Srážení, extrakce a centrifugace

Transkript

1 Do jednoho prostoru dialysační nádoby je umístěn roztok proteinu o koncentraci 0,1 mmol/l (pi je 7,0) v 50mM fosfátovém pufru, ph 7,0 s 5mM NaCl. Do druhého prostoru o stejném objemu je umístěn roztok 50mM fosfátovém pufru, ph 7,0 s NaCl o koncentraci 25 mmol/l. Jaké bude rozložení iontů po ustanovení rovnováhy? Srážení, extrakce a centrifugace 1

2 VSTUPNÍ MATERIÁL DEZINTEGRACE PURIFIKAČNÍ TECHNIKY S NÍZKÝM ROZLIŠENÍM: srážení síranem amonným srážení organickými rozpouštědly srážení organickými polymery a sloučeninami srážení selektivní denaturací afinitní precipitace, imunoprecipitace extrakce CENTRIFUGACE: diferenciální gradientová PURIFIKAČNÍ TECHNIKY S VYSOKÝM ROZLIŠENÍM: Technika Vlastnost ionexová chromatografie náboj chromatofokusace náboj, pi reversní fáze hydrofobicita hydrofobní interakce relativní hydrofobicita gelová chromatografie molekulová hmotnost, tvar afinitní chromatografie biospecifické interakce VSTUPNÍ MATERIÁL OVEREXPRESE PROTEINU AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE FŮZNÍCH PROTEINŮ Ni NTA agarosa (6-His tag) Amylosa ( maltose binding protein ) GST agarosa (glutathion transferasa) ODŠTĚPENÍ FŮZNÍHO PROTEINU Faktor Xa thrombin enterokinasa 2

3 Frakcionace biomakromolekul na základě rozdílů v rozpustnosti Nezaměňovat s denaturací bílkoviny zůstávají v nativním stavu vsolování vysolování 3

4 Franz Hofmeister ( ) pro anionty: SO 4 2- > F - > IO 3- > NO 2 - >Br - > NO 3 - > I - > CNS - pro kationty: Li + > Na + > K + > NH 4+ > Rb + > Cs + Mechanismus tvorby precipitátu tvorba precipitátu je proces závislý na čase zahrnuje tvorbu malých částic, které vznikají asociací makromolekul precipitace může být sledována turbidimetricky Zákal Čas a: vstupující světlo, b: štěrbina, c: reakční kyveta, d: fotodetektory, e: zařízení pro pohlcení světla 4

5 Srážení síranem amonným Mimořádně velká rozpustnost Rozpustnost se málo mění s teplotou Levný Stabilizuje bílkoviny Relativně čistý množství (NH 4 ) 2 SO 4 (g/l roztoku) potřebného pro změnu koncentrace v roztoku z původních procent saturace na požadované nasycení při 0 C 5

6 Příklad: 1. Po dezintegraci jste získali 20 ml extraktu o koncentraci proteinů 0,5 mg/ml. Jako první krok purifikace hexokinasy si zvolíte srážení síranem amonným (Mr 132,14). Zjistili jste, že se sráží až při 50 % koncentraci síranu. Proto jste se rozhodli udělat dvoukrokové srážení (40 %, 50 %). Napište jak byste postupovali (konkrétní navážky a postup), 2. Pokud chcete zabránit lokálnímu zvýšení koncentrace, budete při srážení přidávat rozpuštěný síran amonný. Spočítejte kolik ml 5M síranu amonného musíte přidat k 40 ml extraktu, aby výsledná koncentrace byla 20 %. 6

