Genové inženýrství a Geneticky modifikované organizmy

Transkript

1 Genové inženýrství a Geneticky modifikované organizmy

2 Definice GMO biologická Pojem GMO zahrnuje takové organizmy, jejichž genetický základ byl úmysln pozm n vnesením i vyjmutím n jakého genu (gen ). Definice GMO legislativní GMO je organizmus, krom lov ka, jehož di ný materiál byl zm n genetickou modifikací.

3 Genetická modifikace = každá zm na DNA irozená um lá Genetické modifikace vyvolané: - zá ením - šlecht ním - k ížením vedou ke vzniku odr d, plemen, kultivar apod. - p ímou a zám rnou manipulací s DNA vedou ke vzniku GMO

4 Genové inženýrství (GI) = techniky vedoucí k um lé tvorb geneticky pozm ných bun k nebo celých organizm zásahem do jejich DNA výsledkem vznik nových modifikovaných genom, transgenních organizm, které by se za normálních okolností v p írod nemohly vyskytnout

5 Cílem jsou v podstat dva procesy: - vložení cizího DNA segmentu (genu, konstruktu) do DNA p íjemce - vy azení nežádoucího genu z funkce, tzv. genový knock-out

6 Techniky GI - identifikace a izolace gen, získání genového konstruktu - volba p íjemce pro p enos genového konstruktu - volba metody pro p enos genového konstruktu

7 Konstrukce transgenu - modifikace izolovaného genu podmínka pro úsp šnou integraci a expresi genu Sekvence promotoru - idána k transgenu z d vodu správné exprese genu (tzn. p eklad do proteinového produktu) Termina ní sekvence - signalizuje bu ce zakon ení sekvence genu Marker gen - p idán z d vodu identifikace úsp šného v len ní transgenu

8 Tvorba rekombinantní DNA (rdna( rdna) rdna je um le vytvo ená DNA. DNA z n kolika zdroj je v len na do jedné rekombinantní molekuly DNA.

9 Namnožení molekuly DNA Molekulární klonování získání identických kopií cílového transgenu nebo rdna Molekulární klonování in vitro - procesem polymerázové et zové reakce (PCR) Molekulární klonování in vivo - pomocí prokaryot (bakterie, nap. E. coli), - pomocí eukaryot (kvasinky), - pomocí bun k savc rostoucích v tká ových kulturách.

10 Molekulární klonování in vitro Polymerázová et zová reakce (PCR) = enzymatické namnožení (amplifikace) DNA syntézou mnoha kopiií vybrané sekvence DNA - cyklická reakce o t ech teplotních fázích: Denaturace: dvouvláknová DNA denaturována na dv jednovláknové templátové molekuly DNA Annealing: nasedání oligonukleotidových sond (primer ) na obou stranách cílové DNA Elongace: syntéza nových vláken pomocí termostabilní DNA polymerázy od 5 konce ke 3 konci za ínající od primer

11 Schéma PCR v každém cyklu se množství DNA zdvojnásobí exponenciální amplifikace z každé molekuly p vodního templátu bude vytvo eno 2 n kopií, kde n je po et cykl 30 cykl = násobné namnožení DNA

12 Molekulární klonování in vivo = namnožení ur itých fragment DNA pomocí vektor vektor = molekula, která obsahuje všechny sekvence pot ebné ke vstupu, p ežití a množení v ur ité hostitelské bu ce klonovací vektor = slouží nejen k p enesení do bu ky, ale i k zajišt ní jejího klonování v bu ce (plazmidy, fasmidy, kosmidy, bakteriofágy )

13 Klonování DNA pomocí bakteriálního plazmidu

14 íprava GM rostlin íprava GM živo ich

15 íprava GMO = logické pokra ování klasických zp sob šlecht ní zrychlení a zjednodušení tradi ních postup

16 íprava GM rostlin Schéma tvorby GM rostlin - výb r genu( ) pro dosažení požadované vlastnosti - izolace vhodného genu( ) a klonování genu v baktérii - úpravy genu( ) - transformace genu( ) do genomu rostliny - selekce transformovaných rostlin - sledování projevu transgenu - testy v uzav ených prostorách laborato í a skleník - vyhodnocení biologické bezpe nosti - polní zkoušky transgenních rostlin - hodnocení biologické bezpe nosti - registra ní zkoušky GM odr dy

17 Metody transformace transgenu Existuje ada metod, kterými je docílena transformace transgenní DNA do rostlinných bun k. Nej ast ji využívanými: - transformace s využitím bakterií - p ímá transformace

18 P íprava GM rostlin s využit itím m bakterií

19 P íprava GM rostlin p ímoup transformací

20 Transgenní rýže Normální rýže Zlatá rýže. Tato transgenní rýže obsahuje beta-karoten, který je zdrojem vitamínu A. Tato rýže pomáhá odstranit nedostatek vitamínu A u poloviny sv tové populace která je závislá na rýži jako hlavní potravin. V sou asnosti trpí 70% d tí stá í do p ti let v jihovýchodní Asii nedostatkem vitamínu A. Jako vektor byl užit Ti plasmid.

