abychom odstranili případné vzduchové bubliny. Na blotovací papíry umístíme gel, na gel položíme membránu (brát pinzetou). Následně opět položíme 2 blotovací papíry a odstraníme případné vzduchové bubliny. Nakonec opět přidáme blotovací polštářek. Celou kazetu uzavřeme a zajistíme

17 g. Blotovací kazetu umístíme do blotovací aparatury černou stranu kazety na černou stranu aparatury. (viz. Obrázek). Aparaturu umístíme do vany a zalijeme vychlazeným TB pufrem. Do vany přidáme míchadlo. h. Celou blotovací aparaturu umístíme do komorové lednice (4 C) na míchačku a připojíme ke zdroji napětí i. Blotujeme 60 minut při napětí 100 V

18 5. Kontrola transferu proteinů pomocí Ponceau S a. Vypneme zdroj, rozebereme blotovací aparaturu a blotovací kazetu. Membránu ostřihneme dokola přesně na velikost gelu. Označíme vrchní stranu membrány (číslo skupiny). Pokud správně proběhl bloting měli bychom vidět na membráně přeblotované standardy. b. Membránu umístíme do krabičky a necháme barvit v Ponceau S asi 1 minutu. Membránu přemístíme do krabičky s 1xPBS a lehce odmyjeme zbytky Ponceau (nesmíme promývat příliš dlouho, barvení je reverzibilní a rychle bledne). Provedeme vizuelní kontrolu provedeného blotingu. c. Membránu následně kompletně odbarvíme v PBS 6. Blokování membrány Pro blokování membrány dopředu připravíme blokovací roztok: 1xPBS + 5% sušeného mléka (Na jeden gel budeme potřebovat 100 ml, je nutné dobře rozmíchat mléko) a. Membránu vložíme do blokovacího roztoku (30-40 ml) a umístíme na třepačku (100 rp, RT). Blokujeme 1 hodinu 7. Inkubace s protilátkami Primární protilátka (Ab) monoklonální Ab, anti-ha, supernatant Sekundární protilátka (Ab) purifikovaná polyklonální anti-myší Ab konjugovaná s POD (křenová peroxidasa) a. Membránu opláchneme pomocí PBS (30-40 ml, 2 min). Přidáme 15 ml blokovacího roztoku s primární protilátkou (ředění 1:100). Umístíme na třepačku (100 rpm a inkubujeme přes noc v komorové lednici (4 C) b. Další den slijeme primární protiláku Promyjme membránu (3x7 min.) 1x PBS + 0,05% Tween-20 2x PBS c. Přidáme 15 ml blokovacího pufru se sekundární protilátkou (ředění 1:5000). Umístíme na třepačku (100 rpm,1h) d. Promyjme membránu (3x7 min.) 1x PBS + 0,05% Tween-20 2x PBS

19 8. Detekce Western blotu a. Membránu umístíme na filtrační papír, lehce vysušíme a umístíme do euroslohy. b. Připravíme detekční substrát připravit těsně před vlastní detekcí Připravíme 3 ml detekční substrátu (množství na jeden gel) smícháním složky A a B v poměru (1:1) z kitu ECL Western blot detection. c. Detekční směs nalijeme na membránu a inkubujeme 1 minutu. Poté ji odsajeme pomocí filtračního papíru. Uzavřeme euroslohu a vložíme do detekčního zařízení. d. V detekčním zařízení snímáme chemiluminiscenční signál. Seznam potřebného vybavení a chemikálií Zásobní roztok pro přípravu separačního gelu: 12.5% akrylamid:bisakrylamid 19:1; 0,375 M Tris-HCl, ph 8,8; 0,1% SDS Zásobní roztok pro koncentrační gel: 5% akrylamid:bisakrylamid 19:1; 0,125 M Tris-HCl, ph 6,8; 0,1% SDS 10% persíran amonný (APS) TEMED (N,N,N,N -tetrametyletylendiamin) RB (Elektrodový pufr): 25 mm Tris; 0,192 M glycin; 0,1% SDS, ph 8,3 IVTT směsi p73 alfa a p73 delta Proteinové standardy Prestained SDS-PAGE standards, High range (Biorad) 2xCSB: 50 mm Tris-HCl, ph 6,8; 100 mm -merkaptoetanol; 2% SDS; 0,1% bromfenolová modř; 10% glycerol odtučněné sušené mléko (Laktina): 25 mm Tris; 0,192 M glycin TB (blokovací pufr) : 25 mm Tris; 0,192 M glycin, ph 8,3, 20% methanol ECL Western blot detection kit (Amersham) Filtrační papír Pinzeta Nůžky, pravítko, euroshloha Pipety Špičky Ependorfky 1,5 ml Termoblok Elektroforetická aparatura

20 Blokovací aparatura Zdroj napětí Třepačka Dokumentační systém III. Studium vazby dvou isoforem proteinu p73 na nadšroubovicovou a lineární DNA pomocí imunoprecipitace na magnetických kuličkách Princip metody: Magnetické kuličky nesoucí různé rozpoznávací částice (např. protein G, protilátky, streptavidin, oligonukleotidy, ) jsou vhodným nástrojem pro vysoce specifické zachycení, izolaci a analýzu různých molekul (DNA, RNA nebo proteinů) nebo celých buněk. Magnetické kuličky jsou využívány k různým účelům, např. ke studiu hybridizace DNA, DNA-protein interakcí, imunoprecipitace. + + capture DNA release detection antibody protein DNA magnetic beads

