Regulace imunitní reakce, Protilátky T subpopulace

Transkript

1 Regulace imunitní reakce, Protilátky T subpopulace

2 Typy antigenů vyvolávajících imunitní odpověď Tvorba protilátek, příčiny diverzity a odlišné funkce, jejich regulace Funkce protilátek za fyziologického a patologického stavu Navození protektivní imunitní odpovědi (protilátkové i buněčné) principy protiinfekční vakcinace

3 Lokalizace imunitní odpovědi Imunitní odpověď proti antigenům lokalizovaným v krvi obvykle začíná ve slezině Odpověď proti mikroorganizmům v tkáních je tvořena v lokálních lymfatických uzlinách Většina patogenů vstupuje po inhalaci nebo ingesci vstupem přes mukózní povrchy aktivují buňky MALT (Mucosa-associated lymphoid tissues)

4 Lymfocyty a jejich cestování Získaná imunitní odpověď vyžaduje specializované mikroprostředí, ve kterém relevantní buňky mohou efektivně spolupracovat Protože málo lymfocytů je specifických pro daný antigen, T a B lymfocyty musí migrovat v těle pro zvýšení pravděpodobnosti, že se s tímto antigenem setkají (lymfocyty stráví pouze asi 30 min v krvi během cyklu v těle)

5 Rozeznání antigenu Antigen je rozeznáván na základě svého tvaru: tvar epitopu doplňuje tvar protilátky Complementarity-determining regions (CDR) protilátek se nekovalentně vážou ke strukturám, které rozpoznávají Pro malé antigeny, vazebné místo protilátky může být tvořeno kapsou, nebo rýhou, ale ve většině se podobná zvlněnému povrchu

6 Požadavky pro imunogenicitu - Ag Cizorodost pouze cizí molekuly jsou imunogenní Molekulární velikost Extrémně malé molekuly nejsou imunogenní (AA, m- sacharidy) Molekuly menší než 10 kd jsou slabě imunogenní, nebo neimunogenní Nejsilnější antigeny jsou těžší než 100 kd Chemická komplexita Immunogenicita roste s chemickou komplexitou Jednoduché syntetické peptidy jsou slabé imunogeny, aromatické AA jsou imunogenní více Stabilita

7 Dávka a aplikace imunogenu Dávka a způsob aplikace jsou podstatné Vysoká dávka jednorázově může vést k imunoparalýze (anergie) Nízká dávka jednorázově může být příliš rychle destruována Optimum malá až středně velká, opakované dávky antigenu

8 Chování epitopů CpG motivy mohou stimulovat B lymfocyty přímo (též vlastnosti adjuvancia) Epitope spreading Imunitní systém je stimulován jedním epitopem, další epitopy antigenu mohou být zavzaty do odpovědi např. tvorba autoprotilátek Kryptické epitopy Prezentovány pouze po stimulaci APC prozánětlivými cytokiny MBP Antigenní driftt kontinuální mutace mikroorganizmů, kdy je tvořeno velmi málo paměťových buněk

9 Antigenní drift a shift Kontinuální mutace mikroorganizmů způsobují jev zvaný antigenic drift. Mutace způsobí problém pro paměťové buňky imunitního systému Velmi málo (pokud nějaké) paměťové buňky umí při přirozené expozici rozpoznat novou antigenní variantu Antigenní shift je specifický příklad reassortment nebo virového shiftu, který hpůsobí fenotypovou změnu. Příkladem závažného efektu antigenního shiftu je pandenmie viru influenzy

10 Epitopy B lymfocytů Protilátky, ať jsou v sekreční formě nebo působí jako receptor, vyjímečně rozeznávají kontinuální epitopovou sekvenci Obvykle však rozeznávají diskontinuální epitopy, složené z aminokyselin, složených k sobě, když je protein skládán do své nativní struktury

11 Trojrozměrná konfigurace globulárního proteinu - lysozym Protilátky proti celé molekule nereagují po zrušení vazeb Lineární peptidy ztratí antigenní konfiguraci

