UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. Katedra biologických a lékařských věd. Bc. Kristýna Krasulová

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biologických a lékařských věd Bc. Kristýna Krasulová VÝZNAM CYTOCHROMU P450 2W1 U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Diplomová práce Školitel: doc. RNDr. Vladimír Semecký, CSc. Specialista: RNDr. Jana Nekvindová Ph.D. Hradec Králové 2013

2 Prohlašuji, že tato diplomová práce je mým původním autorským dílem a veškeré myšlenky, data a jejich zdroje, z nichž jsem pro zpracování čerpala, řádně cituji. Práce nebyla využita pro získání jiného kvalifikačního titulu. datum podpis 2

3 Děkuji Doc. RNDr. Vladimíru Semeckému, CSc. a RNDr. Janě Nekvindové, Ph.D. za odbornou pomoc a ochotu při řešení mé diplomové práce. 3

4 OBSAH 1. ABSTRAKT ABSTRACT ÚVOD ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE CÍL PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST KOLOREKTÁLNÍ KARCINOM EPIDEMIOLOGIE SVĚT EPIDEMIOLOGIE ČESKÁ REPUBLIKA HISTOPATOLOGIE KRK KLINICKÉ PŘÍZNAKY RIZIKOVÉ FAKTORY BIOLOGIE KOLOREKTÁLNÍHO NÁDORU Molekulární genetika hereditární formy KRK FAMILIÁRNÍ ADENOMATÓZNÍ POLYPÓZA- FAP LYNCHŮV SYNDROM Molekulární genetika sporadické formy KRK Nestabilita mikrosatelitů Chromosomální nestabilita CIMP (CpG island methylator phenotype) Signální dráhy spojené s KRK WNT/APC/CTNNB1signální dráha TGFβ (transformující růstový faktor beta) signální dráha Signální dráha epidermálního růstového faktoru (EGFR) DIAGNOSTIKA Screening kolorektálního karcinomu Laboratorní diagnostika Genetická diagnostika Radiodiagnostika Endoskopie Endosonografie rekta LÉČBA Chirurgická léčba Chemoterapie Radioterapie Cílená terapie Přehled nových léků ve fázi klinického vývoje CYTOCHROM P Cytochrom P450 a jeho role v karcinogenezi Využití CYP v protirakovinné terapii Cytochrom P450 2W EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST PARAMETRY STUDIE Výběr pacientů a kontrolní skupiny PŘÍPRAVA VZORKŮ ALELICKÁ DISKRIMINACE Princip metody Pracovní postup VÝSLEDKY DISKUSE ZÁVĚR SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK LITERATURA

5 1.ABSTRAKT Bc. Kristýna Krasulová Význam cytochromu P450 2W1 u kolorektálního karcinomu Diplomová práce Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Zdravotnická bioanalytika Odborný pracovník v laboratorních metodách Cíl práce: Cytochromy P450 hrají důleţitou roli nejen v karcinogenezi aktivací prokarcinogenů, ale také v léčbě rakoviny, kde se mohou účastnit metabolismu protinádorových léčiv. V práci jsou rešeršně zpracovány současné poznatky o karcinogenezi kolorektálního karcinomu a poznatky o novém členu CYP P450 2W1 a jeho potenciálu v léčbě tohoto onemocnění. Hlavním cílem práce bylo analyzovat výskyt dvou nejvýznamnějších nesynonymních polymorfismů CYP2W1 u pacientů s kolorektálním karcinomem a u zdravých jedinců. Metody: Studovaná skupina se skládala ze 197 pacientů s kolorektálním karcinomem a 202 zdravých subjektů. Vzorky byly získány na základě spolupráce s Masarykovým onkologickým ústavem v Brně. Identifikace CYP2W1 alelických variant byla provedena metodou alelické diskriminace s pouţitím sond TaqMan SNP Genotyping assay. Výsledky: Nesynonymní polymorfismus 541G/A (alela CYP2W1*2, rs ) způsobující aminokyselinovou substituci Ala181Thr a polymorfismus 1463C/T (alela CYP2W1*6, rs ) odpovědný za substituci Pro488Leu jsou v naší populaci oba zastoupeny. Minoritní alela 541A se ve vyšetřovaném souboru vyskytovala u 7 % (MAF: A=0,074) jedinců, bez rozdílů mezi pacienty s kolorektálním karcinomem a zdravými kontrolami. Minoritní alela druhého polymorfismu, 1463T, se vyskytovala u přibliţně 20 % (MAF: T=0,195) zkoumaných subjektů, častěji byla přítomna u zdravých jedinců, ale tento rozdíl nebyl statisticky významný. Závěry: Frekvence obou alel v naší populaci se liší od dosud publikovaných studií a jejich populací, jejich výskyt je geograficky rozdílný. Nenašli jsme významnou souvislost mezi kolorektálním karcinomem a výskytem polymorfismů. Ačkoli tato data nepodporují význam CYP2W1 jako prognostického markeru, celkově je tento nádorově specifický enzym velmi perspektivním kandidátem pro cílenou terapii. 5

6 2.ABSTRACT Bc. Kristýna Krasulová The importance of cytochrome P450 2W1 in colorectal cancer Diploma thesis Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Healthcare Bioanalytics - Specialist in Laboratory Methods Backround: Cytochromes P450 play an important role in carcinogenesis by activating carcinogens as well as in cancer treatment where they can participate in metabolism of anticancer drugs. This work discuses current knowledge about colorectal cancer carcinogenesis and knowledge about the new member of CYP P450 2W1 and its potential in anticancer therapy. The main aim is to detect differences in the frequency of the two most important non-synonymous CYP2W1 polymorphisms between colorectal cancer patients and healthy subjects. Methods: The study group consisted of 197 colorectal patients and 202 healthy subjects gained on the basis of collaboration with Masaryk Memorial Cancer Institute. The identification of CYP2W1 allelic variations was performed by allelic discrimination using TaqMan SNP Genotyping assays. Results: The non-synonymous polymorphism 542G/A (allele CYP2W1*6, rs ) responsible for the amino acid substitution Ala181Thr and polymorphism 1463C/T (allele CYP2W1*6, rs ) causing the amino acid substitution Pro488Leu were both present in the population studied. The 541A allele was present in 7 % (MAF: A=0,074) of the investigated individuals without any differences between colorectal patients and healthy controls. The 1463T allele was present in 20 % (MAF: T=0,195) of the studied group and it was also more common in healthy subjects, but without any statistical significance. Conclusions: The frequency of both alleles in our population is slightly different to what has been published. We have not found any correlation between SNP occurrence and colorectal cancer incidence. Although these data do not support the prognostic utility of CYP2W1, it is still a highly promising candidate for targeted therapy of colon cancer. 6

7 3. ÚVOD 7

8 Zhoubné novotvary zaujímají ve vyspělých zemích jednu z hlavních příčin úmrtí. Česká Republika není výjimkou a na rakovinu zde umírá kaţdý čtvrtý člověk (NOR 2009). Kolorektální karcinom zaujímá svou incidencí přední místo ve zhoubných novotvarech. Celosvětově je kaţdým rokem diagnostikováno přes 1 milion nových pacientů a my patříme dokonce na první příčku incidence v Evropě (Cunningham, Atkin et al. 2010) (Dušek 2005). Jelikoţ se jedná o časté onemocnění, je zde velká potřeba sníţit tato čísla pomocí prevence, screeningu a vývoje nových terapeutických postupů. Porozuměním genetickým změnám v nádorech se vědci snaţí odhalit podstatu karcinogeneze a zlepšit prevenci, diagnostiku a terapii rakoviny. Pro budoucnost se počítá s identifikací nových nádorových markerů a novými léčebnými postupy v oblasti chemoterapie i tzv. cílené terapie. Cytochromy P450 jsou hlavní enzymy metabolismu xenobiotik a mnoha endogenních substrátů. Významnou roli hrají i u metabolismu protinádorových léčiv. Díky jejich variabilitě můţe docházet k významným lékovým interakcím ovlivňujícím výsledek léčby (Gervasini, de Murillo et al. 2010). Mohou se také podílet přímo na procesu karcinogeneze (Nebert and Dalton 2006). Vedle této negativní role jim však jejich výskyt v nádorové tkáni a schopnost aktivovat některá xenobiotika v cytotoxicky působící látky dává potenciál pro cílenou terapii (Hanzawa, Sasaki et al. 2008). Nově objeveným členem rodiny P450 je CYP2W1. Tento enzym není za normálních okolností exprimován v dospělých lidských tkáních, jeho exprese byla téměř výlučně popsána v nádorové tkáni kolorekta, díky čemuţ je uvaţován jako potenciální cíl v protirakovinné terapii kolorektálního karcinomu (Karlgren, Gomez et al. 2006). Účastní se biotransformace několika karcinogenů a má schopnost aktivovat prodrug v cytotoxický metabolit (Wu, Sohl et al. 2006). Jeho zvýšená exprese byla popsána u pacientů s horší prognózou a jeho exprese by tak mohla být také pouţita jako prognostický marker (Edler, Stenstedt et al. 2009). V mnoha hlediscích se zdá být CYP2W1 slibnou molekulou pro léčbu kolorektálního karcinomu. Stejně jako u některých dalších CYP je pro CYP2W1 typická genetická variabilita a dosud byla identifikována řada genových polymorfismů. Existuje zde hypotéza, ţe některé z nich by mohly znamenat vyšší riziko vzniku kolorektálního karcinomu (Gervasini, de Murillo et al. 2010). Tato diplomová práce se zabývá stanovením frekvence významných nesynonymních polymorfismů v naší populaci u pacientů s kolorektálním karcinomem a zdravých kontrol. 8

9 . 4. ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE CÍL PRÁCE 9

10 Práce se zabývá problematikou kolorektálního karcinomu se zaměřením na pokroky v léčbě se specializací na cytochrom P450 2W1. Cílem je zmapovat výskyt dvou nejvýznamnějších nesynonymních CYP2W1 polymorfismů v naší populaci a porovnat jejich rozloţení mezi pacienty s kolorektálním karcinomem a zdravými jedinci. Cíle práce lze rozdělit do několika dílčích úkolů. Zpracovat rešeršně současné poznatky z oblasti kolorektální karcinogeneze se zaměřením na biologii nádoru, moderní diagnostiku a léčbu. Zpracovat dostupné vědecké poznatky o cytochromu P450 2W1 a jeho vyuţití v léčbě kolorektálního karcinomu. Stanovit pomocí metod molekulární biologie frekvenci významných nesynonymních polymorfismů genu CYP2W1 v naší populaci. Porovnat výskyt u pacientů s kolorektálním karcinomem a zdravých kontrol. Získaná data porovnat s výsledky dosud uveřejněných studií. 10

11 5. TEORETICKÁ ČÁST 11

12 5.1. KOLOREKTÁLNÍ KARCINOM Kolorektální karcinom je jedna z nejčastějších malignit v západních zemích. Za poslední dvě dekády stoupla incidence téměř o 200 %, můţeme jej také označit za jedno z civilizačních onemocnění, a proto je kolorektální karcinom a jeho léčba jedním z témat současného výzkumu. Hlavním cílem je zmapovat krok po kroku vznik malignity a tyto poznatky zuţitkovat ve vývoji nových diagnostických a terapeutických postupů. Kolorektální karcinom je zhoubný novotvar vznikající maligní transformací cylindrického epitelu tlustého střeva a rekta (Adam 2002). Obr. 1. Tlusté střevo (Dušek 2013) Jedná se o úsek dlouhý 1,3 1,7 m s průměrem od 4 do 7,5 cm. První část se nazývá cékum (intestinum caecum) neboli slepé střevo, jehoţ součástí je i červovitý výběţek (appendix vermiformis). Po céku následuje hlavní část tlustého střeva - tračník (colon). Od slepého střeva směrem vzhůru stoupá tračník vzestupný (colon ascendens). Napříč zprava doleva prochází tračník příčný (colon transversum) a od něj klesá tračník sestupný (colon descendens), který je napojen na esovitou kličku (colon sigmoideum) propojující tračník s posledním úsekem - konečníkem (rectum) vyúsťujícím řitním otvorem (anus) (Čihák 2002). 12

13 5.2. EPIDEMIOLOGIE SVĚT V současné době je onkologické onemocnění hlavní příčinou úmrtí člověka ve vyspělých zemích. V rozvojových zemích se umístilo na druhém místě a čísla stále rostou ruku v ruce s převzetím ţivotního stylu západní civilizace zahrnující kouření, nedostatek pohybu a nezdravou stravu (Jemal, Bray et al. 2011). Významný podíl pak tvoří zhoubné novotvary kolorekta (Obr. 2). Obr. 2. Incidence zhoubných novotvarů ve světě dle údajů z roku 2008 (Ferlay J 2010). Podle údajů mezinárodní agentury pro výzkum rakoviny GLOBOCAN z roku 2008 zaujímá incidence kolorektální rakoviny (KRK) u muţů 3. místo s celkově případy (10 % ze všech zhoubných novotvarů). Úmrtností se řadí na 4. místo hned po rakovině plic, jater a ţaludku. U ţen je incidence jen lehce niţší, s celkově případy zaujímá 3. místo (9,4 % ze všech ZN) a 4. místo v počtu úmrtí (po karcinomu prsu, cervixu a plic) (Ferlay J 2010) EPIDEMIOLOGIE ČESKÁ REPUBLIKA Stejně jako ve světě, tak i v České Republice vykazuje výskyt KRK stoupající tendenci. Dle údajů Národního onkologického registru ČR z roku 2009 je incidence u muţů 93,1/ a 61,1/ u ţen (NOR 2009). Bohuţel nás tato data řadí na přední pozice v Evropě i po celém světě. Jedná se o druhý nejčastější zhoubný novotvar v české populaci. První místo zaujímá u muţů rakovina prostaty a u ţen karcinom prsu (Dušek 2012). Kaţdým rokem je nově diagnostikovaných okolo 8000 pacientů s KRK a zhruba poloviční počet na něj umírá (Dušek 2005). Věk většiny pacientů s touto 13

