QJ Roční zpráva 2013 o postupu prací na projektu

Transkript

1 Roční zpráva 2013 o postupu prací na projektu QJ Vývoj efektivních opatření eliminujících dopad invaze Chalara fraxinea v lesním školkařství a v navazujících aspektech lesního a vodního hospodářství Ludmila Havrdová Karel Černý Karel Dohnal Miloň Dvořák Vladimír Foltánek Šárka Gabrielová Markéta Hejná Libor Jankovský Zuzana Haňáčková Ondřej Koukol Marcela Mrázková Kateřina Novotná Dagmar Palovčíková Vítězslava Pešková Veronika Strnadová Petra Štochlová Michal Tomšovský

2 V průběhu řešení v roce 2013 probíhaly práce celkem na 7 dílčích cílech (C001, C002, C003, C004, C005, C006, C007) a sedmi aktivitách (A1301 A1307) podle plánu a v předpokládaném rozsahu. Obsah Dílčí cíl C001, Aktivita A1301 Výskyt a význam Chalara fraxinea.. 2 Dílčí cíl C002, Aktivita A1302 Výskyt Hymenoscyphus albidus 5 Souvislosti mezi kmeny Ch. fraxinea Dílčí cíl C003, Aktivita A1303 Výběr fungicidů in vitro testy... 7 Výběr fungicidů in vivo testy Dílčí cíl C004, Aktivita A1304 Studium mykoflóry jasanu 9 Dílčí cíl C005, Aktivita A1305 Biologický přípravek využitelný proti Ch. fraxinea Dílčí cíl C006, Aktivita A1306 Biologie patogenu jako základ efektivních ochranných a obranných opatření Dílčí cíl C007, Aktivita A1307 Ověření metodiky testů rezistence Fenotypově více odolní jedinci.. 16 Ověření metodiky odběru, uchování a napěstování materiálu Přehled výsledků RIV.. 18 Hospodaření v r Změny v r Postup prací v r

3 Dílčí cíl C001 A1301 Výskyt a význam Chalara fraxinea. (Ludmila Havrdová a kol.) Aktivita proběhla podle plánu. V letošním roce byla upřesněna metodika sběru dat pro C001 - rozšíření Ch. fraxinea v ČR, byly vybrány čtverce a zahájeno mapování. Dále byla ve spolupráci s LČR, s.p. získána data poškození jasanových porostů v LČR, s.p. a ve spolupráci se Sdružením lesních školkařů byly získány informace ke škodám vzniklým ve školkařských provozech. Na základě znalostí výskytu patogenu a jeho kvantifikace bude možné vyhodnotit význam infekce pro jednotlivé zájmové okruhy (školkařství, lesní hospodářství, vodohospodářství, ochranu krajiny atp.) V rámci cíle C001 bylo v roce 2013 ve čtvercové síti 5 x 5 km pokrývající celou ČR vybráno 298 čtverců (tj. 10 % území) (Obr. 1), na kterých probíhá mapování výskytu a škod způsobených patogenem H. pseudoalbidus. Území ČR bylo na základě přírodních podmínek (členitost reliéfu, nadmořská výška, průměrné roční srážky a teploty) rozděleno do pěti typů krajiny potenciálně ovlivňujících rozšíření jasanu a H. pseudoalbidus. Při výběru čtverců byla zohledňována četnost čtverců v jednotlivých typech krajiny a dodrženo rovnoměrné rozložení čtverců po celém území ČR (Obr. 1). V kategorii první bylo vybráno 101 čtverců, v kat. druhé 102 čtverců, v kat. třetí 21 čtverců, v kat. čtvrté 36 čtverců a v kategorii páté 38 čtverců. Aby byla postihnuta variabilita porostů s jasanem, v každém čtverci jsou hodnoceny tři charakteristické typy porostů s jasanem: břehový porost (BP), roztroušená výsadba (RV), lesní porost (LP), každý typ porostu je hodnocen ve třech opakováních (vzhledem k časové náročnosti byl počet sledování pro každý typ porostu snížen ze 4 hodnocení na tři). Za každý čtverec tak bude moci být hodnoceno maximálně 9 porostů. Zjištěné hodnoty budou za celý čtverec zprůměrovány a použity ve vyhodnocení. Pro terénní sběr dat byl vytvořen formulář (viz níže) a metodika sběru dat. V r bylo v rámci terénních průzkumů zhodnoceno 73 čtverců a celkem 563 porostů. Patogen byl identifikován téměř v 96 % porostů podíl napadení byl nejmenší u roztroušených výsadeb (91%) a nejvyšší u lesních porostů (99 %). Podrobná data o počtech sledovaných porostů a napadení viz Tab. 1. Z předběžných výsledků vyhodnocených ploch také vyplývá, že ve všech typech porostu nejvíce převládá prosychání do 10 % koruny (Tab. 2). Z informací lesních školkařů vyplývá, že patogen se v posledních třech letech ve školkách vyskytuje. Pěstování jasanu každoročně klesá a jedním z důvodů je nekróza jasanu, dalším, pravděpodobně i důležitějším faktorem je nezájem odběratelů o koupi jasanů z důvodu obavy jejich úhynu v důsledku nekrózy jasanu. Získané informace jsou digitalizovány a probíhá jejich vyhodnocení. V r probíhal sběr dat výskytu a podílu poškození způsobeného H. pseudoalbidus na území Lesů ČR, s.p.; sběr probíhal dle metodiky prezentované v loňském roce. Data byla digitalizována a v současné době probíhá jejich úprava a vyhodnocení. Dle prvních výstupů ze získaných dat lze konstatovat, že patogen je v lesích ČR velmi rozšířen. Ze sledovaných ploch byl patogen nalezen na 1036 plochách (82 %). Významné je zjištění, že jsou lesní porosty jasanu v ČR poškozeny velmi nerovnoměrně, přičemž podíl porostů v jednotlivých kategoriích poškození je velmi podobný. Poškození do 10 % bylo zaznamenáno u 180 2