12 Antigen B lymfocytů Antigen globulárního proteinu mozaika determinant (epitopový cluster) Individuální protilátky v polyklonálním séru Monoklonální protilátka se za normálních okolností v organizmu nevyskytuje

13 Protilátková molekula, znázorněny struktury těžkého a lehkého řetězce, s volnými řetězci κ a λ Permission obtained from The Binding Site Bradwell, A.R. Serum free light chain analysis. 4th edn, page 12 (2006) Hutchison, C. A. et al. (2009) Serum free light chain assessment in monoclonal gammopathy and kidney disease Nat. Rev. Nephrol. doi: /nrneph

14 Polyklonální proliferace plazmatických buněk Monoklonální proliferace plazmatických buněk Infekce Autoimmunita Zvýšená produkce obou FLC Tumory plazmatických buněk Zvýšená produkce jednoho FLC Normální poměr zůstává zachován Poměr je abnormální

15 Mnohočetný myelom A 66-letý muž pociťoval konstantní ostrou bolest v bederní krajině, trvající od pádu ze žebříku před 6 týdny. Normální červený, bílý KO, sedimentace 98mm/h. Celková bílkovina zvýšena 98g/l (NR 65-75g/l) Sérový albumin, kreatinin a urea byly normální. Měl zvýšenou hodnotu Ca (3.2 mmol/l), ale normální alkalickou fosfatazu. Elektroforéza sérových proteinů ukázala monoklonální pás v obl. gama globulinu Pás byl typován pomocí imunoelectroforezy jako IgG, kappa typ. Kvantitace sérových Ig ukázalo zvýšenou hodnotu IgG 67g/l (NR g/l), nízké IgA 0.3g/l (NR g/l), nízké IgM 0.2g/l (NR g/l). Elektroforeza moče nalezla monoklonální pás, IELFO -free kappa lehké řetězce. RTG pánve ukázalo malé, ostře ohraničené leze v L páteři, a destrukci symfysis pubis Biopsie k.dřeně zvýš. počet atypických plazmocytů

16 Aktivace B lymfocytů 1. Přímo vazbou antigenu 2. S pomocí T lymfocytů buněčný kontakt nebo vlivem cytokinů buňky jsou aktivovány, proliferují (s identickou nebo velmi podobnou specificitou), diferencují v plazmatické buňky charakteristikou je vysoká produkce solubilních receptorů

17 Antigeny B lymfocytů nezávislé na T lymfocytech: TI-1 Protilátková reakce na TI antigeny TI-1 antigen např. bakteriální lipopolysacharid- polyklonální BCR aktivace/ nespecifická (v případě vysoké koncentrace LPS) Nízkoafinitní, protilátky izotypu IgM Podobné rostlinným lektinům nebo bakteriálním superantigenům aktivátory T lymfocytů

18 B antigeny nezávislé na T lymfocytech: TI-2 TI-2 - polymery, repetitivní struktury typické po buněčnou stěnu opouzdřených bakterií (Pneumokoky) nebo polymérní proteiny (flagellin - několik podjednotek bakterií) Repetitivní struktury reagují s mnohočetnými BCR, intenzívně BCR agregují a aktivují B lymfocyty(zralé) signály pro proliferaci bez pomoci T lymfocytů

19 Antigeny nezávislé na T lymfocytech - souhrn první linie obrany proti povrchovým polymerům mikroorganizmů mají mnohokráte opakované epitopy (např. polysacharid) intenzívní prokřížení membránových Ig nahradí pomocné signály. Není nezbytný kontakt Th lymfo, postačují cytokiny od T, NK buněk nedochází k afinitní maturaci není imunologická paměť

20 Limitace TI antigenů Pouze zralé B lymfocyty jsou schopny reagovat s TI antigeny Nezralé B lymfocyty jsou anergizovány (novorozenci mají vysoké procento nezralých B lymfocytů). Splenektomie je riziko pro ID TI2 Ag Je stále potřeba slabé cytokinové pomoci (IL- 2, IL-3, IFN gama), původem zřejmě z NK buněk, T lymfocytů?

