Průtoková cytometrie

Transkript

1 Průtoková cytometrie Princip průtokové cytometrie Použití více fluorescenčních barev - teorie kompenzace Možnosti analýzy dat Některé aplikace průtokové cytometrie Imunologické laboratorní metody

2 Průtokový cytometr = Automatický mikroskop Průtoková cytometrie je technologie, která umožňuje simultánní měření několika charakteristik na úrovni jedné buňky Detekce & Počítání Buňky prochází před objektivem mikroskopu a je automaticky změřena jejich fluorescence. Odpad Vzorek Nevýhody oproti mikroskopii: nevíme, kde je v buňce signál lokalizován

3 Složky průtokového cytometru Fluidika: vzorek buněčná suspenze. Nasátí vzorku do přístroje. Průtok vzorku přístrojem. Vytvoření proudu buněk pro měření. Sortování. Regulace rychlosti měření. Optika: Zdroj excitačního záření. Optické zařízení pro sběr emitovaného záření a odraženého světla. Zdroje světla (lasery, detektory, filtry) Elektronika: Převod optického signálu na elektronický signál. Digitalizace pro počítačovou analýzu. Analýza dat: Zobrazení dat & analýza identifikace populací kvantifikace intenzity značení kvantifikace zastoupení buněk v dané populaci

4 Schéma fluidiky vzorek Odpad Unášecí tekutina Tlak unáš. tek. (Stálý) Tlak Vzorku (Variabilní) Vakuum Natlakování

5 Princip průtokové cytometrie Jádro průtokového cytometru: Flow cell - kyveta Nasátí buněk Quartz nozzle Fluorescenční signály Laserový paprsek Velikost otvoru v nozzle = 50 to 400 µm - na některých přístrojích lze měnit

6 Hydrodynamická fokusace v kyvetě Dobré rozlišení Horší rozlišení Vzorek Unášecí tekutina Vzorek Unášecí tekutina Nízký tlak vzorku,úzký proud vzorku Vhodné pro DNA analýzu Vysoký tlak vzorku, široký proud vzorku. Nevhodné pro DNA analýzu nízký vysoký

7 Rozptyl světla buňkou: Forward Scatter (FSC) Čím větší buňka, tím větší rozptyl světla FSC závisí na velikosti buňky Laserový paprsek FSC Detektor tor

8 Rozptyl světla buňkou: Side Scatter (SSC) Laserový paprsek FSC Detektor tor Intenzita SSC je proporcionální množství cytosolických struktur v buňce (granula, buněčné inkluze, atd.) SSC závisí na granularitě buňky Sběrn rné čočky SSC Detektor tor

9 Rozdělení krevních buněk dle FSC a SSC Lymfocyty Granulocyty SSC Monocyty Erytrocyty debris, Mrtvé buňky FSC

10 Detekce fluorescence, značení protilátkami

11 Intenzita fluorescence Relativní intenzita fluorescence Počet buněk

12 Fluorescenční kanály Fluorochromy (buňce vlastní nebo navázané, např. pomocí protilátek) na buňkách absorbují část světla a excitují se Emise světla o nižší energii, tj. o delší vlnové délce než byla excitační. Emitované fotony prochází přes sběrné čočky a jsou pomocí soustavy filtrů a zrcadel rozděleny do kanálů dle svojí vlnové délky Stokesův posun

13 Lasery Light amplification by stimulated emission of radiation Zdroj monochromatického světla (jediná vlnová délka) Zdroj koherentního vlnění = vlnění o stejné frekvenci, stejného směru kmitání a stejné fáze (nebo se stejným fázovým rozdílem). Stabilní zdroj záření Lasery v průtokovém cytometru: Dvoulaserové průtokové cytometry argon laser - modrý (488 nm) helium-neon diode laser - červený (633 nm). Třílaserové průtokové cytometry violet laser - fialový (407 nm) nebo UV laser (350 nm)

