POVRCHOVÉ ÚPRAVY STOMATOLOGICKÝCH A ORTOPEDICKÝCH IMPLANTÁTŮ POVLAKY TiN A ZrN. THE SURFACING OF DENTAL AND ORTHOPEDIC IMPLANTS BY TiN AND ZrN LAYERS

Transkript

1 POVRCHOVÉ ÚPRAVY STOMATOLOGICKÝCH A ORTOPEDICKÝCH IMPLANTÁTŮ POVLAKY TiN A ZrN THE SURFACING OF DENTAL AND ORTHOPEDIC IMPLANTS BY TiN AND ZrN LAYERS Jitka Kabátová a Sonia Bartáková b František Hnilica a Vítězslav Březina c Ladislav Cvrček d a UJP PRAHA a. s., Nad Kamínkou 1345, Praha - Zbraslav, kabatova@ujp.cz b FN u sv. Anny v Brně, Pakařská 53, Brno c B. P. MEDICAL spol. s r. o., Příkop 843/4, Brno d HVM Plasma spol. s r. o., Na Hutmance 2, Praha 5 Abstrakt Biokompatibilita (reakce buněk na zkoušený materiál a jejich schopnost dostát všech svých fyziologických funkcí) je primárně důležitá pro materiály implantátů vedle jejich mechanických a fyzikálních vlastností. Otázka úpravy povrchů implantátů je velmi aktuální s nástupem nových technik povlakování. V práci byly studovány vlastnosti povlaků TiN a ZrN deponovaných technologií PVD. Povlaky byly naneseny na substráty technicky čistého titanu, slitiny titanu Ti6Al4V, Ti38Nb, Ti35Nb6Ta a stomatologické slitiny CoCrMo. Byly použity různé úpravy povrchů substrátů a změřeny tloušťky vrstev, drsnosti povrchů a mechanické vlastnosti včetně přilnavosti k povrchům. Zkoušky cytokompatibility byly zaměřeny na studium adherace a kolonizace buněk k substrátům. Výsledky ukázaly, že vrstvy TiN a ZrN jsou vhodné na povlakování všech studovaných materiálů. Abstract A biocompatibility (reaction of cells with testing materials and ability of physiological function) is primarly important property of the materials suitable for implants, except of their mechanical and physical properties. The surfacing of implants is very actual question with starting of new technologies. The study was oriented on properties of TiN and ZrN layers deposited by PVD technology. The layers were applied on commercially pure Ti, Ti6Al4V, Ti38Nb, Ti35Nb6Ta alloys and CoCrMo dental alloys. Various surfacing of substrates were used. The thickness of layers, surface roughness, mechanical properties (including adhesion) were measured. The tests of cytocompatibility were oriented on study of adhesion and colonization of cells on substrates. Results showed, that the TiN and ZrN layers are suitable for studied materials. 1. ÚVOD Pro materiály určené na implantáty je, kromě jejich mechanických a fyzikálních vlastností, primárně důležitá jejich biokompatibilita, to znamená, jak reagují buňky na setkání se zkoušeným materiálem a zda jsou schopny všech svých fyziologických