4 porostů, poškození 10 25% bylo zjištěno u 310 porostů, poškození % u 306 porostů a poškození korun nad 50 % bylo identifikováno u 240 porostů. V rámci dílčího cíle mapování byl publikován leták LOS Havrdová L., Černý K., Pešková V. (2013): Hymenoscyphus pseudoalbidus V. Queloz, C. r. Grünig, R. Berndt, T. Kowalski, T. N. Sieber et O. Holderieder (anamorfa Chalara fraxinea T. Kowalski) Nekróza jasanu. Lesnická práce 92 (6), příloha 4 s. Dále byly výsledky prezentovány ve formě přednášek, článku a abstraktu na konferenci LOS 2013 a na 3. Česko-slovenské mykologické konferenci. Obr. 1. Vybrané čtverce pro mapování s vyznačenými oblastmi zpracovanými v r Tab. 1. Výskyt H. pseudoalbidus dle typu porostu Tab. 2. Podíl napadení korun dle typu porostu 3

5 CHALARA - sběr dat Číslo čtverce: Datum: Zpracoval: Pozn.: stupeň podíl jasanů (%): x < prosychání (%): 0 < šíře toku (m): x < > 10 vodní plocha číslo šetření označení GPS BP RV LP podíl jasanů (stupeň) H. pseudoalbidus prosychání (stupeň) šíře toku (stupeň) označení GPS podíl jasanů (stupeň) H. pseudoalbidus prosychání (stupeň) označení GPS H. pseudoalbidus prosychání (stupeň) vodní tok, plocha ano / ne ano / ne ano / ne ano / ne ano / ne ano / ne ano / ne ano / ne ano / ne ano / ne ano / ne ano / ne Poznámka: 4

6 Dílčí cíl C002 A1302 Izolace kmenů Ch. fraxinea (Ondřej Koukol a kol.) A. Výskyt Hymenoscyphus albidus V rámci cíle jsme pokračovali v započatém sběru a identifikaci plodnic Hymenoscyphus z řapíků jasanů na území ČR s cílem potvrdit, nebo vyvrátit hypotézu, že druh H. pseudoalbidus nahrazuje původní druh H. albidus na území ČR. Při předchozím studiu 9 položek z herbáře Národního muzea z let se nám podařilo amplifikovat oblast ITS rdna z DNA izolované z plodnice a potvrdili jsme, že před rokem 2000 byl na našem území sbírán pouze druh H. albidus. K identifikaci současných sběrů jsme použili jak morfologické znaky, tak metodu genetického fingerprintu a sekvence ITS rdna. DNA byla extrahována ze tří náhodně vybraných plodnic na jedné lokalitě (každá plodnice pocházela z jiného řapíku) pomocí InstaGene Matrix a následně byl po arbitrární PCR s primerem M13-core zjištěn profil amplifikovaných úseků na gelové elektroforéze (1,5% TBE, 110 V po dobu 60 min.). Jako kontrola byla přidána i DNA z kmene izolovaného z nekrózy (H. pseudoalbidus) a z plodnice ze sběru z roku 1942 patřící druhu H. albidus. Většina vzorků měla identický či velmi podobný profil s DNA pocházející prokazatelně z H. pseudoalbidus a odlišující se od H. albidus. Pouze u vzorků s unikátním odlišným profilem, u nějž nebylo možné jej jednoznačně přiřadit, jsme následně amplifikovali a sekvenovali úsek ITS rdna pro potvrzení identifikace. Tímto způsobem jsme výrazně redukovali počet sekvenčních reakcí a také zrychlili identifikaci. Provedli jsme sběry na čtyřech historických lokalitách, ale H. albidus jsme již nenašli, řapíky byly masově kolonizovány druhem H. pseudoalbidus. Na dalších cca 50ti lokalitách se nacházel rovněž druh H. pseudoalbidus, ale na některých jsme překvapivě nalezly řapíky zcela nebo částečně bez H. pseudoalbidus a místo nich další příbuzný druh z řádu Helotiales, Crocicreas fraxinophilus. Opět na základě údajů na položkách z herbáře Národního muzea jsme provedli odběr na lokalitách s historicky doloženým výskytem druhu C. fraxinophilus a potvrdili jsme, že je zde stabilně přítomen a krom toho je možné ho najít i na dalších lokalitách. Dále jsme nalezli na několika lokalitách i plodnice druhu H. caudatus, což dokazuje, že invaze H. pseudoalbidus má negativní vliv pouze na H. albidus, ale už ne na další příbuzné druhy. Plodnice C. fraxinophilus byly nacházeny později, v období září až říjen, ale řapíky byly světlé, což znamená, že nebyly vůbec, nebo jen zčásti kolonizovány druhem H. pseudoalbidus. Výsledky připravujeme do publikace, která bude zaslána k recenznímu řízení začátkem roku V letošním roce byl zaslán k recenznímu řízení popularizační článek shrnující historii a současnost výzkumu nekrózy jasanů v ČR i ve světě. B. Souvislosti mezi kmeny Ch. fraxinea Z důvodu nevhodných klimatických podmínek nebylo možné v letošním roce zahájit pokus na zjištění konkrétních souvislostí mezi kmeny Ch. fraxinea kolonizujících řapíky a výhony hostitele. Z důvodu vysokých teplot a sucha v době zrání plodniček infekce H. pseudoalbidus téměř vůbec neproběhla, nebo jen lokálně na nevhodných stanovištích pro 5