21 Princip úlohy: V této úloze budeme sledovat vazbu dvou isoforem proteinu p73 s nadšroubovicovou DNA v přítomnosti lineární DNA (obsahující, ppgm1, nebo neobsahující, pbsk, p53 vazebnou sekvenci). Pomocí magnetických kuliček pokrytých proteinem G zachytíme imunokomplex protilátka-protein-dna vytvořený za optimálních podmínek v roztoku. Působením SDS a zahřátím vzorku na 65 C uvolníme navázanou DNA z komplexu, a tu pak analyzujeme pomocí gelové elektroforézy (barvení ethidium bromidem nebo SYBR Greenem). POSTUP: 1) do 4 eppendorfek připravíme vzorky dle rozpisu, ve vazebném prostředí (5 mm Tris, 50 mm KCl, 2 mm DTT, 0,01% Triton) smícháme nejdříve danou protilátku a protein p73, necháme inkubovat 15 minut v ledové lázni 2) přidáme DNA podle rozpisu a necháme na ledové lázni 20 minut 3) mezitím připravíme do 1 eppendorfky 50 ul magnetických kuliček 4) promyjeme (na vortexu) 3x400 ul pufrem (5 mm Tris, 50 mm KCl, 2 mm DTT, 0,01% Triton), tzn. resuspendování kuliček na vortexu, na magnetu odebrání špinavého pufru a přidání čistého 5) roztok kuliček před posledním odebráním pufru rozpipetujeme do 4 eppendorfek a odebereme pufr 6) ke kuličkám (bez pufru) přidáme preinkubovaný imuno-komplex 7) necháme inkubovat v termomixeru 2 cykly 10 minut při 10 C (1 cyklus = 1 min třepat při 900 ot/min, 9 min třepat při 450 ot/min) 8) dáme do magnetu, odebereme roztok, promyjeme 3x100 ul pufru (protřepeme v ruce) 9) zároveň necháme zahřát termomixer na 65 C, nastavíme 5 minut, 500 ot/min 10) ke kuličkám přidáme 15 ul 0.5% SDS, protřepeme 11) necháme zahřát na 65 C, 5 min, 500 ot/min. 12) stočíme na minicentrifuze, epp. dáme do magnetu a roztok odebereme do čistých epp. s 2 ul barvy 13) naneseme na gel (1,3% agarozový gel, pufr 1xTAE) 14) necháme jet 30 min při 120 V, lab. teplota) 15) obarvení gelu Et-Br nebo SYBR Greenem, snímání gelu na LAS

22 KONTROLY: scdna a lindna, které nebyly vázané přes magnetické kuličky Příprava: 1 ul sc nebo lindna (200 ng) + 1 ul barvičky (obs. SDS) + 9 ul vody vzorek č sc/lin DNA B/B B/P B/B B/P P/B P/P P/B P/P vých. konc. sc DNA 660 ug/ml 0,6 0,6 0,6 0,6 2,5 2,5 2,5 2,5 linb DNA 127 ug/ml 3,1-3,1-3,1-3,1 - linp DNA 190 ug/ml - 2,1-2,1-2,1-2,1 KCl 500 mm VP 10x DTT 20 mm protilátka 1100 ug/ml ,4 0,4 0,4 0,4 p73 alfa p73 delta voda 4,9 5,9 4,9 5, Příprava agarózového gelu GEL: 0,33 g agarózy 0,5 ml 50xTAE 25 ml vody smícháme vše v erlenmayerově nádobě, necháme rozvařit v mikrovlnné troubě, dovážíme na původní objem, erlenku mírně zchladíme pod tekoucí vodou, nalejeme do gelového nosiče s hřebínkem pro 8 startů, necháme ztuhnout Seznam potřebného vybavení a chemikálií Pipety, špičky, mikrozkumavky Termoblok Zdroj napětí Dokumentační systém Zásobní roztok 50xTAE, DNA, vazebný pufr, KCl, DTT, protilátka anti-ha Magnetické kuličky s proteinem G, magnet

23 Kapitola 2: Elektrochemická detekce poškození DNA a monitorování látek poškozujících DNA Živé organizmy jsou neustále vystavovány působení chemických a fyzikálních vlivů, které často vedou k poškození DNA. Různým způsobem poškozená DNA pak přestává plnit svoji hlavní úlohu v buňce, kterou je uchovávání a přenos genetické informace. Toto poškození často vede ke změně genetické informace (mutaci), která může být příčinou vzniku zhoubného bujení. Jedním z významných důsledků poškození DNA je přerušení cukrfosfátové páteře (dochází ke vzniku jedno nebo dvojřetězcových zlomů). Tento druh poškození DNA lze velmi citlivě detekovat měřením elektrochemických signálů DNA citlivých ke změnám její struktury (pík CA v cyklické voltametrii, pík 3 v AC voltametrii (ACV) na visící rtuťové kapkové elektrodě (HMDE)). I. Detekce poškození DNA na rtuťových elektrodách HMDE modifikovaná scdna jako senzor pro stanovení látek poškozujících DNA Princip a cíl: Měření ACV píku 3 na HMDE je jednou z nejcitlivějších elektrochemických metod pro detekci výskytu jedno nebo dvojřetězcových zlomů v DNA. Díky ireverzibilní adsorpci nukleových kyselin na povrch rtuti lze připravit HMDE modifikovanou superhelikální DNA (scdna). Takto modifikovaná HMDE pak může sloužit jako senzor pro stanovení koncentrace látek poškozujících DNA. Jako modelové vzorky budou použity tzv. chemické nukleázy (komplexy přechodných kovů, které poskytují Fentonovu reakci, při které vznikají hydroxylové radikály) a enzym DNasa I, který do DNA zavádí jedno a dvouřetězcové zlomy. Cílem úlohy je stanovení koncentrace neznámého vzorku látky poškozující DNA

24 Pracovní postup: 1. Připravíme vzorek scdna (C = 40 g/ml, V = 60 l) v 0,2 M NaCl. 2. Provedeme kontrolní měření nepoškozené scdna, pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí ACV (AdTS ACV). 3. Za použití AdTS ACV naměříme kalibrační závislost pro tři koncentrace modelového vzorku poškozujícího činidla (detaily experimentu budou sděleny na základě výběru činidla). 4. Změříme neznámý vzorek a z kalibračního grafu určíme koncentraci poškozujícího činidla. Seznam potřebného vybavení a chemikálií: - potenciostat (Autolab) - elektrodový systém (663 VA-stand), pracovní elektroda: HMDE, referentní elektroda: Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda: platinový drát - základní elektrolyt: roztok 0,3 M NaCl a 50 mm Na 2 HPO 4 - roztoky: CuSO 4, FeCl 2, EDTA, 1,10 fenanthrolin, kyselina askorbová, H 2 O 2, MgSO 4, CaCl 2, Tris (ph 7,5) - DNasa I - scdna II. Detekce poškození DNA na uhlíkových elektrodách Princip a cíl: Na uhlíkových elektrodách (např. elektroda z pyrolytického grafitu, PGE) podléhají zbytky purinových bází (A a G) elektrochemické oxidaci za vzniku analyticky využitelných voltametrických signálů (pík A ox a G ox ). Tyto signály nejsou citlivé ke změnám ve struktuře DNA. Cílem úlohy je ověřit, že strukturní změny způsobené účinkem látek zavádějících do DNA jedno a dvouřetězcové zlomy nejsou pomocí měření oxidačních signálů scdna detekovatelné