14 diagnózou je v rozmezí mezi 61. a 78. rokem, ale 21 % pacientů je pod 60 let (NOR 2009). Dalším problémem je nedostatečně včasná a účinná diagnostika, protoţe více neţ polovina případů je objevena aţ ve III. či vyšším stádiu choroby. To je nepříznivé pro budoucí léčbu a nepřispívá to ani k optimistické prognóze. Navzdory těmto faktům byl však zaznamenán klesající trend mortality (Obr. 3), ta je však stále druhá nejvyšší ze zhoubných novotvarů v ČR (Dušek 2012). Obr. 3 Incidence a mortalita kolorektálního karcinomu v letech v ČR (Dušek 2005) HISTOPATOLOGIE KRK Kolorektální karcinom vychází z epiteliálních buněk sliznice tlustého střeva (Rubin 2011). Nejčastěji se objevuje v tračníku (lat. colon) a konečníku (lat. rektum), odtud tedy název kolorektální karcinom. Jeho lokalizace má v posledním desetiletí tendenci posunu doprava. Méně se dotýká rekta, a naopak více tlustého střeva. Adenomy představují prekancerózu, protoţe mají schopnost transformace v karcinom. Podle morfologických studií je jasné, ţe existuje souvislost mezi velikostí a typem adenomu a stupněm epitelové dysplazie a jeho malignizací. Vývoj KRK probíhá v několika morfologických stupních (Obr. 4). Z normálního epitelu vznikají aberantní kryptové fokusy s dysplazií a mění se v adenom s nízkým rizikem maligního zvratu. Riziko se postupem času zvyšuje, aţ vznikne adenokarcinom, nádor ţlázového původu, který se bez zásahu mění v metastazující adenokarcinom (Holubec 2004). 14

15 Takto vzniká většina (90 %) KRK, v menším mnoţství se vyskytuje v mucinózní formě (Rubin 2011). Dle mikroskopického obrazu rozlišujeme tubulární a vilózní adenom. Převáţná většina (80 %) karcinomů je zastoupena tubulární formou, čistá vilózní forma je zastoupena jen u 2,6 % a zbytek (okolo 18 %) je tvořen přechodnou tubulovilózní mikroskopickou stavbou (Becker 2005). Obr. 4 Histologické preparáty normálního, hyperplastického a maligního střevního epitelu. Vlevo vidíme běţné uniformní střevní buňky, přesně seřazené podle bazální membrány. Uprostřed jsou buňky morfologicky normální, ale díky vyššímu počtu buněk v kryptách dochází ke shlukování a slizničnímu skládání. Vpravo vidíme typický vzhled karcinomu: vyšší poměr cytoplazma/jádro, neuniformní buňky, větší počet jader seřazených podél bazální membrány (Kinzler and Vogelstein 1996). Pro histologický staging (určení rozsahu nádoru) je nejrozšířenější uţití klasifikace TNM (tabulka 1), která vychází z rozsahu penetrace nádoru do sliznice střeva a okolních orgánových struktur (Obr. 5). Pouţívá se zejména k určení stádia KRK, které je pak rozhodujícím faktorem pro volbu vhodného léčebného postupu. Jednotný standard pro hodnocení vztahu histologického obrazu s biologickou povahou nádoru chybí, ale mezi nejpouţívanější patří klasifikace dle Dukese (Compton 2003; Becker 2005). Ten ve svém hodnocení upřednostňuje buněčné uspořádání a míru postiţení. K prvnímu Dukesovu stupni se řadí nádory s nejdiferenciovanějšími buňkami, tubulární, s nejmenším počtem jaderných polymorfismů. Stupeň poslední je charakteristický nejméně diferenciovanými buňkami, pouze občas je zde zřetelná ţláznatá struktura, buňky jsou neuniformní, často v mitóze (Labianca, Beretta et al. 2010). Kolorektální karcinom metastazuje buď přímým růstem do okolí, nebo se dostává pomocí lymfatických kanálků do lymfatických uzlin pod nádorem a dalších vzdálenějších orgánů. Metastáze se mohou vyskytovat prakticky všude, často se vyskytují v játrech (Rubin 2011). Prognostický význam má spíš rozsah invaze nádoru skrz střevo neţ velikost či histopatologický obraz. Obecně však platí, ţe čím 15

16 vyšší stádium, tím horší prognóza. Karcinom z prstenčitých buněk má vţdy horší prognózu, stejně tak mucinózní adenokarcinom. Naopak medulární forma KRK je prognosticky příznivější (Compton and Greene 2004). T- kategorie - primární nádor TX Primární nádor nelze posoudit T0 Bez známek primárního nádoru TIS Nádor in situ (intraepiteliální nebo intramukózní) T1 Nádor prorůstá do submukózy T2 Nádor prorůstá do tunica muscularis propria Nádor pokračuje v invazi přes muscularis propria do subserózy nebo se šíří do neperitonealizované perikolické nebo perirektální tkáně pt3a minimální invaze: < 1mm za hranici muscularis propria pt3b lehká invaze: 1-5 mm za hranici muscularis propria pt3c střední invaze: >5 15 mm za hranici muscularis propria T3 pt3d rozsáhlá invaze: >15 mm za hranici muscularis propria Nádor přímo postihuje jiné orgány či struktury (T4a) T4 Nádor prorůstá na viscerální peritoneum (T4b) N kategorie - regionální uzliny NX Regionální mízní uzliny nelze hodnotit NO Bez metastáz N1 Metastáze v 1 aţ 3 lymfatických uzlinách N2 Metastáze ve 4 a více lymfatických uzlinách M kategorie - vzdálené metastázy MX Přítomnost vzdálených metastází nelze posoudit MO Bez vzdálených metastáz M1 Přítomnost vzdálených metastáz stádium 0 Tis N0 M0 N/A stádium I T1 N0 M0 stádium A T2 N0 M0 stádium B1 stádium IIA T3 N0 M0 stádium B2 stádium IIB T4 N0 M0 stádium B3 stádium IIIA T1, T2 N1 M0 stádium C1 stádium IIIB T3, T4 N1 M0 stádium C2, C3 stádium IIIC Jakékoliv T N2 M0 stádium C1, C2, C3 stádium IV stádium D Jakékoliv T Jakékoliv N M1 (TNM) (Dukes) Tabulka 1TNM klasifikace KRK (Compton and Greene 2004) (Sobin 2010) 16

17 Obr. 5 Staging kolorektálního karcinomu (Metrohealth 2012) KLINICKÉ PŘÍZNAKY Klinické symptomy souvisí s lokalizací kolorektálního karcinomu, s jeho velikostí, typem nádoru a v pozdějších stádiích s mírou postiţení metastázemi. Pro kolorektální karcinom je typické dlouhotrvající asymptomatické období, které můţe dojít aţ k rozvoji akutního stavu, jako je perforace či obstrukce tlustého střeva. Jediným příznakem v asymptomatickém období bývá přítomnost okultního krvácení. Symptomatické karcinomy lokalizované na pravé straně tračníku jsou doprovázeny mikrocytární sideropenickou anémií způsobenou chronickým okultním krvácením. Dalším znakem bývá neidentifikovatelná abdominální bolest způsobená invazí tumoru. Levostranné nádory jsou doprovázeny změnami defekačního stereotypu, plynatostí, enteroragií a subileózními stavy. Pro nádory rekta jsou typické tenezmy, následované vyprázdněním neodpovídajícího mnoţství stolice s přítomností hlenu a krve (Rubin 2011). 17

18 5.5. RIZIKOVÉ FAKTORY Kolorektální karcinom je multifaktoriální onemocnění. Na rozvoji KRK se podílejí dvě hlavní skupiny rizikových faktorů exogenní a hereditární. Působení exogenních faktorů má především podíl na vzniku nádorů v oblasti sestupného tračníku, esovité kličky a konečníku. Hereditární faktory odpovídají výskytu zhoubných nádorů v oblasti céka a vzestupného tračníku (Holubec 2004). Mezi osoby se zvýšeným výskytem kolorektálního karcinomu patří pacienti s chronickým zánětlivým onemocněním střev, nositelé dispozice k hereditárnímu karcinomu a osoby s individuálně zvýšeným rizikem pro sporadický karcinom (Becker 2005). Aţ 25 % pacientů s KRK má pozitivní rodinnou anamnézu a u 15 % se jedná přímo o příbuzné prvního stupně. V tomto případě je šance na KRK dvojnásobná (Johns and Houlston 2001). Pokud se v rodině vyskytuje více neţ jeden případ KRK u prvního stupně příbuzenství, riziko narůstá čtyřnásobně. Stejně tak rozvinutí zhoubného novotvaru kolorekta u příbuzného před 60. rokem znamená zvýšené riziko (Becker 2005). U sporadických nádorů se v procesu karcinogeneze uplatňují nejvýznamněji exogenní rizikové faktory. (Arnold, Goel et al. 2005). Byla potvrzena souvislost mezi typem výţivy západních zemí a zvýšenou incidencí KRK (Slattery, Boucher et al. 1998). Patří sem především nadbytek tuků v potravě, nízký příjem vlákniny, nevhodné tepelné zpracování potravy, nadměrná exkrece ţlučových kyselin do stolice, nízká koncentrace vápníku v potravě, nízký příjem vitamínů skupiny A, C a také E, a také vysoký příjem alkoholu a kouření (Holubec 2004). Mezi rizika také patří sedavý způsob ţivota a nadváha (Becker 2005). Mezi hereditární faktory patří familiární adenomatózní polypóza s mutací tumor supresorového genu APC a Lynchův syndrom (hereditární nepolypózní KRK) s mutací v genech MLH1 a MSH2 (Arnold, Goel et al. 2005). Pacienti s chronickým zánětlivým onemocněním střev mají určité predispozice k rozvoji KRK. Výskyt dysplastických lézí, jako jsou různé polypy, s sebou nese nebezpečí závislé na jejich histologické stavbě a jejich velikosti. Colitic ulcerosa se často zvrhává do malignity, především pokud trvá onemocnění delší dobu a zánět postihuje celé střevo. Distální manifestace (rectum, sigmoideum) bývají nepodstatné, ale postiţení levé strany zvyšuje riziko aţ 4krát a totální postiţení aţ 23krát. Maligní zvrat 18

19 u Crohnovy nemoci není jednoznačně definován, ale manifestace onemocnění před 30. rokem představuje určitou hrozbu (Becker 2005) (Holubec 2004) BIOLOGIE KOLOREKTÁLNÍHO NÁDORU Porozumění biologické aktivitě nádoru hraje důleţitou roli pro pochopení průběhu onemocnění. Hraje významnou roli pro pokroky ve vývoji nových léčebných postupů. Snahou současného výzkumu je odhalení celého procesu karcinogeneze krok po kroku se všemi zapojenými geny a jejich proteinovými produkty. Pro budoucnost se počítá, díky těmto poznatkům, s léčebnými postupy zahrnujícími korekce genetických poruch, inhibice metastazování, inhibice angiogeneze a podobně (Holubec 2004). Nádor vzniká jako výsledek několikastupňového procesu inaktivace různých tumor supresorových genů a/nebo aktivace onkogenů několika cílových skupin genů (Fearon and Vogelstein 1990). Výsledkem je přeměna normálního epitelu v maligní struktury. Pokud se KRK vyvine na základě genetické predispozice, mluvíme o hereditární formě, která je zastoupena asi ve 20 % případech. Ostatní nádory, asi 80 %, patří do skupiny sporadických zhoubných novotvarů (Livstone 2012) Molekulární genetika hereditární formy KRK Kolorektální karcinom je typický existencí několika dědičných predispozic, které přispívají k jeho rozvoji (tabulka 2). Dva nejvýznamnější jsou familiární adenomatózní polypóza a Lynchův syndrom. Gen Syndrom Typ dědičnosti Ţivotní riziko Familiární adenomatózní Autozomálně APC polypóza dominantní 100 % APC Zeslabená FAP Autozomálně dominantní 69 % MUTYH MUTYH asociovaná polypóza Autozomálně recesivní 80 % MLH1, MSH2 Lynchův syndrom Autozomálně dominantní 80 % STK11 Peutz-Jeghersův syndrom Autozomálně dominantní 39 % SMAD 4, BMPR1A Juvenilní polypóza Autozomálně dominantní 39 % PTEN Cowdenův syndrom Autozomálně dominantní vzácné Tabulka 2 Přehled hlavních genů a syndromů hereditární formy KRK, převzato z (Migliore, Migheli et al. 2011) 19