14 Detekce Fluorescence Laser Beam FSC Detector Emitovaná fluorescence je pomocí sestavy filtrů a čoček rozdělena podle vlnové délky do kanálů. Na koncových detektorech je v každém m z nich vyhodnocena intenzita fluorescence. Collection Lens Fluorescence Detector A, B, C, etc

15 Intenzita fluorescence Relative fluorescence intensity Number of Events

16 Long Pass Filtry (LP) Propouští všechny vlnové délky vyšší než specifikovaná vlnová délka Example: 500LP bude propouštět všechny vlnové délky větší než 500nm Transmittance 400nm 500nm 600nm 700nm

17 Short Pass Filtry (SP) Propouští všechny vlnové délky kratší než specifikovaná vlnová délka Příklad: 600SP bude propouštět všechny vlnové délky kratší než 500nm. Transmittance 400nm 500nm 600nm 700nm

18 Pásmové filtry Propouší specifické rozmezí vlnových délek Příklad: 550/20BP Filter bude propouštět vlnové délky mezi 540nm a 560nm (550/20 = 550+/-10, ne 550+/-20) Transmittance 400nm 500nm 600nm 700nm

19 Dichroické filtry Mohou být long pass (LP) nebo short pass (SP) Filtr je umístěn v úhlu 45 Část světla je odražena v úhlu 90º k příchozímu paprsku, část světla je propuštena. Detector 1 Dichroic Filter Detector 2

20 Jednoduché schéma optiky přístroje Počet kanálů: 2 lasery obvykle 4 kanály 3 lasery až 11 kanálů APC PE FacsCalibur PC5

21

22 Spektra běžných fluorochromů Laser Lines (nm) PE-Texas Red Texas Red PI Ethidium PE cis-paranaric Acid

23 Elektronika Detektory PMT (photomultiplier tube): elektrony dopadají na fotokatodu Lze měnit napětí na PMT lze nastavit citlivost detektoru Konverze optického signálu do elektronických signálů (změny v napětí - pulsy) Amplifikace signálu a digitalizace (Analog to Digital Converters = ADC ). Analýza výšky Height (H), šířky Width (W) a plochy Area (A) pulsu Softwarová analýza dat LIST MODE FILE: pro každou buňku hodnoty všech parametrů

24 Vznik pulsu napětí na PMT 1. Laser t Voltage 2. Laser t Voltage 3. Laser t Voltage

25 Výška, šířka a plocha pulsu Napětí Výška pulsu (H) Plochy pulsu (A) 0 40 Šířka pulsu (W) čas (µs)

26 Práh (Threshold) Hodnota treshold definuje minální intenzitu signálu v daném kanálu, která je zaznamenáno. Nižší signály nejsou zobrazeny ani zaznamenány.

27 Kompenzace Fluorochromy typicky emitují světlo v širokém spektru vlnových délek (100nm nebo víc) V závislosti na uspořádání filtrů, detektory mohou zachytit fluorescenci od jiných fluorochromů, které jsou detekovány v jiných kanálech kanálů (tzv. přesvit, překryv spekter) Přesvit je třeba kompenzovat, tak aby detektor zaznamenal signál pouze 1 fluorochromu

28 Excitační a emisní spektra fluorochromů (modrý laser) Stejná excitace různá emise Překryv spekter (overlap)

29 Překryv spekter (spektral overlap) Fluorescein Isothiocyanate PE Phycoerytrin

30 Jde pouze o výpočet, úpravu dat, tak aby byla analyzovatelná Závisí na: nastavení přístroje (PMT napětí na detektorech) vlastnostech dané šarže fluorochromu Kompenzace Jednobarevné značení CD8 FL2-%FL1=0% FL2-%FL1=12%

31 Kompenzace pomocí softwaru Je potřeba připravit jednobarevně značené kontrolní vzorky Software vypočítá hodnoty kompenzací Snadné, přesné a rychlé Umožňuje to mnohobarevnou analýzu Možné na cytometrech nové generace Kompenzační matrix FL1 FL2 FL3 FL1 Comp FL2 Comp FL3 Comp