25 Pracovní postup: 1. Připravíme vzorek scdna (C = 40 g/ml, V = 60 l) v 0,2 M NaCl. 2. Provedeme kontrolní měření nepoškozené scdna, pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí square wave voltametrie (AdTS SWV) na PGE. 3. Připravíme tři vzorky obsahující scdna a různé koncentrace vybraného poškozujícího činidla. Po inkubaci (1 min) budou vzorky proměřeny pomocí AdTS SWV na PGE (detaily experimentu budou sděleny na základě výběru činidla). Seznam potřebného vybavení a chemikálií: potenciostat (Autolab) elektrodový system (663 VA-stand), pracovní elektroda: PGE, referentní elektroda: Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda: platinový drát základní elektrolyt acetátový pufr (ph 5,0) roztoky: CuSO 4, FeCl 2, EDTA, 1,10 fenanthrolin, kyselina askorbová, H 2 O 2, MgSO 4, CaCl 2, Tris (ph 7,5) Dnasa I scdna III. Kontrola štěpení DNA na agarózovém gelu Princip a cíl: Elektroforéza v agarózovém gelu je jednou z klasických metod studia struktury a strukturních přechodů DNA. V silném elektrickém poli dochází k rozdělení nabitých molekul biopolymerů. Cílem úlohy je ověřit míru poškození scdna vybraným činidlem. Pracovní postup: 4. Připravíme vzorky scdna a scdna po inkubaci (1 min.) s různými koncentracemi vybraného poškozovacího činidla. (detaily experimentu budou sděleny na základě výběru činidla) 5. Provedeme elektroforézu v agarózovém gelu. 6. Gel obarvíme a vyhodnotíme

26 Seznam potřebného vybavení a chemikálií: zdroj napětí elektroforetická aparatura roztoky: CuSO 4, FeCl 2, EDTA, 1,10 fenanthrolin, kyselina askorbová, H 2 O 2, MgSO 4, CaCl 2, Tris (ph 7,5) DNasa I scdna

27 Kapitola 3: Využití elektroaktivních značek pro identifikaci nukleotidových sekvencí Princip: Některé analytické a diagnostické aplikace nedovolují studovat nativní DNA přímo. Proto je vhodné DNA označit, tj. připojit molekulu (nebo molekuly)- značky umožňující převést detekci nativní DNA na detekci této značky. Dosud byla navržena řada molekul ve funkci značky, možností jejich navázání na DNA i metod jejich detekce. Jedním z možných způsobů přípravy značené DNA je navázání deoxynukleotidů nesoucích značku k řetězeci DNA pomocí enzymů (nejčastěji polymeráz). I. Analýza nukleotidových sekvencí pomocí DNA značené terminální transferázou Princip a cíl: Terminální deoxynukleotidyl transferáza (TnT) je enzym podobný polymerázám, který je schopen připojovat nukleotidy k 3 konci řetězce DNA. Na rozdíl od polymeráz však pracuje bez přítomnosti templátu. Nukleotidy jsou připojovány náhodně a tak dlouho, dokud není reakce limitována nějakým faktorem (např. množstvím nukleotidů v reakční směsi, velikostí značky,...). Cílem této úlohy je připravit DNA nesoucí úsek elektroaktivně značených nukleotidů pomocí TnT. Použitím této DNA, která pak bude sloužit jako sonda pro elektrochemickou detekci hybridizace DNA s využitím magnetických částic, určete, ke které z cílových DNA je tato sonda komplementární

28 Pracovní postup: A) Značení DNA sondy (60 minut) 7. Každá skupina připraví vzorek o celkovém obsahu 50 μl, který bude obsahovat: 10 μg/ml DNA (sondy - wt273-tnt) (zásobní roztok 100 μg/ml) 1x pufr pro terminální transferázu (zásobní roztok 10x koncentrovaný) 1x CoCl 2 (zásobní roztok 10x koncentrovaný) 0,75 μl enzymu TnT voda 100 μm nukleotid - skupina a) dgtp (zásobní roztok 1mM) b) dgtp-no 2 (zásobní roztok 1mM) c) deaza-dgtp (zásobní roztok 1mM) 8. Nechte inkubovat v termobloku 30 min / 37 C / netřepat. B) Hybridizace na magnetických částicích (MBT) (75 minut) Příprava MBT a hybridizace 1. Odeberte 40 μl rozotku MBT (Magnetic beads d(t) 25 - částice nesoucí oligonukleotidy polyt 25 ) do čistých eppendorfek, postavte je do magnetického koncentrátoru, počkejte až se MBT přitáhnou ke stěně, odeberte roztok, přidejte 100 μl 0,3 M NaCl / 10 mm Tris, protřepejte na vortexu, stočte na centrifuze. Postup 2x opakujte

29 2. Rozdělte MBT na poloviny do 2 čistých eppendorfek. 3. Připravte vzorky značené sondy s 2 cílovými DNA, aby obsahovaly 20 μl značené sondy (připraveno v A) ) + 6,7 μg/ml cílové DNA X a Y (zás. roztok 100 μg/ml, jen jedna z nich je komplementární k sondě) + 0,3 M NaCl (zás. roztok 2,5 M) + doplňte vodou do 30 μl. 4. Odeberte roztoky od MBT připravených v bodu 2 pomocí magnetu. K MBT přidejte vzorky připravené podle bodu Nechte inkubovat v termobloku zchlazeném na 20 C / 20 min / třepat 1000 rpm. Promytí: 6. Vzorky dejte na magnet, odeberte roztok, přidejte 100 μl PBS + Tween 20, protřepejte na vortexu, stočte na centrifuze. Postup 3x opakujte. Poté proveďte 3x totéž s roztokem 0,3 M NaCl / 10 mm Tris. Denatrurace: 7. Na magnetu odeberte roztok od MBT a přidejte do každé eppendorfky 20 μl vody (Sigma), dejte do termobloku vyhřátého na 75 C / 2 min / 1200 rpm. 8. Pomocí magnetu přeneste roztoky nad MBT do čistých eppendorfek = vaše vzorky, MBT vyhoďte. 9. Ke vzorkům přidejte NaCl, aby výsledná konc. byla 0,3 M (zás. roztok 2,5 M). C) Měření (40 min) Skupina a) a b) provede měření pomocí visící rtuťové kapkové elektrody na potenciostatu Autolab metodou cyklická voltametrie v mravenčanu jako základním elektrolytu. Skupina c) provede měření pomocí pyrolitické grafitové elektrody na potenciostatu CH Instruments metodou square wave voltametrie v acetátovém pufru jako základním elektrolytu. Získané výsledky porovnejte mezi skupinami

POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: 3. 10. 7. 10. 2011 II. TURNUS: 17. 10. 21. 10.

POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: 3. 10. 7. 10. 2011 II. TURNUS: 17. 10. 21. 10. POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY NÁVODY KE CVIČENÍM BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: 3. 10. 7. 10. 2011 II. TURNUS: 17. 10. 21. 10. 2011 MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: POKROČILÉ PRAKTICKÉ

Více

PROTOKOL WESTERN BLOT

PROTOKOL WESTERN BLOT WESTERN BLOT 1. PŘÍPRAVA ELEKTROFORETICKÉ APARATURY Saponátem a vodou se důkladně umyjí skla, plastové vložky a hřebínek, poté se důkladně opláchnou deionizovanou/destilovanou vodou a etanolem a nechají

Více

Western blotting. 10% APS 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl

Western blotting. 10% APS 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl 20,28 µl 40,56 µl 81,12 µl Western blotting 1. Příprava gelu složení aparatury hustotu gelu volit podle velikosti proteinů příprava rozdělovacího gelu: 10% 12% počet gelů 1 2 4 1 2 4 objem 6 ml 12 ml 24 ml 6 ml 12 ml 24 ml 40% akrylamid

Více

POKROČILÝ KURZ V RÁMCI UDRŽITELNOSTI PROJEKTU POŘÁDÁME MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA

POKROČILÝ KURZ V RÁMCI UDRŽITELNOSTI PROJEKTU POŘÁDÁME MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA V RÁMCI UDRŽITELNOSTI PROJEKTU POŘÁDÁME POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY NÁVODY KE CVIČENÍM BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. POKROČILÝ

Více

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE)

SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS PAGE) Princip SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza slouží k separaci proteinů na základě jejich velikosti (molekulové hmotnosti). Zahřátím vzorku za

Více

SDS-PAGE elektroforéza

SDS-PAGE elektroforéza SDS-PAGE elektroforéza Příprava gelu... 1 Recept na 0.75 mm gel (1 gel/2 gely)... 2 Recept na 1.5 mm gel (1 gel/2 gely)... 2 Příprava vzorku... 3 Elektroforéza... 3 Barvení gelů Blue Silver... 4 Chemikálie

Více

S filtračními papíry a membránou je nutno manipulovat pinzetou s tupým koncem.

S filtračními papíry a membránou je nutno manipulovat pinzetou s tupým koncem. Western Blotting Příprava blotovacího sendviče... 1 Blotování... 2 Kontrola přenesení proteinů na membránu... 2 Blokování membrány... 2 Aplikace protilátek... 2 Vizualizace... 3 Vyvolání filmu... 4 Chemikálie

Více

Protokoly Transformace plasmidu do elektrokompetentních buněk BL21 Pracovní postup:

Protokoly Transformace plasmidu do elektrokompetentních buněk BL21 Pracovní postup: Protokoly Pracovní potřeby, pufry a chemikálie jsou uvedeny na konci protokolu. Pracovní postupy jsou odvozeny od těchto kitů: Champion pet160 Directional TOPO Expression Kit with Lumio Technology (Invitrogen)

Více

IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod: detekce přímo v buňkách - fluorescenční barvení

Více

Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování

Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování Obsah Protein Gel Electrophoresis Kitu a jeho skladování Protein Gel Electrophoresis Kit obsahuje veškerý potřebný materiál provádění vertikální polyakrilamidové gelové elektroforézy. Experiment provádějí

Více

ZÁKLADNÍ KURZ V RÁMCI UDRŽITELNOSTI PROJEKTU POŘÁDÁME ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL

ZÁKLADNÍ KURZ V RÁMCI UDRŽITELNOSTI PROJEKTU POŘÁDÁME ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL V RÁMCI UDRŽITELNOSTI PROJEKTU POŘÁDÁME ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY

Více

Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE

Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE Elektroforéza v přítomnosti SDS SDS PAGE je jednoduchá, rychlá a reprodukovatelná metoda pro kvalifikovanou charakterizaci a srovnání bílkovin.tato metoda separuje

Více

1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I

1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I 1. Příloha 1 Návod úlohy pro Pokročilé praktikum z biochemie I Vazba bromfenolové modři na sérový albumin Princip úlohy Albumin má unikátní vlastnost vázat menší molekuly mnoha typů. Díky struktuře, tvořené

Více

ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I.

ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM / EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: 12. 4. 16. 4. 2010 II. TURNUS: 19. 4. 24. 4. 2010 MODERNÍ

Více

ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I.

ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM / EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: 18. 4. 22. 4. 2011 II. TURNUS: 2. 5. 6. 5. 2011 MODERNÍ

Více

Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie

Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie IZOLACE GENOMOVÉ DNA Deoxyribonukleová kyselina (DNA) představuje základní genetický materiál většiny

Více

ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL

ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL ZÁKLADNÍ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: 23. 4. 27. 4. 2012 / II. TURNUS: 14. 5. 18. 5. 2012 ZÁKLADNÍ

Více

1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru

1. Metodika. Protokol č. F1-4 Metodika: Srovnávací analýza efektivity přípravy rekombinantního proteinu ve fermentoru Protokol č.: F1-4 Datum: 20.12.2010 Metodika: analýza efektivity přípravy výběr z výsledků ze zkušebních provozů výroby antigenů. Vypracoval: Ing. Václav Filištein, Mgr. Tereza Chrudimská, Spolupracující

Více

ANALÝZA MARKERŮ OXIDAČNÍHO POŠKOZENÍ DNA, PROTEINŮ A LIPIDŮ PO IN VITRO APLIKACI LÁTEK NA BUNĚČNÉ KULTURY HEL a A549

ANALÝZA MARKERŮ OXIDAČNÍHO POŠKOZENÍ DNA, PROTEINŮ A LIPIDŮ PO IN VITRO APLIKACI LÁTEK NA BUNĚČNÉ KULTURY HEL a A549 ANALÝZA MARKERŮ OXIDAČNÍHO POŠKOZENÍ DNA, PROTEINŮ A LIPIDŮ PO IN VITRO APLIKACI LÁTEK NA BUNĚČNÉ KULTURY HEL a A549 O B S A H 1. Aplikace testovaných látek na buněčné kultury 2. Oxidační poškození DNA

Více

WESTERN BLOT. Velikost signálu je vyhodnocována srovnáním s naneseným proteinovým markerem, což je komerčně dostupná směs proteinů o známé velikosti.