7 založení pokusu. Proto byla pouze vyzkoušena metoda zachytávání řapíků (Obr. 2) z jednotlivých výhonů a probíhala optimalizace izolace kmenů Ch. fraxinea z řapíků. Vzhledem k tomu, že mírnější infekce proběhla až koncem léta, průběh infekce byl odlišný a také se jinak projevovala na hostitelích. Po konzultaci s mykology ze zahraničí, kteří se zabývají problémem nekrózy jasanů, se jedná o velmi aktuální a zajímavé téma, které by mělo upřesnit, zda nekrózu způsobují konkrétní genotypy v populaci. Tuto otázku je možné zodpovědět po izolaci kmenů anamorfního stádia Ch. fraxinea z řapíků a z odpovídající nekrózy vznikající v místě jeho listové stopy. Řapíky určené k izolaci budou v terénu vytipovány a přichyceny provázkem k výhonu tak, aby bylo možné je po jejich přirozeném opadu odebrat (Obr. 2). Následně budou rozděleny na segmenty po cca 1-2 cm a po povrchové sterilizaci z nich budou izolovány kmeny anamorfního stádia Ch. fraxinea. Z kmenů bude extrahována DNA a následně budou zjištěny jejich genotypy pomocí mikrosatelitů vyvinutých speciálně pro druh H. pseudoalbidus. V zimě pak bude na stejných lokalitách provedena izolace z označených výhonů s nekrózou a po analýze DNA z izolovaného kmene (kmenů) bude srovnán jejich genotyp s kmeny z řapíků (opět pomocí mikrosatelitů). Obr. 2. Zkušební zajištění listů proti opadu 6

8 Dílčí cíl C003 A1303 Výběr fungicidů. (Markéta Hejná a kol.) Dílčím cílem C003 je zjistit citlivost Ch. fraxinea vůči fungicidním přípravkům. V roce 2013 byla testována účinnost fungicidních přípravků v in vitro podmínkách a dále byly založeny pokusy pro ověření účinnosti přípravků na rostlinách ve školkařských provozech. A. In vitro testy Celkem bylo testováno 26 fungicidních přípravků (Tab. 3) s unikátní účinnou látkou. Účinnost fungicidů byla hodnocena podle rychlosti růstu kolonií Ch. fraxinea na médiu (malt extract agar) s přidanými fungicidy v porovnání s koloniemi na médiu bez fungicidů. Pro každý fungicid bylo testováno 6 koncentrací účinné látky (a.i.) v médiu: 1000, 100, 10, 1, 0,1, 0,01 µg a.i./ml (Obr. 3). Pro testování byly vybrány tři různě rostoucí izoláty Chalara fraxinea z různých lokalit ČR. Naočkované Petriho misky s různými médii byly uloženy v termostatu ve tmě při 20 C, pokusy byly prováděny ve 3 opakováních. Růst kolonií byl hodnocen po 10 a 20 dnech od inokulace. Byl měřen průměr kolonií ve dvou kolmých směrech a vypočítáno procento inhibice růstu vzhledem ke kontrolním koloniím. U různých přípravků byla zjištěna různá míra účinnosti. Nejúčinnější fungicidy (např. Score 250 EC a Zato 50 WG) výrazně potlačovaly růst kolonií již v koncentraci 0,1 µg a.i./ml a ve vyšších koncentracích růst mycelia prakticky inhibovaly (inhibice růstu přes 90%). Většina fungicidů (např. Dithane DG Neotec, Merpan 80 WG a Mythos 30 SC) způsobovala inhibici růstu přes 80% pouze při nejvyšších testovaných koncentracích (100 a 1000 µg a.i./ml), ale při nižších koncentracích jejich účinnost prudce klesala. Nejméně účinné byly fungicidy, které ani v nejvyšší koncentraci 1000 µg a.i./ml nedosahovaly 50% inhibice růstu kolonií (např. Aliette 80 WP a Kocide 2000). V rámci cíle C003 je v přípravě článek, ve kterém budou výsledky pokusu publikovány. B. In vivo testy Celkem bylo pro testování na stromcích ve školkařských provozech vybráno 5 fungicidů: Discus, Horizon 250 EW, Ortiva, Score 250 EC a Zato 50 WG. Přípravky byly vybrány na základě účinnosti v in vitro pokusech, ale také s ohledem na to, zda jsou registrované pro použití v lesním hospodářství. Pokusy byly založeny ve třech školkách a to v Přerově nad Labem (Školky Montano s. r. o.), v Řečanech nad Labem (Lesoškolky s. r. o.) a v Krásném Poli (Uniles, a.s.). V každé školce je používán jiný typ pěstování sazenice prostokořenné, sazenice krytokořenné v sadbovačích a v květináčích (Obr. 4). Infekce se na všech lokalitách vyskytuje opakovaně každý rok, proto probíhala pouze přirozená inokulace stromků patogenem H. pseudoalbidus. Ve všech školkách bylo testováno stejných 5 fungicidů, každý fungicid minimálně na 120 stromcích. Pro pokusy byly v každé školce vyčleněny zdravé, minimálně dvouleté stromky, které nebyly v průběhu roku ošetřované jinými přípravky. Aplikace fungicidů byla prováděna ručními tlakovými postřikovači společně se smáčedlem v koncentracích doporučených výrobcem. Na kontrolní stromky byla aplikována pouze voda se smáčedlem. Načasování postřiků bylo provedeno v souladu s dosavadními znalostmi o době největšího 7