2 funkcí. Charakter interakce buňka-materiál může mít totiž řadu dalších projevů vyjádřených nejenom cytotoxicitou, anebo klastogenitou. Pro dentální implantáty je nejvýznamnější oseointegrace, nebo lépe řečeno příjem materiálu způsobem, který znamená plnohodnotnou, nebo téměř plnohodnotnou náhradu původní struktury. Zde se tak naskýtá i otázka úpravy povrchu implantátu, která se stává velmi aktuální s nástupem nových technik povlakování a zejména s nástupem nanotechnologií umožňujících strukturovat povrch tak, aby byl pro buňky téměř přirozeným substrátem. 2. STUDIJNÍ MATERIÁL A POUŽITÉ EXPERIMENTÁLNÍ METODY 2.1 Použité substráty Práce byly zaměřeny na stanovení vlastností povlaků TiN a ZrN nanesených na komerčně vyráběný technicky čistý titan (čistoty Grade 2), slitiny Ti6Al4V a stomatologické slitiny CoCrMo (69,9 % hm. Co, 28,7 % hm. Cr a 1,4 % hm. Mo). Dále byly v UJP PRAHA a. s. odlity beta slitiny typu Ti38Nb a Ti35Nb6Ta. Tyto slitiny byly tepelně a mechanicky zpracovány za účelem zajištění vhodných mechanických vlastností a tvarů připravených polotovarů. Z materiálu dodaných slitin, i slitin odlitých a zpracovaných v UJP, byly připraveny experimentální vzorky ve tvaru válečků o průměru 8 mm a tloušťky 3 mm. 2.2 Způsob úpravy povrchu vzorků Čelní plochy byly broušeny a potom ze všech stran upraveny způsobem uvedeným v následující tabulce 1. Tabulka 1 Způsob úpravy povrchu a označení vzorků Označení vzorků Povrch označení slitiny/1 Leštěný označení slitiny/2 Leštěný, leptaný bez povrchové ztráty materiálu označení slitiny/3 Leštěný, leptaný s povrchovou ztrátou materiálu do 0,03 mm označení slitiny/4 Balotinovaný částicemi Al 2 O 3 zrnitosti 120 mesh označení slitiny/5 Balotinovaný částicemi Al 2 O 3 zrnitosti 120 mesh, leptaný bez povrchové ztráty materiálu označení slitiny/6 Balotinovaný částicemi Al 2 O 3 zrnitosti 120 mesh, leptaný s povrchovou ztrátou materiálu do 0,03 mm označení slitiny/7 Balotinovaný částicemi Al 2 O 3 zrnitosti 60 mesh označení slitiny/8 Balotinovaný částicemi Al 2 O 3 zrnitosti 60 mesh, leptaný bez povrchové ztráty materiálu označení slitiny/9 Balotinovaný částicemi Al 2 O 3 zrnitosti 60 mesh, leptaný s povrchovou ztrátou materiálu do 0,03 mm označení slitiny/10 Balotinovaný částicemi Al 2 O 3 zrnitosti 22 mesh označení slitiny/11 Balotinovaný částicemi Al 2 O 3 zrnitosti 22 mesh, leptaný bez povrchové ztráty materiálu označení slitiny/12 Balotinovaný částicemi Al 2 O 3 zrnitosti 22 mesh, leptaný s povrchovou ztrátou materiálu do 0,03 mm Vzorky ze slitiny CoCrMo byly pouze balotinovány. Takto připravené vzorky byly povlakovány vrstvou TiN, resp. ZrN. Pro povlakování byly vzorky rozděleny do dvou skupin. První skupina byla povlakována vrstvou TiN a druhá skupina vrstvou ZrN. Povlaky TiN a ZrN byly vytvořené technologií PVD (Physical Vapour Deposition) metodou katodového obloukového napařování CAE (Cathodic Arc Evaporation).