7 1. Po dezintegraci jste získali 20 ml extraktu o koncentraci proteinů 0,5 mg/ml. Jako první krok purifikace hexokinasy si zvolíte srážení síranem amonným (Mr 132,14). Zjistili jste, že se sráží až při 50 % koncentraci síranu. Proto jste se rozhodli udělat dvoukrokové srážení (40 %, 50 %). Napište jak byste postupovali (konkrétní navážky a postup), 2. Pokud chcete zabránit lokálnímu zvýšení koncentrace, budete při srážení přidávat rozpuštěný síran amonný. Spočítejte kolik ml 5M síranu amonného musíte přidat k 40 ml extraktu, aby výsledná koncentrace byla 20 %. 20% 106g / l 0,8M c. V = c. V 5. V = 0,8.(0,04 + V ) 1 1 V = 7,6ml Srážení organickými rozpouštědly nepolární vodou mísitelná rozpouštědla srážení za nízké teploty (< 0 C)!!! aceton, EtOH, isopropanol, MetOH, propanol, diethyleter Srážení acetonem (< 1µg/ml) přidat 5 objemů vychlazeného ( 20 C) acetonu ke vzorku a vortexova t. nechat 30 min při 20 C. centrifugace 5 min, 6,000 10,000 g. odstranit supernatant a peletu nechat vysušit na vzduchu resuspendovat peletu 7

8 Srážení organickými polymery a sloučeninami PEG nedenaturující, ve vodě rozpustný polymer, lze kombinovat se srážením síranem amonným tichloroctová kyselina nukleové kyseliny > 20 nukleotidů, příprava vzorků na SDS-PAGE (>5µg/ml) přidat 1 objem 100 % TCA do vzorku a vortexovat nechat 20 min na ledu nebo 15 min při 20 C centrifugace 5 min, g odstranit supernatant resuspendovat peletu v 0,1 M NaOH nebo opláchnout peletu směsí ethanol/ether (1/1) a resuspendovat peletu v pufru Selektivní denaturace Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina (enzym) musí zůstat z % v nativním stavu. Denaturační vlivy T, ph Balastní bílkovina musí nejen denaturovat, ale i precipitovat 8

9 Srážení vlivem teploty Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin ph při tepelné denaturaci musí být přesně definováno % teplota Bílkovina 1 Bílkovina 2 Srážení vlivem ph mnoho proteinů se sráží z roztoku v ph, které odpovídá pi je dobré znát pi proteinu (chromatofokusace, isoelektrická fokusace) 9

10 Afinitní precipitace bifunkční ligandy bis-nad, bis-amp, barevné ligandy polymer ligand PEG- ligand Imunoprecipitace antigeny mohou být precipitovány použitím odpovídajících protilátek protilátky mohou být precipitovány použitím odpovídajících antigenů antigeny mohou být precipitovány použitím nerozpustné formy protilátky 10

11 Centrifugace Při centrifugaci se separují částice od roztoku na základě jejich velikosti, tvaru, hustoty, viskozity media a rychlosti otáčení rotoru Rychlost sedimentace čtástic v = d 2 ( ρ ρ ) p 18µ l g v = rychlost sedimentace ρ p = hustota částice g = centrifugační rychlost d = průměr částice ρ l = hustota kapaliny µ = viskozita kapaliny 11

12 Centrifugace - rozdělení Centrifugace Pomalootáčková ot/min Rychlootáčková ot/min Ultracentrifugace ot/min RPM x RCF rychlost: počet otáček za minutu (rpm = revolutions per min.) odstředivá síla: relativní odstředivé zrychlení (RCF = relative centrifugal force) rad RCF = f x r x (rpm) 2 f = přepočítavací faktor 1, r - poloměr rotoru centrifugy (cm) jednotky: g (RCF udává, kolikrát je zrychlení centrifugy větší, než je normální tíhové zrychlení g = 9,81 m/s 2 ) 12

13 Centrifugace Preparativní Analytická diferenciální gradientová sedimentační rovnováhy sedimentační rychlost Cetrifugace - aplikace Centrifugace = separační technika, separace na základě hustoty a rozdílu velikosti ve směsi látek koncentrace buněk nebo precipitátu z velkého objemu tekutiny stanovení molekulové hmotnosti, hustoty, sedimentačního koeficientu separace buněčných komponent (frakcionace) celé buňky (a poškozené buňky) jádra lysosomy mitochondrie peroxisomy mikrosomy (z endoplasmatického retikula) 13