21 T dependentní antigeny Charakteristiky: Primární a sekundární imunitní reakce Dvě fáze mohou být odděleny (nízká dávka antigenu, intervaly mezi dávkami) nebo mohou být kontinuální (přirozená infekce) Výsledek paměťové buňky, vysokoafinitní protilátky

22 Populace B lymfocytů B1 lymfocyty B lymfocyty, které vzniknou nejdříve během ontogeneze se nazývají B1. Většina exprimuje CD5 znak, adhezívní a signální membránové molekuly Jsou zdrojem takzvaných přirozených IgM protilátek Často jsou polyreaktivní (např. rozpoznávají několik různých antigenů, často včetně běžných patogenů a autoantigenů obdoba mitogenů) Přirozené protilátky mají relativně velmi nízkou afinitu

23 B2 lymfocyty Většinová populace B2, nemají CD5 Před kontaktem s antigenem zralé B2 buňky exprimují současně IgM and IgD protilátky Po aktivaci se stanou buňkami paměťovými, obvykle se přepínají k použití IgG, IgA, nebo IgE jako jejich antigenního receptoru Když se B2 buňky v germinálních centrech setkají s antigenem, dojde k izotypovému přesmyku a začínají tvořit IgG, IgA, nebo IgE, a dojde k somatické hypermutaci, finálně plazmat.bb. v sek. lymf. tkáni Obecně žijí krátce, poločas mají asi jen několik dní, pouze některé plazmatické buňky přežívají týdny (BM)

24 Vlastnosti Ig IgG IgA IgM IgD IgE Fixace C Placentární transfer Distribuce Krev Intersticium Zevní sekrety Poločas v séru (dny) Buněčná vazba PMN Makrofágy Bazofily Mastocyty

25 Klonální selekce Protože každý B lymfocyt je programován tvořit pouze jednu z mnoha protilátek, všechny antigenní receptory na jednom B lymfo mají stejnou specifitu Tyto klony lymfocytů jsou vybrány k účasti v imunitní reakci, pokud nesou receptor, který se může vázat na relevantní antigen, proces zvaný klonální selekce Buňky vybrané antigenem proliferují, což vede k rychlému vzestupu počtu B a T lymfocytů, které mohou rozpoznat antigen

26 Souhrn vývoje B lymfocytů kritické kroky 1. Přeskupení genů pro H řetězec a povrchová exprese pre-bcr ( + L) 2. Úspěšné přeskupení genů pro L- řetězec a povrchová exprese IgM (BCR) 3. Nezralé B lymfocyty testování pro potenciální autoreaktivitu (apoptot.sign.) 4. Somatické mutace a afinitní maturace - přežijí pouze buňky s nejvyšší afinitou pro antigen

27 Primární protilátková odpověď 1. Stimulace B lymfocytů prostřednictvím BCR ( B cell receptor) 2. Stimulace Th ( Th2) pomocí APC (MHC+protein). Výsledkem aktivace je tvorba nízkoafinitních IgM protilátek. Imunokomplexy IgM a antigen jsou uchovávány na povrchu folikulárních dendritických buněk (FDC).

28 Primární protilátková odpověď (pokrač.) 1. Pohlcení antigenů profesionálními fagocyty (APC především dendritické buňky). Prezentace MHC II + Ag Th lymfocytům klony Ag specifických Th2 lymfocytů 2. Th2 rozpoznávají aktivované B lymfocyty (přítomnost MHC II +Ag) a pomáhají jim pomocí cytokinů přísun, proliferace a diferenciace tvorba plazmatických buněk s tvorbou protilátek 3. Paměťové buňky část B lymfocytů. Spouštějí sekundární protilátkovou odpověď