3 2.3 Použité experimentální metody Byly studovány charakteristiky, které jsou vyžadovány pro zajištění dobrých užitných vlastností implantátů, tzn. podrobně byly charakterizované povrchy substrátů a související povrchy deponovaných povlaků TiN a ZrN, tloušťky vrstev povlaků a jejich fyzikálně-mechanické vlastnosti a adheze k výše uvedeným substrátům. Zkoušky cytokompatibility byly zaměřeny na studium adherence a kolonizace buněk k substrátům a povlakovaným vrstvám TiN a ZrN a byly porovnány vazby buněk k různě členitým povrchům. Povrch je sledován na řádkovacím el. mikroskopu JSM JEOL Měření drsnosti povrchu bylo provedeno kontaktní metodou na přístroji Hommel Basic T1000. Povlaky TiN a ZrN byly vytvořené v zařízení HTC 625 Multilab ABS TM (Hauzer Techno Coating). Úhel smáčení (kontaktní úhel) povlaků TiN a ZrN byl měřen na zařízení See System Standard fy Advex Instruments s. r. o. 3. VÝSLEDKY A JEJICH DISKUSE 3.1 Vlastnosti povlaků TiN a ZrN Hodnocení povlakování pomocí metalografických řezů Charakter deponovaných vrstev TiN a ZrN, tj. jejich rovnoměrné rozložení a jeho ovlivnění různou členitostí povrchu, tloušťka vrstvy a její homogenní rozložení na povrchu substrátů, byly hodnoceny na metalografických výbrusech. Vrstva TiN na leštěném povrchu substrátu Ti38Nb je relativně homogenní s malou lokální členitostí povrchu (obr. 1). Členitý reliéf povrchu vzorků po balotinování částicemi menší zrnitosti 120 mesh, resp. po jeho naleptání, s napařenou vrstvou TiN je dokumentován na obr. 2. Balotinováním povrchu substrátu slitiny Ti38Nb částicemi hrubší zrnitosti byl vytvořen reliéfnější povrch a částice Al 2 O 3 v povrchové vrstvě často ulpěly. Na mírně leptaném povrchu (obr. 3), ale i na povrchu s výraznějším leptáním, je oproti neleptaným vzorkům zřetelné jemné zvlnění dané zřejmě vznikem leptacích důlků (pittingu). Na šikmých částech povrchu substrátu je však často tloušťka povlaku výrazněji menší než je její střední hodnota. Balotinování částicemi nejhrubší zrnitosti 22 mesh mělo za následek vytvoření velmi členitého povrchu, s deformací povrchové vrstvy, která vytváří četné záhyby. Deponovaná vrstva TiN v některých místech zcela nepokrývá povrch substrátu, zejména v místech větších záhybů (obr. 4). Silnější leptání, s odleptáním povrchové vrstvy tloušťky 0,03 mm, vedlo k odstranění největších nerovností, nejhrubší nerovnosti a záhyby však nebyly odstraněny ani tímto způsobem přípravy. Povlaky vrstev TiN deponované na povrchy substrátu ostatních slitin připravené stejným postupem jako u substrátu slitiny Ti38Nb mají stejný, výše popisovaný, charakter. Pomocí metalografických výbrusů, na kolmých řezech k povlakovaným povrchům, byly sledovány i vrstvy ZrN deponované na všechny substráty. Povlaky mají obdobný charakter jako povlaky TiN deponované na povrch stejného substrátu připraveného stejným postupem. Průměrné střední hodnoty tloušťky vrstev a jejich odchylky jsou v tabulce 2. Tabulka 2 Střední hodnoty tloušťky vrstev Ti Grade 2 Ti6Al4V CoCrMo Ti38Nb Ti35Nb6Ta TiN [mm] 1,9±0,2 1,5±0,3 2,7±0,2 2,1±0,4 1,5±0,2 ZrN [mm] 1,4±0,3 2,0±0,1 2,9±0,4 2,3±0,4 1,5±0,2

