Referenní postup mení katalytické koncentrace -amylázy pi 37 C. Metoda IFCC.

Transkript

1 Referenní postup mení katalytické koncentrace -amylázy pi 37 C. Metoda IFCC. J. Kratochvíla, B. Friedecký SEKK Pardubice Referenní postup mení katalytické koncentrace -AMS v krevním séru vypracovala komise IFCC pro enzymové referenní systémy (IFCC Committee on Reference Systems for Enzymes (C-RSE)) pod vedením prof. G.Schumanna z Hannoveru jako osmou ást doporuení IFCC pro stanovení enzym. Postup bude publikován v asopise Clinical Chemistry and Laboratory Medicine pod názvem: IFCC Primary Reference Procedures for the Measurement of Catalytic Activity Concentrations of Enzymes at 37 ºC Part 8. Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Concentration of -Amylase [-Amylase: 1,4--D-Glucan 4-Glucanohydrolase (AMY), EC ] Postup byl dokonen a k pipomínkám odeslán v lednu Referenní postup je odvozen z již díve publikované referenní metody IFCC (1). Použití teploty 37 C namísto pvodních 30 C vedlo jen k minimálním zmnám v optimalizaci podmínek stanovení. Zatímní recenze navrženého postupu jsou velmi kladné a pipomínky jsou minimální, takže data konené publikované verze se zjevn nebudou lišit od dat námi uvedených v tomto sdlení. ásti 1-7 Referenních postup IFCC pojednávají o referenních micích systémech pro ostatní enzymy, jmenovit pro AST, ALT, CK, GT, LD a o enzymových certifikovaných referenních materiálech IFCC-IRMM a jsou ve struné form k nalezení na v oddíle Infoservis. Princip mení EPS + H 2 O -Amyláza 4-Nitrofenyl-G(7-x) + (7-x) H 2 O -Glukosidáza 4,6 Ethyliden-Gx + 4-Nitrofenyl-G(7-x) (7-x) Glukóza + 4-Nitrofenoxid Reakce je monitorována fotometrickým mením pírstku absorbance žlutého 4-nitrofenoxidu pi vlnové délce 405 nm. Jako pufr je použit HEPES. CaCl 2 a NaCl jsou použity jako modifikátory enzymové reakce. Zkratky: EPS: 4,6-Ethyliden(G1)-4-nitrofenyl(G7)--(1->4)-D-maltoheptaosid (substrát) HEPES: N-2- hydroxyethylpiperazin-n -ethan sulfonová kyselina Podmínky mení Tabulka 1: Složení finální reakní smsi N-2-Hydroxyethylpiperazin-N -ethan-sulfonová kyselina 50 mmol.l -1 ph (37 C) 7 ± 0,03 4,6-Ethyliden(G1)-4-nitrofenyl(G7)--(1->4)-D-maltoheptaosid 5 mmol.l -1 Chlorid sodný 70 mmol.l -1 Chlorid vápenatý 1 mmol.l -1-1-

2 -Glukosidáza (bacillus stearothermophilus -37 C) 135 µkat.l -1 (8100 U/l) Objemový pomr séra 0,03226 (1 : 31) Molární absorpní koeficient indikátoru (nitrofenoxidu) siln závisí na ph. Zmna ph o 0,01 zpsobuje zmnu v kinetice asi o 1 %. Proto je nutné pln respektovat pesné nastavení ph tak, jak je uvedeno v tabulce 1 (3). Tabulka 2: Reakní podmínky mení Teplota 37 C ± 0,1 C Vlnová délka Pološíka vln. délky Optická dráha (tlouška kyvety) as inkubace as preinkubace Interval mení 405 nm ± 1 nm 2 nm 10 mm ± 0,01 mm 60 s 180 s 180 s Poet bod mení 6 Chemikálie Kyselina N-2-Hydroxyethylpiperazin-N -ethansulfonová [HEPES] (C 8 H 18 N 2 O 4 S), M r = 238,31 4,6-Ethyliden(G1)-4-nitrofenyl(G7)--(1->4)-D-maltoheptaosid [EPS], (C 50 H 77 NO 38 ), Mr = 1300,2 -Glukosidáza (EC ) z mikroorganismu (nap. z bacillus stearothermophilus) Chlorid sodný (NaCl), Mr = 58,44 Chlorid vápenatý, dihydrát (CaCl 2 2 H 2 O), M r = 147,02 Hovzí sérový albumin, Frakce V, M r = Požadavky na kvalitu chemikálií EPS Kontaminace substrátu EPS 4-nitrofenyl--D-maltoheptaosidem (G7-4-NP) mže zpsobit prodloužení preinkubaní fáze (lag fáze) a mže pak i interferovat s mením. Hmotnostní podíl G7-4-NP v EPS nesmí pekroit hodnotu 0,001. -Glukosidáza Lze použít jen takového pípravku, který umožní štpení všech glykosidových vazeb - amylázového reakního produktu napíklad z bacillus stearothermophilus (3). Hovzí sérový albumin Nesmí obsahovat proteázy. Tato vlastnost musí být deklarována ve specifikaci výrobce IVD. Píprava roztok Je teba použít vysoce istou vodu v kvalit bidestilované vody (vodivost < 2 µs/cm, silikáty < 0,1 mg.l -1 ). Rozšíená kombinovaná nejistota (k = 2) (gaussovská distribuce) postupu vážení musí být U c 1,5 % ( 3). Roztok 1 Vodný roztok 313,1 mmol.l -1 CaCl 2 dihydrátu -2-