WESTERN BLOT. Velikost signálu je vyhodnocována srovnáním s naneseným proteinovým markerem, což je komerčně dostupná směs proteinů o známé velikosti. WESTERN BLOT Western blot je metoda používaná pro kvalitativní nebo semikvantitativní detekci určitého proteinu ve vzorku. Metoda je tvořena třemi základními kroky: 1. elektroforetickou separací proteinů,

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální

Více

Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách

Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách Určení koncentrace proteinu fluorescenční metodou v mikrotitračních destičkách Teorie Stanovení celkových proteinů Celkové množství proteinů lze stanovit pomocí několika metod; například: Hartree-Lowryho

Více

Izolace nukleových kyselin

Izolace nukleových kyselin Izolace nukleových kyselin Požadavky na izolaci nukleových kyselin V nativním stavu z přirozeného materiálu v dostatečném množství požadované čistotě. Nukleové kyseliny je třeba zbavit všech látek, které

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální

Více

PROTEINOVÁ DENATURUJÍCÍ ELEKTROFORÉZA (SDS PAGE)

PROTEINOVÁ DENATURUJÍCÍ ELEKTROFORÉZA (SDS PAGE) PROTEINOVÁ DENATURUJÍCÍ ELEKTROFORÉZA (SDS PAGE) Denaturující proteinová elektroforéza (SDS PAGE - SDS Protein Acrylamide Gel Electrophoresis) je metoda, která se používá k separaci proteinů podle velikosti,

Více

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Izolace RNA doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD.. Metodiky izolace RNA celková buněčná RNA ( total RNA) zahrnuje řadu typů RNA, které se mohou lišit svými fyzikálněchemickými vlastnostmi a tedy i nároky na jejich

Více

Sraz studentů v 8:00 před laboratoří A5/108, s sebou plášť a přezutí PRINCIP. Polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti SDS (SDS-PAGE)

Sraz studentů v 8:00 před laboratoří A5/108, s sebou plášť a přezutí PRINCIP. Polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti SDS (SDS-PAGE) PRINCIP Sraz studentů v 8:00 před laboratoří A5/108, s sebou plášť a přezutí Polyakrylamidová gelová elektroforéza v přítomnosti SDS (SDS-PAGE) SDS-PAGE slouží k separaci proteinů na základě jejich molekulové

Více

ELEKTROFORETICKÉ METODY

ELEKTROFORETICKÉ METODY ELEKTROFORETICKÉ METODY ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE AMINOKYSELIN NA PAPÍROVÉM NOSIČI Aminokyseliny lze rozdělit elektroforézou na papíře. Protože molekulová hmotnost jednotlivých aminokyselin není příliš

Více

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN Fragmenty nukleových kyselin lze dle jejich velikosti rozdělit elektroforézou. Elektroforéza využívá rozdílné pohyblivosti jednotlivých fragmentů, danou právě

Více

Tkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche

Tkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche Izolace RNA Pracovní postup Homogenizace: Pozn. Postup homogenizace platí pouze pro izolaci RNA z nativní tkáně, v případě izolace z buněčné suspenze je tento krok vynechán a začíná se přídavkem homogenizačního

Více

Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů

Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů Bioanalytické metody Prof. RNDr. Pavel Peč, CSc. Úvod Kritéria výběru metod stanovení koncentrace proteinů jsou založena na možnostech pro vlastní analýzu,

Více

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY ELEKTROFORÉZA K čemu to je? kritérium čistoty preparátu stanovení molekulové hmotnosti makromolekul stanovení izoelektrického

Více

Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul

Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 8.11.2007 7 1 UV spektroskopie DNA a proteinů Všechny atomy absorbují v UV oblasti

Více

Laboratorní analytické metody. Petr Tůma

Laboratorní analytické metody. Petr Tůma Laboratorní analytické metody Petr Tůma Rozdělení analytických metod Metody separační Chromatografie kapalinová plynová Elektroforéza Metody spektrální absorpční spektrometrie v UV/VIS Metody elektrochemické

Více

2) Připravte si 3 sady po šesti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky.

2) Připravte si 3 sady po šesti zkumavkách. Do všech zkumavek pipetujte 0.2 ml roztoku BAPNA o různé koncentraci podle tabulky. CVIČENÍ Z ENZYMOLOGIE 1) Stanovení Michaelisovy konstanty trypsinu pomocí chromogenního substrátu. Aktivita trypsinu se určí změřením rychlosti hydrolýzy chromogenního substrátu BAPNA (Nα-benzoyl-L-arginin-p-nitroanilid)

Více

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

Více

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR Úvod IntellMed, s.r.o., Václavské náměstí 820/41, 110 00 Praha 1 DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR Jednou z nejvhodnějších metod pro detekci minimální reziduální choroby

Více

Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku

Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku Kurz 1 Úvod k biochemickému praktiku Pavla Balínová http://vyuka.lf3.cuni.cz/ Důležité informace Kroužkový asistent: RNDr. Pavla Balínová e-mailová adresa: pavla.balinova@lf3.cuni.cz místnost: 410 studijní

Více

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů Polymorfismus délky restrikčních fragmentů Princip: Chemikálie: PCR produkt z předchozího praktického cvičení Endonukleáza KpnI 10 U μl -1 Pufr pro KpnI 10 koncentrovaný (Tris-HCl 100 mmol l -1 ph 7,5,

Více

Seminář izolačních technologií

Seminář izolačních technologií Seminář izolačních technologií Zpracoval: Karel Bílek a Kateřina Svobodová Podpořeno FRVŠ 2385/2007 a 1305/2009 Úpravy a aktualizace: Pavla Chalupová ÚMFGZ MZLU v Brně 1 Lokalizace jaderné DNA 2 http://www.paternityexperts.com/basicgenetics.html

Více

Sbohem, paní Bradfordová

Sbohem, paní Bradfordová Sbohem, paní Bradfordová aneb IČ spektroskopie ve službách kvantifikace proteinů Mgr. Stanislav Kukla Merck spol. s r. o. Agenda 1 Zhodnocení současných možností kvantifikace proteinů Bradfordové metoda

Více

Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii

Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 1/1 Proč biofyzikální metody? Biofyzikální metody využívají fyzikální principy ke studiu biologických systémů Poskytují kvantitativní

Více

Praktické cvičení: Izolace a purifikace rekombinantního proteinu

Praktické cvičení: Izolace a purifikace rekombinantního proteinu Praktické cvičení: Izolace a purifikace rekombinantního proteinu Toto blokové praktické cvičení spočívá v teoretickém i praktickém seznámení s rekombinantními proteiny, jejich izolací, purifikací a využitím.

Více

Vzdělávání středoškolských pedagogů a studentů středních škol jako nástroj ke zvyšování kvality výuky přírodovědných předmětů CZ.1.07/1.1.00/14.