9 infekčního tlaku patogenu. První postřik byl proveden počátkem července a druhý postřik na konci července. Z důvodu velmi suchého počasí v průběhu července byl ve dvou školkách na části pokusných stromků proveden navíc ještě třetí postřik první zářijový týden. Pokusné plochy byly na podzim roku 2013 zkontrolovány, patrné byly určité rozdíly mezi stromky ošetřenými různými přípravky a neošetřenými. Pokus bude vyhodnocen na jaře roku 2014 a předpokládáme, že bude v následující sezóně zopakován. Tab. 3. Přehled testovaných fungicidních přípravků Obr. 3. Vliv fungicidů na růst kolonií (6 koncentrací účinné látky vlevo nejvyšší, vpravo nejnižší, dole dvě misky kontrolní) Obr. 4. Ilustrační foto in planta testy v různých školkařských provozech 8

10 Dílčí cíl C004 A1304 Studium mykoflóry jasanu. (Haňáčková a kol.) V letošním roce byla dokončena identifikace druhů hub z letního odběru jasanových výhonů z r Dohromady bylo na obou lokalitách zjištěno 35 druhů endofytických hub, nejčastěji z řádů Pleosporales a Xylariales (Tab. 4). Mezi složením společenstva endofytů ve výhonech relativně zdravých stromů a infikovaných stromů nebyly zjištěny signifikantní rozdíly. Na začátku února byl na stejných lokalitách proveden zimní odběr. Výhony pro izolaci endofytů byly odebrány ze stejných stromů jako v roce 2012 a zpracovány dle již dříve prezentované metodiky. Celkový počet 537 kolonií hub byl rozdělen do 64 morfotypů podle fenotypových znaků. U většiny morfotypů byla izolována DNA a průběžně jsou jednotlivé morfotypy identifikovány na základě porovnání morfologických a molekulárních znaků. Stejně jako v letním odběru byl počet kolonií na lokalitě Heřmanice výrazně nižší. Celkově se zdá, že je druhové společenstvo odlišné od letního odběru a i četnost některých druhů se mění. Například velmi hojný druh Aureobasidium pullulans poklesl v zimním odběru z 19% na 5,5% a naopak blíže neurčený druh Dothideomycetes sp.1, který byl v létě zaznamenán pouze v 0,8%, zvýšil svou četnost na 18%. V současné době se dokončuje determinace izolovaných endofytů a probíhá vyhodnocování získaných dat. Předpokládáme přípravu publikace v r. 2014, s uveřejněním v r taxon zdravé infikované stromy stromy Alternaria alternata 2 2 Aureobasidium pullulans Cladosporium sp. 3 3 Dothideomycetes sp Dothideomycetes sp Lophiostoma corticola 1 2 Phoma macrostoma 5 5 Phoma macrostoma var. incolorata 12 8 Phoma sp. 1 1 Pleosporales sp Pleosporales sp Pleosporales sp Pyrenochaeta sp. 3 1 Annulohypoxylon cohaerens 0 1 Annulohypoxylon multiforme 0 1 Anthostomella pinea 5 1 Coniochaeta sp. 1 0 Cytospora sp. 2 1 Fusarium avenaceum 1 3 Fusarium lateritium 3 3 Geniculosporium serpens 0 1 Chaetomium globosum 1 2 Phomopsis sp. 3 7 taxonomické zařazení do tříd a jejich celková četnost ve výhonech Dothideomycetes 50% Sordariomycetes 18% 9

11 taxon zdravé infikované taxonomické zařazení do tříd a jejich stromy stromy celková četnost ve výhonech Sordaria fimicola 1 1 Sordariomycetes 18% Sordariomycetes sp. 1 0 Stegonsporium pyriforme 0 1 Xylaria longipes 0 1 Aspergillus versicolor 2 4 Aspergillus sp. 1 0 Eurotiomycetes 5% Penicillium steckii 1 2 Botrytis cinerea 1 1 Bulgaria inquinans 1 1 Leotiomycetes 1% Ascomycete sp. F yeast unindentified 26% yeast Tab. 4. Četnost izolace endofytů ze zdravých stromů a ze stromů s infekcí Ch. fraxinea (léto 2012) 10

12 Dílčí cíl C005 A1305 Biologický přípravek využitelný proti Ch. fraxinea (Haňáčková a kol.) Tento cíl se zaměřuje na výběr vhodného endofyta, který by mohl potenciálně potlačovat průnik patogenu do výhonu nebo by zpomaloval jeho růst výhonem. Na testování těchto vlastností u endofytů izolovaných z jasanových výhonů (viz C004) byly zvoleny antagonistické testy in vitro. V roce 2013 byla optimalizována a konkretizována metodika těchto testů. Jako kultivační médium byl vyzkoušen 2 sladinový agar, 2 malt extract agar s výluhem z jasanových výhonů a agar s výluhem z jasanových výhonů. Do některých médií byly přidány kousky výhonů. Vzhledem k potřebě přiblížit podmínky testování antagonismu in vitro co nejvíce přirozenému prostředí (Obr. 5), byly antagonistické testy také zkoušeny na kouscích jasanových dřívek. Tyto testy probíhaly při 18 C a 4 C. Ch. fraxinea byla inokulována na bazální i apikální část dřívka. Ze všech typů substrátu byla zkoušena reizolace patogenu. Jako vhodné médium byl vybrán agar s výluhem z jasanových výhonů, do kterého byla přidána mikrokrystalická celulóza jako zdroj uhlíku. Projevy antagonismu na tomto médiu nejsou tak markantní, ale médium lépe simuluje podmínky in vivo. Antagonistické pokusy byly provedeny u 2 kmenů Ch. fraxinea s 31 endofyty z letního odběru a 18 endofyty z odběru zimního. Každé párování bylo opakováno třikrát a jako kontrolní byl použit pár Ch. fraxinea Ch. fraxinea. Růst patogenu byl měřen směrem k antagonistovi na spojnici obou kolonií, a ve 45 pod a nad spojnici. Změny růstu byly zaznamenány po 14 a 28 dnech. a Obr. 5. Rozdíly v růstu na 2 SL(a) a médiu chudém na živiny (b) b Během pokusu byly pozorovány interakce omezující růst Ch. fraxinea jako je přerůstání druhou houbou a vytvoření deadlock zóny. Přerůstání Ch. fraxinea byly schopné často druhy známé také jako patogeni rostlin, což znemožňuje jejich využití jako biologického přípravku. Celkově se zdá být Ch. fraxinea velmi odolná vůči antagonistickým účinkům jiných hub, naopak mnoho druhů sama potlačuje. 11

