Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Transkript

1 Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

2 Investice do rozvoje vzdělávání ZTOX / Základy Toxikologie Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

3 Investice do rozvoje vzdělávání Distribuce,Eliminace, Toxikokinetika Vlivy na metabolismus cizorodých látek Radim Vrzal Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

4 Investice do rozvoje vzdělávání Seznámit s procesy eliminace škodlivin, časovou závislostí koncentrace toxických látek v těle, jejím matematickým zpracováním Distribuční objem, renální eliminace, enterohepatální oběh, AUC Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

5 Distribuce = Přesun látky z místa absorpce do cílové tkáně/celého organismu = reversibilní pohyb škodliviny mezi krví a tkáněmi - Vlivy na distribuci: - promývání tkáně (perfuse) mozek, játra vs tuková tkáň - vazba na proteiny - exkrece, biotransformace - fyz.chemické parametry pka, rozpustnost v tucích, Mw - z krve do tkání většinou difuzí po gradientu - Akumulace v tkáních, pro které je vysoká afinita k dosažení efektu v místě účinku nutná vyšší koncentrace - Výhoda je-li látkou škodlivina (Tetracyklinová antibiotika afinita pro místa s vysokým obsahem Ca 2+ ; Pb afinita pro kosti; Antimalarikum quinacrine se akumuluje v játrech; PCB akumulace v tucích)

6 Limity distribuce - Anatomické bariéry mozkomíšní bariéra (BBB) - Vazba na protein snížení aktivní koncentrace k 1, k 2 asociace / disociace Proteiny vážící xenobiotika: albumin, a1-acid glykoprotein, lipoproteiny (HDL, VLDL, LDL), globuliny Množství navázané na protein = afinita, počet vazebných míst, koncentrace škodliviny Vazba na protein nebrání dosažení místa účinku, jen snižuje rychlost s jakou je účinku dosaženo. Vazba na proteiny - Kovalentní uplatnění v případech karcinogenních metabolitů - Nekovalentní snažší disociace

7 Limity distribuce II. Ionizovatelnost a rozpustnost v tucích ovlivňuje vazbu na proteiny. LDL Dieldrin

8 Matematika distribuce Metoda analýzy vazebných míst rovnovážná dialýza Určení vazené afinity (K a ), počet vazebných míst, procento navázaného léčiva Nespecifická vazba van der Walsovy síly, hydrofobní interakce vnitřní vazebné konstanty přibližně stejné velikosti (k 1 =k 2 =..=k n ) K binding - rovn.konst pro asociaci TP - látk.konc komplexu T - látková koncentrace škodliviny P - látková koncentrace volného proteinu Nepopisuje vazebnou afinitu či vazebná místa týká se vazeb síly vodíkové vazby či méně snadná asociace/disociace Dvojitě reciproční výnos 1/[TP] na 1/[T]

9 Matematika distribuce Scatchardova rovnice n moly ligandu (škodliviny) vázané na mol proteinu [T] koncentrace volné škodliviny k vnitřní afinitní konstanta n počet míst s afinitou k 2 vazebná místa s rozdílnými afinitami Váže-li se méně než 90% plasmatické koncentrace malý klinický význam Např. 99% se váže a 1% je aktivní, pak při kompetitivní vazbě s jiným léčivem poklesne vazba na např. 94% a volné frakce je 6% 6 x více Vazba na proteiny může mít za následek sníženou eliminaci, je-li glomerulární filtrace jediná cesta eliminace

10 Matematika distribuce II. Distribuční objem (V d ) popisuje objem kapaliny potřebné k tomu, aby bylo dosaženo, při daném množství (A) škodliviny, stejné koncentrace (C p ) ve všech částech těla jako v plasmě Malý V d vše v plasmě, difuze membránami je omezena Velký V d, větší i než teoretický objem kapalin v těle rozpustné v lipidech, snadný prostup membránou (EtOH, DIAzepam), vazba na tkáňové proteiny V d distribuční objem V p objem plasmy V TW domnělý objem tkáně C TW koncentrace v tkáni Frakce vázaná do tkáně

11 Vazba na proteiny = Delší eliminace delší účinek škodliviny

12 Toxikokinetika Rozšíření farmakokinetiky za použití vyšších koncentrací Snaha odhadnout tkáňovou koncentraci v místě spojeném s toxickým účinkem Po vstupu do těla: - změna lokalisace, koncentrace, chemické identity eliminace, - transport různými systémy, aktivace, akumulace Každý proces lze popsat rychlostní konstantou kinetiky 1.řádu!!!