Vzdělávání středoškolských pedagogů a studentů středních škol jako nástroj ke zvyšování kvality výuky přírodovědných předmětů CZ.1.07/1.1.00/14. Praktické cvičení z chemie 1) Stanovení lipofilních listových barviv pomocí adsorpční chromatografie. 2) Stanovení proteinů v roztoku. 3) Homogenizace rostlinného materiálu pomocí tekutého dusíku a stanovení

Více

Sure-MeDIP I. with magnetic beads and MNase. www.krd.cz

Sure-MeDIP I. with magnetic beads and MNase. www.krd.cz Sure-MeDIP I with magnetic beads and MNase www.krd.cz 1 Obsah soupravy a skladování MeDIP souprava obsahuje reagencie na provedení 25 reakcí. Souprava je rozdělen do dvou částí, jedna je distribuována

Více

Praktický kurz. Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii

Praktický kurz. Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii Oddělení funkční genomiky a proteomiky Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Praktický kurz Moderní biofyzikální přístupy v experimentální biologii Místo konání: Brno,

Více

MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY:

MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: POKROČILÉ PRAKTICKÉ VZDĚLÁVÁNÍ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII Operační program Vzdělávání pro konkurenceschopnost Číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/09.0046 Praktický kurz pokročilých

Více

Identifikace mikroorganismů pomocí sekvence jejich genu pro 16S rrna

Identifikace mikroorganismů pomocí sekvence jejich genu pro 16S rrna Praktická úloha Identifikace mikroorganismů pomocí sekvence jejich genu pro 16S rrna Pro spolehlivou identifikaci mikroorganismů pomocí genetických metod se velmi často využívá stanovení nukleotidové sekvence

Více

PROTOKOL NORTHERNOVA HYBRIDIZACE

PROTOKOL NORTHERNOVA HYBRIDIZACE ! NORTHERNOVA HYBRIDIZACE Vzhledem k tomu, že se při Northern hybridizaci pracuje s RNA a RNA je extrémně citlivá na působení RNáz, je zapotřebí se vyvarovat jakékoliv kontaminace RNázami. Pro snížení

Více

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin Aktivita KA 2340/4-8up Stanovení bílkovin v mléce pomocí SDS PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu s přídavkem dodecyl sulfátu sodného) vypracovala: MVDr. Michaela Králová, Ph.D. Princip: Metoda

Více

Imunochemické metody. na principu vazby antigenu a protilátky

Imunochemické metody. na principu vazby antigenu a protilátky Imunochemické metody na principu vazby antigenu a protilátky ANTIGEN (Ag) specifická látka (struktura) vyvolávající imunitní reakci a schopná vazby na protilátku PROTILÁTKA (Ab antibody) molekula bílkoviny

Více

Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202)

Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202) Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202) Popis Column DNA Lego Kit je základ moderní stavebnicové (Lego) soupravy pro izolaci čisté DNA různého

Více

Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření

Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Praktický kurz Monitorování hladiny metalothioneinu po působení iontů těžkých kovů Vyhodnocení měření Vyučující: Ing. et Ing. David Hynek, Ph.D., Prof. Ing. René

Více

MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY:

MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: POKROČILÉ PRAKTICKÉ VZDĚLÁVÁNÍ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII Operační program Vzdělávání pro konkurenceschopnost Číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/09.0046 Praktický kurz základních

Více

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně. Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného záměru MZe č. 0002700602. Autor: Ing.

Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně. Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného záměru MZe č. 0002700602. Autor: Ing. Výzkumný ústav rostlinné výroby Praha Ruzyně Optimalizovaná metodika SDS-PAGE pro analýzu LMW podjednotek gluteninů pšenice Metodika byla vypracována jako výstup výzkumného záměru MZe č. 0002700602 Autor:

Více

Monitorování hladiny metalothioneinu a thiolových sloučenin u biologických organismů vystavených působení kovových prvků a sloučenin

Monitorování hladiny metalothioneinu a thiolových sloučenin u biologických organismů vystavených působení kovových prvků a sloučenin Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Monitorování hladiny metalothioneinu a thiolových sloučenin u biologických organismů vystavených působení kovových prvků a sloučenin Ing. Kateřina Tmejová, Ph. D.,

Více

cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2

cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2 cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2 Obsah soupravy a její skladování Tato souprava pro reverzní transkripci obsahuje reagencie potřebné k provedení reverzní transkripce (RT)

Více

METODY STUDIA PROTEINŮ

METODY STUDIA PROTEINŮ METODY STUDIA PROTEINŮ Mgr. Vlasta Němcová vlasta.furstova@tiscali.cz OBSAH PŘEDNÁŠKY 1) Stanovení koncentrace proteinu 2) Stanovení AMK sekvence proteinu Hmotnostní spektrometrie Edmanovo odbourávání

Více

ELFO: DNA testovaných vzorků společně se značeným velikostním markerem je separovaná standardně použitím agarosové elektroforézy.

ELFO: DNA testovaných vzorků společně se značeným velikostním markerem je separovaná standardně použitím agarosové elektroforézy. SOUTHERNOVA HYBRIDIZACE Existuje celá řada protokolů pro Southernovu hybridizaci. Tyto protokoly se do značné míry totožné co se týče úvodních fází, jako je příprava vzorků elektroforetickou separací,

Více

Stanovení kritické micelární koncentrace

Stanovení kritické micelární koncentrace Stanovení kritické micelární koncentrace TEORIE KONDUKTOMETRIE Měrná elektrická vodivost neboli konduktivita je fyzikální veličinou, která popisuje schopnost látek vést elektrický proud. Látky snadno vedoucí

Více

Inovace bakalářského studijního oboru Aplikovaná chemie CZ.1.07/2.2.00/15.0247

Inovace bakalářského studijního oboru Aplikovaná chemie CZ.1.07/2.2.00/15.0247 Papírová a tenkovrstvá chromatografie Jednou z nejrozšířenějších analytických metod je bezesporu chromatografie, umožňující účinnou separaci látek nutnou pro spolehlivou identifikaci a kvantifikaci složek

Více

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné:

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné: Výběrové otázky: 1. Součástí všech prokaryotických buněk je: a) DNA, plazmidy b) plazmidy, mitochondrie c) plazmidy, ribozomy d) mitochondrie, endoplazmatické retikulum 2. Z následujících tvrzení, týkajících

Více

Praktický kurz Příprava nanočástic metodami syntézy v žížalách, charakterizace - Imunohistochemické barvení

Praktický kurz Příprava nanočástic metodami syntézy v žížalách, charakterizace - Imunohistochemické barvení Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Praktický kurz Příprava nanočástic metodami syntézy v žížalách, charakterizace - Imunohistochemické barvení Vyučující: Mgr. Bc. Markéta Komínková Postup imunohistochemického

Více

Metody práce s proteinovými komplexy

Metody práce s proteinovými komplexy Metody práce s proteinovými komplexy Zora Nováková, Zdeněk Hodný Proteinové komplexy tvořeny dvěma a více proteiny spojenými nekovalentními vazbami Van der Waalsovy síly vodíkové můstky hydrofobní interakce