20 FAMILIÁRNÍ ADENOMATÓZNÍ POLYPÓZA- FAP U FAP dochází k rozvoji několika adenomatózních polypů po první dekádě ţivota, a pokud nedojde k léčebnému zásahu, většina se rozvine postupem času v kolorektální karcinom. Jedná se o autozomálně dominantní dědičnou chorobu vyskytující se u 1 člověka z 1000 se stejnou incidencí u muţů i ţen (Boland, Sato et al. 1995). FAP můţe být doprovázená mimostřevními manifestacemi, jako jsou osteomy, zubní abnormality, vrozené hypertrofie pigmentového epitelu sítnice a extrakolonické nádory (u % pacientů, nádory mozku, slinivky, ţaludku, štítné ţlázy) (Jasperson, Tuohy et al. 2010). Za výskyt FAP je odpovědná mutace genu APC (adenomatosis polyposis coli) na 5. chromozomu (Groden, Thliveris et al. 1991). Pod pojem familiární adenomatózní polypóza můţeme také zařadit méně váţnější formy Gardnerův syndrom a tlumenou adenomatózní polypózu (Migliore, Migheli et al. 2011) LYNCHŮV SYNDROM Lynchův syndrom neboli hereditární nepolypózní kolorektální karcinom (HNPCC) je autozomálně dominantní onemocnění. Charakteristikou tohoto onemocnění je časný nástup (přelom 3. a 4. dekády ţivota) KRK a jiných tumorů (endometria, vaječníku, ţaludku, močového traktu, slinivky, tenkého střeva a mozku) u několika členů rodiny bez výskytu kolorektálních polypů (Jasperson, Tuohy et al. 2010) (Lynch, Lynch et al. 2009). Na počátku 90. let byla zjištěna souvislost Lynchova syndromu s mikrosatelitovou nestabilitou (MSI) (Peinado, Malkhosyan et al. 1992). Ukázalo se, ţe postiţenými geny v tomto případě jsou geny patřící k DNA,,mismatch opravnému systému (MMR) MSH2 a MLH1 (Lynch and de la Chapelle 2003). Tento systém pomocí několika proteinů zajišťuje opravu DNA během replikace (Peltomaki 2001) Molekulární genetika sporadické formy KRK Sporadické kolorektální nádory jsou klonálního typu. Mutace se týká několika genů, obvykle 4-5, a ty nejsou specifické pro ţádnou chorobu. Teprve aţ jejich nahromaděním vzniká maligní transformace (Adrouny 2002). 20

21 Porozumění genetickému podkladu familiární adenomatózní polypózy a hereditární nepolypózní KRK pomohlo pochopit patologické cesty vzniku mutací u sporadických forem. Rozlišujeme tři aţ čtyři základní molekulární příčiny: nestabilita mikrosatelitů (MSI, microsatellite instability), chromozomální nestabilitu (CIN, chromosomal instability) a CIMP (CpG island methylator phenotype) (Adrouny 2002; Arnold, Goel et al. 2005) (Migliore, Migheli et al. 2011). V některých zdrojích se uvádí čtvrtá cesta, a to globální hypometylace DNA (Pritchard and Grady 2011). Tyto cesty však ještě nejsou všechny přesně identifikovány a je moţné, ţe existuje více moţností. Arnold a kol. hledali u 209 pacientů s KRK aktivaci CIN a MIN, u 14 % KRK byla prokázána nestabilita mikrosatelitů, u 51 % chromozomálně nestabilní dráha, u necelých 4 % se projevily obě dvě, ale u 38 % ani jedna (Arnold, Goel et al. 2005) Nestabilita mikrosatelitů Nestabilita mikrosatelitů (MSI) se vyskytuje asi u 15 aţ 20 % sporadických KRK. MSI bylo Národním institutem pro rakovinu definováno jako porucha nejméně 30 % míst z 5-10 definovaných, bez změny karyotypu (Boland, Thibodeau et al. 1998). Pouţívá se panel 5 mononukleotidových markerů (BAT 25, BAT 26, NR 21, NR 24, MONO 27) (Bacher, Flanagan et al. 2004). Ukázalo se, ţe pacienti s MSI mají lepší prognózu neţ pacienti s tumorem vzniklým na základě CIN (Walther, Houlston et al. 2008). Pod MSI patří i mechanismus při poruše MMR genů. Dochází k defektu,,mismatch a vzniklé mutace jsou přenášeny do dalších generací, coţ můţe vést ke vzniku tumoru. (Lengauer, Kinzler et al. 1998). Porucha těchto genů se vyskytuje aţ u 90 % HNPCC. V současné době bylo identifikováno 5 MMR genů: MSH2, MLH1, PMS1, PMS2 a HMS % pacientů s HNPCC má mutaci v genu MSH2, 30 % v MLH1 a mutace ostatních genů se vyskytují jen vzácně (Adrouny 2002). K rozlišení sporadické formy od Lynchova syndromu slouţí v tomto případě přítomnost mutace BRAF, která je typická pro sporadické karcinomy. Vylučuje tedy moţnost Lynchova syndromu (Wang, Cunningham et al. 2003). 21

22 Chromosomální nestabilita Chromosomální nestabilita (CIN) se vyskytuje asi u 85 % sporadických forem KRK. Projevuje se buď výskytem aneuploidií, polyploidií, delecemi chromozomů nebo jejich ramének, anebo ztrátou heterozygozity. Existují dva obecné mechanismy odpovědné za změny v chromozomech. Jedním z nich je chyba v segregaci, pak vznikají aneuploidie po ztrátě či zisku chromozomů. Druhým mechanismem jsou pak poruchy ve strukturálním uspořádání: nesymetrické translokace, delece atd., vyúsťující ve ztráty či zisky částí chromozomů (Lengauer, Kinzler et al. 1997). Dle několika studií je CIN spojován s horším průběhem nemoci. (Walther, Houlston et al. 2008) (Popat and Houlston 2005). Obr. 6 Model karcinogeneze dle Fearona a Vogelsteina (Mináriková 2005) V roce 1990 Fearon s Vogelsteinem představili model formace sporadického karcinomu (Fearon and Vogelstein 1990). Ten vychází z předpokladu, ţe tumor vzniká z adenomových polypů mutací několika genů (Obr. 6). Avšak od představení prvního modelu došlo díky pokroku v odhalení jednotlivých kroků molekulární patogeneze k několika revizím jejich návrhu (Obr. 7). 22

23 Dle Fearona a Vogelsteina první mutace bývá u APC genu, který je umístěn na dlouhém raménku chromozomu 5 (Adrouny 2002). Jeho funkce spočívá v udrţování struktury a adheze buňky. Při poruše dojde k formaci chromozomálně nestabilního adenomu, coţ vede k dalším genetickým ztrátám. Následkem inaktivace APC můţe například dojít k aktivaci onkogenu c-myc nebo k interakci s adhezivním proteinem β-kateninem. Výsledkem je sníţená adheze buněk, která tvoří ideální podmínky pro náhodný buněčný růst. (Adrouny 2002). Mutace genu APC je přítomna u 70 % pacientů s KRK (Pritchard and Grady 2011). Na chromozomu 12 se vyskytuje další protoonkogen, který je zapojen do formace sporadického karcinomu kolorekta. Je jím K-ras. Jeho produkt se účastní intracelulární signalizace a jeho mutace byla detekována aţ u 60 % KRK (Capella, Cronauer-Mitra et al. 1991). Další mutovaná oblast je na 18. chromozomu v oblasti genu DDC (,,Deleted in KRK ). Posledním krokem podle tohoto modelu je deaktivace tumor supresorového genu p53, regulátoru buněčného cyklu. V případě, ţe protein p53 nalezne významněji poškozenou, neopravenou DNA, zastaví replikaci a navodí buňce apoptózu. Při jeho deaktivaci dochází tedy k proliferaci poškozených buněk. Mutace genu p53 na 17. chromozomu se vyskytuje u 75 % sporadických KRK (Adrouny 2002). Obr. 7 Nové schéma vývoje adenomu v karcinom. V současné době jsou dvě dobře známé a popsané cesty vzniku KRK. Chromozomová nestabilita (CIN) je typická pro vývoj tubulárního adenomu. Sled mutací začíná genem APC a vede k nesprávné regulaci WNT signální dráhy. V tomto případě je častá mutace K-ras onkogenu, ztráta heterozygotnosti chromozomu 18 (18qLOH) a mutace TP53. Naopak nádory vzniklé na základě mikrosatelitové nestability (MSI) vyţadují mutaci v genu BRAF a není zde přítomna mutace 18qLOH a TP53 (Pritchard and Grady 2011). 23

24 Kromě modelu karcinogeneze dle Fearona a Vogelsteina existují další popsané dráhy (Obr. 7), které vedou ke vzniku fenotypu typického pro KRK. Za poslední dobu bylo zjištěno nejméně 80 genů, jejichţ mutace jsou spojené s KRK, ale jen méně neţ 15 z nich je opravdu odpovědná za vlastní karcinogenezi (Leary, Lin et al. 2008). Mimo geny zmíněné výše to jsou například geny spojené s centromerami kódující protein kinázu Aurora A (AURKA) či serin/treonin kinázu (Plk1). Můţe se také jednat o poruchu genů regulujících apoptózu FAS a FASL, dále COX-2, PPAR a další (Migliore, Migheli et al. 2011) (Pino and Chung 2010) CIMP (CpG island methylator phenotype) Epigenetika se týká dědičných změn genové exprese bez změny DNA sekvence. CIMP se vyskytuje asi u 20 % KRK (tabulka 3). Mezi epigenetické mechanismy patří DNA metylace cytosinů v tzv. CpG ostrůvcích posttranslační modifikace histonů nebo mikrorna (Sharma, Kelly et al. 2010), přičemţ u karcinogeneze KRK se nejvíce uplatňuje DNA metylace CpG ostrůvků. Stále není jasný celý proces epigenetických změn, ale jedná se o ţhavé téma současnosti. Je zde určitá asociace mutace BRAF a CIMP KRK, která ukazuje na BRAF jako iniciátora patogeneze metylace (Weisenberger, Siegmund et al. 2006). Hypometylace některých genů je fyziologický proces, který je zesilován stoupajícím věkem. Věk je také jedním z rizikových faktorů podporujících hypometylaci v procesu karcinogeneze (Feinberg 2004). Ukázalo se, ţe tyto změny vytvářejí prostředí pro mutace související s KRK (Worthley, Whitehall et al. 2010). CIMP někteří vědci rozdělují do dvou podskupin. Například Issa a jeho kolegové dle výsledků své studie zařadili do první skupiny CIMP nádory s mikrosatelitovou nestabilitou a mutací BRAF, do druhé uvedli nádory s mutací KRAS, BRAF nebo p53, ale bez mikrosatelitové nestability (Shen, Toyota et al. 2007). V současné době se známé epigenetické změny pouţívají jako biomarkery pro diagnostiku, určení prognózy a terapeutické léčby (Lao and Grady 2011). 24

25 Gene Protein Funkce Účinek ztráty funkce APC Adenomatous polyposis Inhibice signální dráhy coli Wnt Vzrůst Wnt/β-katenin dráhy MLH1 MutL homolog 1 oprava DNA mismatch Mikrosatelitová nestabilita MGMT O-6-metylguanin-DNA Vzrůst frekvence G A Oprava alkylace DNA metyltransferáza mutace RASSF1A Ras asociovaná doména rodiny1 (izoforma A) proapoptická aktivita, stabilizace mikrotubulů, inhibitor RAS Vzrůst RAS/RAF/MAP kinázy signalizace, porucha apoptózy SLC5A8 RUNX3 SFRP1 SFRP2 CDH1 Sodium solute symporter rodiny 5 člen 8 Runt-spojený transkripční faktor 3 Secreted frizzledrelated protein 1 Secreted frizzledrelated protein 2 E-Kadherin CDH13 Kadherin 13 CRABP1 CDKN2A/p 16 HLTF CDKN2A (P14, ARF) Retinol-vázající protein 1 Cyklin-dependentní kináza inhibitor 2A Helikáze podobný transkripční faktor Protein 14 ESR1 Estrogenový receptor 1 TIMP3 CXCL12 ID4 IRF8 Tkáňový inhibitor metaloproteinázy 3 Chemokin (C-X-C) ligand 12 Inhibitor DNA vázající 4 Interferon regulatorní faktor 8 Přenašeč sodíku a krátkých mastných kyselin Transkripční faktor Wnt antagonista Wnt antagonista Na vápníku závislý adhesivní protein Účastní se na buněčném rozpoznávání a adhezi, antiapoptická aktivita přenašeč retinolu Regulace buněčného cyklu dsdna translokáza, ubikvitin ligáza Inhibice E3 ubikvitin ligázy Ligand-aktivující transkripční faktor inhibice MMPs a ADAMs Alfa chemokin transkripční faktor transkripční faktor pokles TGF-β/BMP signalizace Vzrůst Wnt/β-catenin signalizace Vzrůst Wnt/β-catenin signalizace Ztráta buněčné adheze Vzrůst PI3K/Akt/mTOR signalizace, MAPK signalizace Zvýšená proliferace Porucha DNA reparace Pokles p53 stabilizace a aktivace Ztráta estrogenové signalizace Vzrůst EGF receptor signalizace, TNFalfa signalizace Zvýšené metastázováni Interferonová signalizace Tabulka 3 Přehled některých běţně metylovaných a down-regulovaných genů u kolorektálního karcinomu, převzato z (Lao and Grady 2011) Signální dráhy spojené s KRK Různé genetické změny a jejich akumulace vedou k poruše regulačních mechanismů buněčných signálních drah. Ty mají v organismu řídit proliferaci, diferenciaci, apoptózu, angiogenezi a všechny další buněčné mechanismy. 25