14 Centrifugace - rotory Úhlové diferenciální centrifugace, kratší doba centrifugace Výkyvné gradientová centrifugace, lepší separace Diferenciální centrifugace: opakovaná centrifugace se zvyšující se rychlostí na základě hustoty a velikosti částic buněčná komponenta otáčky [x g] čas [min] buňky (eukaryotické) chloroplasty, buněčné membrány, jádra mitochondrie lysosomy, bakteriální membrány ribosomy

15 Gradientová centrifugace Kritéria pro výběr centrifugačního media: musí v roztoku tvořit gradient nesmí interferovat se vzorkem musí být lehce odstranitelné ze vzorku Jednoduché cukry sacharosa, sorbitol, glycerol Polysacharidy Ficoll, dextran, glykogen Proteiny BSA Anorganické soli CsCl, Cs 2 SO 4 15

16 A. Izopyknická Gradientová centrifugace B. zonální (sedimentační, nerovnovážná) Gradientová centrifugace A. Izopyknická separace na základě různých hustot, nezávisle na jejich velikosti a molekulové hmotnosti molekuly separovány do rovnováhy, ne podle rychlosti sedimentace rychlost x g, 18 hod 16

17 1 2 složka směsi s největší hustotou složka směsi s nejmenší hustotou složka směsi se střední hustotou 3 4 v = d 2 ( ρ ρ ) p 18µ l g 5 Možnosti uspořádání izopyknicné centrifugace

18 ml B. zonální (sedimentační, nerovnovážná) hustota gradienu musí být menší než hustota dělených látek vzorek se nanáší nad gradient nejčastěji sacharosový gradient (5-20%) gradient stabilizuje zóny 18

19 Porovnání gradientových metod Zonální centrifugace Izopyknicná centrifugace Centrifugace nižší rychlost vysoká rychlost ukončení před kompletní sedimentací Sedimentace do rovnováhy, dlouhý čas Sedimentační rychlost Sedimentační rovnováha Vzorek Obdobná hustota, různá Mw/tvar Proteiny (podobná hustota, různá Mw) Podobná Mw, různá hustota Nukleové kyseliny, buněčné organely Analytická centrifugace 19

20 sedimentační rovnováha měření molekulové hmotnosti studium protein-protein interakcí určování nativního stavu proteinu (monomer, dimer, trimet, atd.) měření rovnovážné konstanty měření stechiometrie komplexů dvou nebo více různých proteinů (antigen-protilátka, receptor-ligand) difuse sedimentace 20

21 sedimentační rychlost měření rychlosti sedimentace v závislosti na centrifugační rychlosti závisí jak na molekulové hmotnosti, tak i na tvaru molekul potvrzování homogenity vzorku detekce agregátů a kvantifikace detekce tvaru neglykosylovaných proteinů (globulární, tyčinkovité) detekce změn v konformaci proteinu detekce tvorby a stechiometrie komplexů (receptor-ligand, antigen-protilátka) ( V ρ) m 1 m = M / N s = f Svedberg (S), 1 S = 10 _ -13 s V parciální specifický objem ρ hustota f frikční koeficient M - hmotnost 1 molu látky, N - Avogadrovo číslo 21

22 22

23 SEDIMENTAČNÍ RYCHLOST SEDIMENTAČNÍ ROVNOVÁHA ANALYTICAL Ultracentrifugation, John Burgner, 23

24 Nukleové kyseliny RNA vs. DNA RNA: 2 OH skupina (ribosa) Uracil se páruje s adeninem (A,U,C,G) Mnoho typů a funkcí Je modifikována sestřihem Nejběžněji jednořetězcová DNA: 2 H (deoxyribosa) Thymin se páruje s adeninem (A,T,C,G) Permanentně modifikována (mutace) Dvouřetězcová Struktura helixu 24

25 RNA genomová (chromosomální) organelová plasmidová Isolace nukleových kyselin Messenger RNA (mrna): 1-5 % slouží jako templát pro syntesu proteinů Ribosomální RNA (rrna): > 80 % tvoří součást ribosomů Transferová RNA (trna): % překlad informace z mrna do aminokyselinové sekvence DNA fágová/virová (ds nebo ss) Postup izolace nukleových kyselin kultivace buněk lyse - otevření buněk stanovení koncentrace purifikace DNA nebo RNA stanovení velikosti a kvality 25