Více

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH Michaela Nesvadbová Význam identifikace živočišných druhů v krmivu a potravinách povinností každého výrobce je řádně a pravdivě označit

Více

Úloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1. Úkol 1. Ředění roztoků. Teoretický úvod - viz návod

Úloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1. Úkol 1. Ředění roztoků. Teoretický úvod - viz návod Úloha č. 1 Odměřování objemů, ředění roztoků Strana 1 Teoretický úvod Uveďte vzorec pro: výpočet směrodatné odchylky výpočet relativní chyby měření [%] Použitý materiál, pomůcky a přístroje Úkol 1. Ředění

Více

Moderní vizualizační nástroje pro elektrochemickou detekci iontů těžkých kovů

Moderní vizualizační nástroje pro elektrochemickou detekci iontů těžkých kovů Název: Školitel: Moderní vizualizační nástroje pro elektrochemickou detekci iontů těžkých kovů Renáta Kenšová, Marie Konečná Datum: 11. 9. 2013 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.0148 Název projektu: Mezinárodní

Více

Jazykové gymnázium Pavla Tigrida, Ostrava-Poruba Název projektu: Podpora rozvoje praktické výchovy ve fyzice a chemii

Jazykové gymnázium Pavla Tigrida, Ostrava-Poruba Název projektu: Podpora rozvoje praktické výchovy ve fyzice a chemii Datum: Jazykové gymnázium Pavla Tigrida, Ostrava-Poruba Název projektu: Podpora rozvoje praktické výchovy ve fyzice a chemii Laboratorní cvičení č. Tlak vzduchu: Teplota vzduchu: Bílkoviny(proteiny) Vlhkost

Více

TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin

TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin Teoretický úvod: TESTOVÁNÍ GMO Praktikum fyziologie rostlin 1 Teoretický úvod: TESTOVÁNÍ GMO Obecně na úvod Určitě jste už slyšeli pojem geneticky modifikovaný organismus (GMO). Úprava vlastností přirozeně

Více

α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C

α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C α-globin StripAssay Kat. číslo 4-160 10 testů 2-8 C Popis stripů: Pracovní postup Izolace DNA Doporučujeme použít následující kit pro izolaci DNA z plné krve nebo jiných typů vzorků: Spin Micro DNA Extraction

Více

ÚLOHA C Klonování PCR produktu do plasmidu

ÚLOHA C Klonování PCR produktu do plasmidu Jméno a učo: Datum: ÚLOHA C Klonování PCR produktu do plasmidu TEORETICKÝ ÚVOD Při klonování PCR produktů do plasmidů se využívá vlastnosti Taq polymerasy, a jiných non-proofreading polymeras, přidávat

Více

Stanovení izoelektrického bodu kaseinu

Stanovení izoelektrického bodu kaseinu Stanovení izoelektrického bodu kaseinu Shlukování koloidních částic do větších celků makroskopických rozměrů nazýváme koagulací. Ke koagulaci koloidních roztoků bílkovin dochází porušením solvatačního

Více

OBSAH. PP Master Mixy... 11 PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14

OBSAH. PP Master Mixy... 11 PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14 OBSAH DNA polymerázy pro PCR a pufry.................. 3 Taq DNA polymeráza 4 Taq DNA polymeráza Unis 5 TaqPurple DNA polymeráza 6 Taq DNA polymeráza 1.1 7 Combi Taq DNA polymeráza 8 LA DNA Polymerases

Více

COMET ASSAY (SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS)

COMET ASSAY (SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS) COMET ASSAY (SINGLE CELL GEL ELECTROPHORESIS) OBSAH 1. Princip metody 2. Přístroje a zařízení 3. Příprava vzorků 3.1 Kultivace a sklízení buněk A549 3.2 Výpočet koncentrace buněk 3.3 Hodnocení viability

Více

I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í

I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Laboratorní práce č. 10 Bílkoviny Pro potřeby projektu

Více

Turnusové praktikum z biochemie

Turnusové praktikum z biochemie Turnusové praktikum z biochemie FÚ UK Turnusové praktikum z biochemie úloha název strana 1 Identifikace neznámého vzorku, aneb chemik detektivem 3-11 2 Izolace nukleových kyselin 12-13 3 Fluorescenční

Více

CHEMIE. Pracovní list č. 10 - žákovská verze Téma: Bílkoviny. Mgr. Lenka Horutová

CHEMIE. Pracovní list č. 10 - žákovská verze Téma: Bílkoviny. Mgr. Lenka Horutová www.projektsako.cz CHEMIE Pracovní list č. 10 - žákovská verze Téma: Bílkoviny Lektor: Mgr. Lenka Horutová Projekt: Student a konkurenceschopnost Reg. číslo: CZ.1.07/1.1.07/03.0075 Teorie: Název proteiny

Více

Protokol 04. pšeničná bílkovina. masné výrobky. zkrácená verze

Protokol 04. pšeničná bílkovina. masné výrobky. zkrácená verze 1 Popis vzorku Podle protokolu č. 04 lze vyšetřit vzorky různých druhů masných výrobků na přítomnost pšeničné bílkoviny. 2 Detekční limit vyšetření Přítomnost pšeničné bílkoviny lze spolehlivě prokázat,

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MĚDI, ŽELEZA, MANGANU A ZINKU METODOU FAAS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MĚDI, ŽELEZA, MANGANU A ZINKU METODOU FAAS Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU MĚDI, ŽELEZA, MANGANU A ZINKU METODOU FAAS 1 Účel a rozsah Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení obsahu mědi, manganu, zinku a železa ve

Více

Metody testování humorální imunity

Metody testování humorální imunity Metody testování humorální imunity Co je to humorální imunita? Humorální = látková Buněčné produkty Nespecifická imunita příklady:» Lysozym v slinách, slzách» Sérové proteiny (proteiny akutní fáze)» Komplementový

Více

Obr. 1. Schematické znázornění 2D-PAGE (převzato z Lodish, H. a kol.: Molecular Cell Biology, 3. vyd., Freeman 1996)

Obr. 1. Schematické znázornění 2D-PAGE (převzato z Lodish, H. a kol.: Molecular Cell Biology, 3. vyd., Freeman 1996) Dvourozměrná elektroforéza (2D-PAGE) 2D-PAGE je vysoce efektivní separační metodou umožňující rozdělení komplikovaných směsí stovek různých bílkovin a představuje základní nástroj v novém rozvíjejícím

Více

Inkubace enzymů se substráty

Inkubace enzymů se substráty Inkubace enzymů se substráty Inkubace redukčních enzymů... 1 Inkubace oxidačních enzymů... 2 Extrakce látek z inkubační směsi... 2 Příprava vzorků k HPLC/UHPLC detekci... 3 Chemikálie a roztoky... 4 Substráty...