13 Dílčí cíl C006 A1306 Biologie patogenu jako základ efektivních ochranných a obranných opatření. (Miloň Dvořák a kol.) V roce řešení 2013 bylo odstartováno pozorování fenologie patogenu H. pseudoalbidus pomocí lapačů spor v plném rozsahu. Terénní i laboratorní práce probíhaly shodně s předchozím rokem řešení. Rozdíl byl v počtu pokusných ploch, kde výzkum probíhal; v tomto roce přibyly k původní jedné pokusné ploše další tři. Výskyt spor je zásadní moment fenologie patogenu, který určuje načasování ochranných zásahů při kontrole infekce např. aplikace fungicidů. Vzhledem k tomu, jaké mají tyto poznatky významný praktický dopad, byl v tomto roce publikován článek v odborném recenzovaném periodiku Zahradnictví článek, který popisuje tuto námi používanou metodiku a její aplikaci pro optimalizaci použití fungicidů v boji proti nekróze jasanů. Sledování bionomie patogenu bylo, tak jako v loňském roce 2012, realizováno pomocí zařízení na odchyt spor se současnou instalací meteorologické staničky. Spory H. pseudoalbidus byly odchytávány v období jejich předpokládaného výskytu (dle předchozích výsledků) s určitou rezervou. Konkrétně to bylo většinou od začátku června do začátku října Pro odchyt spor byly použity lapače spor (Amet) Burkardova typu (Hirst, 1952). Lepové pásky se sporami byly opět vyhodnocovány mikroskopicky. Meteorologická data byla zaznamenávána automatickými klimatickými stanicemi SIGNALIZÁTOR (Amet), která v hodinových intervalech zaznamenávala teplotu a vlhkost vzduchu, rosný bod a ovlhčení listů (prostřednictvím měření napětí mezi sadou elektrod propojenou exponovaným filtračním papírem) (Graf 1). Pokusné plochy byly v roce 2013 celkem čtyři (Obr. 6): 1. Hackerova školka na území Školního lesního podniku Masarykův les Křtiny, GPS: 49 19'23.962"N, 16 44'39.419"E, 470 m n. m. Jde o zapojený smíšený porost v údolí Křtinského potoka s jednotlivými jasany s jasnými příznaky nekrózy. Lapač byl umístěn 5 m od paty kmene asi 20 letého jasanu ztepilého s jasnými příznaky infekce nekrózou jasanu už v předchozích letech. Lapač byl napájen autoakumulátory a solárními panely. Lapání probíhalo od do a výměnou pásek byl pověřen student oboru Arboristika Vojtěch Kasal, který na téma nekrózy jasanu zpracovává bakalářskou práci. 2. Vranovice jsou součástí LZ Židlochovice, GPS: 48 56'39.857"N, 16 36'8.842"E, 170 m n. m. Plocha se nachází uvnitř rozlehlého jasanového porostu na lužním stanovišti, který je téměř kompletně napaden nekrózou jasanu. Lapač byl napájen autoakumulátorem a solárním panelem (Obr. 7). Odchyt spor probíhal od do , výměnou pásek byl pověřen student oboru Lesního inženýrství Jiří Rozsypálek, který na téma nekrózy jasanu zpracovává diplomovou práci. 3. Hlincova Hora se nachází na okraji Českých Budějovic, jedná se o městskou zeleň, GPS: 48 58'35.610"N, 14 30'42.228"E, 407 m n. m. Zdrojem spor byly dva vzrostlé jasany s mírným napadením nekrózou jasanu, lapač byl umístěn 10 m od paty kmene a 12

14 napájen z elektrické sítě. Odchyt spor probíhal od do , výměnu pásek částečně prováděli místní obyvatelé. 4. Líska je lokalita umístěná na okraji vsi v Lužických horách, GPS: 50 49'38.185"N, 14 27'43.283"E, 568 m n. m. Jedná se o liniovou výsadbu vzrostlých jasanů podél nezpevněné cesty v mírném svahu, které jsou citelně napadeny nekrózou. Lapač byl instalován 10 m od paty kmene a napájen z elektrické sítě. Odchyt spor probíhal od do a výměnou pásek byli částečně pověřeni místní obyvatelé. Výsledky lapání spor jsou v současné době ve stádiu rozpracování a budou dokončeny v průběhu ledna. Graf 1. Příklad naměřených klimatických dat na lokalitě Líska v létě 2013 Obr. 6. Umístění pokusných ploch v r

