Elektromigrační metody

Transkript

1 Elektromigrační metody

2 Princip metoda využívaná k separaci makromolekul na základě náboje, konformace nebo velikosti migrace nabitéčástice v elektrickém poli je úměrná jejímu celkovému náboji, velikosti a tvaru v = q. E / f frikční koeficient (popisuje tvar a velikost molekuly) rychlost celkový náboj intenzita el. pole + pi > ph pi < ph kladný náboj záporný náboj malé částice s velkým nábojem velká pohyblivost velké částice s malým nábojem malá pohyblivost - volná elektroforesa zónová elektroforesa rovnovážná elektroforesa isoelektrická fokusace kapilární elektroforesa

3 Volná elektroforesa pufr vložením elektrod do pufru se molekuly proteinů začnou pohybovat k elektrodám s opačnou polaritou a rozdělí se na základě rozdílných nábojů a koeficientů tření vzniknou pohyblivá rozhraní mezi jednotlivými druhy proteinů nevýhody: konvekční míchání zón, mnoho vzorku, složitá aparatura vzorek

4 Zónová elektroforesa elektroforesa na nosiči nosiče: filtrační papír celulosa agarosa polyakrylamid omezení konvenčního míchání lepší rozdělení menší spotřeba vzorku elektroforéza na celulóze pohyb iontu v rozhodující míře závislý na poměru náboje k velikosti částice elektroforéza v gelu porózní gely umožňují separaci na principu molekulového síta a zároveň elektroforetické pohyblivosti provedení v trubičkách plošná vertikální horizontální

5 Aparatury pro trubičkové gely

6 AGAROSA Gely polysacharid z červených mořských řas extrémně jednoduchá příprava pory větší než 10 nm teplota tání 35 C - 95 C low melting agarosa (teplot a tání ~ 65 C) velikost pórů: 150 nm 1 % gel 500 nm 0,16 % gel široký separační rozsah, ale relativně nízkou rozpustnost koncentrační rozsah 0,5 % - 4 % fragmenty DNA bp (větší fragmenty pulsní elektroforesa bp) velmi velké proteiny a proteinové agregáty PUFR: Tris-acetát-EDTA (TAE) nebo Tris-borát-EDTA (TBE) NANÁŠECÍ PUFR ( loading buffer -PLB): sacharosa, glycerol,... bromphenolová modř a xylen-cyan

7 Nukleové kyseliny analysa a purifikace DNA restrikičních fragmentů Ethidium bromid, SYBR Green citlivost 100 pg 1 ng/proužek

8 % agarosa 0,7 0,9 1,2 1,5 2,0 rozsah [kb] 0,8-20 0,5-7 0,4-6 0,2-4 0,1-3

9 Pulsní gelová elektroforesa (PFG) použití: separace nukleových kyselin ( až bp)

10

11 Uspořádání PFG field inversion gel electrophoresis (FIGE) transverse alternating field electrophoresis (TAFE) rotating gel electrophoresis (RGE) clamped homogeneous electric field (CHEF)

12 FIGE 23 kb 48,5 kb 12 kb 0,5 kb Figure 2. Increased separation of the kb range with field inversion gel electrophoresis (FIGE). Run conditions: 230 V, 7.9 V/cm, 16 hrs., 50 msec. pulse, forward:reverse pulse ratio = 2.5:1, 1% GTG agarose, 0.5X TBE, 10 C.a) 1 kb ladder, kb; b) Lambda/Hind III, kb; and c) High molecular weight markers, kb. HSI Laboratories, Hoefer Scientific Instruments San Francisco, CA

13 RGE Figure 3. Rotating gel electrophoresis (RGE) separation Saccharomyces cercevisiae chromosomes ( kb). Run conditions: 180 V, 5.1 V/cm, 34 hrs., 120 angle, sec. pulse ramp, 0.5X TBE, 1.2% GTG agarose, 10 C. Two combs were used on the same gel to load 32 samples, a maximum of 72 are possible HSI Laboratories, Hoefer Scientific Instruments San Francisco, CA

14 Imunoelektroforesa ZÓNOVÁ ELEKTROFORESA/IMUNODIFUSE směs antigenù je nejprve elektroforeticky rozdělena, po té je do podélného žlábku nanesena směs protilátek a provedena imunodifuse tvorba precipitačních linií dojde-li k tvorbě komplexu Ag-Pl

15 ELEKTROIMUNODIFUSE - RAKETKOVÁ TECHNIKA gel obsahuje definovanou koncentraci protilátky

16 POLYAKRYLAMID chemicky inertní a mechanicky stabilní obtížnější příprava oproti agarosovému gelu T celková koncentrace akrylamidu C stupeň prokřížení podíl dimeru k monomeru T C = = a + b.100[%] V b.100[%] a + b a...hmotnost akryamidu [g] b hmotnost methylenbisakrylamidu [g] V objem [ml]