3 Roztok 2 Vodný roztok 52,10 mmol.l -1 N-2-Hydroxyethylpiperazin-N -ethansulfonové kyseliny a 86,13 mmol.l -1 chloridu sodného Diluent pro reakní enzymy Vodný roztok 1,20 g.l -1 hovzího albuminu a 154 mmol.l -1 NaCl. Roztok 3 16,9 mkat.l -1 (1,014 ku/l) -glukosidázy pi 37 C rozpuštné v diluentu pro reakní enzymy Reagencie Reakní roztok Promíchá se 25 ml roztoku 2 s 0,25 ml roztoku 3. Stabilita pi 2 C až 8 C je 2 týdny. Startovací roztok Vodný roztok 31,00 mmol.l -1 4,6-Ethyliden(G1)-4-nitrofenyl(G7)- -(1->4)-Dmaltoheptaosidu a 52,1 mmol.l -1 HEPES adjustovaný pomocí 0,2 mol.l -1 NaOH na ph (37 ºC) 7,00. Postup mení Vytemperuje se odpovídající objem vzorku ( 0,6 ml pro jedno mení) startovacího roztoku na 37 C krátce ped mením. Zbytek startovacího roztoku se uchovává pi teplotách 2 C až 8 C. Do kyvety se pipetují následující objemy reagencií po sob (tabulka 3). Tabulka 3: Postup mení 2,000 ml Reakní roztok Vytemperovat na teplotu 37,0 C 0,080 ml Vzorek Intenzivn se promíchá a inkubuje po dobu 60 s. Po skonení inkubace by ml mít roztok v kyvet teplotu 37 C 0,400 ml Startovací roztok Intenzivn se promíchá, eká se po dobu 180 s a pak se mí pírstek absorbance v závislosti na ase po dobu 180 s. Je teba užít kvalitní spektrofotometr s vysokým stupnm rozlišení a metrologicky ovené pipety a odmrné nádobí. Musí být vyhodnoceny a dokumentovány standardní nejistoty kinetického fotometrického mení a mení objemu vzorku. Reagenní blank K urení hodnoty reagenního blanku se nahradí mený vzorek roztokem 9 g.l -1 (154 mmol.l -1 ) chloridu sodného. Postup mení je stejný jako je uvedeno výše v tabulce 3. Poátení absorbance nesmí pekroit 0,35 a asová zmna absorbance blanku pak musí být menší než 3,3 x 10-5 s -1 (0,002 min -1 ). Musí být odstranny všechny možné zdroje kontaminace (zejména slinná -AMS) a neistoty reagencií. -3-