15 Obr. 7. Instalace zařízení na pokusné ploše Vranovice 14

16 Dílčí cíl C007 A1307 Ověření metodiky testů rezistence. Ověření metodiky výběru fenotypově více odolných jedinců odběru, uchování a napěstování materiálu. (Kateřina Novotná a kol.) A. Ověření metodiky testů rezistence Cílem dílčího úkolu bylo zjistit případný vliv sledovaných faktorů prostředí na rozvoj umělé in vitro infekce Ch. fraxinea u F. excelsior a detekovat tak faktory, které by mohly zkreslovat výsledky průzkumu citlivosti. Mezi zkoumané faktory patřily délka inkubace, vliv in situ infekce Ch. fraxinea hostitele (zdravý jedinec, akutně infikovaný jedinec) a termín odběru vzorků. Inokulace segmentem mycelia Ch. fraxinea byly realizovány podle metodiky z roku Pro infekční testy byly použity izoláty Ch. fraxinea uložené ve sbírce VÚKOZ, v. v. i. pod kódem C9/12 (Výrava, Královéhradecký kraj) a C28/12 (Ploužnice, Liberecký kraj). Po čtyřech týdnech (viz dále) obvykle ve dvaceti opakováních v každé variantě byla u jednotlivých segmentů změřena šířka a délka nekrózy způsobená v důsledku napadení Ch. fraxinea. Od zjištěných rozměrů byla následně odečtena velikost vyraženého otvoru. Nekrózy byly překresleny na pauzovací papír. Pauzovací papír s plochami nekróz byl naskenován a velikost jednotlivých nekróz byla zjištěna pomocí softwaru ImageJ Pro statistické vyhodnocení byl použit software Statistica 8.0 (Statsoft Inc., Tulsa, OK); pokusy byly znáhodněny. Opakovaným měřením nekróz (po 1, 2, 3 a 4 týdnech) bylo určeno jako ideální hodnocení velikosti nekróz po 4 týdnech z důvodu velmi pomalého rozvoje nekróz. Pro zjištění, zda závisí intenzita rozvoje umělé in vitro infekce Ch. fraxinea na zdravotním stavu F. excelsior, byly odebrány vzorky větví ze dvou zdravých a čtyřech napadených stromů stejného stáří, ze dvou různých lokalit. Bylo prokázáno, že na rozvoj umělé infekce má vliv akutní in situ infekce stromu, ze kterého byly vzorky odebírány. Průkazně menší léze byly na segmentech větví ze zdravých stromů oproti segmentům větví z infikovaných stromů a to při použití obou izolátů i ve všech termínech, přičemž byly velikosti nekróz odlišné i mezi jednotlivými testovanými genotypy jasanů (Tab. 5). Izolát C9/12 Izolát C28/12 Lokalita Zdravotní Datum Datum stav únor duben červenec říjen únor duben červenec říjen Homogenní skupiny Homogenní skupiny Horní Světlá Z a a a a a a a a N c b d b b b a b b b ab a a a a a Luž Z ab a bc a a a a a N ab ab e b a a a c ab b cd a a a b ab Pozn.: Z = zdravý, N = akutně infikovaný Tab. 5. Rozdělení plochy lézí do homogenních skupin na základě mnohonásobného porovnávání po inokulaci jednotlivými izoláty v jednotlivých termínech Pro ověření závislosti rozvoje umělé infekce Ch. fraxinea na době odběru vzorků větví, byly odebrány vzorky ze stejných stromů jako v předchozím případě. Vzorky byly 15

17 odebrány ve 4 různých termínech (15. 2., , a ). Statisticky průkazně odlišný termín byl pouze ; v tomto termínu byly velikosti lézí nejrozsáhlejší, a to u všech testovaných genotypů jasanů i při použití obou izolátů (Obr. 8) Plocha nekróz (mm 2 ) Legenda: zdravé jasany infikované jasany izolát C9/12 izolát C28/12 0 únor duben červenec říjen Termín inokulace Obr. 8. Závislost velikosti lézí u F. excelsior na termínu umělé infekce Ch. fraxinea u jednotlivých izolátů Závislost rozvoje umělé infekce Ch. fraxinea na termínu inokulace byla dále zjišťována v podmínkách in situ na semenáčích pěstovaných v záhonech na venkovní pokusné ploše (poskytnuté na základě spolupráce se Sdružením lesních školkařů ČR). Do pokusu bylo zařazeno rostlin pro každou variantu (izolát C9/12 a izolát C28/12) a opakování. Pokus byl založen ve znáhodněných blocích ve třech opakováních a byl proveden ve dvou termínech ( a ). Hodnoty všech sledovaných rozměrů lézí se průkazně lišily mezi jednotlivými použitými izoláty v obou termínech i mezi jednotlivými termíny u obou izolátů. Získané výsledky v rámci aktivity byly prezentovány na semináři LOS Škodliví činitelé v lesích Česka a na 3. Česko-slovenské mykologické konferenci v Olomouci ve formě posteru Průzkum odolnosti A. glutinosa a F. excelsior vůči invazním patogenům P. alni a Ch. fraxinea (autoři Novotná, Štochlová, Havrdová, Strnadová a Černý). B. Fenotypově více odolní jedinci Podle metodiky vytvořené v loňském roce byly v terénu vyhledáváni zdraví jedinci F. excelsior, kteří se vyskytují v bezprostřední blízkosti již infikovaných jasanů (tj. jsou již delší dobu vystaveni infekčnímu tlaku) a mají stejné či přibližné stanovištní podmínky. V letošním roce bylo nalezeno 7 takových jedinců (Tab. 6) Všechny lokality byly zaměřeny pomocí GPS. 16

