AdnaTest ProstateCancerSelect

Transkript

1 AdnaTest ProstateCancerSelect Obohacení nádorových buněk z krve pacientů s rakovinou prostaty pro analýzu genové exprese Pro diagnostiku in vitro Příručka T-1-520

2 Obsah Informace pro objednávky... 3 Účel... 3 Zkratky a symboly... 4 Patenty a registrované obchodní známky... 4 Popis výrobku... 5 Obsah soupravy... 6 Další potřebný materiál... 7 Skladování... 8 Informace o použití... 8 Varování a bezpečnostní opatření pro diagnostiku in vitro Protokol A. Příprava kuliček ProstateSelect B. Výběr nádorových buněk Charakteristiky funkčních vlastností Stručná příručka

3 Informace pro objednávky Informace o objednávání naleznete na a Na jakékoli otázky o AdnaTest Vám navíc odpoví tým podpory QIAGEN Hannover (support@adnagen.com). Účel Test byl vyvinut pro obohacení cirkulujících nádorových buněk z periferní krve pacientů s rakovinou prostaty a je určen pro diagnostiku in vitro. Pro další analýzu genové exprese související s rakovinou prostaty se doporučuje test AdnaTest ProstateCancerDetect. 3

4 Zkratky a symboly AdnaMag-L AdnaMag-S bp cdna DNA mrna PCR RNase ot./min RT koncentrátor magnetických částic (-velký) koncentrátor magnetických částic (-malý) páry bází komplementární deoxyribonukleová kyselina deoxyribonukleová kyselina mediátorová ribonukleová kyselina polymerázová řetězová reakce ribonukleáza otáčky za minutu reverzní transkripce datum použitelnosti omezení teploty katalogové číslo viz návod k použití výrobce diagnostický zdravotnický prostředek in vitro Patenty a registrované obchodní známky Dynabeads je registrovaná obchodní známka společností Invitrogen a Life Technologies Corporation. 4

5 Popis výrobku Test umožňuje imunomagnetické obohacování nádorových buněk pomocí epitelových a nádorových antigenů. Protilátky proti epitelovým a nádorovým antigenům jsou konjugovány na magnetické kuličky (Dynabeads ), což umožní označení nádorových buněk v periferní krvi. Označené buňky jsou extrahovány koncentrátorem magnetických částic (AdnaMag-L a AdnaMag-S) a následně lyzovány (obr. 1). Buněčný lyzát prochází další analýzou (doporučujeme pokračovat testem AdnaTest ProstateCancerDetect). Kuličky ProstateSelect Inkubace Separace Buněčná lyze RNA Purifikace mrna pomocí magnetických kuliček potažených Oligo(dT) 25 Reverzní transkripce Krvinky Nádorové buňky RNA RNA cdna Magnetické kuličky potažené protilátkou nebo Oligo(dT) 25 AdnaTest ProstateCancerDetect Obrázek 1. Schematický přehled přípravy vzorku 5

6 Obsah soupravy Test obsahuje tyto součásti: Tabulka 1. Obsah soupravy Součást ProstateSelect Beads (Kuličky ProstateSelect) Lysis/Binding Buffer (Lytický/vazebný pufr) Symbol T (12 testů)

7 Další potřebný materiál Vybavení: Rotátor na 15ml a 1,5ml zkumavky Koncentrátory magnetických částic AdnaMag-L (QIAGEN Hannover GmbH, kat. č. T-1-700) AdnaMag-S (QIAGEN Hannover GmbH, kat. č. T-1-800) Materiál: Sterilní 10ml skleněné nebo plastové pipety bez RNázy a pipetor Sterilní 1,5ml reakční zkumavky bez RNázy (např. Sarstedt, kat. č ) 15ml zkumavky (používejte sterilní polypropylenové zkumavky bez RNázy, např. Sarstedt, kat. č ) Pipety a pipetovací špičky bez RNázy s aerosolovou bariérou vhodné k pipetování objemů 100 µl až 1000 µl Ochranné rukavice, ochranné brýle Činidla: Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS), ph 7,0 7,3 (např. Fisher, kat. č. VX , D-PBS) 7