4 METAL 2009 Obr. 1 Povlak TiN na substrátu ozn. Ti38Nb/1 Obr. 2 Povlak TiN na substrátu ozn. Ti38Nb/5 Obr. 3 Povlak TiN na substrátu ozn. Ti38Nb/8 Obr. 4 Povlak TiN na substrátu ozn. Ti38Nb/ Měření drsnosti povrchu Ukázka vybraných naměřené hodnot je uvedena v tabulce 3. Tabulka 3 Parametry drsnosti Ra a R3z povlaků TiN a ZrN Povlak TiN Povrch Ti38Nb Ti35Nb6Ta Ra R3z Ra R3z 1 0,34 0,78 0,27 1,12 2 0,33 1,22 0,26 1,08 3 0,37 1,42 0,41 1,7 4 1,4 6,74 1,25 5,92 5 1,2 6,21 0,91 4,58 6 1,16 5,3 0,89 4,3 7 3,02 13,21 3,56 15,04 8 2,25 9,16 2,65 12,08 9 2,25 9,16 2,51 10, ,18 24,02 6,36 24, ,91 23,97 6,17 24, ,59 19,23 6,91 25,97 Povlak ZrN Ti38Nb Ti35Nb6Ta Ra R3z Ra R3z 0,35 1,65 0,37 1,82 0,32 1,36 0,3 1,58 0,46 2,02 0,39 1,77 1,35 6,58 1,46 7,08 1,18 5,65 1,25 6,45 1,03 4,75 1,2 5,63 3,63 15,32 3,45 14,52 2,9 12,64 2,85 12,47 2,52 11,52 2,61 11,69 5,66 22,65 6,86 26,39 5,81 23,05 7,66 30,53 5,77 20,35 7,32 28,84

5 Je zřejmé, že s použitím hrubšího prášku při balotinování se drsnost povrchu charakterizovaná Ra zvyšuje, roste i špičatost povrchu R3z. Výraznějším leptáním leštěného povrchu vzorků jejich drsnost a špičatost mírně roste, kdežto u balotinovaných povrchů zrnitostí prášků 120 a 60 mesh pozorujeme spíše tendenci k poklesu těchto veličin. U vzorků, kdy byl povrch substrátu balotinován práškem nejhrubší zrnitosti 22 mesh, není patrná žádná prokazatelná změna drsnosti vyvolaná leptáním povrchu Měření nanotvrdosti, modulu pružnosti a adheze povlaků Nanotvrdost a modul pružnosti povlaků TiN a ZrN byly určeny u vzorků s vrstvami připravenými na leštěných površích substrátů, resp. površích mírně leptaných. Zjištěné hodnoty pro vrstvu TiN jsou: H it = 22,6 ± 1,4 GPa, E it = 255 ± 23 GPa a vrstvu ZrN jsou: H it = 20,3 ± 1,2 GPa, E it = 263 ± 31 GPa. Měření adheze vrstev, pomocí tzv. scratch testů, probíhalo při plynule se zvyšujícím zatížení F n od 0 do 100 N působícím na indentor po délce stopy 3 mm. Příklad průběhu scratch testu u vzorku Ti38Nb/1 je uveden na obr. 5. Fn, Ft [N] Fn Ft AE 0 0,5 1 1,5 2 2, ,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 AE [%] délka [mm] Obr. 5 Závislost třecí síly Ft, intenzity signálu akustické emise AE na síle zatížení Fn, resp. délce stopy. Vzorek Ti38Nb/1 s vrstvou TiN. Na leštěném povrchu substrátu slitiny Ti38Nb s vrstvou TiN se při scratch testu, v délce vrypu nad 1 mm, začínají objevovat první výraznější signály akustické emise, které výrazně rostou a po dosažení maxima dochází opět k jejich útlumu. V oblasti zvýšené akustické emise je na křivce průběhu třecí síly F t pozorován zlom, tj. výrazné zvýšení třecí síly. Výrazné zvýšení třecí síly F t nastává vždy v místě proniknutí indentoru k materiálu substrátu. Obr. 6 Místo proniknutí indentoru vrstvou povlaku