Více

Chelatometrie. Stanovení tvrdosti vody

Chelatometrie. Stanovení tvrdosti vody Chelatometrie Stanovení tvrdosti vody CHELATOMETRIE Cheláty (vnitřně komplexní sloučeniny; řecky chelé = klepeto) jsou komplexní sloučeniny, kde centrální ion je členem jednoho nebo více vznikajících kruhů.

Více

PO STOPÁCH BAKTERIÍ V/KOLEM NÁS

PO STOPÁCH BAKTERIÍ V/KOLEM NÁS PO STOPÁCH BAKTERIÍ V/KOLEM NÁS Jana Spáčilová, UK v Praze, PřF, Katedra buněčné biologie Svět bakterií je nesmírně druhově bohatý a máme ho blíž než před očima. Mikroskopickými metodami můžeme obdivovat

Více

Braf V600E StripAssay

Braf V600E StripAssay Braf V600E StripAssay Kat. číslo 5-570 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci čerstvých nebo mražených biopsií použijte soupravy Qiagen QIAmp DNA Mini nebo Micro. Pro izolaci

Více

Laboratorní cvičení z kinetiky chemických reakcí

Laboratorní cvičení z kinetiky chemických reakcí Laboratorní cvičení z kinetiky chemických reakcí LABORATORNÍ CVIČENÍ 1. Téma: Ovlivňování průběhu reakce změnou koncentrace látek. podmínek průběhu reakce. Jednou z nich je změna koncentrace výchozích

Více

Cvičení ke kurzu Obecná ekotoxikologie. Úloha A - Stanovení ekotoxicity v testu klíčení rostlin

Cvičení ke kurzu Obecná ekotoxikologie. Úloha A - Stanovení ekotoxicity v testu klíčení rostlin Cvičení ke kurzu Obecná ekotoxikologie Nutné potřeby, které studenti přinesou s sebou do cvičení: - Tento návod - Poznámkový sešit, psací potřeby - Nůžky - Pravítko (s milimetrovým rozlišením) - Přezůvky

Více

NRAS StripAssay. Kat. číslo 5-610. 20 testů 2-8 C

NRAS StripAssay. Kat. číslo 5-610. 20 testů 2-8 C NRAS StripAssay Kat. číslo 5-610 20 testů 2-8 C Popis stripu: Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci DNA musí být použita vhodná metoda vzhledem k typu tkáně vzorku. Pro doporučení vhodné metody kontaktujte

Více

CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS AFLP ANALYSIS CZECH VERSION

CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS AFLP ANALYSIS CZECH VERSION CLP ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS AFLP ANALYSIS CZECH VERSION AFLP ANALÝZA *** Technika AFLP (Amplification Fragment Lenght Polymorphism - polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů) je modifikací RFLP,

Více

Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy,

Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy, Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy, vyhodnocení výsledků, diskuse Anotace

Více

Elektroforéza nukleových kyselin

Elektroforéza nukleových kyselin Elektroforéza nukleových kyselin Elektroforéza nukleových kyselin je založena na tom, že NK jsou v neutrálním nebo zásaditém prostředí polyanionty. Protože se zvyšujícím se počtem nukleotidů v molekule

Více

GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI

GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI INDUKOVANÉ PŮSOBENÍM ORGANICKÝCH LÁTEK Z PRACHOVÝCH ČÁSTIC V OVZDUŠÍ Kateřina Hanzalová Oddělení genetické ekotoxikologie Ústav experimentální medicíny AV ČR v.v.i.

Více

Elektromigrační metody

Elektromigrační metody Elektromigrační metody Princip: molekuly nesoucí náboj se pohybují ve stejnosměrném elektrickém Arne Tiselius rozdělil proteiny krevního séra na základě jejich rozdílných rychlostí pohybu v elektrickém

Více

HbA1c. Axis - Shield. Společnost je zapsána v obchodním rejstříku Městského soudu v Praze, odd. C vložka 1299

HbA1c. Axis - Shield. Společnost je zapsána v obchodním rejstříku Městského soudu v Praze, odd. C vložka 1299 Lékařská technika a speciální zdravotní materiál Společnost je zapsána v obchodním rejstříku Městského soudu v Praze, odd. C vložka 1299 Obchodní 110, 251 70 Praha Čestlice Tel. +420 296 328 300 Fax. +420

Více

KARBOXYLOVÉ KYSELINY

KARBOXYLOVÉ KYSELINY LABORATORNÍ PRÁCE Č. 28 KARBOXYLOVÉ KYSELINY PRINCIP Karboxylové kyseliny jsou látky, které ve své molekule obsahují jednu nebo více karboxylových skupin. Odvozují se od nich dva typy derivátů, substituční

Více

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC 1 Rozsah a účel Postup specifikuje podmínky pro stanovení obsahu semduramicinu v krmivech metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) v koncentračním

Více

Praktický kurz Praktický kurz monitorování apoptózy a autofágie u nádorových prostatických buněk pomocí průtokové cytometrie

Praktický kurz Praktický kurz monitorování apoptózy a autofágie u nádorových prostatických buněk pomocí průtokové cytometrie Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Praktický kurz Praktický kurz monitorování apoptózy a autofágie u nádorových prostatických buněk pomocí průtokové cytometrie Nastavení průtokového cytometru a jeho

Více

EGFR XL StripAssay. Kat. číslo 5-630. 20 testů 2-8 C

EGFR XL StripAssay. Kat. číslo 5-630. 20 testů 2-8 C EGFR XL StripAssay Kat. číslo 5-630 20 testů 2-8 C Popis stripu Pracovní postup 1. Izolace DNA Pro izolaci DNA použijte vhodný izolační kit. Doporučené kity jsou následující: Pro izolaci čerstvých nebo

Více

Pokročilé biofyzikální přístupy v experimentální biologii

Pokročilé biofyzikální přístupy v experimentální biologii Molekulální komplexy chromatinu CEITEC, Masarykova univerzita Praktický kurz Pokročilé biofyzikální přístupy v experimentální biologii Místo konání: Brno, Univerzitní kampus Bohunice blok A2, seminární

Více

Spektroskopické é techniky a mikroskopie. Spektroskopie. Typy spektroskopických metod. Cirkulární dichroismus. Fluorescence UV-VIS

Spektroskopické é techniky a mikroskopie. Spektroskopie. Typy spektroskopických metod. Cirkulární dichroismus. Fluorescence UV-VIS Spektroskopické é techniky a mikroskopie Spektroskopie metody zahrnující interakce mezi světlem (fotony) a hmotou (elektrony a protony v atomech a molekulách Typy spektroskopických metod IR NMR Elektron-spinová

Více