8 Skladování Test je nutné skladovat při 4 8 C. Žádná součást se nesmí používat po uplynutí doby použitelnosti. Informace o použití V případě vnějšího poškození obalu soupravy nebo jednotlivých součástí kontaktujte prosím Technické služby společnosti QIAGEN (kontaktní informace naleznete na Test musí provádět pouze personál vyškolený v technikách molekulární biologie. Příprava vzorku: Krevní vzorky je nutné odebrat před použitím terapeutických látek. Test AdnaTest nepoužívejte dříve než 7 dní po posledním léčebném zásahu! Odběr krve: K odběru nejméně 5 ml plné krve používejte výhradně zkumavky na odběr krve AdnaCollect (kat. č. T-1-600, QIAGEN Hannover GmbH) nebo zkumavky na odběr krve s antikoagulantem EDTA (např. S Monovette Kalium EDTA, Sarstedt; BD Vacutainer K3EDTA, Becton Dickinson). Heparin a citrát se nesmí používat. Krev je nutné okamžitě uchovat při 4 8 C. 8

9 Vzorky je nutné zpracovat co nejdříve. Při použití standardních EDTA zkumavek do 4 hodin a při použití zkumavek AdnaCollect do 24 hodin. Nesmí dojít k hemolýze krve. Manipulace: Kuličky ProstateSelect 1 obsahují jako ochrannou látku azid sodný. Azid sodný je cytotoxický a proto je nutné ho odstranit před použitím kuliček. Všechny součásti a další činidla od jiných dodavatelů je nutné uchovávat podle jejich pokynů. Platí bezpečnostní pokyny příslušných výrobců. Aby nedošlo ke kontaminaci DNA, RNA a RNázou, používejte ochranné rukavice. Kuličky ProstateSelect rozdělte na alikvotní podíly, aby nedošlo ke kontaminaci. Test se musí provést v daném pořadí a časy a teploty inkubace musí odpovídat všem specifikacím. Jestliže při obohacování buněk dojde k aglutinaci kuliček, vzorky zlikvidujte. Aby nedošlo ke zkřížené kontaminaci, proveďte zpracování vzorků včetně reverzní transkripce a následnou analýzu amplifikovaných PCR produktů v oddělených místnostech, pokud je to možné. Použití výrobků jiných než doporučených dodavatelů může mít za následek horší výsledky. 9

10 Varování a bezpečnostní opatření pro diagnostiku in vitro Při práci s chemikáliemi vždy používejte vhodný laboratorní pracovní oděv, jednorázově použitelné rukavice a ochranné brýle. Bližší informace jsou uvedeny v příslušných bezpečnostních listech (SDS). Jsou k dispozici také online v PDF formátu na stránkách kde můžete najít, přečíst a vytisknout bezpečností listy všech souprav a součástí souprav QIAGEN. Vzorky a odpad z analýzy zlikvidujte v souladu s místními bezpečnostními předpisy. 10

11 Protokol A. Příprava kuliček ProstateSelect Před použitím je nutné promytím kuliček ProstateSelect odstranit azid sodný: 1. Důkladným pipetováním resuspendujte kuličky Prostate- Select 1; nevortexujte! 2. Vypočtěte objem kuliček ProstateSelect 1 nutný pro všechny zpracované vzorky (100 µl na vzorek) a přeneste vypočtený objem do 1,5ml reakční zkumavky. Jestliže zpracováváte více než 10 vzorků, použijte další 1,5ml reakční zkumavky. 3. Vložte zkumavku do AdnaMag-S. 4. Po 1 minutě odstraňte supernatant pomocí pipety. Při každém postupu je důležité: Při odstraňování supernatantu se nedotýkejte kuliček! 5. Promývání a. Z AdnaMag-S vyjměte magnetický posuvník. b. Přidejte 1 ml PBS a opakovaným pipetováním resuspendujte kuličky. c. Vložte magnetický posuvník zpět do AdnaMag-S. d. Po 1 minutě zcela odstraňte supernatant pomocí pipety. Opakujte dvakrát (celkem tři promytí). 6. Vyjměte zkumavku z AdnaMag-S a resuspendujte kuličky v PBS na původní objem (100 µl na vzorek). 11

12 B. Výběr nádorových buněk 1. Napipetujte 5 ml vzorku krve do 15ml zkumavky. (Používejte pouze schválené zkumavky na odběr krve, viz strana 8.) 2. Pipetováním důkladně resuspendujte kuličky ProstateSelect (připravené v kroku A6) a 100 µl těchto kuliček přidejte do každého vzorku krve. 3. Pomalu otáčejte zkumavkami (asi 5 ot./min) po dobu 30 minut při teplotě laboratoře na zařízení, které umožňuje jak naklánění, tak otáčení. 4. Vložte zkumavky do AdnaMag-L bez magnetického posuvníku. Mávnutím AdnaMag-L směrem dolů uvolněte kapky krve zachycené ve víčku. 5. Vložte magnetický posuvník a inkubujte zkumavky v AdnaMag- L po dobu 3 minuty při teplotě laboratoře. 6. Mezitím vytemperujte lytický/vazebný pufr 2 na teplotu laboratoře. Poznámka: Zkontrolujte, zda lytický/vazebný pufr neobsahuje žádné usazeniny. Jestliže pozorujete usazeniny, vytemperujte pufr na teplotu laboratoře a míchejte jej, dokud se usazeniny zcela nerozpustí ml pipetou zcela odstraňte krevní supernatant, aniž byste se dotkli kuliček. 8. Promývání a. Z AdnaMag-L vyjměte magnetický posuvník. b. Přidejte 5 ml PBS, uzavřete zkumavky a opatrným protřepáním AdnaMag-L 5krát tam a zpět resuspendujte komplexy magnetických kuliček s buňkami. 12