29 Primární protilátková odpověď- souhrn 3-4 dny po imunizaci Lokalizace sekundární lymfatické orgány Typ odpovědi IgM izotyp, nízká afinita k antigenu, účinné v blokádě Ag spreading Imunokomplexy Ab+Ag uchovávané v lymfatických uzlinách na FDC (velmi dlouho, možná roky!) primární lymfoidní folikuly. FDC opět stimulují B lymfocyty (klonální expanze buněk primárně stimulovaných Ag)

30 Sekundární odpověď B lymfocytů Podmínky: Rozpoznání antigenů na FDC v primárních lymfatických folikulech Signály z Th lymfocytů Nové dělení a diferenciace B lymfocytů. Mutace V genového segmentu pro H, L řetězce Mutantní klony B lymfocytů s odlišnými vazebnými místy (ve srovnání se vstupujícími buňkami) Pouze B lymfocyty s velmi silnou afinitou přežijí, buňky s afinitou slabou (ne-produktivní mutace) zahynou

31 Somatická hypermutace Geny kodující receptory B lymfocytů projdou procesem zvaným somatická hypermutace - během proliferace B lymfocytů v germinálních centrech sekundárních lymfatických orgánů. Změny v AMK vyladí rozpoznávání antigenu a určí sílu vazby (afinitu) protilátky Výsledek klonální selekce je populace B lymfocytů s vysokou afinitou a výlučnou antigenní specifitou pro imunizující antigen, a populace paměťových buněk pro tento antigen

32 Selekce B lymfocytů s protilátkovými mutantami o vysoké afinitě

33 Izotypový přesmyk těžkého řetězce Aby byl exprimován izotyp jiný než nebo, v lokusu H řetězce proběhne přeskupení, které umístí novou C H sekvenci k exonu V/D/J Delece skupiny exonu enzymatickou cestou, odlišnou od V/D/J přeskupení V obrázku je gen přepojen na C 1 izotyp

34 Isotypový přesmyk řetězce Ig Cíl: Výměna konstantní oblasti protilátky Ireverzibilní delece oblastí genového komplexu pro H řetězec, beze změn v genové oblasti VDJ C a C jsou odstraněny. Rekombinázy rozpoznávají switch sequences umístěné u C segmentů (pouze nejsou přítomny mezi C and C )

35 Regulace izotypového přesmyku Cytokiny IL-4 IFN - γ TGF IL-10 Přesmyk na: IgE, IgG1, inhibiční IgG2 IgG2a, IgG3 IgG2b, IgA IgA

36 Sekundární odpověď B lymfocytů (pokračování) Rostoucí výběr a soutěž buněk, protože klesá množství antigenu (na FDC) Intenzívní proliferace a hynutí Lokalizováno v sekundárních lymfoidních folikulech v germinálních centrech (mikroskopicky) Výsledek afinitní maturace: Afinita 4-6 řády vyšší než u IgM primární odpovědi

37 Indukce protilátkové odpovědi - souhrn antigenní stimulace probíhá v sekundárních lymfatických orgánech odpověď na většinu antigenů vyžaduje kooperaci s T lymfocyty aktivace a klonální expanze antigen specifických B lymfocytů izotypové přepnutí, somatické mutace diferenciace do stádia plazmatických buněk primární a sekundární protilátková odpověď

38 Primární a sekundární protilátková produkce

39 Výsledný efekt sekundární protilákové odpovědi 1. Protilátky s vysokou afinitou 2. Protilátky s odlišnou efektorovou funkcí (aktivace komplementu, FcR funkce) 3. Paměťové buňky

40 Imunitní ochrana protilátkami Neutralizace Opsonizace Aktivace komplementu Tkáňové poškození díky tvorbě Ab

41 Neutralizace Protilátky mohou neutralizovat aktivitu toxinů virů jiných mikroorganismů Mechanizmy: vazba na kritické epitopy prevence adheze na buňky nebo vstupu do buněk