26 Nejlépe prostudovanými signálními dráhami, které se týkají kolorektálního karcinomu, jsou dráhy WNT-β kateninu, TGFβ, EGFR mitogen aktivující protein kinázy (MAPK) a fosfatidylinositol 3-kinázy (PI3K). Poznatky získané studiem těchto drah se vyuţívají k rozvoji cílené terapie. Některé léky ovlivňující zmíněné dráhy jsou jiţ klinicky pouţívané a některé jsou zatím součástí klinických studií (Pritchard and Grady 2011) WNT/APC/CTNNB1signální dráha Tato signální dráha začíná navázáním Wnt ligandů na transmembránové receptory Frizzled a jejich kofaktory. Tímto se zahájí fosforylace a sekvestrace komplexu proteinů APC, kasein kinázy 1, glykogen syntáza-kinázy 3 a axinu. Po inhibici těchto proteinů dojde k stabilizaci β-katenin genu (CTNNB1) a kumulaci β- kateninu v cytoplazmě v nefosforylované formě. Vstupuje do jádra, kde interaguje s transkripčními faktory, které ovlivňují buněčný růst a diferenciaci. Funkcí APC je tedy negativní regulace Wnt signální dráhy vázáním na β-katenin a aktivací ubikvitinem regulované degradace. Porucha APC vede k vyšší činnosti Wnt signální dráhy díky stabilizaci β-kateninu (Barker and Clevers 2006). V současné době zatím neexistuje lék cílený na tuto signální dráhu ani na APC ani na β-katenin. Nenašlo se uplatnění této dráhy v diagnostice ani jako diagnostický faktor (Pritchard and Grady 2011) TGFβ (transformující růstový faktor beta) signální dráha TGFβ se povaţuje za tumor supresorovou signální dráhu. Mutacemi v receptorových genech TGFBR2 a TGFBR1, v post receptorových genech SMAD2 a SMAD4 a v rodině TGFβ genů dochází k inaktivaci této dráhy. Mutace těchto genů jsou celkem časté, například TGFRB2 je pozměněn u více neţ 30 % KRK pacientů a nejvíce se vyskytuje u nádorů s mikrosatelitovou nestabilitou. Prozatím se tyto geny nevyuţívají ke klinickým účelům. Nicméně SMAD4 se vyskytuje u více neţ 50 % tumorů a zdá se, ţe je spojený s výskytem metastáz v lymfatických uzlinách, a jeví se také jako prognostický marker pro léčbu 5-fluorouracilem. Nadějným prediktivním markerem se zdá i 18qLOH (ztráta heterozygozity LOH) Tato cytogenetická alterace se objevuje u 70 % KRK a hlavní roli v jejím vzniku hrají DCC a SMAD4 geny. Bylo vypozorováno spojení s horší prognózou, v současné době na toto téma probíhají klinické studie (Pritchard and Grady 2011). 26

27 Signální dráha epidermálního růstového faktoru (EGFR) Receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR) je členem rodiny receptorů s tyrosinkinázovou aktivitou. Skládá se z intracelulární domény, která nese enzymovou aktivitu. Transmembránově je uloţena lipofilní část a extracelulárně leţí ligand-vázající doména. Jedním z ligandů můţe být transformující růstový faktor TGFα, aktivátor DNA syntézy a buněčného růstu v nádorové tkáni. Navázání takovéhoto ligandu na EGFR spouští sled událostí, jejichţ výsledkem je buňka chráněná před apoptózou, inhibující opravy DNA a podporující angiogenezi (Arteaga 2002). Hlavní aktivovaná dráha je Ras /Raf /MAPK. Postupně dojde aţ k fosforylaci ERK1 a ERK2. Tyto MAP kinázy mohou regulovat transkripci molekul zapojených do buněčného přeţívání a proliferace (Mendelsohn and Baselga 2003). Obr. 8 Schéma EGFR signalizace a místa účinku protirakovinných léků (Merla and Goel 2012). 27

28 Jedním z nejčastějších mutovaných genů u všech rakovin je gen KRAS, je to také nejdůleţitější onkogen u kolorektálního karcinomu. KRAS protein, člen Ras rodiny, je ligandem EGFR. Kras aktivuje MAPK přes BRAF a podporuje tak buněčný růst a přeţití buňky. Mutace KRAS ve 12. nebo 13. kodonu je přítomna u 40 % KRK a mutace genu BRAF asi u 15 % pacientů s KRK. Právě mutace jednoho z těchto dvou genů přispívá ke karcinogenezi vyvolanou Ras/Raf/MAPK signální dráhou (Pritchard and Grady 2011). Význam EGFR v procesu karcinogeneze jej předurčilo jako vhodný cíl pro vývoj protirakovinných léčiv (Obr. 8). Vyuţití zde našly například protilátky proti EGFR, bohuţel ne všichni pacienti reagují na léčbu. Reakce pacienta na léčivo závisí na několika faktorech: aktivaci EGFR, nepřítomnosti KRAS mutace a dalších (Spano, Milano et al. 2008). Tato tématika bude rozebrána v kapitole o léčbě. Další dráhou, která můţe být spuštěna přes EGRF, je dráha PI3K a protein serinová treoninkináza Akt. Signály, vytvořené aktivací této cesty, ovlivňují růst buňky, její proliferaci a přeţití (Mendelsohn and Baselga 2003). PI3K- Akt dráha je inhibována tumor supresorovým proteinem PTEN, mutací jeho genu dochází k aktivaci dráhy a tumorové progresi (Merla and Goel 2012). Mutace v PI3K signální dráze jsou přítomny asi u 40 % KRK, nejčastěji v katalytickém místě p110α PI3KCA a právě v genu PTEN. PI3K dráha je ovlivňována EGFR signalizací přes KRAS aktivaci, a proto se uvaţuje o uţití těchto dvou mutací jako prediktivní markery anti- EGFR léčby (Pritchard and Grady 2011). Přes EGFR můţe být také nastartována cesta JAK/STAT nebo stresem aktivovaná protein kinázová dráha (Mendelsohn and Baselga 2003). 28

29 5.7. DIAGNOSTIKA Důleţitou roli hraje správné stanovení osobní a rodinné anamnézy. Na prvním místě při podezření na kolorektální karcinom je palpace břicha a vyšetření per rectum. V algoritmu vyšetření dále stojí zobrazovací metody a laboratorní diagnostika vč. stanovení okultního krvácení do stolice (Obr. 9) (Adam 2002). Obr. 9. Diferenciální schéma diagnostiky kolorektálního karcinomu Screening kolorektálního karcinomu Screening populace se provádí s cílem detekce tumoru v časném stádiu, cílem je zajistit včasnou léčbu, která je méně radikální a sníţit tak mortalitu. V současné době probíhá v České Republice screening třech nádorových malignit. V roce 2002 se rozjel projet pro včasný záchyt rakoviny prsu, od roku 2008 probíhá screening nádorů hrdla děloţního a od roku 2009 také program pro kolorektální karcinom. Na screening má právo kaţdá asymptomatická osoba nad 50 let. Osoby s pozitivní osobní či rodinnou anamnézou se do tohoto procesu nepočítají, patří do jiných speciálních programů dle stupně jejich rizika. Kolorektální screening zahrnuje pravidelné testy okultního krvácení do stolice (TOKS) a kolonoskopii. 29

30 Screening probíhá ve dvou fázích. Ve věku od 50 do 54 let by měl kaţdý jedinec podstoupit jednou za rok TOKS. Lidé starší věku 54 let mohou v tomto pokračovat nebo mohou podstoupit jednou za deset let primární screeningovou kolonoskopii (Dušek 2013). Jiný screening probíhá u vysoko rizikových skupin, kam řadíme všechny pacienty s polypózami, osoby s Lynchovým syndromem, blízké příbuzné pacientů s KRK, pacienty se střevními záněty a pacienty s KRK po léčbě. U jednotlivých stavů se postupuje individuálně, rizikoví pacienti jsou hlídání od niţšího věku, odborníci se opírají o genetický screening, opakované kolonoskopie a TOKS (Holubec 2004) Laboratorní diagnostika Laboratorní diagnostika zahrnuje klasické biochemické vyšetření krve, moči a stanovení nádorových markerů. V brzkých stádiích bývá málokdy biochemický nález pozměněn. Růst nádoru se projeví urychlenou sedimentací erytrocytů, zvýšeným CRP, zmnoţením α-globulinů, mukoproteinů, také se můţe vyvinout anémie (Holubec 2004). Stanovení nádorových markerů bývá doplňkovým terapeutickým postupem, protoţe v současné době neexistuje ideální marker a v klinické interpretaci je nutná spolupráce klinika s laboratoří. První volbou je stanovení karcinoembryonálního antigenu (CEA) a CA CEA je sérový glykoprotein. Účastní se intercelulární adheze a umoţňuje agregaci nádorových buněk kolorektálního tumoru (Benchimol, Fuks et al. 1989). Jedná se o produkt nádorových buněk střeva, prsu a jater, bývá také zvýšený u chronických onemocnění jater. U kuřáků bývá zvýšená hladina, ale hodnoty by neměly přesahovat 5mg/l (Ilantzis, DeMarte et al. 2002). Hladina CEA před operací koreluje s velikostí primárního nádoru a stupněm postiţení uzlin. Ukázalo se, ţe CEA je dobrým prognostickým ukazatelem po chirurgické léčbě. Při úspěchu by se hladiny CEA během 4-6 týdnů měly vrátit do normálu (Fletcher 1986). Proto se pouţívá sledování hladin tohoto markeru ke kontrole účinnosti terapie. (Holubec 2004). Tumorový marker CA 19-9 patří do skupiny glycidových antigenů, je produkovaný adenokarcinomy pankreatu, ţaludku, močového měchýře a střeva. Pro KRK je méně citlivý neţ CEA, ale výrazně koreluje s výskytem vzdálených metastáz. Optimální je proto kombinace těchto dvou markerů (Gupta, Arciaga et al. 1985) (Holubec 2004). 30

31 5.7.3 Genetická diagnostika Pouţití genetické diagnostiky není zatím rutinně pouţívaná věc, ale uplatňuje se například u hereditárních forem KRK. Familiárně se vyskytuje asi 1/5 KRK a důleţitou roli pro indikaci genetického vyšetření zde hraje rodinná anamnéza. Při podezření na familiární adenomatózní polypózu se stanoví rodokmen a můţe se potvrdit sekvenační analýzou APC genu, kdy hledáme patologické mutace. K detekci přeskupení genů, delecí a jiných změn slouţí southern blott (Arnold, Goel et al. 2005). Jedním z postupů jak určit diagnózu Lynchova syndromu je splnění tzv. Amsterodamských kritérií. Jedná se o 3 podmínky, kdy při jejich splnění se pacient posílá na genetické vyšetření. Tyto kritéria zahrnují výskyt alespoň jednoho nemocného s KRK v rodině diagnostikovaného do 50 let. Musí být postiţeny nejméně dvě po sobě jdoucí generace. V rodině musí být alespoň 3 příbuzní s histologicky potvrzenou diagnózou KRK, přičemţ jeden z nich je příbuzným prvního stupně těch dvou (Holubec 2004). Molekulární diagnostika zahrnuje analýzu MMR genů MLH1, MSH2, hhmsh6 a PMS2 pomocí PCR a následně denaturační gradientové gelové elektroforézy (Holubec 2004). Toto vyšetření je však značně nákladné a proto byly navrţeny série testů zaloţených na molekulární patologii KRK. Nejdříve se vyšetří tumorová tkáň na ztrátu produktů MMR genů (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) pomocí imunohistochemie a pomocí PCR se zjistí výskyt MSI (Baudhuin, Burgart et al. 2005). Pokud se zjistí přítomnost MSI a ztráta produktu MMR genů, pokračuje se v testování na výskyt mutace BRAF V600E a hypermetylace promotoru MLH1, abychom od sebe odlišili sporadický tumor (BRAF mutace u 50 %, metylace u 99 %) od Lynchova syndromu (bez BRAF mutace, málo častá metylace) (Baudhuin, Burgart et al. 2005; Bettstetter, Dechant et al. 2007). U Lynchova syndromu je důleţité včasné odhalení tohoto onemocnění. Pacienti a jejich rodinní příslušníci jsou pak zařazeni do speciálního programu prevence (Pritchard and Grady 2011). Poslední dobou se studie o kolorektálním karcinomu zabývají prognostickým významem mutací KRAS, BRAF a PIK3CA (Richman, Seymour et al. 2009) (Ogino, Nosho et al. 2009). Pokud se u vyvinutého kolorektálního karcinomu identifikuje mutace v genech KRAS a BRAF, zjistilo se, ţe tyto nádory mají pak horší průběh a celkové přeţití je niţší (Richman, Seymour et al. 2009). Jelikoţ je známo, ţe mutace 31