21 íprava GM zví at Cílem p enosu genového konstruktu: asné stadium vývinu embrya na úrovni 1 bu ky (zygoty) p ed splynutím prvojader linie pluripotentních bun k

22 íprava GM zví at metodou mikroinjekce superovulace a oplození izolace bun k (zygot) mikroinjekce transgenu transfer vají ek do náhradnic

23 Transformace embryonálních kmenových bun k Výsledný jedinec je chimérou. Testace potomstva na ítomnost vloženého genu. Pá ení heterozygotních jedinc s cílem získat homozygotní transgenní linii.

24 Klonování organizm - technika používaná k vytvo ení identických organizm Reproduk ní klonování - vytvo ení duplikátu( ) existujícího jedince Terapeutické klonování - strategie bun né terapie

25 Reproduk ní klonování - dv techniky: enos jádra zárode né bu ky enos jádra somatické bu ky

26 Cíle živo išného reproduk ního klonování: - produkce hospodá ských zví at (zlepšení kvality zví at i jejich produkt ) - produkce GM laboratorních zví at (studium lidských chorob, testace nových lék ) - produkce GM hospodá ských zví at (produkce vysoce terapeutických protein ) - pokus záchrany ohrožených i vyhynulých druh - zlepšení klonovaných domácích zví at - produkce živo ich vhodných pro xenotransplantace

27 Schéma enosu jádra zárode né bu ky

28 Ovce Dolly - 5. ervence února 2003 utracena z d vodu plicní infekce - vyvinuta kolektivem vedeným Ianem Wilmutem (Roslin Institute, Skotsko) reproduk ním klonováním jádro oocytu nahrazeno jádrem somatické bu ky s dosp lé ovce vytvo ena genetická kopie p vodní dosp lé dárkyn

29 Vytvo ení ovce Dolly

30 Transgenní myš V roce 1982 Ralph Brinster a Richard Palmiter vytvo ili transgenní myši do myších embryí byl vložen krysí gen pro r stový hormon. Myš, nesoucí tento cizí gen (na obr. vlevo) produkovala velké množství stového hormonu a vyrostla do dvojnásobné velikosti ve srovnání se svými sourozenci (vpravo) Brinster, School of Veterinary Medicine, University of Pennsylvania

31 Terapeutické klonování - využívá schopnosti embryonálních kmenových bun k regenerovat orgány i tkán - strategie bun né terapie - postup: vodní genetický materiál kmenových bun k nahrazen genetickým materiálem pacienta spušt na jejich diferenciace ve specifické t lní bu ky transplantace do místa poškozené tkán bez spušt ní imunitní reakce

32 Schéma terapeutického klonování

33 Diagnostika GMO v potravinách kvalitativní (pr kaz p ítomnosti GMO) kvantitativní (pr kaz množství GMO) PCR ítomnost transgenní DNA v potravin Imunochemické metody ELISA ítomnost transgenního proteinu v potravin Real-Time PCR na p ístroji Lightcycler > 1% GMO v potravin povinnost jejího ozna ení vyplývající ze zákona

34 farmacie a medicína: Význam GMO - výroba lé iv (inzulín, lidský r stový hormon, srážlivý faktor atd.) - studium chorob a vývoj lék zem lství zem lsko-potraviná ská odv tví: - zlepšení technologických vlastností (odolnost herbicid m, houbovým a virovým chorobám, šk dc m, zvýšení nutri ní hodnoty) - produkce farmaceuticky využitelných látek (obsah a kvalita lipid a škrobu) pr mysl: - kvasný, textilní - výroba aminokyselin, bílkovin, škrobu - pr myslové aplikace a zpracování surovin (produkce enzym pro potraviná ský a papírenský pr mysl, produkce biodegradovatelných polymer ) životní prost edí: - likvidace ropných havárií a další...

35 íklady GMO - efekt plodiny s rezistencí v i herbicid m (sója, epka, kuku ice, bavlník) plodiny produkující bakteriální insekticidní toxiny (brambory,kuku ice) plodiny s upraveným metabolismem cukru (brambory) plodiny s prodlouženou trvanlivostí (raj ata) plodiny produkující biodegradabilní polyestery, bioocel plodiny s upraveným pom rem látek (raj ata, epka) bavlník s p írodn zabarveným vláknem raj ata, cukrovka s vysokým obsahem fruktanu eviny se sníženým obsahem ligninu pro výrobu papíru plodiny se zvýšenou odolností v i stresu chladem i suchem plodiny se schopností asimilace vzdušného dusíku rýže produkující betakaroten peckoviny s odolností k viru šarky škodlivý hmyz enášející gen zp sobující neplodnost potomstva živo ichové s rychlým r stem (losos)

36 Možnosti rizik GMO zdraví lidí a zví at (toxicita a kvalita/bezpe nost potravin, alergie, rezistence k lé iv m) životní prost edí (tvorba genu, transgenu nebo transgenních produkt, náchylnost necílových organizm, rostoucí množství použití chemikálií v zem lství, nep edpokládaná exprese genu a nestabilita transgenu) zem lství (rezistence/tolerance cílových organizm, superplevele, zm na nutri ní hodnoty, snížení po tu odr d a ztráta biodiverzity) horizontální p enos gen (genetické zne išt ní pomocí pylu nebo rozptylováním semen, rozptylování transgen nebo promotor, p enos cizorodých gen do mikroorganizm nebo vznik nových vir rekombinací) všeobecné rizika (ztráta p íslušnosti v systému, vyšší náklady v zem lství, neplánování polních pokus p i odhadu rizika)