6 Výrazné zvýšení třecí síly F t nastává vždy v místě proniknutí indentoru k materiálu substrátu, obr. 6. Z podrobného rozboru s použitím řádkovací elektronové mikroskopie se ukazuje, že k oddělování vrstvy TiN od substrátu nedošlo po celé délce vrypu. K praskání a oddělování materiálu povlaku dochází pouze na dně vrypu, tj. v okamžiku a místě, kdy indentor proniká přes vrstvu TiN k substrátu. Pozorujeme pouze oddělování malých kousků materiálu povlaku při okrajích vrypu, což je spojeno s tvárnou deformací substrátu nacházejícího se pod povlakem. Obdobný průběh měly i zkoušky na všech studovaných substrátech, tj slitině Ti35Nb6Ta, technicky čistém titanu, slitině Ti6Al4V i stomatologické slitině CoCrMo. U vzorků s povlaky ZrN bylo v průběhu scratch testů zjištěné stejné, výše popisované, chování jako u vzorků s povlaky TiN Měření kontaktního úhlu Úhel smáčení (kontaktní úhel) TiN a ZrN byly měřeny přímou metodou na přisedlé kapce destilované vody. Kontaktní úhel byl určován jako úhel, který svírá tečna k povrchu kapky (povrch kapky je aproximován kružnicí) v bodě dotyku kapky s povrchem, při bočním pohledu na kapku. Výrazné rozdíly v drsnostech u vzorků připravených balotinováním prášky různé zrnitosti a následně povlakovaných se neprojevily významně na změně velikosti kontaktního úhlu. Byly proto stanoveny průměrné hodnoty z měření na všech vzorcích a pro jednotlivé vrstvy porovnány. Povlak TiN se vyznačuje nižším kontaktním úhlem 85,3 o oproti 102 o u povlaku ZrN. 4. ZKOUŠKY CYTOKOMPATIBILITY 4.1 Analýza kolonizace povrchů implantačních materiálů s povlakem TiN a ZrN Cílem zkoušek cytokompatibility bylo porovnání schopností buněk adherovat a dilatovat na podkladový materiál a stejný materiál s nanesenou vrstvou TiN nebo ZrN. Jako kriterium bylo zvoleno obsazení povrchu materiálu buňkami po 72 hodinách kultivace, tedy jejich kolonizací. K pokusům byla vybrána standardní testovací heteroploidní buněčná linie L929, fibroblastoidní morfologie. Na optickém nebo řádkovacím el. mikroskopu bylo vyšetřeno 25 zorných polí a stanoveny kolonizované a nekolonizované plochy. K hodnocení byl užit software NIS (Lucia Nikon). Z výsledků analýzy kolonizace buněčné populace na testovaný materiál s týž nanesenou vrstvou TiN a ZrN plyne, že obě zkoušené vrstvy jsou vhodné pro pokrytí všech studovaných substrátů, i když se zdá, že vrstva TiN je v tomto případě vhodnější. To je patrné zejména v případě pokrytí slitiny Ti6Al4V. Zde je významný rozdíl mezi TiN a ZrN vrstvou v nižších inokulačních hladinách. Ten je ovšem při inokulum 60 tisíc buněk na ml suspenze zcela vyrovnán. Slitina Ti6Al4V a zejména její pokrytí je z hlediska kolonizace buňkami zajímavé v oblasti od 7,5 do 30 tisíc buněk inokulační suspenze. Výrazný rozdíl v kolonizaci nejmenší inokulační hladiny a pokrytí může být způsobeno zatím neznámým faktorem, který může působit stimulačně již v první inokulační hladině, kde je očekávaná kolonizace v hodnotách 20 až 40 %, zatímco pro oba povlaky se pohybuje kolem 80 %. Tento výsledek je překvapivý, ale opakované pokusy prokázaly totéž.