32 KRAS se vyskytuje u mnoha nádorů, stanovuje se pro posouzení nároků léčby cetuximabem nebo panitumumabem. A do budoucna se bude do klinického vyuţití zavádět také prognostický marker mutace KRAS (Pritchard and Grady 2011). Dříve se mutace detekovala pomocí sekvenování, ale tato metoda měla nedostatečnou sensitivitu. Uplatnění v detekci KRAS mutace našla RFLP PCR s denaturační gradientovou elektroforézou a ARMS PCR (Shor and Jothy 2009) Radiodiagnostika V současné době je tato metoda vytlačena rozvojem endoskopie. Radiodiagnostické metody zachycují tlusté střevo vcelku, mohou detekovat některé poruchy motility, polohy a fixace. Patří sem konvenční radiodiagnostika - irigoskopie s metodou dvojího kontrastu. Provádí se, pokud nelze pouţít kolonoskopii, například při obtíţných anatomických poměrech. Vyšetření probíhá při podání baryové suspenze a insuflaci vzduchu. Mezi další radiodiagnostické metody pouţívané k diagnostice KRK patří ultrasonografické vyšetření, počítačová tomografie a magnetická rezonance. Tyto metody slouţí hlavně k detekci metastatického procesu především v játrech a retroperitoneálních uzlinách (Holubec 2004) Endoskopie Endoskopická vyšetření (rektoskopie, sigmoideoskopie, kolonoskopie) jsou rozšířenou technikou diagnostiky rakoviny kolorekta, ale i jiných onemocnění této oblasti. První volbou bývá kolonoskopie. Umoţňuje snesení polypů nebo vzorků z neidentifikovaných tkání a jejich následné histologické vyšetření. Výhodou je moţnost okamţitého odstranění polypů metodou polypektomie, coţ prokazatelně sniţuje incidenci KRK. Lze pouţít i ultrazvukovou sondu zavedenou kanálem endoskopu (Adam 2002). Jako alternativa nepříjemné kolonoskopie se zdá virtuální endoskopie tlustého střeva pomocí spirální počítačové tomografie. Touto metodou lze vytvořit rekonstrukci střeva a odhalit nádory, ale je zde riziko falešné pozitivity (hlen, výkaly) (Holubec 2004). 32

33 5.7.6 Endosonografie rekta Jedná se o důleţitou metodu, která pomáhá určit staging karcinomu rekta před operací. Spolu s magnetickou rezonancí patří k nejlepším metodám zobrazení rekta. Lze stanovit rozsah infiltrace ve stěně rekta a také stav regionálních uzlin (Adam 2002; Holubec 2004) LÉČBA Léčba kolorektálního karcinomu zahrnuje několik pouţívaných postupů, mezi které patří chirurgické řešení, radioterapie, chemoterapie a v neposlední řadě také rozvíjená cílená terapie (Prakash and Porwal 2012) Chirurgická léčba Chirurgická léčba bývá často pouţívaná v prvních stádiích kolorektálního karcinomu. Existuje několik chirurgických technik, které se volí podle rozsahu a umístění tumoru. Pokud se nádor týká střeva, provádí se otevřená kolektomie (hemikolektomie), kdy dochází k odstranění postiţené části střeva a blízkých lymfatických uzlin. Můţe se provádět laparoskopicky. Povrchové karcinomy a polypy se odstraňují polypektomií, nedochází tady k otevření pacienta, ale provádí se pomocí kolonoskopie. Přístup přes anální otvor se také uplatňuje při transanální resekci a transanální endoskopické mikrooperaci. U karcinomu rekta se podle místa postiţení volí různé typy resekce (Nelson, Petrelli et al. 2001) Chemoterapie I přesto, ţe se podaří chirurgicky odstranit nádor u 75 % pacientů s KRK, stále dochází u poloviny z nich k vývoji generalizovaného onemocnění. Proto se pouţívá adjuvantní chemoterapie ke zničení latentní nádorové populace a zamezení vývoje metastáz. Standardní postup u kolorektálního karcinomu je podávání 5-fluorouracilu (5- FU) a leukovorinu u pacientů ve III. klinickém stádiu (T2-T4, N1-N2 M0). 5-FU se pouţívá od roku 1957 k léčbě zejména nádorů trávicího traktu. V organizmu se rychle metabolizuje v játrech, poločas rozpadu je 10 aţ 25 minut. (Holubec 2004). Transformuje se na 5-fluoro-deoxyuridin monofosfát (5-FdUMP) a blokuje metylaci kyseliny deoxyuridilové na kyselinu thymidylovou. Inhibuje tak syntézu DNA 33

34 a způsobuje začlenění 5-FdUMP do RNA. Působí tedy v S fázi buněčného cyklu (SUKL). Ukázalo se však, ţe tato léčba je neefektní u MSI nádorů (Ribic, Sargent et al. 2003). 5-FU totiţ ke své cytotoxicitě potřebuje funkční MMR systém. Tento typ nádoru lépe odpovídá na adjuvantní irinotekanovou léčbu (Fallik, Borrini et al. 2003). Také ztráta 18q je spojována s neúčinností adjuvantní chemoterapie na bázi 5-FU (Watanabe, Wu et al. 2001). Mezi další pouţívaná léčiva patří tedy irinotekan. Jedná se o inhibitor topoizomerázy a její vysoká exprese předpovídá rezistenci nádoru na tento lék (Braun, Richman et al. 2008). K novějším lékům u kolorektálního karcinomu patří raltitrexed, oxaliplatina a capecitabin (Holubec 2004) Radioterapie Radioterapie se pouţívá samostatně nebo v kombinaci s chemoterapií, předoperačně i pooperačně a slouţí k redukci počtu lokálních recidiv u pacientů ve II. a III. stádiu. Uplatňuje se aplikace 5-fluorouracilu s ozářením pánve dávkou do 50 Gy vysokoenergetickým svazkem brzdného či gama záření (Holubec 2004) Cílená terapie Cílené terapie v onkologii napadá specifický molekulární cíl, který je součástí patogenetického mechanismu zodpovědného za karcinogenezi. V 80. letech byl vytvořen in vitro model tumoru ke studiu molekulární biologie nádoru a ke zkoumání nových terapeutických strategií. Cílem je pochopit patogenetický mechanismus onkogeneze, všechny aktivované signální dráhy zapojené do maligní transformace. K pochopení mechanismů také pomohlo zmapování lidského genomu a v roce 2001 se zavedl do klinické praxe první cílený lék imanitib proti myeloidní leukémii následovaný dalšími léčivy (Giaccone and Soria 2007). Cílená terapie se uplatňuje také v léčbě kolorektálního karcinomu (tabulka 4). Uplatňuje se zde nejvíce signální dráha EGFR aktivující zejména Ras/Raf/MAPK a PI3K-Akt (Merla and Goel 2012). EGFR dráha se fyziologicky účastní udrţování střevní homeostázy. Avšak její hyperaktivace byla nalezena u několika typů zhoubných nádorů. Ukázalo se ţe EGFR má vlastnosti podporující hypotézu pouţití EGFR jako cíle terapie. Vznikly tedy anti- EGFR léky, které byly schváleny pro léčbu metastatické nemalobuněčné rakoviny plic, 34

35 kolorektálního karcinomu, nádorů hlavy a krku a rakoviny pankreatu (Vecchione, Jacobs et al. 2011). K anti-egfr léčbě se uţívají buď inhibitory tyrosin kinázy (TKIs) anebo monoklonální protilátky. Alternativně je ve vývoji cílení na EGFR mrna pomocí antisense nukleotidů nebo ribozomů se zamezuje translaci EGRF. Další variantou je pouţití intracelulárních protilátek, které by zabránily migraci receptorů na povrch buňky (Spano, Milano et al. 2008). Mezi TKI patří gefinitib a erlotinib. Principem jejich působení je zablokování ATP kapsy katalytické intracelulární domény receptoru. Znemoţní tak fosforylaci a přenos signálu v EGFR kaskádě. Dráha Specifický cíl Lék EGF/MAPK PI3K WNT EGFR (mab) EGFR (TKI) KRAS BRAF MEK PI3K mtor AKT Cetuximab, Panitumumab Erlotinib, Gefitinib Tipifarnib, Lonafarnib Sorafenib, PLX4032, XL281 Selumetinib BKM120, BGT226, XL147, GDC-0941 Everolimus, XL765 Perifosine Resveratrol TGFβ TGFβ2 AP VEGF Bevacizumab VEGF Vatalanib, AMG706, Pazopanib, VEGFR Cediranib HGF HGF mab AMG102 IGF IGF-1 mab AMG479, IMC-A12 Tabulka 4 Přehled léku v klinickém uţití nebo v klinických testech a dráhy, které ovlivňují. Mezi monoklonální protilátky anti- EGFR patří cetuximab (Erbitux, chimerický IgG1) a panitumumab (ABX-EGF nebo Abgenix, plně lidský IgG2). Jsou cílené proti extracelulární doméně receptoru, navázáním na receptor zabrání dimerizaci, fosforylaci a následnému přenosu signálu (Vecchione, Jacobs et al. 2011). Cetuximab nebo panitumumab je indikován pacientům ve IV. stádiu KRK v kombinaci s irinotekanem, s jiným chemoterapeutikem (5-FU, FOLFOX4 -fluorouracil, leucovorin a oxaliplatin, FOLFIRI - fluorouracil, leucovorin a irinotekan) anebo sám (Shor and 35

36 Jothy 2009). Nejlépe na léčbu odpovídají pacienti s wild-type alelou genů KRAS, BRAF a PI3K a s expresí fosfatázy a PTEN proteinu. Bohuţel se totiţ ukázalo, ţe pacienti s mutací v genu KRAS jsou rezistentní k léčbě cetuximabem (Lievre, Bachet et al. 2008). Mutací dochází k aktivaci dráhy Ras/Raf/MAPK a inhibice receptoru je zde neefektivní. Také mutace BRAF a PTEN vedou k rezistenci pacienta na cetuximab a panitumumab (Di Nicolantonio, Martini et al. 2008) (Frattini, Saletti et al. 2007). Biomarker KRAS kodon 12/13 mutatace KRAS kodon 61/117/146 mutace BRAF V600E mutace Frekvence mutace 40 % 1 % 10 % PIK3CAmutace 20 % ztráta PTEN 30 % MSI 15 % 18qLOH/ztráta SMAD4 50 % Nízká Topo I. 50 % Vztah k léku Důkaz Status Předpovídá rezistenci k anti-egfr terapii Pravděpodobně předpovídá rezistenci k anti-egfr terapii Pravděpodobně předpovídá rezistenci k anti-egfr terapii Můţe předpovídat rezistenci k anti-egfr terapii Můţe předpovídat rezistenci k anti-egfr terapii Můţe předpovídat nepříznivý výsledek léčby 5-FU a lepší výsledek irinotekanu Můţe předpovídat rezistenci k 5-FU Můţe předvídat rezistenci k irinotekanu silný střední střední omezený omezený střední střední omezený validovaný, pouţívá se v klinice pouţívá se v klinice, není plně validovaný pouţívá se v klinice, není plně validovaný nepouţívá se nepouţívá se zatím se nepouţívá nepouţívá se nepouţívá se Tabulka 5 Přehled moţných biomarkerů a prediktorů léčby u kolorektálního karcinomu, převzato z (Pritchard and Grady 2011). Tři na sobě nezávislé studie potvrdily neúčinnost cílené anti-egfr terapie u pacientů s mutací genu KRAS. Studie OPUS (oxaliplatin a cetuximab) (Bokemeyer, Bondarenko et al. 2009), CRYSTAL (Cetuximab v kombinaci s irinotekanem) (Van Cutsem, Kohne et al. 2009) a PRIME (panitumumab v kombinaci s chemoterapií pro metastatický KRK) (Douillard, Siena et al. 2010) potvrdily účinnost cetuximabu a panitumumabu pouze u wild-type KRAS. Tyto poznatky vedly ke zkoumání dalších 36