17 logu 200 = logu K T U T...relativní pohyblivost T 0 R. Fergusonova analýza U 0...volná relativní pohyblivost K R...tzv. retardační koeficient K. 2 7 R = 2, ,53.10 M r log UT koncentrace gelu [% T] Ferguson, K.A. (1964) Starch-gel electrophoresis-application to the classification of pituitary proteins and polypeptides. Metabolism 13,

18 Uspořádání: kontinuální diskontinuální PAGE ZAOSTŘOVACÍ GEL: nižší hodnota ph, nižší koncentrace polyakrylamidu DĚLÍCÍ GEL: má vyšší hodnotu ph než rozdělovací ELEKTRODOVÝ PUFR: Tris/Glycin/SDS zaostřovcí gel velké póry dělící gel malé póry princip zaostřování

19 SDS-PAGE Tris/Gly/SDS anionický detergent po zahřátí na 100 C rozbaluje protein a váže se na něj (1 molekula SDS na 2 AK, 1,4 g SDS na 1 g proteinu) velký náboj velká pohyblivost vysoké rozlišení dobrá fixace proužků lze odstranit z gelu, aniž by se uvolnily proteiny 10x vyšší detekční limit než nativní elfo Nevýhody: za nízkých teplot krystalizuje mnoho proteinů se chová anomálně -v důskedku neuniformní vazby SDS -proteiny s velkým záporným, velkým kladným nábojem a na prolin bohaté proteiny NANÁŠECÍ PUFR ( loading buffer -PLB): SDS, glycerol, DTT, pufr, bromfenolová modř, H 2 O

20

21

22 SDS-PAGE Tris/Tricin/SDS separace proteinů < 14 kda lineární rozlišení kda Tricin = N-Tris(hydroxymethyl) methyl glycine

23 SDS-PAGE Tris/Borát/EDTA elektroforesa glykoproteinů SDS se neváže na sacharidy CTAB-PAGE CTAB kationický detergent pro záporně nabité proteiny, silně bazické nukleoproteiny nedenaturuje protein, tj. řada proteinů má i po CTAB PAGE enzymatickou aktivitu kyselé prostředí ph 3-5 Nativní-PAGE i jiné pufry HEPES, MOPS, MES zymogramy

24 Gradientová gelová elektroforesa

25 Gradientová gelová elektroforesa

26 Preparativní PAGE

27 2D-PAGE

28

29

30 PAGE Nukleových kyselin sekvenování poslední krok sekvenace TBE pufr teplota > 50 C, p řítomnost močoviny manuální sekvenování radioaktivní značení 32 P - chromogenní nebo chemiluminiscenční detekce na membráně pomocí značené proby - barvení gelu stříbrem

31 08_dideoxy_sequencing.swf

32 automatizované sekvenování 4 rozdílné fluorescenční značky 1 fluorescenční značka - fluorescein

33

34 PAGE nukleových kyselin fragmentů DNA % akrylamid 3,5 5,0 8,0 12,0 20,0 rozsah [bp] ARDRA restrikční analysa amplifikované rdna rozdělení po restrikčním štěpení specifický obraz

35 ARDRA profiles after restriction with AluI of 18 different Mycoplasma species. Since all samples of the same species gave identical restriction patterns, the number of strains tested for each species is indicated in parenthesis. A Generuler 50-bp ladder (Fermentas) was used as size-marker. doi: /

36 DNA fingerprinting RFLP restriction fragment lenth polymorphism

37 DNA fingerprinting Analýza VNTR pomocí PCR (highly variable repeat sequences)

38

39

40 RAPD náhodně amplifikovaná polymorfní DNA rychlá detekce polymorfismu širokého spektra organismů 2 krátké primery, nízká teplota amplifikace sady různých DNA fragmentů o různé velikosti RAPD různých variet kvasinek

41 Silver-stained polyacrylamide gel showing three distinct RAPD profiles generated by primer OPE15 for Haemophilus ducreyi isolates from Tanzania, Senegal, Thailand, Europe, and North America.

42 Detekce mutantů pomocí PAGE ss KONFORMAČNÍ POLYMORFISMUS malá změna v sekvenci jiné intramolekulové párování jiná pohyblivost ds KONFORMAČNÍ POLYMORFISMUS - heteroduplex na elfo oba homoduplexy a heteroduplex možný posun

43 DGGE ELEKTROFORESA S GRADIENTEM DENATURUJÍCÍHO ČINIDLA detekce jednobodové mutace rozdílná elektroforetické pohyblivost částečně denaturovaných molekul (6 M močovina % formamid) TGGE ELEKTROFORESA S TEPLOTNÍM GRADIENTEM teplotní gradient (katoda 15 C, anoda 70 C)

44

45 Negative image of an ethidium bromide stained DGGE gel loaded with 16S rrna coding gene fragments