26 odstranění proteinů odstranění DNA nebo RNA Cíle purifikace Metody: rozdílná rozpustnost adsorpční metody hustotní gradient Isolace a purifikace genomové DNA Klasický postup lyse buněk např. SDS, CTAB, sarkosyl + proteinasa K (55 o C, 1hod), RNasa fenol-chloroform-isoamylalkoholová extrakce odstředění vodná fáze organická fáze Separace organické fáze od vodné fáze Organické rozpouštědlo ve spodu Vodná fáze nahoře (obsahuje DNA) Buněčné zbytky a proteiny jako tenký film na rozhraní mezi dvěma fázemi precipitace isopropanolem opláchnutí ethanolem rozpuštění ve vodě nebo TE pufru 26

27 Klasický postup Isolace plasmidové DNA resuspendace buněk lyse buněk (SDS, NaOH) neutralizace (CH 3 COOK, ph 5,2) chloroformová extrakce precipitace isopropanolem precipitace ethanolem Isolace a purifikace RNA Komplikace - Ribonukleasy Enzymy, které degradují RNA Běžné kontaminanty laboratoří (lidský i mikrobiální původ) Také se uvolňují během isolace RNA ze vstupního materiálu Je obtížné je inaktivovat ochrana před ribonukleasami ochranné rukavice používání RNase-free zkumavek, pipet, špiček, atd. používání RNase-free roztoků přídavek inhibitorů RNas 27

28 Isolace RNA Klasický postup obdobný isolaci DNA inhibitor RNas nižší ph fenolu (4-6) ošetření DNasou (RNase free) selektivní precipitace LiCl (rrna, mrna) oligo dt pro přečištění mrna AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTT Isolace mrna nanesení totální RNA poly-a konec mrna se váže na oligo(dt) nosiče odmytí rrna a trna eluce mrna z oligo(dt) nosiče 28

29 Příklad využití mrna DNA primární transkript - hnrna ZÍSKÁME IZOLACÍ sestřižená RNA mrna primer poly T reversní transkriptasa jednořetězcová DNA DNA polymerasa cdna Využití metody MICROARRAY pro určení profilu produkovaných proteinů isolace RNA ze zdravé tkáně Příprava fluorescenčně značené cdna (ZELENÁ) isolace RNA z nádoru Příprava fluorescenčně značené cdna (ČERVENÁ) 29

30 Využití metody MICROARRAY pro určení profilu produkovaných proteinů cdna vytvořená ze zdravé tkáně ZELENÁ ČERVENÁ cdna vytvořená ze zdravé tkáně smíchání fluorescenčně značené cdna z obou tkání aplikace na destičku s imobilizovanou DNA Využití metody MICROARRAY pro určení profilu produkovaných proteinů zdravá tkáň značená zelenou fluorescenční barvou intensita zelené barvy spotu (tečky) odpovídá hladině exprese daného genu intenzivně zelené spoty silná exprese genu slabě zelené spoty - slabá exprese genu 30

31 Využití metody MICROARRAY pro určení profilu produkovaných proteinů nádorová tkáň značená červenou fluorescenční barvou intensita červené barvy spotu (tečky) odpovídá hladině exprese daného genu intenzivně červené spoty silná exprese genu slabě červené spoty - slabá exprese genu Využití metody MICROARRAY pro určení profilu produkovaných proteinů překryti zelených a červených dat stejné destičky rozdílná exprese genu ZELENÁ geny přepisované ve zdravých buňkách ČERVENÁ - geny přepisované v nádorových buňkách ŽLUTÁ - geny přepisované v obou typech buněk 31

32 Využití gradientové centrifugace pro purifikaci NK Příklad: experiment na potvrzení semikonzervativní teorie replikace Matt Meselson & Frank Stahl

33 zonální centrifugace sacharosový gradient izopyknická centrifugace CsCl gradient 33

34 Purifikace NK pomocí kitů vazba na resin selektivní membrána magnetické částice gelova chromatografie 34

35 35