37 mutací v EGFR cestě a jejich souvislostí s resistencí na léčbu monoklonálními protilátkami. Bylo zjištěno, ţe mutace BRAF a p110 katalytické podjednotky PI3K působí stejně jako mutace KRAS rezistenci nádoru proti této léčbě. Jelikoţ se tyto mutace vyskytují v nádorech společně, je těţké přesně definovat jejich roli v tomto procesu (Vecchione, Jacobs et al. 2011). Další moţné biomarkery najdeme v tabulce Přehled nových léků ve fázi klinického vývoje Jelikoţ dosavadní léky mají pouze omezené pole působnosti a jsou neefektivní v několika příkladech (mutace KRAS apod.), pracuje se neustále na hledání nových léčiv, která by zaplnila chybějící místa ve farmakologické terapii kolorektálního karcinomu. a) INHIBITORY EGFR/ LÉKY PŮSOBÍCÍ NA EXTRACELULÁRNÍ DOMÉNU Jedním z těchto kandidátů je BIBW 2992/Afatinib, selektivní inhibitor EGFR a HE2. Patří mezi druhou generaci TKI a ukázal dobré výsledky při léčbě nemalobuněčného karcinomu plic. V současné době probíhá klinická studie na pacientech s metastatickým KRK. Lidský IgG1 proti EGFR zvaný necitumumab/imc-11f8 je další zkoumaný lék ve 3. fázi klinické studie v kombinaci s FOLFOX-6. b) LÉKY V 1. FÁZI VÝZKUMU UČINKUJÍCÍ NA EGFR Zalutumumab je monoklonální protilátka proti EGFR, která zatím prokazuje dobré výsledky v testech u pacientů s karcinomem hlavy a krku. Probíhá také testování zalutumumabu v kombinaci s irinotekanem u pacientů s metastazujícím KRK. Dalším zkoušeným lékem je inhibitor EGFR-TKI a HER2. Mimo pokusy s léčbou KRK se také hodnotí jeho účinnost u rakoviny prsu. Nimotuzumab je lidská monoklonální protilátka testovaná v Číně v kombinaci s irinotekanem u metastazujícího KRK bez mutace v genu KRAS. c) INHIBITORY RAS/RAF/MAPK DRÁHY V klinickém pokusu je několik látek cílených na inhibici některé z komponent Ras/Raf/MAPK signální dráhy. Jsou důleţité převáţně díky časté 37

38 mutaci v genech BRAF a RAS, které podmiňují resistenci vůči cetuximabu. Jeden takový inhibitor RAF je látka zvaná BMS U pacientů s KRAS mutací se testuje další látka, MSC B. Jedná se o MEK inhibitor a zkouší se jeho účinnost v kombinaci s FOLFORI. Inhibitor MEK1/MEK2 selumetinib se testuje u KRK, melanomu a hepatocelulárního karcinomu. Látka PLX 4032/vemurafenib je inhibitor V600E mutace BRAF kinázy. Několik studií ukázalo slibné účinky u maligního melanomu a zkouší se také u pacientů s KRK, kteří mají také tuto BRAF mutaci. Dalším inhibitorem této Ras/Raf/MAPK dráhy je Sorafenib, v současnosti pouţívaný při léčbě rakoviny ledvin a ve výzkumu mnoha tumorů, mezi nimi i KRK. d) INHIBITORY PI3K AKT Mezi inhibitory této cesty patří MK-2206, coţ je současně inhibitor Akt i RAS/MAPK dráhy. Everolimus je léčivo uţívané při terapii karcinomu ledvin a testuje se i pro léčbu metastatického KRK, kterým selhala léčba cetuximabem a panitumumabem (Merla and Goel 2012). 38

39 5.9. CYTOCHROM P450 Výskyt kolorektálního karcinomu je ovlivněn i exogenními faktory. Významnou roli hrají cytochromy P450 (CYP), enzymy, které mohou aktivovat prokarcinogeny spojené s KRK (Gervasini, de Murillo et al. 2010). Cytochromy P450 se účastní metabolismu dvou třetin klinicky uţívaných léků. Jedná se o monooxygenázy a mimo léčiva oxidují i další endogenní sloučeniny, mastné kyseliny, vitamíny, steroidy, ale také environmentální polutanty a karcinogeny (Hanzawa, Sasaki et al. 2008) (Li, Tang et al. 2009). Polymorfismus těchto enzymů často ovlivňuje reakci organismu na léčivo. CYP mohou být léčivy inhibovány nebo naopak indukovány. Dochází k významným interakcím vedoucím k neţádoucím účinkům nebo k selhání léčby. Doposud je známo u člověka 57 CYP enzymů. Mezi hlavní patří CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9 a CYP 2C19. Funkce některých CYP enzymů je prozatím nejasná, jsou nazývány tzv.,,orphan cytochromy (Stark and Guengerich 2007). CYP rodina patří k hemovým enzymům a vyskytuje se zejména v endoplazmatickém retikulu jater. Byl ovšem zaznamenán i jejich výskyt mimo játra a to v respiračním a trávicím traktu. Mimojaterní výskyt a další pozitivní vlastnosti, jako je jejich schopnost aktivace i inaktivace protirakovinných léčiv, je nominoval na potenciální cíl terapie (Hanzawa, Sasaki et al. 2008). Jednou z moţností je pouţití při gene-directed enzyme prodrug therapy (GDEPT), kdy je cílem vpravit gen enzymu do nádorové tkáně. Produkovaný enzym je zde pak schopen selektivně přeměnit neškodnou látku v cytotoxickou (Yakkundi, McErlane et al. 2006). Například vloţení CYP2B6 do buněk 9L gliosarkomu, který následně mění prodrug cyklofosfamid v cytotoxický metabolit, který ničí zejména nádorovou tkáň v játrech. Několik CYP se totiţ exprimuje ve vyšší míře u některých karcinomů, např. CYP4Z1 je zvýšen u rakoviny prsu (Rieger, Ebner et al. 2004). Tento efekt byl také nalezen u KRK. Lze zde najít vyšší hladiny CYP2W1, CYP1B1, CYP2S1, CYP2U1, CYP3A5 a CYP51 (Kumarakulasingham, Rooney et al. 2005). 39

40 Obr. 10 Schéma metabolismu xenobiotik za účasti enzymů metabolizujících xenobiotika (XME). Celý proces se většinou skládá ze dvou fází. V I. fázi, dochází k funkcionalizaci pomocí oxidace ze % zprostředkovanou CYP enzymy ze skupiny 1,2,3 a 4. Můţe docházet jak k deaktivaci, tak k další aktivaci xenobiotika. Ve II. fázi dochází ke konjugaci s látkami, jako je například glukoronid, acetát, metyl, sulfát, glycin a další. Cílem je získat hydrofilní produkt, který by byl snáz vyloučen a proces detoxikace by tak byl zakončen. Xenobiotika reagují s receptory XME a regulují tak expresi XME genů. Obr. převzat z (Nebert and Dalton 2006) Cytochrom P450 a jeho role v karcinogenezi Cytochromy P450 mohou být do procesu karcinogeneze zapojeny několika způsoby. Například díky jejich hlavnímu úkolu detoxikaci. Při přeměně xenobiotika na konjugovaný hydrofilní produkt můţe vznikat řada reaktivních intermediátů. Tyto se pak mohou vázat na nukleové kyseliny a jiné molekuly a způsobit tak poškození DNA, bílkovin i lipidů (Obr. 10). Poškozená DNA dál způsobuje dysregulaci řídících signálů a ústí aţ v hypermutabilitu, nestabilitu genomu a iniciaci tvorby tumoru. Exprese genů kódujících CYP můţe ovlivnit metabolismus kyseliny arachidonové a zasahovat do signálních drah jejích produktů. Můţe tak vyvolat zánět, který se můţe stát iniciálním krokem tumorgeneze. Zapojení různých členů rodiny P450 do procesu karcinogeneze závisí do jisté míry na variantách genů pro tyto enzymy i genů zapojených do určitých signálních drah (Nebert and Dalton 2006). Vědci se snaţí pochopit princip zapojení CYP do procesu karcinogeneze a zjistit asociaci mezi jejich aktivitou a mírou rizika vzniku rakoviny jiţ od 70. let minulého století (Kouri, McKinney et al. 1982). Ţivotní styl, kouření, sloţení stravy, alkohol, to vše jsou faktory, které mohou reagovat s genetickými faktory. Kaţdý jedinec nese jiné 40

41 riziko na jiné onemocnění. Díky pokrokům v molekulární biologii se ví, ţe metabolismus xenobiotik je ovlivňován některými variabilitami v genech genů kódujících xenobiotika metabolizující enzymy. Mnoho studií se zabývá právě mírou asociace rizika rakoviny a přítomností polymorfismů (Kiyohara 2000). Prvotní informace byly odhaleny při pozorování závislosti mezi zvýšenou aktivitou benz(a)pyren hydroxylázy (CYP1A1) u kuřáků a vyšším výskytem rakoviny plic (Kouri, McKinney et al. 1982). U stejného typu rakoviny, tedy u karcinomu plic, se také dokázala souvislost mezi fenotypem CYP2D6 a zvýšeným rizikem rakoviny. Tento enzym má dosud přes 80 známých alel, které ústí do 4 fenotypů. Kaţdá tato varianta je zodpovědná za rozdílný metabolismus léků. Fenotyp nazvaný pomalý metabolizátor (poor metabolizer, PM), vykazuje sníţený metabolismus léků, a proto vyţaduje niţší dávky léčiva, aby se předešlo intoxikaci organismu (Teh and Bertilsson 2012). Genetický polymorfismus genu CYP1A1 je spojen s vyšším rizikem rakoviny prostaty (Ding, Xu et al. 2013), rakoviny plic (Ji, Wang et al. 2012), rakoviny kolorekta (Jin, Hu et al. 2011) i hlavy a krku (Liu, Wu et al. 2013). Variantní alely spojeny s vyšší náchylností k rakovině mají i další geny jako například CYP1B1, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4, CYP2A6 a CYP2B6. Díky epidemiologickým studiím je známá asociace mezi rozdílnými fenotypy-genotypy CYP1, CYP2, CYP3, CYP4 a určitým typem rakoviny vyvinutým na základě vystavení environmentálních faktorů. Avšak přesné karcinogenní látky a mechanismy nejsou dosud známy (Nebert and Dalton 2006). Většina prokarcinogenních xenobiotik patří k velmi hydrofobním látkám (arylaminy, alkyl-aminy, heterocyklické aminy, polyhalogenované aromatické uhlovodíky, polycyklické aromatické uhlovodíky). Jsou pak vylučovány za účasti enzymů patřících do skupiny CYP1, zejména CYP1A1, CYP1A2 a CYP1B1 (Nebert, Dalton et al. 2004). Polyhalogenované aromatické uhlovodíky mohou ovlivňovat CYP1 geny. Mají vysokou afinitu k arylovaným uhlovodíkovým receptorům. Pomocí nich dochází pak ke zvýšené expresi CYP1 genů, mohou dále reagovat i s jinými transkripčními faktory a ovlivňovat tak geny zapojené do buněčného cyklu a apoptózy (Nebert and Dalton 2006). Genetický polymorfismus CYP genů můţe být také zapojen do odlišností v léčbě. Příkladem můţeme uvést karcinom prsu a jeho léčbu tamoxifenem. Tento lék je v těle metabolizován CYP2D6 na účinnou látku endoxifen. Ukázalo se však, ţe polymorfismus CYP2D6 ovlivňuje farmakokinetiku tamoxifenu (jeho aktivaci na účinný endoxifen) a u 5 aţ 7 % populace způsobuje niţší účinek tohoto léku a horší 41

42 výsledek u léčby pacientek. Proto se v současné době zavádí CYP2D6 genotypizace k zajištění účinnosti léčby (Vianna-Jorge, Festa-Vasconcellos et al. 2012) (Walko and McLeod 2012) Vyuţití CYP v protirakovinné terapii Tkáňově specifická exprese některých enzymů z CYP rodiny dává předpoklad pro jejich vyuţití v cílené terapii. Například CYP 17 a CYP 19 se vyskytují ve varlatech, vaječníkách a nadledvinách (Bruno and Njar 2007). A stejně tak i další členové z rodin CYP1, CYP2 a CYP3 byly prokázány mimo játra. Zejména pak CYP1B1 a CYP2W1 se vyznačují tumor specifickou expresí (Murray, Taylor et al. 1997; Karlgren, Gomez et al. 2006). Snaha vědců je vyuţít této vlastnosti a pouţít tyto enzymy jako cíle v terapii a prevenci, kdy je zde moţnost působit na ně malými přírodními či syntetickými molekulami. Pro vývoj těchto léků - molekul je však nutnost znát dobře enzymové substráty, struktury i mechanismus účinku daného enzymu. Strategií vyuţití CYP pro léčbu je několik. Mohou se vyvinout molekuly, které by inhibovaly tyto enzymy a poškozovaly buňky odebráním jejich přirozené funkce. Anebo mohou být pouţity jako aktivátory prodrug, případně mohou být cílem imunitní odpovědi. (McFadyen, Melvin et al. 2004). Za velmi výhodné se zdá pouţití inhibice CYP v léčbě hormon-dependentních nádorů. Tak například rozvoj karcinomu prostaty souvisí s produkcí testosteronu a jeho inhibice se pouţívá jako standardní léčba. Potlačením CYP17 lze docílit blokace tvorby testosteronu. K tomuto účelu byla testována antifungální látka ketokonazol, inhibitor několika CYP. Bohuţel díky ovlivnění více CYP docházelo k toxicitě, a proto se hledají další látky (Trachtenberg, Halpern et al. 1983). Na stejném principu, inhibice CYP19, potenciálně funguje i blokace estrogenu u hormon-dependentního karcinomu prsu (Bruno and Njar 2007). K pouţití v cílené terapii se zdá být vhodný člen CYP1 skupiny a to CYP1B1. Účastní se aktivace několika karcinogenů, byla zjištěna souvislost mezi jeho polymorfismy a vyšším či niţším výskytem některých nádorů (Shimada, Hayes et al. 1996) (Bruno and Njar 2007). Hraje roli při metabolismu estradiolu a zdá se, ţe i u estrogen spojené tumorgeneze. Metabolit estradiolu vzniklý reakcí s CYP1B1 má 42