18 Poř. číslo Lokalita Okres Typ porostu Zeměpisná šířka (N) Zeměpisná délka ( E ) Nadm. výška 1 Samota Benešov linie 49, , Křížov Benešov linie 49, , Peklo Pelhřimov linie 49, , Jalovčí Praha-východ linie 49, , Věžníkov Kutná hora les 49, , Hejště Jihlava linie 49, , Těšínky Kolín linie 49, , Tab. 6. Vytipovaní jedinci vykazující vyšší odolnost vůči infekci Ch. fraxinea (terénní šetření 2013) C. Ověření metodiky odběru, uchování a napěstování materiálu Cílem tohoto dílčího úkolu je ověřit nejvhodnější způsob vegetativního množení u jasanu ztepilého a namnožit jeho vybrané genotypy. Na jaře 2013 bylo provedeno roubování 3 genotypů F. excelsior (2 stromy z lokality Luž a 1 strom z okolí Mnichova Hradiště), které na základě vizuálního hodnocení provedeného v minulém roce v terénu vykazovaly fenotypově vysokou odolnost proti patogenu Ch. fraxinea, na podnož F. excelsior; podnože byly získány na základě spolupráce se Sdružením lesních školkařů ČR. Z každého genotypu bylo naroubováno 20 jedinců. Úspěšnost roubování byla 38 % (tj. po řadě 55%, 40% a 20 %). Všechny řízkovance, které zakořenily v loňském roce, se podařilo uchovat během zimy 2012/2013. V červnu 2013 byly všechny rostliny přesazeny, tj. celkem 21 rostlin. Květináče s roubovanci a řízkovanci jsou nyní přemístěny do chladného skleníku. Rostliny zde přezimují a v příštím roce budou přesazeny. 17

19 Výsledky v r Pro rok 2013 nebyly žádné výsledky RIV plánovány. V rámci dílčího cíle C001 vznikl leták LOS: Havrdová L., Černý K., Pešková V. (2013): Hymenoscyphus pseudoalbidus V. Queloz, C. r. Grünig, R. Berndt, T. Kowalski, T. N. Sieber et O. Holderieder (anamorfa Chalara fraxinea T. Kowalski) Nekróza jasanu. Lesnická práce 92 (6), příloha 4 s. V rámci cíle C001 byly dále publikovány dílčí výsledky ve formě prezentace a článku na konferenci Škodliví činitelé v lesích Česka 2012/2013: Havrdová L. et Černý K. (2013): Nekróza jasanu přehled současných znalostí. Zpravodaj Ochrany Lesa 17/2013: s V rámci cíle C002 a C001 je v přípravě popularizační článek (Živa) shrnující historii a současnost výzkumu nekrózy jasanů v ČR i ve světě. Cíl C003 byl prezentován formou posteru na konferenci LOS: Hejná M., Havrdová L., Fedusiv L., Černý K.(2013): Citlivost patogenu Chalara fraxinea vůči fungicidním přípravkům v in vitro podmínkách. Škodliví činitelé v lesích Česka 2012/2013 v Průhonicích, ; dále formou posteru a abstraktu Hejná M., Havrdová L., Fedusiv L., Černý K.(2013): Efficacy of some selected fungicides on the in vitro growth of Chalara fraxinea causing ash dieback na konferenci IUFRO 2013 WP Foliage, shoot and stem diseases, May 20th - 25th 2013, Brno and Černá Hora, Czech Republic, Book of Abstracts p. 111.; a dále na. 3. Česko-slovenské Mykologické konferenci v Olomouci, , Mykologické Listy 125, s. 40. Výsledky byly také prezentovány formou posteru a abstraktu na konferenci COST FRAXBACK: Hejná M., Havrdová L., Fedusiv L., Černý K. (2013): The influence of selected fungicides on in vitro growth of Chalara fraxinea isolates. 4th 6th September 2013, Malmö, Sweden, Abstracts of Posters s Dílčí výsledky cíle C004 a C005 byly publikovány formou posteru a abstraktu na třech konferencích: Kolářová Z., Havrdová L., Koukol O., Fedusiv L., Černý K. (2013): Endophytic community in shoots of Fraxinus excelsior and its competitive potential against Chalara fraxinea.; na konferenci IUFRO 2013 WP Foliage, shoot and stem diseases, May 20th - 25th 2013, Brno and Černá Hora, Czech Republic, Book of Abstracts p. 97.; dále na 3 Česko-slovenské mykologické konferenci v Olomouci, , Mykologické Listy 125, s. 48.; a na konferenci COST FRAXBACK, 4th 6th September, 2013, Malmö, Sweden, Abstracts of Posters s. 28. Dílčí části cíle C006 a C003 byly publikovány v časopise Zahradnictví (Jrec): Dvořák M., Humplíková Z., Hejná M., Havrdová L., Fedusiv L.(2013): Současné poznatky o nekróze jasanů a výzkum biologie jejího původce za účelem vývoje metod obrany. Zahradnictví 9/2013, s ISSN Dílčí výsledky cíle C006 byly dále zveřejněny formou posteru a abstraktu na konferenci COST FRAXBACK: Dvořák M., Humplíková, Z. (2013): Hymenoscyphus pseudoalbidus spore trapping in the Czech Republic 2012, 4th 6th September, 2013, Malmö, Sweden, Abstracts of Posters s Cíl C007 byl prezentován formou posteru na konferenci LOS: Novotná K., Štochlová P., Havrdová L., Strnadová V., Černý K.(2013): Průzkum odolnosti A. glutinosa a F. excelsior vůči invazním patogenům P. alni a Ch. fraxinea. Škodliví činitelé v lesích Česka 2012/2013, , Průhonice a na 3 Česko-slovenské mykologické konferenci v Olomouci formou posteru a abstraktu: Novotná K., Štochlová P., Havrdová L., 18