13 Situace není statická!!!

14 Toxikokinetika Clearence kvantitativní zhodnocení eliminace = rychlost vyloučené škodliviny vzhledem k plasmatické koncentraci - za fysiologických podmínek = objem krve vyčištěné od sloučeniny za jednotku času (sběr krve a moči) Každý proces (absorbce, distribuce, eliminace) lze popsat jako rychlost.

15 Toxikokinetika 1.Řád IV cesta pokles žádná absorpce Obecně transportní proces Rychlost eliminace Jednokompartmentový model - nejjednodušší

16 Toxikokinetika Toxikokinetická data nelze vždy vystihnout lineárním modelem. Složitější modely zahrnující transport mezi kompartmenty (všechny místa v těle s podobnými vlastnostmi)

17 Toxikokinetika AUC Ne IV podání!!! Biodostupnost = frakce látky, která dosáhne systémové cirkulace - 100% pro IV podání - závisí na místě podání, first pass efektu, atd. t 1/ 2 ln 2 k el AUC c k el DOSE( m0 ) DOSE( m0 ) k V Cl 0 el D

18 Toxikokinetika příklad Králíkovi o hmotnosti 3 kg byla intravenosně aplikována látka v množství 10 mg/kg. V tabulce jsou uvedeny koncentrace látky v krvi v závislosti na čase. Určete eliminační konstantu (k el ), poločas vylučování (t 1/2 ), počáteční koncentraci (C 0 ), distribuční objem (V D ), plochu pod křivkou (AUC) a clearanci (C l ). Čas/min Koncentrace/ mg/ml 3,86 3,03 1,45 0,47 0,22 Řešení: k el C 120 C 5 C C C ln C t t e e k el k el t t ,22 ln 3, C 5 0 t e C k el 0,0249 min 5 1 t 1 / 2 27,8min C 0 4,37mg / ml V D 6862, 2ml AUC 175mg.min. ml 170,87ml.min C l C C 5 ( t 5 e k el t )

19 Eliminace škodlivin = kritické pro přežití Jednobuněčné organismy difuse Mnohobuněčné organismy zvýšená komplexnost účinnost difuse byla kompromitována několika následky evoluce 1. nárůst velikost 2. zmenšení povrchu těla vůči hmotnosti 3. kompartmentalizace těl 4. nárůst v obsahu tuků 5. anatomické bariéry jako ochrana před vnějším prostředím

20 Eliminace škodlivin II. 3 majoritní cesty Játra biotransformace lipofilních sloučenin na hydrofilní a eliminace do žluči Ledviny sběr škodlivin filtrací a eliminace močí Plíce odstranění těkavých sloučenin výdechem

21 Minoritní cesty Kůže těkavé sloučeniny Eliminace škodlivin III. Pot ztráta cca 0.7 l vody denně, ve vodě rozpustné sloučeniny Vlasy Hg, kokain analýza vlasů jako marker expozice Mléko bohaté na lipidy a lipoproteiny, eliminace v tucích i vodě rozpustných sloučenin (DDE, PCBs) výhoda pro matku, ne však pro dítě

22 Renální eliminace - Transport oběhovým systémem - rozpustné látky difusí a cirkulací k místům eliminace - lipofilní látky vazba na proteiny či lipoproteinů v místě eliminace difuse k membránám či vazba na receptory membrány s proteinem (endocytosa) a intracelulární procesy vedoucí k eliminaci Ledviny místa eliminace ve vodě rozpustných sloučenin - velikost - < Da projdou - rozpustnost - lipofilní látky transportovány do ledvin vázané na proteiny neschopné eliminace nutnost biotransformace

23 Renální eliminace II. Krev přiváděna renální arterií. Funkční jednotka = nefron - síť kapilár = glomerulus - vysoký tlak krve přestup póry glomerulu a sběr v Bowmanově váčku (voda, glukosa, AK, močovina, cizí sloučeniny) - proximální tubul reabsorpce některých složek do krve (aktivním transportem) glukosa, AK - Henleho klička reabsorpce vody v klesající části, iontů (Na +, K +, Cl - ) ve stoupající části Zbylý materiál ve filtrátu = moč

24 Jaterní eliminace Játra - tvorba proteinů - biotransformace - eliminace exkrecí do žlučníku Krev je dodávána ze 2 zdrojů: - jaterní arterie (okysličená krev) - portální žíla (živiny) Spojení obou cév do sinusoid = prostory mezi hepatocyty cca 70% povrchu hepatocytů je v kontaktu s krví