43 schopnost vázat se na DNA a působit mutagenně. Z tohoto důvodu by mohla vzniknout chemoprevence inhibicí CYP1B1. Tento enzym se také účastní přeměny resveratolu na protirakovinně působící látku piceatannol, ale jeho působení je pouze omezené a proto se hledají další látky s podobným, ale silnějším účinkem (Chun and Kim 2003). Dalším nadějným CYP je nedávno objevený CYP2W1, který se vyskytuje v kolorektální a nadledvinové tumorové tkáni. Zatím bohuţel máme omezené informace o jeho vlastnostech Cytochrom P450 2W1 CYP 2W1 patří k nově objeveným členům rodiny CYP450. CYP 2W1 je jedním z mála CYP, které nejsou exprimovány v játrech (Girault, Rougier et al. 2005). Ve vyšší míře je tento protein exprimován v lidské fetální tkáni a také v nádorové tkáni (Karlgren, Gomez et al. 2006). Lidská CYP2W1 mrna byla nalezena v malém mnoţství v nádorové tkáni vzorků z karcinomů močového měchýře, prsu, jater, pankreatu, ţaludku a štítné ţlázy. Nejvíce se však vyskytuje u kolorektálního karcinomu, jeho exprese byla přítomna u 78 % KRK (Karlgren, Gomez et al. 2006). CYP2W1 byl nalezen v myších embryích, ale u dospělých jedinců přítomen nebyl. Tento fakt naznačuje roli tohoto enzymu u fetálního střeva a poté je jeho exprese inhibována a aktivní je opět aţ v tumorové tkáni (Choudhary, Jansson et al. 2005). Část sekvence genu CYP2W1 byla zaznamenána uţ v roce 2000 v cdna knihovně lidské hepatocelulární buněčné linie HepG2. (Karlgren, Miura et al. 2005). Exprese genu CYP2W1 je řízena epigenetickým mechanismem metylací CpG ostrůvku na přechodu exon 1 - intron 1. Obecně je známo, ţe hypometylace je spojována s genovou nestabilitou a můţe vyústit v karcinogenezi (Gomez, Karlgren et al. 2007). Tento mechanismus se projevil také ve spojení s enzymy skupiny cytochromů P450. Například hypometylace CYP1B1 je spojována s jeho nadměrnou expresí u karcinomu prostaty (Tokizane, Shiina et al. 2005). Podobný princip se objevil také u KRK. Našla se souvislost mezi hypometylací genu a zesílenou expresí CYP2W1 v kolorektální tkáni (Gomez, Karlgren et al. 2007). Edler a kol. ukázali na 162 pacientech spojitost mezi zvýšenou expresí CYP2W1 a horším průběhem onemocnění. Tyto poznatky naznačovaly pouţití CYP2W1 k nezávislému hodnocení prognózy pacientů s KRK (Edler, Stenstedt et al. 2009). Nedávno svoji hypotézu potvrdili na rozsáhlejší skupině pacientů s KRK. Navíc prokázali, ţe CYP2W1 je ve tkáni 43

44 exprimován rovnoměrně, coţ by bylo další pozitivum pro pouţití CYP2W1 v cílené terapii (Stenstedt, Hallstrom et al. 2012). Protoţe je CYP2W1 poměrně nově objevenou molekulou, nejsou dosud známy všechny vlastnosti a fyziologické funkce, proto se stále povaţuje za,,orphan enzym. Ví se, ţe CYP2W1 je zapojen do metabolismu různých exogenních i endogenních substrátů v mikrozomech a na bakteriální membráně. Jako enzym se účastní například biotransformace arachidonové kyseliny, benzfetaminu a indolu. Můţe také katalyzovat aktivaci několika karcinogenů, včetně polycyklických uhlovodíkových diolů (Wu, Sohl et al. 2006) (Gervasini, de Murillo et al. 2010). Ke zkoumání enzymových substrátů byla pouţita zkrácená forma CYP2W1 exprimovaná v Escherichii coli. Moţnými substráty se ukázaly indoly a aflatoxin 1, nicméně reakce byla velmi slabá (Wu, Sohl et al. 2006). Dle nedávného výzkumu substrátové specifity tohoto enzymu byly objeveny další moţné substráty náleţící do skupiny lysofosfolipidů. CYP2W1 byl inkubován s extrakty z tkáně KRK a ukázalo se, ţe reaguje s lysofosfatidylcholinem, lysofosfatidyletanolaminem, lysofosfatidylinositolem, lysofosfatidylserinem, lysofosfatidylglycerolem a lysofosfatidovou kyselinou (Xiao and Guengerich 2012). CYP2W1 je jedním z dalších CYP, který má schopnost účastnit se metabolismu banoxantronu (AQ4N) (Gomez 2008). Látka AQ4N je neaktivní prodrug, která se metabolizuje přes AQ4M na konečný produkt AQ4. Působí pouze v hypoxických buňkách, kde inhibuje topoizomerázy a spouští sled reakcí vedoucích aţ k buněčné smrti (Atkinson, Loadman et al. 2007). Analýzou normální i nádorové kolorektální tkáně se prokázala hypotéza N-glykosylace CYP2W1 v místě Asn177. Zatím je to jediná známá ukázka glykosylace u lidského P450, protoţe jsou většinou orientovány směrem k cytoplazmě, coţ jim neumoţní styk s glykosyltransferázami umístěnými v endoplazmatickém retikulu. Dle dalšího výzkumu byla dokázána přítomnost CYP2W1 také na plazmatické membráně (asi 8 %) a to v glykosylované i neglykosylované formě (Gomez, Nekvindova et al. 2010). Enzym CYP2W1 se zdá být vhodný pro vývoj cílené terapie. Má totiţ schopnost aktivovat prodrug v cytotoxický metabolit. A jelikoţ se jeho výskyt omezuje skoro jen na tumorovou tkáň, bude snad v budoucnu moct být pouţit k protirakovinné terapii jako cytostatický prodrug nebo snad i jako specifická protilátka (Gomez, Nekvindova et al. 2010). 44

45 Gen CYP2W1 o délce 5,5kb leţí na chromozomu 7p22.3 a obsahuje 9 exonů (Obr. 11 a 12). Nejvyšší podobnost na proteinové úrovni vykazuje s CYP2D6 (42 %) a s CYP2S1 (40 %). Byl také nalezen u jiných ţivočišných druhů. S krysím genem vykazuje 78 % totoţnost a s myším 66 % (Karlgren, Gomez et al. 2006). Obr. 11 Schematický obrázek chromozomu 7 a umístění genu CYP2W1 (dbsnp 2013). Obr. 12 Grafické znázornění genu CYP2W1 a jeho 9 exonů (dbsnp 2013). Pro některé CYP je typická velká interindividuální rozmanitost. Mezi tyto patří i CYP2W1. Doposud bylo nalezeno několik nukleotidových polymorfismů (SNP) jak v intronové, tak v exonové oblasti. Genetická variabilita tohoto genu můţe ovlivnit jeho biotransformační schopnosti a to se můţe odrazit na náchylnosti pacienta k rakovině. SNP mohou být zodpovědné za změnu funkce proteinu, jeho skládání, sestřih mrna, její stabilitu a další (Gervasini, de Murillo et al. 2010) (Gomez 2008). Některé variantní alely ukázaly spojitost s vyšším rizikem kolorektální rakoviny. Ačkoliv bylo zveřejněno mnoho SNPů, pouze některé mají schopnost změnit strukturu proteinu a případně jeho aktivitu. Tyto SNP nazýváme nesynonymní (tabulka 6 a 8). V současné době je známo dle NCBI dnsnb databáze 252 polymorfismů CYP2W1 (dbsnp 2013). 45

46 Alela Protein změna nukleotidu, cdna změna nukleotidu, gen efekt CYP2W1*1A CYP2W1.1 beze změny beze změny žádný CYP2W1*1B CYP2W C>T 166C>T žádný CYP2W1*2 CYP2W C>T; 541G>A 166C>T; 2008G>A A181T CYP2W1*3 CYP2W C>T; 173A>C 166C>T; 173A>C E58A CYP2W1*4 CYP2W G>A 5432G>A V432I CYP2W1*5 CYP2W G>A; 1446G>C 5432G>A; 5584G>C V432I; Q482H CYP2W1*6 CYP2W C>T 5601C>T P488L Tabulka 6 Nomenklatura alel genu CYP2W1. Jako první bývá označována alela referenční (,,normální ). Další varianty mohou někdy působit rozdíly v metabolismu, zvýšenou či naopak sníţenou aktivitu enzymu. Vlastnosti alel CYP2W1 jsou ve zkoumání (Hanzawa, Sasaki et al. 2008) (Gervasini, de Murillo et al. 2010). RS označení Změna nukleotidu MAF změna AK RS označení změna nukleotidu MAF změna AK rs A/G G=0.001/1 Ile243Val rs C/T T=0.003/7 Pro464Leu rs C/G G=0.001/3 Ile202Met rs A/G A=0.001/3 Arg328His rs A/G A=0.001/1 Asp395Asn rs A/T neznámé Phe115Ile rs G/T neznámé Leu451Arg rs C/G neznámé Met206Ile rs A/G A=0.001/2 Gly376Ser rs C/G G=0.001/1 His254Gln rs A/G A=0.001/3 Gly461Asp rs A/G A=0.005/10 Asp468Asn rs C/T neznámé Arg437Cys rs A/G neznámé Val233Ile rs A/G neznámé Arg366His rs C/G neznámé Gly200Ala rs A/G neznámé Ala103Thr rs A/G neznámé Asn406Asp rs C/T neznámé Arg420Trp rs C/T T=0.001/1 Pro142Leu rs C/T T=0.001/1 Arg337Trp rs A/G neznámé Ala428Thr rs C/T T=0.001/1 Pro167Leu rs C/G C=0.016/34 Val462Leu rs G/T G=0.001/1 Leu351Arg rs C/T neznámé Thr298Met rs A/G G=0.001/1 Tyr63Cys rs C/G G=0.003/6 Leu183Val rs C/T T=0.001/2 Arg241Cys rs A/C neznámé Pro332Thr rs C/T T=0.001/2 Pro316Leu rs C/T T=0.001/2 Ala282Val rs A/G neznámé Arg241His rs A/G A=0.014/31 Val432Ile rs A/T neznámé Val143Glu rs C/T T=0.001/2 Arg251Trp rs A/G T=0.22/479 Pro488Leu rs A/G A=0.023/50 Arg186His rs C/T A=0.06/138 Ala181Thr Tabulka 8 Přehled SNPů genu CYP2W1 a příslušných záměn aminokyselin v proteinu CYP2W1. Databáze NCBI dbsnp uvádí 252 dosud známých polymorfismů, které se vyskytují v exonové i intronové oblasti (dbsnp 2013). Tato tabulka obsahuje pouze nesynonymní polymorfismy, které způsobují substituci aminokyseliny. Šedě jsou označeny námi měřené SNP. 46

47 Dosud se studiem výskytu alel genu CYP2W1 věnovaly dvě studie. Na území Japonska byly určeny frekvence pro všechny do té doby popsané alely (Obr. 13) (Hanzawa, Sasaki et al. 2008). Později provedla španělská skupina studii 3 alel v jejich populaci (tabulka 7). Ukázalo se, ţe frekvence alel se u obou populací liší. Například alela CYP2W1*6 měla v Japonské studii frekvenci 37 %, ale ve druhé studii byla přítomna jen u 14 % (Hanzawa, Sasaki et al. 2008) (Gervasini, de Murillo et al. 2010). Na základě studie Gervasiniho a kol. se předpokládá spojitost alely CYP2W1*2 s vyšším rizikem kolorektálního karcinomu. Frekvence alely CYP2W1*6 byla také zkoumána v rámci vědecké skupiny Karolinska institutu ve Švédsku (Obr. 14) (Gomez 2008). Obr. 13 Frekvence alelických variant v Japonské populaci. Schéma ukazuje wild-type alelu genu CYP2W1 a 6 jejích variant (Hanzawa, Sasaki et al. 2008). Měřená skupina jedinců zahrnovala 200 Japonců. Nejvíce byla zastoupena CYP2W1*1A (26 %), CYP2W1*1B (32%) a alela CYP2W1*6 (37 %). Ostatní alely se vyskytovaly jen v malém mnoţství, jmenovitě: CYP2W1*2 (0,5 %), CYP2W1*3 (0,5 %), CYP2W1*4 (0,8 %) a CYP2W1*5 (0,3 %). 47