13 c. Mávnutím AdnaMag-L se zkumavkami dvakrát směrem dolů uvolněte kapky zachycené ve víčku. d. Vložte magnetický posuvník do AdnaMag-L a inkubujte 1 minutu při teplotě laboratoře. e. Pipetou zcela odstraňte supernatant. Opakujte dvakrát (celkem tři promytí). 9. Z AdnaMag-L vyjměte magnetický posuvník. 10. Resuspendujte komplexy magnetických kuliček s buňkami v 1 ml PBS a přeneste každý vzorek do 1,5ml reakční zkumavky. 11. Vložte reakční zkumavky do AdnaMag-S s magnetickým posuvníkem. Poznámka: Magnetický posuvník je možné do AdnaMag-S vložit dvěma způsoby. Vždy vkládejte posuvník bílým plastovým filmem směrem dopředu, aby magnety byly blízko reakčních zkumavek. 12. Po 1 minutě pipetou zcela odstraňte supernatant, aby optimálně proběhla následná buněčná lyze. 13. Z AdnaMag-S vyjměte magnetický posuvník. 14. Do každé reakční zkumavky přidejte 200 µl lytického/ vazebného pufru 2 (vytemperovaného na teplotu laboratoře). Nejméně 5krát pipetujte, aby došlo k resuspendaci. 15. Vložte magnetický posuvník do AdnaMag-S a inkubujte 1 minutu. 16. Přeneste supernatanty (buněčné lyzáty) do nových 1,5ml reakčních zkumavek. 17. Zlikvidujte zkumavky s kuličkami. 13

14 18. Okamžitě pokračujte s izolací mrna (test AdnaTest Prostate- CancerDetect) nebo uchovejte buněčné lyzáty při max. 20 C nejdéle 2 týdny. Charakteristiky funkčních vlastností Funkční vlastnosti testu AdnaTest ProstateCancerSelect viz Stručná příručka Součásti ProstateSelect Beads (Kuličky ProstateSelect) Lysis/Binding Buffer (Lytický/vazebný pufr) 2 1 Pro každý vzorek potřebujete 5 ml plné krve (podrobnosti viz s. 8) 1 15ml zkumavka 2 1,5ml reakční zkumavky 10ml skleněné nebo plastové pipety (bez RNázy) a pipetor µl pipety a špičky (bez RNázy) Protokol Důkladně resuspendujte kuličky ProstateSelect 1 a přeneste 100 µl pro každý krevní vzorek do 1,5ml reakční zkumavky. Promyjte kuličky ProstateSelect pomocí 3 1 ml PBS. 14

15 Resuspendujte kuličky ProstateSelect ve 100 µl PBS pro každý krevní vzorek. Přeneste 5 ml plné krve do 15ml zkumavky. Přidejte 100 µl promytých kuliček ProstateSelect do každého vzorku krve. Inkubujte 30 minut při teplotě laboratoře při naklánění a rotaci při přibližně 5 ot./min. Vložte zkumavku na 3 minuty do AdnaMag-L a separujte kuličky. Mávnutím AdnaMag-L směrem dolů uvolněte kapky krve zachycené ve víčku. Odstraňte krevní supernatant. Promyjte kuličky pomocí 3 5 ml PBS. Resuspendujte kuličky v 1 ml PBS a přeneste je do nové 1,5ml reakční zkumavky. Separujte kuličky v AdnaMag-S a odstraňte supernatant. Pipetováním alespoň 5krát resuspendujte kuličky ve 200 µl lytického/vazebného pufru 2. Umístěte reakční zkumavky do AdnaMag-S a přeneste supernatant do nové reakční zkumavky. Okamžitě pokračujte testem AdnaTest ProstateCancerDetect nebo můžete zkumavky uchovat při max. 20 C nejdéle 2 týdny. 15

16 HB-2099-CS-001# QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse 1 D Hilden NĚMECKO Telefonická podpora Telefon: +49 (0) Fax: +49 (0) support@adnagen.com Internet: a