7 METAL Analýza cytokompatibility povrchů implantačních materiálů s povlakem TiN a ZrN různé drsnosti Při těchto testech byl zkoumán charakter interakce povrchů a buněk in vitro. K pokusům byly užity buňky L 929 užívané jako standard. Postup zkoušky spočívá ve vysetí buněk přímo na zkoušený materiál umístěný na dně kultivační jamky. Očkovací suspenze buněk materiál převrství a buňky adherují na povrch. Kultivuje se 48 hodin při teplotě 37 oc a 5 % atmosféře CO2. Poté se provádí standardní laboratorní procedura, při které se vrstva fixuje, odvodní, pokoví a připraví na hodnocení v rastrovacím mikroskopu. Hodnocena je zejména morfologie povrchu buněk a odlišnosti v pokrytí povrchů lišících se různým materiálem a různou drsností. Obr. 6 Leštěný povrch opatřený vrstvou ZrN s místy, kde buňky neadherují Na leštěném povrchu opatřeném vrstvou ZrN jsou patrna místa, kde buňky neadherují, při stejném inokulu (obr. 6). Povrch opatřený vrstvou TiN vykazuje více mitotických buněk (obr. 7). Obr. 7 Leštěný povrch opatřený vrstvou TiN pokrytý buňkami

8 Na leštěném povrchu, který byl před nanesením krycí vrstvy leptán je rozdíl mezi oběma povlaky menší. Přesto jsou patrná místa, kde buňky neochotně adherují a dělících se buněk je podstatně méně. Tento rozdíl je menší až při balotinování povrchu částicemi hrubší zrnitosti. I při balotinování povrchů částicemi nejhrubší zrnitosti 22 mesh buňky kopírují nerovnosti deformovaného povrchu substrátu. Podobný obraz byl zjištěn u všech dodaných vzorků a nezáleží na tom, jaké povahy je substrát. Buňky očkované na povrchy s vrstvou buď ZrN nebo TiN nevykazovaly podstatné morfologické rozdíly. Rozdíl byl zjištěn v kolonizaci povrchu a to tak, že na vrstvě TiN jsou buňky lépe adherovány a dilatovány, než na vrstvě ZrN. Při vyšších počtech inokula se tento rozdíl ztrácí. Rozdíl v adherence a dilatace buněk je v případě balotinovaného povrchu zanedbatelný, drobné změny v charakteru povrchových membrán jsou u obou povlaků stejné. 5. ZÁVĚR Vlastnosti povrchů byly kvalitativně charakterizovány pomocí řádkovací elektronové mikroskopie a kvantitativně byly určeny parametry charakterizující drsnost povrchu. Tyto vlastnosti jsou důležité pro zajištění dobrého zakotvení implantátů v tkáni a ovlivňují také vlastnosti biologické. Měření tloušťky povlaků pomocí metalografických výbrusů na plochách kolmých řezů k povrchu povlaku ukázalo, že povrchy substrátů jsou při použité technologii a parametrech povlakování souvisle pokryty relativně homogenními vrstvami, s výjimkou nejdrsnějších povrchů, kde nejsou dostatečně pokryta místa se strmými stupni a záhyby materiálů. Provedené scratch testy prokázaly velmi dobrou adhezi povlaků TiN a ZrN ke všem studovaným substrátům, tj. technicky čistému titanu, slitině Ti6Al4V, beta titanovým slitinám Ti38Nb a Ti35Nb6Ta i stomatologické slitině CoCrMo. U vzorků povlakovaných vrstvami TiN byl zjištěn nižší úhel smáčení 85,3 o a než u vrstev ZrN (102 o ). Zkoušené povlaky na pěti různých substrátech vykazují dobré vlastnosti vzhledem k buněčné reakci adherence a dilatace buněk na zkoušený povrch a v případech nanesené vrstvy TiN a ZrN dávají téměř shodné výsledky. Z pokusů kolonizace na slitině Ti6Al4V lze vyčíst lepší vlastnosti vrstvy TiN oproti vrstvě ZrN, avšak u ostatních materiálů jsou obě krycí vrstvy téměř shodné. Zdrsnění materiálu má význam zejména při nižším inokulu. Rozdíl v kolonizaci buněk na povrchu je patrný pouze u leštěných matriálů a nižším počtu inokulovaných buněk. Buňky očkované na povrchy s vrstvou buď ZrN nebo TiN nevykazovaly podstatné morfologické rozdíly. Z výsledků analýzy plyne, že obě zkoušené vrstvy jsou z hlediska cytokompatibility vhodné pro pokrytí všech studovaných substrátů. Je-li podkladový materiál hodnocen co do cytokompatibility hůře, nanesený materiál tuto nevýhodu odstraní. Tím je otevřena možnost užít i méně cytokompatibilní materiály a tuto nevýhodu odstranit vhodným povlakováním. LITERATURA [1] R. VLADOIU, V. CIUPINA, V. DINGA, G. MUSA: Chem. List 102, s (2008) Poděkování: Práce vznikla v rámci řešení projektu MPO ČR č. FI-IM5/020.