48 RS číslo alela KRK (%, 95) Kontroly (%, 95) OR (%, 95) p q bez RS čísla rs rs A 201 (67,0; 61,7-72,3) 352 (66,9; 62,9-70,9) 173C 99 (33,0; 27,7-38,3) 174 (33,1; 29,1-37,1) 541G 287 (95,7; 93,4-98,0) 478 (90,9; 88,4-93,3) 541A 13 (4,3; 2,0-6,6) 48 (9,1; 6,7-11,6) 1463C 257 (85,7; 81,7-89,0) 462 (87,8; 85,0-90,6) 1463T 43 (14,3; 10,4-18,3) 64 (12,2; 9,4-15,0) 1,00 (0,74-1,36 0,981 0,654 2,22 (1,2-4,12) 0,011 0,022 0,83 (0,55-1,25) 0,373 0,373 Tabulka 7 Frekvence alel CYP2W1 ze studie Gervasiniho a kol. Studie se účastnilo 403 jedinců (z toho150 pacientů s KRK). Jejich DNA byla zkoumána na přítomnost 5 nesynonymních SNP, ale dva v populaci nebyly nalezeny (CYP2W1*4 a CYP2W1*5). Polymorfismus 173C se vyskytoval u 33 %, CYP2W1*6 u 13%. Alela CYP2W1*2 měla rozdílný výskyt u pacientů s KRK a u kontrol. Na základě toho byla zjištěna souvislost alely 541A/G s vyšším rizikem KRK (Gervasini, de Murillo et al. 2010). KRK: kolorektální karcinom; OR: poměr šancí (odds ratio); p-hodnota, q-hodnota Obr. 14 Alelická a genotypická frekvence CYP2W1*6 Švédů, Španělů, Tanzánců a Číňanů. Data byla získána v rámci vědecké skupiny Karolinska institutu ve Švédsku. (Gomez 2008). 48

49 6. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 49

50 6.1. PARAMETRY STUDIE Výběr pacientů a kontrolní skupiny Studovaná skupina byla sloţena z pacientů Masarykova onkologického ústavu v Brně s nově diagnostikovaným sporadickým kolorektálním karcinomem v časovém rozmezí od ledna 2008 do prosince Diagnóza byla potvrzena pomocí histologie. Pacientská skupina se skládala ze 197 jedinců s průměrným věkem 63 ± 9 let (105 muţů, 92 ţen). Kontrolní skupina byla sloţena z 202 dobrovolných dárců krve s podobnou věkovou charakteristikou, 65 ± 14 let (93 muţů, 109 ţen). Všichni byli bez předešlé historie jakéhokoliv typu rakoviny a bez přítomnosti rakovinných symptomů, bez anémie. V tomto případě nebyl kolorektální karcinom vyloučen pomocí kolonoskopie, protoţe se jedná o invazivní metodu. Všichni členové studie byli z bělošské populace. Studie byla povolena nemocniční etickou komisí a všichni pacienti i kontrolní subjekty podepsali informovaný souhlas. 6.2.PŘÍPRAVA VZORKŮ Krevní vzorky všech pacientů byly uchovávány při teplotě -80 C. Izolace DNA byla provedena pomocí kitu QIAamp DNA mini Kit (QIAGEN). Vzorky byly vytemperovány na laboratorní teplotu. Do 1,5 ml zkumavky bylo napipetováno 200 µl nesráţlivé krve (EDTA). Ke vzorku bylo přidáno 20 µl QIAGEN Proteázy a 200 µl AL pufru. Následně byla celá směs zvortexována po dobu 15s a inkubována po 10 minut při 56 C. Rychlým stočením byly odstraněny kapky z víčka. Ke vzorku bylo přidáno 200 µl % etanolu a opět zvortexováno a stočeno. Poté se vzorek opatrně přelil do kolonky se sběrnou tubou a byl centrifugován 1 minutu při ot/min. QIAamp kolonka byla přemístěna do nové čisté 2ml sběrné tuby. Do kolonky bylo přidáno 500 µl AW 1 pufru a centrifugováno 1 min při ot/min. Kolonka byla opět přemístěna do nové, čisté 2ml sběrné tuby. Následně bylo do kolonky přidáno 500 µl AW2 pufru a kolonka byla centrifugována 3 minuty při ot/min. Poté byla kolonka přemístěna do čisté 1,5 ml zkumavky a DNA byla eluována 150 µl AE pufru. Směs byla inkubována po dobu 1 minuty při laboratorní teplotě a poté 1 minutu centrifugována při ot/min. Nakonec byl eluát důkladně zvortexován. Orientačně, průměrná koncentrace vzorků byla 138 ng/µl a čistota 1,9 (A260/280). Vzorky byly skladovány aţ do analýzy při -20 C. 50

51 6.3. ALELICKÁ DISKRIMINACE Princip metody Alelická diskriminace slouţí k detekci specifických mutací a nukleotidových polymorfismů bez pouţití genového sekvenování. Metoda zahrnuje real-time PCR adaptovanou pro analýzu polymorfismů. Jedná se o systém pouţívající dvoubarevnou assay. Pro kaţdý polymorfismus je navrţen pár amplifikačních primerů a pár fluorescenčních značek (sond), jedna sonda pro wild-type alelu a druhá odpovídající nukleotidové sekvenci se SNP. Kaţdá sonda nese na 5 konci jinou fluorescenční značku (zde konkrétně FAM/VIC) a na 3 konci zhášeč. Pokud je sonda vcelku, fluorescence barviva je tlumena navázaným zhášečem. Během PCR nasednou primery a sondy na odpovídající sekvence DNA. Při amplifikaci je sonda rozštěpena polymerázou a tím dojde k oddělení zhášeče od fluorescenční značky a nárůstu fluorescence (Obr. 15). Aby se zabránilo amplifikaci od místa sondy je 3 konec sondy blokován. Tento proces se opakuje kaţdý cyklus a zároveň je měřen nárůst fluorescence obou barviv (McGuigan and Ralston 2002). U homozygotů bude nárůst fluorescence patrný na jednom kanálu (barvě), u heterozygotů na obou kanálech. Obr. 15 Schéma navázání sondy na DNA a následný nárůst fluorescence. 51

52 6.3.2 Pracovní postup Identifikace alelických variant CYP2W1 byla provedena metodou alelické diskriminace na přístroji Rotor-Gene 6000 (Corbett Research) a data byla vyhodnocena pomocí Rotor-Gene 6000 software. V metodě byly pouţity sondy TaqMan SNP Genotyping Assays pro alely CYP2W1*2 a CYP2W1*6. Vzorky DNA byly rozmraţeny při laboratorní teplotě, zvortexovány a stočeny. Analýza byla připravena v předchlazených zkumavkách v 15 µl reakčním objemu. alela sekvence [VIC/FAM] MAF assay č. CYP2W1*2 CTCCCTCCAATATCACCTTC[A/G]CGCTCCTCTTCGGCCGCCGATTTGA A=0,063/ _1 CYP2W1*6 CCAGGCCCTGTGTGCGGTGC[C/T]CAGGCCCTAGGAGCTCCCCCAGCC T=0,219/ _1 Tabulka 9 Charakteristika TaqMan SNP Genotyping assay Kaţdá reakce obsahovala 1X TaqMan Genotyping Master mix (7,5 μl), 1X TaqMan SNP Genotyping assay 40X (0,375 μl) a přibliţně 100 ng DNA. Vzorky DNA byly rozmraţeny, zvortexovány a stočeny. V kaţdém běhu byla zařazena negativní kontrola (NTC no template control), obsahující pouze vodu místo DNA. Připravené mikrozkumavky byly zavíčkovány, umístěny do 72místného rotoru a vloţeny do přístroje RotorGene 6000 (Corbett Research). Teplotní profil byl 2 min při 50 C, 10 min. při 95 C, 50 cyklů při 92 C po 15 s a 60 C po 90 s. Analýza byla zakončena 10 min při 25 C. Real-time detekce fluorescenčního záření byla provedena v průběhu 60 C kroku. Genotypy jednotlivých vzorků DNA byly přiřazeny automaticky softwarem Rotor-gene Genotypy byly rozlišeny na základě intenzit fluorescenčních barviv FAM a VIC v 50 cyklech. Přičemţ VIC barvivo náleţí homozygotům s alelou 1, FAM barvivo homozygotům s alelou 2 a signál obou barviv značí heterozygota. Obr. 16 Teplotní profil alelické diskriminace genu CYP2W1 52

53 Obr. 17 Rotor-gene 6000 software. Obr. ukazuje výstup z analýzy alelické diskriminace. Kaţdému vzorku náleţí dvě křivky pro mutovanou alelu křivka s krouţky a pro normální alelu bez krouţků. Významné jsou signály přesahující pozadí (threshold). Na obrázku můţeme například vidět 2 nejvýše postavené křivky s krouţky naznačující přítomnost dvou mutovaných alel ve vzorku (příslušné signály druhého kanálu jsou v pozadí). 53

54 6.4. VÝSLEDKY Všechny DNA pacientů i zdravých kontrol byly analyzovány metodou alelické diskriminace na přítomnost dvou nesynonymních polymorfismů genu CYP2W1. Tabulka 10 popisuje získaná data: polymorfismus CYP2W1*2, alela 541A byla nalezena ve stejném zastoupení u pacientů s kolorektálním karcinomem i u zdravých kontrolních subjektů (graf 2), její frekvence byla 0,074 (7%). Polymorfismus CYP2W1*6 (graf 3), alela 1463T byla nalezena ve vyšším počtu u zdravých kontrol (21 %), u pacientů s kolorektálním karcinomem se vyskytovala u 18 %. Její výsledná frekvence byla 0,195 (20 %). K určení asociace mezi výskytem jednotlivých alel a onemocnění jsme pouţili chí-kvadrát test (tabulka 12, 13), výpočet pro poměr pravděpodobnosti (relativní risk, RR) a výpočet pro poměr šancí (OR). Na základě provedení těchto testů jsme nezjistili ţádnou statisticky významnou spojitost mezi CYP2W1*2, CYP2W1*6 a rizikem kolorektálního karcinomu. Graf 1 Celkový výskyt alel v testovaných vzorcích DNA. Graf zobrazuje genotypové rozdělení v celé zkoumané skupině. CYP2W1*2 CYP2W1*6 Alela KRK, n (%) Kontroly, n (%) 541G 356 (93) 268 (93) 541A 30 (7) 22 (7) 1463C 313 (82) 266 (78) 1463T 67 (18) 72 (21) RR (95%) OR (95%) 0,90 (0,681-1,200) 1,03 (0,58-1,81) 1,04 (0,996-1,086) 0,79 (0,55-1,16) Tabulka 10 Alelické frekvence CYP2W1 u pacientů a kontrol. n: počet alel, RR: relativní risk, OR: poměr šancí (odds ratio) 54

55 alela genotyp kontroly, n (%) KRK, n (%) Ulc. Kol., n (%) Crohn, n (%) CYP2W1*2 CYP2W1*6 WT (GG) 127 (87) 164 (85) 6 (100) 5 (100) HET (GA) 14 (10) 28 (15) 0 0 MUT (AA) 4 (3) 1 (0,5) 0 0 WT (CC) 107 (63) 127 (67) 3 (60) 2 (40) HET (CT) 52 (31) 59 (31) 2 (40) 3 (60) MUT (TT) 10 (6) 4 (2) 0 0 Tabulka 11 Genotypové frekvence CYP2W1 u pacientů a kontrol. n:počet; WT: wild-type homozygot; HET: heterozygot; MUT: homozygot s mutantní alelou alela počet výskytu znaku relat. četnost výskytu hladina významnosti G kontrola ,6% 0,331 G KRK ,0% G kontrola 14 4,8% A kontrola 14 3,6% 0,438 G KRK 28 9,7% A KRK 28 7,3% 0,262 A kontrola 8 2,8% 0,017 A KRK 2 0,5% * Tabulka 12 Výsledek chí-kvadrát testu CYP2W1*2 pro jednotlivé alely. alela počet výskytu znaku relat. četnost výskytu hladina významnosti C kontrola ,3% C KRK ,8% C kontrola 52 15,4% T kontrola 52 13,7% C KRK 59 17,5% T KRK 59 15,5% T kontrola 20 5,9% T KRK 8 2,1% 0,322 0,518 0,486 0,008 ** Tabulka 13 Výsledek testu chí-kvadrát CYP2W1*6 pro jednotlivé alely. Polymorfismus CYP2W1*2 byl přítomný v homozygotní formě (AA) u 3 % kontrolní skupiny a u 0,5 % pacientů s kolorektálním karcinomem. Heterozygoti (AG) byli zastoupeni 10 % kontrol a 15 % pacientů s KRK. Homozygoti (GG) s wild-type alelou byli v 87% u kontrol a v 85% u pacientů (tabulka 11, graf 2). 55

56 Dříve publikovaná studie uvádí asociaci alely 541A/G s vyšším rizikem kolorektální rakoviny (Gervasini, de Murillo et al. 2010). V naší populační skupině jsme nenašli ţádnou statisticky významnou asociaci alely 541A/G a kolorektální rakovinou. Graf 2 Genotypová a alelická frekvence CYP2W1*2. Polymorfismus CYP2W1*6 byl zastoupen v homozygotní formě (TT) 6 % u kontrolní skupiny a 2 % u pacientů s KRK. Heterozygotní forma (CT) se vyskytovala ve 31 % případů u obou dvou skupin. Wild-type alela (CC) byla přítomna u 63 % zdravých jedinců a u 67% pacientů (graf 3). U alely 1463T byl zjištěn malý rozdíl ve výskytu mezi kontrolní skupinou (vyšší frekvence) a pacientskou skupinou, coţ odpovídá hypotéze, ţe CYP2W1 se účastní kancerogeneze a je tedy ve vyšší míře přítomen ve wild-type (funkční) formě. Data ale nejsou statisticky významná. Graf 3 Genotypová a alelická frekvence CYP2W1*6. 56