42 Aktivace komplementu, opsonizace Klasická cesta aktivace komplementu vázán C1q, s Fc fragmentem IgM nebo IgG na povrchu buňky tvorba C3b a dalších biologicky aktivních složek komplementu, které podporují fagocytózu Pokud není přítomen komplement, mikroorganizmy jsou obaleny protilátkami IgG, IgA, nebo IgE, které se váží na příslušný receptor

43 Cytotoxicita způsobená protilátkami NK buňky mohou způsobit: IgG zprostředkovanou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC) Cytotoxicita závislá na protilátkách IgE Makrofágy, eosinofily a destičky se účastní cytotoxických mechanizmů, pokud je cílová buňka příliš velká pro fagocytózu. Používány perforiny, granzymy, nebo někdy reaktivní metabolity kyslíku

44 Regulace funkce imunitního systému Účinná imunitní odpověď eliminuje antigen a odpověď se vrací na bazální úroveň Některé další mechanismy zpočátku vylaďují aktivitu, posléze aktivitu tlumí IgG samo může vypnout odpověď k patřičnému antigenu (negativní zpětná vazba) Fc R a BCR na stejné buňce jsou spojeny imunokomplexy obsahujícími relevantní antigen. Výsledkem je předání inhibičního signálu do jádra B lymfocytů

45 Regulace imunitního systému Antigenem Udržuje paměťové buňky Startuje afinitní maturaci Antigenová kompetice silnější vazba epitopu potlačuje slabší Prahová denzita Ag na APC vyšší na Th2 než Th1 Antagonistickým peptidem TCR může reagovat s MHC+peptid variabilně negativní nebo pozitivní signál

46 Regulace imunitního systému protilátkami Kompetice volných Ab s BCR Imunokomplexy IgG +Ag agregují BCR a CD32b (Fcγ R). Protein-kinázy a protein-fosfatázy reagují navzájem a blokují aktivaci B lymfocytů

47 Složky idiotypové sítě Ag receptor na jednom lymfocytu (Ab), rozeznává idiotyp na receptoru jiného lymfo B a T lymfocyty reagují prostřednictví idiotypové a antiidiotypové reakce výsledkem je stimulace nebo suprese

48 Regulace imunitní odpovědi mezibuněčný kontakt Adhezívní molekuly Ig superfamily (CD40- CD40L) Inhibiční receptory CTLA-4 (CD152) (strukturálně podobné CD28), váží CTLA-4 ligand silný negativní signál T lymfo Inhibiční receptory NK buněk, T lymfo - CD86 KIR - ligand NKG2, Fas-FAsL Interakce Fas s FasL na povrchu aktivovaných T lymfo

49 T lymfocyty - subpopulace

50 T lymfocyty centrální buněčná populace imunity regulaci uskutečňují prostřednictvím cytokinů a membránových interakcí regulují B lymfocyty a protilátkovou imunitu regulují specifickou T lymfocytární cytotoxicitu regulují přirozenou cytotoxicitu složky obranného i poškozujícího zánětu (granulomu)

51 Rozpoznání Ag T lymfocytem na APC Antigen Endocytosis CD4 + T cell APC T Cell Receptor Peptide MHC II

52 Aktivace T lymfocytu aktivovanou APC IL-1 IL-6 IL-12 IL-12 Receptor Signal 3 B7 CD28 CD4 + T cell LPS TLR4 Signal 2 T Cell Receptor Signal 1 Peptide MHC II Antigen Presenting Cell (APC) Signal 1: Specificity Signal 2: Activation Signal 3: Differentiation

53 Populace T lymfocytů T lymfo T-helpers (CD4+) Th1 Th2 Cytotoxické T lymfo (CD8+) Regulační T lymfo (CD4+CD25+?) NKT buňky T lymfo Plasticita T lymfocytů