25 Enterohepatální cirkulace Dekonjugace ve střevě zvýšení lipofility a absopce portální žílou do jater konjugace vyloučení do žluči štěpení ve střevě cyklus Aktivní transport do žluči ATPvazebné kazety (P-glykoprotein)

26 -Těkavé sloučeniny Eliminace plícemi -Výměna plynů mezi krví a alveolem pasivní difusí

27 Ovlivnění metabolismu xenobiotik Stravovací návyky I - Proteiny - nízkoproteinová dieta snížení monooxygenasové aktivity u krys - výhoda např. dimethylnitrosamine - netoxický - nevýhoda např. strychnin více toxický - Sacharidy vysokosacharidová dieta = podobné účinky jako nízkoproteinová u krys - Lipidy deficity v linoleové kyselině či jiných nenasycených = redukce monooxygenasové aktivity - Mikronutrienty deficity vitamínů přinášejí pokles monooxygenasové aktivity (Riboflavin pokles P450 reduktasy, nárůst P450; vitamin C deficit vede k poklesu P450 u morčat; deficit A a E pokles monooxygenasové aktivity; thiamin nárůst; Co, Mn, Pb pokles P450)

28 Nutriční potřeby pro metabolismus Stravovací návyky II xenobiotik B3 B2 B6 B5 P450 vitamin B komplexu, železo

29 Vývoj - nárůst v množství enzymů po narození u savců - rychlost nárůstu rozdílná mezi druhy - novorozenecká žloutenka - konjugace s glycinem dosahuje normálu po 30 dnech u krys, po 8 týdnech u lidí Fysiologické účinky I. Těhotenství - pokles mnoha XMEs (glukuronidace progesteron je inhibitor UGT in vitro) - podobný účinek na sulfataci u těhotných krys a morčat Nemoc - pokles schopnosti metabolizovat sloučeniny (hepatitis) - produkce prozánětlivých cytokinů aktivuje MAP kinasy které potlačují expresi a aktivitu některých XMEs

30 Fysiologické účinky II. Pohlavní rozdíly - rozdíly začnou být nápadné od puberty - samci krys metabolizují některé látky (hexobarbital, aminopyrin) rychleji než samice - u člověka jsou rozdíly méně výrazné (P450, FMO, UGT)

31 Fysiologické účinky II. Hormony thyroidní nárůst v NADPH oxidaci u krys (větší u samic) - u myší snížena hydroxylace anilinu či hexobarbitalu - adrenální hormony - odstranění adrenálních žláz vede k poklesu aktivity mikrosomálních hepatických enzymů u samců krys, ne u samic - insulin některé reakce fáze II sníženy u diabetických zvířat Vlivy prostředí - Teplota variace teploty = forma stresu (caffein u myší) - Ionizující záření redukce rychlosti metabolismu (hydroxylace steroidů) - Světlo krysy a myši největší aktivita P450 na začátku temné fáze - Vlhkost účinek na mouchu domácí - Nadmořská výška zvýšení či snížení (>1500m snižuje toxicitu strychninu u myší)

32 Mezidruhové vlivy - komparativní toxikologie studie variací v toxicitě exogenních sloučenin u rozdílných kmenů či taxonomických druhů - Přínos ve dvou oblastech akutní toxicita a metabolismus - selektivní toxicita sloučenina toxická k určitému druhu (hmyzu) - experimentální modely vhodný model a extrapolace na člověka - enviromentální cyklus xenobiotik rozsah metabolických procesů v přírodě - Rozdíly mezi taxonomickými třídami tvorba glukosidů u hmyzu a rostlin vs glukuronidů u ostatních zvířat Evoluční rozdíly v konjugaci

33 Druhové rozdíly v metabolické konverzi fenolu in vivo

34 Chemické vlivy - Lidé vystaveni spoustě sloučenin - Xenobiotika mohou být induktory či inhibitory enzymových aktivit Enzymová inhibice nárůst či pokles toxicity -Kompetitivní nárůst Km, Vm konstantní -Nekompetitivní pokles Vm, Km stejná -Akompetitivní změna Vm a Km ve stejném poměru -Ireversibilní kovy, CO

35 Chemické vlivy II. Synergismus = = 10 Potenciace = = 10 Antagonismus = = 1 Indukce exprese -TCDD (CYP1A) - fenobarbital (CYP2B a 3A) -rifampicin (CYP3A a 2C) - ethanol (CYP2E1) Ligandem aktivované transkripční faktory PXR (CYP3A), AhR (CYP1A) Zvýšená stabilizace proteinů či mrna (CYP2E1)

36 Slovo závěrem. Procesy distribuce a eliminace určují zda se stanete obětí.