20 Strnadová V., Černý K.(2013): Testování odolnosti vybraných autochtonních dřevin vůči invazním houbovým patogenům , Olomouc, Mykologické Listy 125, s. 54. Hospodaření v r Hospodaření v r probíhalo v souladu s plánem. Hospodaření všech příjemců účelové podpory i dalších účastníků proběhlo v souladu s plánem. Mezi jednotlivými položkami došlo k přesunům v souladu s Všeobecnými podmínkami MZe (čl ), kdy přesuny finančních prostředků mezi jednotlivými schválenými položkami uznaných nákladů u každého příjemce zvlášť činí v maximální částce 20 tis. Kč. Tyto přesuny budou za jednotlivé organizace detailně popsány v elektronické závěrečné zprávě pro MZe. V současné době (prosinec 2013) zbývá dočerpat část mzdových prostředků, část prostředků režijních (u v.v.i. a veřejných vysokých škol se z větší části rozpočítává na konci roku). V roce 2013 v rámci úsporných opatření nedošlo k dočerpání některých položek (v souladu s pravidly poskytovatele), které budou převedeny do fondů FÚUP jednotlivých příjemců (VÚKOZ, v.v.i., VÚLHM, v.v.i.) dle pravidel Smlouvy. Změny v r V roce 2013 nedošlo k žádným změnám v projektu. Postup prací v r Na rok 2014 jsou plánovány práce na dílčích cílech C001 C007. C001: Bude pokračovat sběr terénních dat výskytu a významu Ch. fraxinea dle metodiky a formulářů 2013 (VÚKOZ, v.v.i., VÚLHM, v.v.i., PLA, s.p.). Data získaná od LČR, s.p. a Sdružení lesních školkařů budou statisticky vyhodnocena. C002: V návaznosti na původní obsah cíle C002 se v roce 2014 zaměříme na populační strukturu H. pseudoalbidus na velmi malé škále, na jednotlivých řapících s cílem zjistit, který z kmenů kolonizujících řapík proniká do výhonu a způsobuje nekrózu, či zda jich je několik. Spoluřešitelka cíle, Zuzana Haňáčková, se před samotným pokusem zúčastní krátkodobé vědecké stáže (STSM), která se bude týkat metodiky studia mikrosatelitů a následného vyhodnocení získaných dat. Stáž bude financována z projektu COST Fraxinus dieback in Europe: elaborating guidelines and strategies for sustainable management (FRAXBACK) a uskuteční se od 25. ledna do 2. února ve Švýcarsku (Swiss Federal Institute of Technology in Zurich). C003: Na začátku roku 2014 bude vyhodnocen in vivo pokus založený v lesních školkách v r Na základě vyhodnocených výsledků se zvažuje opakování pokusu, které by proběhlo ve vegetační sezóně

21 C004: Předpokládáme dokončení identifikace endofytů jasanových výhonů ze zimního odběru roku 2013 a porovnání druhového složení endofytů jasanových výhonů v létě a v zimě. Následně se budou data připravovat pro publikování. C005: Budou vyhodnoceny antagonistické pokusy in vitro a vybrány endofytické houby s nejlepšími antagonistickými účinky na Ch. fraxinea. Tyto kmeny pak hodláme použít pro další testy na jasanových dřívkách, eventuelně pro in vivo testy. C006: V r bude nejprve probíhat vyhodnocování dat z roku V průběhu června až září budou opět v provozu lapače spor na čtyřech lokalitách obdobného složení. Mimo tohoto kontinuálního způsobu lapání spor bude aplikováno také lapání spor nárazové s vysokou efektivitou, které se provádí dávkově, vždy 48 hodin nebo i kratší dobu. Za účelem tohoto pokusu budou řešitelem vyrobeny lapače spor s rotujícími lepovými tyčinkami. Tyto lapače spor jsou na výrobu velmi levné, a proto jich lze použít vetší množství. Této výhody bude využito v rámci experimentu, kterým se bude sledovat prostorové šíření spor v různých vzdálenostech od zdroje a také v různých typech porostů. Velká změna nastane ve vyhodnocování lepových pásek (lepových tyčinek). Od roku 2014 budeme optimalizovat v zahraničí již používanou metodiku absolutní kvantifikace spor pomocí metody qpcr, která vyhodnocuje množství druhově specifické DNA ve zkoumaném vzorku. Dojde tím ke zpřesnění metodiky, protože budou vyloučeny omyly při okulární identifikaci spor nebo jejich přehlédnutí. Tuto metodiku vyhodnocování a odchytu spor pomocí rotačních lapačů s lepovými tyčinkami prakticky odzkoušel řešitel Miloň Dvořák v rámci STSM COST FRAXBACK v Belgii, v červenci C007: V roce 2014 se znovu pokusíme vytvořit postup úspěšné inokulace jedinců F. excelsior suspenzí askospor H. pseudoalbidus. Budeme také pokračovat ve sledování rozvoje umělé infekce Ch. fraxinea v podmínkách in situ. V příštím roce proběhne hodnocení zdravotního stavu jasanů (vliv patogenu Ch. fraxinea) na 2 3 provenienčních plochách založených v roce 1999 RNDr. Václavem Buriánkem (VÚRV, v,v,i, Strnady) a v semenném sadu na území LS Jablunkov, revír Horní Lomná, založeného v roce Toto hodnocení bylo plánováno již na rok 2013, kdy k němu však z důvodu velkého množství terénních měření nedošlo. Dále budou prováděny odběry segmentů (roubů, případně bylinných řízků) z vytipovaných odolných jedinců F. excelsior vůči Ch. fraxinea na založení matečnic a dále z jedinců zahrnutých do pokusu testů rezistence na další infekční pokusy. Ludmila Havrdová a kol.,