32 Mnohobarevná cytometrie Výhody Šetří čas a vzorky (1) 6barevná zkumavka = (15) 2barevných zkumavek Exponenciální nárůst informace Data z (1) 6barevné zkumvky» (15) 2barevných zkumavek Identifikace nových/málo zastoupených populací (<0.05%) interní kontroly ve vzorku Problémy Musí se pečlivě zvolit kombinace protilátek a fluorochromů Ne všechny reagencie jsou dostupné ve všech barvách Vyšší možnost vzniku chyb Je potřeba zvolit správné kontroly

33 Analýza a interpretace dat Data v LIST MODE FILE pomocí speciálního softwaru grafické zobrazení Různé typy grafů Statistiky Názvy běžných programů (CellQuest, Flowjo, WinMDI, FCS Express)

34 Histogramy zobrazení 1 parametru LIST MODE FILE Event # Param 1 FSC Param2 SSC Param 3 Param 4 PE Param 5 APC Četnost (count) Intenzita signálu

35 Dot ploty zobrazení 2 parametrů SSC Periferní krev populace dle velikosti a granularity 30% 60% FSC Periferní krev populace lymfocytů dle CD4 a CD8

36 Gatování Populace krevních dendritických buněk Gate je definován jako oblast (za pomoci logických operátorů - AND, NOT, OR) Data mohou být zobrazena pouze pro definovaný subset buněk Vytvoření statistik pro buňky,které nás zajímají: procento pozitivních buněk Hodnota fluorescence (relativní hodnota)

37 Hlavní aplikace na průtokovém cytometru: DNA a RNA analýza Analýza životnosti (zastoupení apopt. buněk) Fenotypizace (zastoupení populací, testování aktivace buněk) Funkce buněk (Ca2+influx) Imunologické funkce ( ox. reakce, cytotoxické funkce) Sorting a buněčná izolace

38 Stanovení zastoupení základních buněčných populací CD16 PE, CD56 PE NK buňky CD3 Periferní krev populace lymfocytů dle CD4 a CD8: CD4+ Th lymfocyty CD8+ Tc (cytotoxické) lymfocyty Ostatní populace: CD16+CD56+ NK buňky CD14+ monocyty

39 Analýza životnosti, apoptózy Apoptóza fosfatidylserin na vnější straně membrány vazba Annexinu V Mrtvé buňky -Průnik barvy do jádra (propidium iodide PI)

40 Analýza buněčného cyklu Events S phase M G1 DNA obsah na průtokovém cytometru G1 G2 G0/ S G2/M DNA obsah Rozložení do fází buněčného cyklu

41 Značení konců DNA dutp Apoptóza fragmentace DNA Na volné konce DNA se enzymaticky naváže [Fluoresceindeoxyuridine triphosphate (dutp)] Detekce v kanálu Green Fluorescence Apoptotické buňky (DNA je fragmentována Živé buňky (DNA není fragmentována Green Fluorescence

42 Oxidační reakce Např. Testování funkce makrofágů Oxidací vzniká fluorescenční produkt, který je detekován cytometricky. Superoxide Hydrogen Peroxide Glutathione levels Nitric Oxide Hydroethidine Dichlorofluorescein Monobromobimane Dichlorofluorescein

43 Influx calcia Stimulace nespecifická, specifická (receptory) Fluorescence barvičky pouze, pokud váže vápník (Indo-1, Rho-2) Flow Cytometry Image Cytometry RATIO [short/long] Stimulation Time (Seconds) Ratio: intensity of 460nm / 405nm signals Time (seconds)

44 Testování fagocytózy Pohlcují dendritické buňky (DC) apoptotické nádorové buňky? Červeně označené nád. buňky, DC označené protilátkou HLA-DR (zelená) Control 0 C 4 hod 24 hod <B-530/30-A>: HLA-DR <B-530/30-A>: HLA-DR <B-530/30-A>: HLA-DR <B-610/20-A>: DiI <B-610/20-A>: DiI <B-610/20-A>: DiI