54 Subpopulace T lymfocytů Zralé TCR + lymfocyty se fenotypově skládají ze více populací - CD4+ (pomocné) nebo CD8+ (cytotoxické) Přibližně 5% až 10% periferni populace T lymfocytů je CD4 - CD8 -. (gama/delta). Pravěpodobné ligandy jsou neklasické MHC molekuly T lymfocyty - IL-2, IFN- a TNF- - T H 1 lymfocyty T lymfocyty - IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, a IL-13 - T H 2 lymfocyty T lymfocyty s regulační/potlačující funkcí jsou Treg (IL-10, TGF-β), Th3 cells (TGF-β, IL-4, IL-10), Tr1 (IL-10)

55 Prozánětlivé buňky Pomoc makrofágům Th1 lymfocyty Aktivace a stimulace jejich cytotoxických funkcí Eliminace intracelulárních mikroorganizmů Pomoc T lymfocytům Proliferace, Th1 diferenciace Sekrece cytokinů (IFN-, TNF-, IL-2) Protiinfekční, pozdní přecitlivělost, autoimunita

56 Th2 lymfocyty Pomoc B lymfocytům Vývoj Sekrece protilátek Regulační funkce Sekrece cytokinů (IL-4,IL-5,IL-6,IL-13) Obrana proti extracelulárním mikroorganizmům Participace v alergických reakcích

57 Fenotypové rozdíly a odlišné funkce T H 1 a T H 2 buněk

58 Regulační T lymfocyty CD8+ T lymfocyty nejsou supresoři!!! CD4+CD25+ FoxP3+ T lymfocyty Th3 T lymfocyty NKT lymfocyty T lymfocyty

59 Funkce regulačních T lymfocytů Inhibice imunitních reakcí Udržování immunologické tolerance Regulace přehnané imunitní reakce proti infekci, alergenům Suprese protinádorové imunitní odpovědi Mechanizmy: Závislý na přímých mezibuněčných kontaktech Sekrece cytokinů (IL-4, IL-10, TGF- ) Zabíjení efektorových buněk

60 Clinické aplikace Treg cells

61 Th17 Vývoj v prostředí bohatém na TGF- a IL-6, IL-21, IL-23 Sekrece IL-17, IL-21, IL-22 Prozánětlivé cytokiny Role v imunitní odpovědi proti Klebsielle a citrobacteru Pravděpodobně se podílí na rozvoji některých orgánspecifických autoimunitních onemocnění v experimentálním modelu Th3

62 Cytotoxické CD8+ T lymfocyty Eliminace of nebezpečných buněk vlastního organismu Eliminace buněk napadených intracelulárními antigeny Eliminace poškozených buněk

63 NK buňky (přirození zabíječi) Natural killer buňky destruují infikované (virem) a maligní buňky Mají Fc receptory které váží IgG: Fc R - vazba na cílové buňky s navázaným IgG (proces zvaný antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC) Receptory aktivující zabíječe rozpoznávají mnoho různých molekul, inhibiční molekuly pro zabíječe rozpoznávají MHC I. třídy

64 Funkce NK buněk Antigen nespecifické Rozpoznání dosud neznámých antigenů na povrchu cílových struktur

65 Funkce NK buněk Aktivace a funkce NK buněk je závislá na interakci aktivačních a inhibičních receptorů na povrchu NK buněk Aktivace: Fc receptor CD16 ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity Inhibice killer inhibitory receptors KIR (Ly49, CD94-NKG2)

66 NKT buňky Natural Killer T cells Fenotyp a funkce obou - NK buněk a T lymfocytů Restrikčním elementem NKT buněk je molekula CD1d prezentující glykolipidy a lipidy

67 Fenotyp NKT buněk Exprese TCR, CD3, CD4 Exprese povrchových znaků typických pro NK buňky Omezený TCR repertoár Rozpoznání konzervovaných struktur na bázi lipidů a glykolipidů

68 Funkce NKT buněk Sekrece Th1 i Th2 cytokinů Role v Th1/Th2 diferenciaci naivních T lymfocytů Activace B lymfocytů Activace NK buněk Activace dendritických a dalších antigen prezentujících buněk Cytotoxické funkce Regulační funkce