4 Blank vzorku K urení hodnoty blanku vzorku se nahradí startovací roztok roztokem 9 g.l -1 (154 mmol.l -1 ) chloridu sodného. Postup mení je stejný jako je uvedeno výše v tabulce 3. Blank vzorku se stanoví a dokumentuje, ale nebere v potaz pi výpotu katalytické koncentrace. Hodnota blanku vzorku u referenních materiál (kalibrátor a/nebo kontrolních materiál) nesmí pekroit 1 % celkové katalytické koncentrace ve vzorku. Horní mez pracovního rozsahu metody Jestliže zmna absorbance v micím intervalu pekroí 0,0039 s -1 (0,234 min -1 ), vzorku musí být naedn vodným roztokem 9 g.l -1 (154 mmol.l -1 ) chloridu sodného a micí postup se opakuje s takto naedným vzorkem. Nalezená výsledná hodnota musí být po mení pepotena násobením edícím faktorem. Zdroje chyb Katalytická koncentrace -glukosidázy ve finální reakní smsi je rzn inhibována specifickými matricemi mených vzork (3). Tyto inhibice musí výrobci IVD zvážit a studovat pro všechny typy matric mených vzork (sérum, plazmu, pracovní kalibrátor, kontrolní materiály). Kontaminace slinnou -AMS vede k prudkému zvýšení namené hodnoty nebo k neakceptovatelnému vzestupu hodnoty reagenního blanku. Výpoet asová zmna absorbance (s -1 ) je vypotena regresní analýzou (metodou nejmenších tverc). Po odetení hodnoty reagenního blanku (s -1 ) se vynásobí takto korigovaná zmna absorbance (s -1 ) faktorem F = 3063 (mení pi 405 nm, 405(4-NP) = 1012 m².mol -1 ) A/t Amylasa Zmna absorbance (s -1 ) po korekci na reagenní blank (s -1 ) b Amylasa Katalytická koncentrace -amylázy (µkat.l -1 ) b Amylasa = 3063 A/t Amylasa (kat.l -1 ) Poznámka: Ohledn vlivu ph na 405 (molární absorpní koeficient) je teba poznamenat, že závislost 405 na pítomnosti bílkovin je ešena uzancí a použitý 405 (4-NP) = 1012 m².mol -1 je doporuen dle IRMM/IFCC. Referenní interval Pedbžný referenní interval v krevním séru byl stanoven ve dvou referenních laboratoích mením dvou referenních populací (celkem 146 muž a žen). Nebyl nalezen signifikantní rozdíl (t-test, p < 0,05) mezi obma referenními kolektivy tvoenými muži a ženami. Referenní interval byl uren jako 2,5 až 97,5 percentil, piemž u obou z nich byly poítány hodnoty 90% intervalu spolehlivosti. Pedbžný referenní interval pro muže a ženy ( 17 let) je: Dolní referenní mez - 2,5 percentil (90 % interval spolehlivosti): 0,52 µkat.l -1 (0,42 µkat.l -1 až 0,60 µkat.l -1 ) Horní referenní mez - 97,5 percentil (90 % interval spolehlivosti): 1,78 µkat.l -1 (1,71 µkat.l -1 až 2,00 µkat.l -1 ) Tento referenní interval byl již verifikován dalšími pracovišti. -4-

5 Referenní interval získaný ve studii NORIP 2000 (4) Hodnoty jsou opt spolené pro dosplé muže a ženy a jsou tém perfektn shodné s výše uvedenými, získanými referenním IFCC postupem, akoliv byly získány rutinními kity IVD pouze s použitím IFCC kalibrace. Krevní sérum: 0,45 až 2,0 kat.l -1 Plazma: 0,4 až 2,0 ka.l -1 l Shrnutí a praktické dopady nového referenního postupu IFCC mení -amylázy V souasné dob je k dispozici certifikovaný referenní materiál CRM IFCC/IRMM amylase (IRMM je referenní instituce Evropského spoleenství - Institute for Reference Materials and Measurements se sídlem v Geelu - Belgie). Tento materiál je uveden v databázi Spojené komise pro návaznost v laboratorní medicín - JCTLM a lze ho vyhledat na nkteré z webových adres: Jeho certifikace je popsaná už od roku 1999 (5) - viz i webovou adresu Infoservis a práce Pavla Sedláka. Praktickým dopadem jeho existence je kalibrace IFCC,která je už nkolik let všeobecn používána výrobci IVD, organizátory EHK a zejména v praxi klinických laboratoí, kde umožuje dosahovat dobe porovnatelných výsledk mezi rznými laboratoemi. Kalibrace IFCC je dobe známa a velkou vtšinou našich laboratoí a výrobc IVD používána. Pokud však doposud neexistoval oficiální referenní postup mení, nebyla k dispozici ani dostaten exaktní báze pro certifikaci referenních materiál a realizaci co nejvyššího stupn návaznosti výsledk rutinních mení. Vytvoení a publikace referenního postupu IFCC vytváí pro certifikaci referenního materiálu exaktní bázi, povede k vyššímu stupni návaznosti, lepší srovnatelnosti a jednotné klinické interpretaci výsledk. Literatura 1. Lorentz K, International Federation of Clinical Chemistry (IFCC). Approved Recommendation on IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes. Part 9. IFCC Method for -Amylase (1,4--D-Glucan 4- Glucanohydrolase, EC ). Clin Chem Lab Med 1998; 36: Linsinger T, Schimmel H, Pauwels J, Schumann G, Siekmann L, IRMM/IFCC information, Catalytic concentration of -amylase determined by IFCC reference method at 37 C, IRMM/IFCC ; EUR EN 3. Schumann G. et all.: Appendix in text: Part 8. Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Concentration of -Amylase [-Amylase: 1,4--D-Glucan 4-Glucanohydrolase (AMY), EC ]. SD-C-RSE of IFCC. Draft January Rustad P, Felding L, Franzson L a spol. The Nordic reference interval project 2000: recommended reference intervals for 25 common biochemical properties. Scand J -5-

6 Clin Lab Invest 2004,64, (Dostupné též na webové adrese: 5. IFCC, Scientific Division Committee on Enzymes, Lorentz K.: Approved Recommendation on IFCC Methods for the Measurement of Catalytic Concentration of Enzymes Part 9. IFCC Method for -Amylase (1,4-alpha-D-Glucan 4- Glucanohydrolase,EC ), Clin.Chim.Acta, S5 S